Một loại vi khuẩn sản xuất axit glutamic được phân lập từ thực phẩm lên men của Malaysia

A. LỜI MỞ ĐẦU 4 B. NỘI DUNG 4 1. GIỚI THIỆU 4 2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 5 2.1. Nhận dạng kiểu hình và kiểu gen 6 2.2. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau đến sản xuất axit glutamic 7 2.3. Nghiên cứu về tiêu thụ glucose 8 2.4. Ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của amoni nitrat đến sản xuất axit glutamic 9 2.5. Mối liên hệ pH với sản xuất axit glutamic 10 2.6. Nghiên cứu về sơ đồ tăng trưởng và mối liên hệ với sản xuất axit glutamic 12 2.7. Nghiên cứu về hồ sơ sản xuất axit glutamic 13 3. PHẦN THỰC NGHIỆM 15 3.1. Mẫu 15 3.2. Hóa chầt và phương tiện 15 3.3. Phân lập vi khuẩn axit lactic 15 3.4. Định lượng vi khuẩn lactic sản xuất axit glutamic 15 3.5. Chiết xuất axit Glutamic trong MRS Broth 15 3.6. Phân tích định lượng Axit Glutamic 16 3.7. Nhận dạng phân lập vi khuẩn lactic 16 C. KẾT LUẬN 17 D. TÀI LIỆU THAM KHẢO 17

Một loại vi khuẩn sảnxuất axit glutamic

được phân lập từthực phẩm lên men

của Malaysia

MỤC LỤC

A.LỜI MỞ ĐẦU 4

B.NỘI DUNG 4

1.GIỚI THIỆU 4

2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 5

2.1.Nhận dạng kiểu hình và kiểu gen 6

2.2 Ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau đến sản xuất axit glutamic 7

2.3 Nghiên cứu về tiêu thụ glucose 8

2.4 Ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của amoni nitrat đến sản xuất axit glutamic 9

2.5 Mối liên hệ pH với sản xuất axit glutamic 10

2.6 Nghiên cứu về sơ đồ tăng trưởng và mối liên hệ với sản xuất axit glutamic 12

2.7 Nghiên cứu về hồ sơ sản xuất axit glutamic 13

3.PHẦN THỰC NGHIỆM 15

3.2.Hóa chầt và phương tiện 15

3.3.Phân lập vi khuẩn axit lactic 15

3.4.Định lượng vi khuẩn lactic sản xuất axit glutamic 15

3.5.Chiết xuất axit Glutamic trong MRS Broth 15

3.6.Phân tích định lượng Axit Glutamic 16

3.7.Nhận dạng phân lập vi khuẩn lactic 16

C.KẾT LUẬN 17

D TÀI LIỆU THAM KHẢO 17

2

A LỜI MỞ ĐẦU

Axit l -glutamaic là chất dẫn truyền thần kinhkích thích chính trong não và là chất trung gianquan trọng trong quá trình trao đổi chất Trongnghiên cứu này, vi khuẩn axit lactic (218) đã đượcphân lập từ sáu loại thực phẩm lên men khác nhaunhư là nguồn sản xuất axit glutamic mạnh mẽ Cácvi khuẩn giả định đã được kiểm tra khả năng tổnghợp axit glutamic Trong số 35 chủng thể hiện khảnăng này, chủng MNZ được xác định là loài tạo raaxit glutamic cao nhất Các thử nghiệm nhận dạngbao gồm xác định trình tự gen 16S rRNA và khảnăng đồng hóa đường đã xác định chủng MNZ là

Lactobacillus plantarum.Các đặc điểm của vi sinh

vật này liên quan đến khả năng sản xuất axitglutamic, tốc độ tăng trưởng, tiêu thụ glucose vàcấu hình pH đã được nghiên cứu Kết quả cho thấyaxit glutamic được hình thành bên trong tế bào vàđược bài tiết ra môi trường ngoại bào Sản xuất axit

glutamic được phát hiện là có liên quan đến tăngtrưởng và glucose đã tăng cường đáng kể sản xuấtaxit glutamic (1,032 mmol / L) so với các nguồncacbon khác Nồng độ 0,7% amoni nitrat như mộtnguồn nitơ giúp tăng cường sản xuất axit glutamicmột cách hiệu quả Theo hiểu biết của chúng tôi,đây là báo cáo đầu tiên về quá trình sản xuất axitglutamic bởi vi khuẩn axit lactic Kết quả củanghiên cứu này có thể được ứng dụng nhiều hơn đểphát triển các loại thực phẩm chức năng làm giàuaxit glutamic và sau đó là axit γ-amino butyric(GABA) như một hợp chất hoạt tính sinh học.

