Luận án phó tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu phương pháp xác định tuổi sinh lí của muỗi (Diptera Culicidae) và ứng dụng trong nghiên cứu sinh thái học, dịch tễ và phòng chống một số quần thể vector quan trọng ở Việt Nam

!

- “H =

h = ý RDO satay "det: gd + <3

» tlie xi Pw 5 `

Pr «ÂN - kư4kog nip ae ae ae

* *» * “hư ; ee) en,

welt FO so ¿g "` a ee7

ì Bs : * + *v*.¬» me F s1

meek wee shes Sống 5z ea ⁄ 3n"

_ - HẠ:NG-198A4_ em rổr 8 i VỤ: ome È-~., : xưa.

“22 SF

BC 1A0 DU ĐÀO TẠO

G ĐẠI HOCT G HOP HA NOI

Tran Thi Hoa

NGHIÊN ee no PHÁP XÁC ĐỊNH TUỔI SINH LÝ Bria fee

: MUOI (Diptera: ‘Culicidae) VA UNG DUNG TRONG NGHIEN CÚU

ự SINH THÁI HỌC, DỊCH TẾ VÀ PHÒNG CHỐNG MỘT SỐ QUẦN

: me 1 THỂ VECTOR QUAN TRỌNG Ở VIỆT NAM.

Chuyên ngành : Côn trùng hoc

Mãsế : 01.05.14

Ƒ Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học

Tập thể hướng dẫn khoa học : PTS Đỗ Si Hiển

PGS-PTS Pham Binh Quyền

PGS-PTS Trương Quang Hoc”

Nieto ` ne FO oe n

fpWCAe4 Vài ee Ie ae)

SOS aay | eral a

Hà nội - 1994

Mở đầu

i Các bệnh do côn trùng truyền lưu hành rộng rãi ở hầu khắp các châu lục, đặcbiệt tại các vùng có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Có bệnh đã từng là thảm hoạvới con người như dịch hạch, sốt vàng, có bệnh đang trở thành vấn đề kinh tế, xã

hội nóng bỏng, có tính toàn cầu như sốt rét (Hội nghị cấp Bộ trưởng Y tế toàn cầu,

Amsterdam, 1992) hoặc mang tính khu vực như sốt xuất huyết Dengue, Viêm não,

giun chi, v.v .

Việt Nam nằm trong vùng lưu hành nang của nhiều bệnh nguy hiểm do côn

trùng truyền như sốt rét, sốt xuất huyết Dengue, viêm não Nhat Bản B (JEB), giun

chỉ Do vậy những thiệt hại to lớn về người và của, những ảnh hưởng nghiêm trọng

về kinh tế, xã hội do các bệnh kể trên gây ra ở nước ta là khó tính toán hết Chính

vì thế cũng như nhiều nước khác trên thế giới, công tác phòng chống các bệnh do

côn trùng truyền kể trên đang trở thành nhu cầu cấp thiết mang tính xã hội của nước

Trong chiến lược phòng chống các bệnh do côn trùng truyền mà phần lớn làdo muỗi truyền, vấn đề phòng chống trung gian truyền bệnh trở thành một khâu hếtsức quan trọng và thậm chí trong một số bệnh như Dengue xuất huyết, đó là biện

pháp chủ yếu Để phòng chống vector một cách hiệu quả, kinh tế, những nghiên cứu

về muỗi và các loài côn trùng y học khác nhau không ngừng được đẩy mạnh trong

nhiều thập kỷ qua nhằm có được sự hiểu biết đầy đủ về sinh học, sinh thái học, vai

trò dịch té của chúng Trong các nghiên cứu kể trên, những công trình có liên

quan tới cấu trúc tuổi quần thể, tập tính hút máu và trú đậu tiêu máu góp phần rất

quan trọng vào đánh giá tiềm năng dịch té học của một quần thể cũng như góp phần

xác định hiệu qua của các biện pháp phòng trừ (Beklemishev et al., 1959; Cheong, |1985 ) Polovodova-Detinova (1941, 1945, 1947, 1949, 1962) đã đề xuất và hoàn

chỉnh phương pháp xác định tuổi sinh lý muỗi bằng phương pháp mé tính nút trên

ống trứng Phương pháp này đã được áp dụng phổ biến trong những năm 40-60 của

thế kỷ XX va góp phần không nhỏ vào việc đánh giá vai trò dịch tễ của một số loài

muỗi truyền sốt rét Tuy nhiên ngay cả phương pháp khá phể biến như trên cũngdần bộc lộ nhược điểm vì nhũng công trình gần đây đã khẳng định nút không phải

là sản phẩm hình thành từ bao trứng sau một lần muỗi đẻ (Hoc T.Q., 1974, 1975,1981; Lange và Hoc T.Q., 1981; Hoc T.Q và Charldwood, 1990).