B NỘI DUNG

1 GIỚI THIỆU

C Axit glutamic là một axit amin đa chức năng liênquan đến nhận thức vị giác, dẫn truyền thần kinh kích thích vàchuyển hóa trung gian Nó đóng một vai trò quan trọng trongquá trình tiêu hóa ở giai đoạn dạ dày với tác dụng đa dạng trong

đường tiêu hóa khi được tiêu thụ các chất dinh dưỡng bằng cáchtăng cường bài tiết ngoại tiết của dạ dày Axit glutamic là mộttiền chất cụ thể cho các axit amin khác như arginine và prolinecũng như cho các phân tử hoạt tính sinh học như axit γ-aminoaminobutyric (GABA) và glutathione γ-aminoamino butyric sở hữu một sốchức năng sinh lý nổi tiếng ( tức là chống tăng huyết áp vàchống bệnh tiểu đường và glutathione đóng một vai trò quantrọng trong việc bảo vệ niêm mạc khỏi tổn thương peroxide vàkhỏi các độc tố trong chế độ ăn uống Hơn nữa, một số nghiêncứu đã chỉ ra tính hữu ích có thể có của axit glutamic trong việctăng cường khả năng nuôi dưỡng ở người già và bệnh nhân cóchế độ dinh dưỡng kém Tại thời điểm hiện tại, axit glutamicphần lớn được sản xuất thông qua quá trình lên men vi sinh vậtvì phương pháp hóa học tạo ra hỗn hợp raxemic của axitglutamic (axit D -amino và L -aminoglutamic) Nhiều nghiên cứu đã báo cáosự bài tiết axit glutamic bởi các vi sinh vật khác nhau; tuy nhiên,hầu hết chúng không phải là vi sinh vật cấp thực phẩm Vikhuẩn lactic (LAB) nổi tiếng là sản xuất nhiều loại chất chuyển

hóa chính Sự tồn tại của gen gdh trong vi khuẩn lactic chịu

trách nhiệm sản xuất axit glutamic đã được chứng minh Ngoàira, vi khuẩn lactic rất cần thiết trong quá trình chế biến nguyênliệu thực phẩm và chúng đã được ứng dụng rộng rãi trong ngànhcông nghiệp thực phẩm vi khuẩn lactic có thể nâng cao thời hạnsử dụng và tính an toàn của thực phẩm, cải thiện kết cấu thựcphẩm, và góp phần vào giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thựcphẩm và cảm quan dễ chịu của sản phẩm sử dụng cuốicùng Mặt khác, sử dụng vi khuẩn lactic với tiềm năng sản xuấtaxit glutamic có thể tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất cácloại thực phẩm chức năng giàu phân tử hoạt tính sinh học như γ-aminoamino butyric Ưu điểm chính của việc sản xuất axit glutamicbằng vi khuẩn lactic là axit amin được sản xuất theo cách này cóhoạt tính sinh học ( axit L -aminoglutamic) và quy trình sản xuất đượccoi là an toàn và thân thiện với môi trường Điều này có thể đạtđược thông qua việc lựa chọn các chủng vi khuẩn lactic thíchhợp từ các vi sinh vật bản địa thích nghi tốt với một sản phẩm cụthể, có tính cạnh tranh cao hơn và có khả năng trao đổi chất caohơn Vì vậy, nghiên cứu tiềm năng công nghệ này được ngànhcông nghiệp quan tâm hàng đầu.

D Do đó, việc lựa chọn các chủng vi khuẩn lactic sản xuất axitglutamic hiệu quả nhất có thể góp phần tạo ra các sản phẩm lênmen mới với các tiêu chuẩn chung được cải thiện liên quan đếnaxit glutamic sinh tổng hợp tự nhiên Điều này có thể dẫn đến sựphát triển của các loại thực phẩm lên men giàu axit glutamic và dođó là γ-aminoamino butyric Do đó, giả thuyết rằng việc sàng lọc các vikhuẩn lactic khác nhau có khả năng tạo ra axit glutamic có thểkhám phá ra con đường mới để sản xuất hàng loạt thực phẩmchức năng giàu γ-aminoamino butyric.

2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

E Trong nghiên cứu này, một số thực phẩm lên men bản địa có sẵn ở Malaysia đã được sử dụng để phân lập vi khuẩn axit lactic Các chủng vi khuẩn lactic phân lập này được kiểm tra riêng dựa trên tiềm năngtạo ra axit glutamic của chúng (Bảng 1) tóm tắt các đặc điểm của vi khuẩn lactic như vậy thể hiện khả năng sản xuất axit glutamic Nó cho thấy rằng 14

chủng 35 sản xuất axit glutamic đã được phân lập từđậu tương lên men Nồng độ cao hơn của axit

glutamic được tạo ra bởi các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ đậu tương lên men cho thấy rằng các chủng này có hiệu quả hơn trong sinh tổng hợp axit glutamic so với các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các mẫu thực phẩm khác Trong số các chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men, chỉ có một chủng cho thấy tiềm năng sản xuất axit glutamic vượt trội với đóng góp là 489,46 μmol / L mol / L axit glutamic Chủng này được chỉ định là MNZ, đã được kiểm tra thêm về kiểu hình và xác định kiểu gen.

I Tổng sốvi khuẩn

J Tổng vikhuẩn lacticvới sản xuất

K.Phạm vi sảnxuất axitglutamic

phân lậpaxit glutamic(μmol / L)μmol / L)mol / L)L Đậu

P Thịtsầuriêng

T Bộtsắnlênmen

X Gạonếp

lênmen

lênmenFF Nướ

JJ Bảng 1: Các đặc điểm của vi khuẩn lactic phân lậpsinh tổng hợp axit glutamic trong môi trường MRS

KK Zalán và cộng sự đã báo cáo sản xuất axit glutamic trước

đây (2010) và Tarek và Mostafa (2009) đối với một số loài LAB

như Lactobacillus paracasei và Lactobacillus spp; tuy nhiên,trong nghiên cứu này, Lactobacillus plantarum được báo cáo là

sản xuất axit glutamic Mức độ axit glutamic được tạo ra bởi LABtrong các nghiên cứu khác được báo cáo là 68,7 mg / L và <25mmol / L Các vi sinh vật Gram dương khác ngoài LAB cũngđược chứng minh là tạo ra axit glutamic Ví

dụ, Brevibacterium spp được tìm thấy để tạo ra axit amin này

trong khoảng từ 10 đến 46 mmol / L

2.1 Nhận dạng kiểu hình và kiểu gen

Để xác định chủng MNZ của vi khuẩn lactic, bộ lên mencarbohydrate API đã được sử dụng Kết quả cho thấy chủng nàycó khả năng đồng hóa các nguồn carbon sau: Ribose,galactose, D -aminoglucose, fructose, mannose, manitol, sorbitol, α -amino

methyl-amino D -aminomannoside, N -aminoacetyl glucosamine, arbutin,cellobiose, maltose, lactose, melibiose, sucrose, gentiobiose,turanose, salicin và aesculin; trong khi khả năng này là tiêu cựcđối với các nguồn carbon còn lại Mô hình khả năng đồng hóacủa phân lập này đối với carbohydrate phù hợp với các đặc điểm

trao đổi chất của Lactobacillus plantarum được mô tả bởi

Bergey's Manual of Systemic Bacteriology Việc xác định phânloại của chủng MNZ ở cấp độ loài được thực hiện bằng giảitrình tự gen 16S rRNA Trình tự đã được ký gửi trên NCBI theo

số gia nhập HM175883 ( Lactobacillus plantarum MZ-amino02).