Mặc dù những phương pháp xác định tuổi sinh lý của các loài côn trùng, nhất

là những loài có ý nghĩa quan trọng trong y học được công bố khá nhiều, song chưa

có phương pháp nào được công nhận là hoàn chỉnh Trong khi đó, đòi hỏi của thực

tiễn phòng chống trung gian truyền bệnh ngày càng cấp bách Sự chưa hoàn chỉnh

của các phương pháp xác định tuổi sinh lý cũng như sự chưa tiện lợi khi áp dụng ở

thực địa đã là những nguyên nhân làm cho công tác xác định tuổi quần thể vector ở

Việt Nam không mang tính thông dụng Điều đó gây khó khăn không nhỏ trong

đánh giá tiềm năng dịch tễ của một quần thể cũng như đánh giá hiệu quả của biện

pháp phòng chống vector.

Nhằm góp phần vào phục vụ công tác phòng chống các trung gian truyền bệnh

ở Việt Nam thông qua việc sử dụng phương pháp xác định tuổi sinh lý côn trùng,chúng tôi đã nhận thực hiện đề tài: "Nghiên cứu phương pháp xác định tuổi sinh lýcủa muỗi (Diptera: Culicidae) và ứng dụng trong nghiên cứu sinh thái học, dịch tễ

và phòng chống một số quần thể vector quan trọng ở Việt Nam ".

Nội dung cơ bản của luận án gồm 2 phần:

- Xây dựng phương pháp xác định tuổi sinh lý muỗi bằng việc mổ - nhuộm

buồng trứng nguyên vẹn trong dung dịch đỏ trung tính 1/8000

-Thử nghiệm phương pháp đề xuất tại một số thực địa nhằm đánh giá độ tin

cậy của phương pháp dựa trên kết quả nghiên cứu của 4 loài muỗi là trung gian

truyền bệnh quan trọng ở Việt Nam: Aedes aegypti Linnaeus, 1762; Culex

quinquefasciatus Say, 1823: Anopheles sinensis Wiedemann, 1828; Culextritaeniorhynchus Giles, 1901.

Mục đích của luận án nhằm:

- Có được một phương pháp xác định tuổi sinh lý muỗi với độ tin cậy cần thiết,

- Thăm dò kha năng ứng dung của phương pháp trên trong nghiên cứu sinh

thái học, đánh giá tiềm năng dịch té của quần thể và xác định hiệu quả của công tác

phòng chống vector.

Phan A |

Mỗi là loài côn trùng hai cánh hút máu (Diptera) có ý nghĩa dịch té rất quan

trọng Rất nhiều bệnh do chúng truyền đang lưu hành phổ biến ở nhiều vùng trên

thế giới và gây những tổn thất to lớn về người và của cho nhân loại Có thể kể tớicác bệnh như Sốt rét, Giun chỉ, Dengue, Viêm não Nhật Bản B

Bệnh sốt rét lưu hành trên hầu khắp các châu lục và gây ra những thiệt hại vôcùng to lớn cho con người Mặc dù đã trải qua chương trình tiêu diệt Sốt rét (TDSR)

trên phạm vi thế giới, song sốt rét đang có xu thế quay trở lại và phát triển ở mức độ

' trầm trọng (WHO,1991).

Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 1991 có khoảng 2 tỷ

người sống trong vùng sốt rét lưu hành, tử vong hàng năm do sốt rét lên đến 1-2

triệu người với số mắc trên khoảng 110 triệu Sốt rét đang trở thành vấn đề kinh tế

và xã hội trên qui mô thế giới (Thông báo của Hội nghị cấp Bộ trưởng Bộ Y tế toàn

cầu họp tại Amsterdam (Hà Lan) 10/1992).