2.2 Ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau đếnsản xuất axit glutamic

LL Ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau đếnviệc sản xuất axit glutamic của chủng MNZ vi khuẩnlactic đã được khảo sát trong nghiên cứu này Người tathấy rằng các loại carbohydrate sau đây đã được lên

men bởi Lactobacillus plantarum MNZ: Ribose, sorbitol,

manitol, fructose, glucose, sucrose và lactose Ba nồng

độ (6, 12 và 24% w / v ) đã được thử nghiệm cho từng

nguồn carbon và việc sản xuất axit glutamic được xácđịnh trong môi trường MRS được bổ sung từng nguồncarbon riêng lẻ ở 30 ° C trong 120 giờ Dựa trên thửnghiệm sơ bộ (dữ liệu không được hiển thị), phạm vi 6-

24% ( w / v ) được tìm thấy là phù hợp nhất để đánh giá

các nguồn carbon khác nhau Các kết quả được trìnhbày trong (Hình 1) chỉ ra rằng glucose là nguồn cungcấp carbohydrate tốt nhất để sản xuất axit glutamictrong số các nguồn được thử nghiệm, nơi 12% được tìmthấy là điểm tối ưu để sản xuất axit glutamic Vì nồng

độ glucose 12% và 24% không cho thấy bất kỳ sự khác

biệt đáng kể nào ( p <0,05) liên quan đến việc sản xuất

axit glutamic bởi chủng MNZ vi khuẩn lactic, lượng thấpnhất đã được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

OO Trong nghiên cứu này, một số nguồn cacbon khác nhau đã đượcthử nghiệm để chọn ra nguồn thích hợp nhất cho mục đích sảnxuất axit glutamic bởi chủng MNZ vi khuẩn lactic Môi trườngchứa các nguồn cacbon khác nhau đã được sử dụng để sản xuấtaxit amin bởi vi khuẩn Trong trường hợp sản xuất axit glutamicvi khuẩn, một số nguồn cacbon khác nhau như glucose, sucrose,

fructose, ribose, vv đã được thử nghiệm và kết quả tương tự đã

được báo cáo so với kết quả thu được trong nghiên cứu này Vídụ, Roy và Chatterjee báo cáo rằng fructose và glucose theo thứtự hiệu quả là nguồn carbon tốt nhất để sản xuất axit glutamictrong môi trường tổng hợp Các nguồn carbon khác bao gồmsucrose và manitol cho thấy ít ảnh hưởng hơn đến việc sản xuấtaxit glutamic Nồng độ glucose tốt nhất (8%) được Roy vàChatterjee báo cáo thấp hơn nồng độ được tìm thấy trong nghiêncứu này (12%).

PP Nghiên cứu này chứng minh hiệu quả của glucose như mộtnguồn carbon thích hợp trong sản xuất axit glutamic so với cácloại đường khác, đặc biệt là những loại đường không phải làhexose, chẳng hạn như ribose, lactose và sucrose Tốc độ phát

triển cao hơn của vi khuẩn axit lactic trên đường glucose dướidạng đường hexose so với đường không hexose có thể là lý docho sự tăng sản xuất axit glutamic từ glucose Mặt khác, axitglutamic được tìm thấy được tạo ra ở vi khuẩn từ glucose thôngqua các chất trung gian của chu trình Krebs Nguồn năng lượngcarbon của glucose có thể được chuyển đổi thành axit pyruvicbằng con đường đường phân, một tiền đề cho chu trình TCA vàchuỗi vận chuyển điện tử Do đó, glucose được coi là loại đườngthích hợp nhất để sản xuất axit glutamic bởi chủng MNZ vi khuẩnlactic trong nghiên cứu này.

QQ Kết quả của nghiên cứu hiện tại liên quan đến tác động của cácnguồn carbon khác nhau đối với quá trình sinh tổng hợp axitglutamic cho thấy rằng mức tối ưu của glucose có thể thúc đẩyhiệu quả sản xuất axit glutamic thông qua chu trình Krebs Nhữngphát hiện như vậy có thể được sử dụng thêm để lựa chọn thíchhợp các chất nền khác có chứa glucose ở mức cao hơn để tăngcường sản xuất axit glutamic.

2.3 Nghiên cứu về tiêu thụ glucose

RR.Để khảo sát mô hình tiêu thụ glucose của chủng vi khuẩn lactic, chủng MNZ đã được nuôi cấy trong môitrường MRS ở 30 ° C trong 144 giờ Nước dùng được bổ sung 12% glucose để kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ glucose đến việc sản xuất axit glutamic Như được hiển thị trong (Hình 2), hàm lượng glucoseđã giảm mạnh trong khoảng thời gian từ 12 đến 72 giờ lên men Điều này có thể là do sự phát triển của vi sinh vật với log 10 CFU / mL cao nhất là 8,3 sau 72 giờ lên men Trong các nghiên cứu khác sử dụng các loài vi khuẩn sản xuất axit glutamic khác, mô hình tiêu thụ glucose trong quá trình sản xuất axit glutamic được phát hiện là tương tự như nghiên cứu hiện tại Việc tiếp tục giảm nồng độ đường mà vi khuẩn tiêu thụ tương ứng với sự phát triển của môi trường nuôi cấy.

dụng là: (▴), hồ sơ tiêu thụ glucose của vi khuẩn; (●),sản xuất axit glutamic.

cho thấy 0,7% ( w / v ) là nồng độ amoni nitrat tốt nhấtđể Lactobacillus plantarum tạo ra axit glutamic Cơ chế

mà amoniac tăng cường sản xuất axit glutamic liên kếtvới nitơ là thành phần thiết yếu để sản xuất axitamin Nitơ đóng một vai trò quan trọng trong quá trìnhlên men vi khuẩn sản xuất axit glutamic Do đó, nitơđược tế bào hấp thụ, và sau đó được đồng hóa để thựchiện quá trình trao đổi chất của chúng.

WW.

YY Hình 3: Ảnh hưởng của các nồng độ amoni nitrat khác nhau đếnsản xuất axit glutamic bởi chủng vi khuẩn lactic MNZ được nuôi

cấy ở 30 ° C trong MRS.

2.5 Mối liên hệ pH với sản xuất axit glutamic

ZZ Ảnh hưởng của các độ pH ban đầu khác nhauđến sản xuất axit glutamic của chủng MNZ vi khuẩnlactic đã được khảo sát trong nghiên cứu này Kết quảcho thấy giá trị pH ban đầu là 4,5 là tốt nhất so với cácgiá trị pH khác (Hình 4) pH đóng một vai trò quan trọngtrong các quá trình sinh học và pH của môi trường rấtquan trọng đối với việc sản xuất axit

glutamic Lactobacillus plantarum thích pH có tính axit

vừa phải 6,5 để tăng trưởng tối ưu Tuy nhiên, lưu ýrằng sản xuất axit glutamic tối đa trong nghiên cứu nàyxảy ra ở độ pH thấp hơn (4,5) Độ pH của môi trườngnuôi cấy có thể ảnh hưởng đến tốc độ phát triển

của Lactobacilli Giá trị pH ban đầu thấp hơn 6,5 làmgiảm tốc độ phát triển của Lactobacillus

plantarum trong môi trường Theo Krämer, sự bài tiết

axit glutamic xảy ra bởi sự trao đổi chất tràn bất cứ khinào sự tăng trưởng bị hạn chế Điều này có thể gây rasự chuyển hướng của dòng chảy 2-oxoglutarate sangsản xuất axit glutamic, dẫn đến tăng tốc độ bài tiết axitglutamic.

AAA.

BBB Hình 4: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sản xuất axitglutamic bởi chủng vi khuẩn lactic MNZ được nuôi cấy ở 30 ° C

trong môi trường MRS.

CCC Nó cũng được chứng minh rằng Lactobacillus

plantarum tạo ra amoniac trong môi trường axit, góp

phần cân bằng nội môi pH và do đó sự tồn tại của visinh vật thông qua việc trung hòa pH Kết quả là,amoniac được tạo ra theo cách này có thể được sửdụng trong sản xuất axit glutamic Do đó, khả

năng giảm pH của Lactobacillus plantarum không

chỉ được coi là một yếu tố an toàn thực phẩm màcòn cải thiện sản xuất axit glutamic ở vi khuẩn nàythông qua việc chuyển hướng chuyển hóa của 2-oxoglutarate theo hướng sản xuất axit glutamic vàsản xuất amoniac, dẫn đến tăng cường sản xuất axitglutamic.

DDD Để hiểu mối liên hệ giữa pH với việc sản xuấtaxit glutamic, hồ sơ pH của môi trường lên men đã