Ở Việt Nam trước đây, sốt rét lưu hành trên 74,6% lãnh thổ (Vũ Thị Phan và

cộng sự, 1992) với hàng triệu người mắc mỗi năm Mặc dù việc triển khai chương

trình TDSR trước đây cùng như chương trình Phòng chống Sốt rét (PCSR) hiện nay

mang lại nhiều kết quả song bệnh sốt rét vẫn còn có xu hướng quay trở lại và phát

triển (Hoàng Đình Hồi, 1993).

Số người mắc sốt rét của năm 1992 tăng 1,3 lần hơn 1991 và lên tới 1.352.813

người (Hoàng Dinh Hồi, 1993) Hàng năm chi phi cho PCSR lên tới gần 100 tyđồng.

Từ lâu nay ta đã biết muỗi Anopheles là vector truyền các loại ký sinh trùng

Plasmodium như: P.falciparum, P vivax, P malariae gây ra bệnh sốt rét Theo

Bruce - Chwatt (1985) trên thế giới có khoảng 60/400 loài Anopheles có khả năngtruyền bệnh trong đó 35/60 loài là các loài vector chủ yếu ở các vùng dia lý khác

Ở 'Việt Nam đã phát hiện 9 loài Anopheles có khả năng truyền bệnh (Đặng Văn

Ngữ, 1973; Vũ Thị Phan và cộng sự, 1980; Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh,

Nguyễn Thọ Viễn, 1991 ), trong đó vector chủ yếu của miền núi là An minimus,

An dirus (Đặng Văn Ngữ và Nguyễn Duy Sĩ, 1967), của vùng ven biển phía bắc là

An.subpictus (Vũ Thị Phan và cộng sự, 1975);cha vùng ven biển phía nam là

An.sundaicus (Nguyễn Long Giang, 1992) Trong số các loài đóng vai trò truyền

bệnh ở vùng đồng bằng, An sinensis là loài rất được quan tâm Đây là loài truyền

bệnh sốt rét chủ yếu ở Trung Quốc, Indonesia (Carroll, 1929; Reid, 1953 ) và đã

được xác định có khả năng truyền bệnh tại Việt Nam (Grasthen, Marneff, 1938;

Phạm Huy Tiến, 1973) Ngoài khả năng truyền sốt rét, An.sinensis còn có khả năng

truyền các bệnh khác như giun chỉ

Bệnh Dengue và sốt xuất huyết Dengue do 4 typ của virus Dengue (typ I - typ

IV) thuộc nhóm Arbovirus gây ra (Doan Xuan Mugu, 1979).

Dengue có phân bố rất rộng, bao gồm nhiều nước thuộc châu Á, Phi, Mỹ

Nhiều tác giả quan niệm Đông Nam A là vùng lưu hành lâu đời của Dengue

-Ởatanasen, Akiyama, 1991; M.J Uddin, S Jalees, R.S.Sharma và T.Verghese,

1992 ) Dengue hay còn gọi là Dengue cổ điển thường có diễn biến lâm sàng nhẹ

song người mắc bệnh bị mệt mỏi và mất sức lao động trong nhiều tuần lễ Đặc điểm

này cùng với việc Dengue lưu hành rộng, số người mắc đông, nên trong các vụ dịch

do Dengue tuy tử vong không đáng kể song ảnh hưởng to lớn tới sức lao động Ví

dụ năm 1922 vụ dịch ở Bang Texas có tới 50-60 vạn người mắc; ở Nhật Bản, các vụ

dịch Dengue hàng năm số người mắc lên tới hàng triệu, đặc biệt tại các khu vực

cảng Oxaca, Kioto (WHO, 1979) Vụ dịch sốt xuất huyết Dengue đầu tiên được ghi

- nhận ở Philipine năm 1953 (Đoàn Xuân Mượu, 1979) Đặc điểm lâm sàng của bệnh

là kèm theo dấu hiệu xuất huyết và choáng, tỷ lệ tử vong trong những năm đầu rất

cao từ 20-30% (WHO, 1979; WHO, 1992) Từ sau năm 1953, sốt xuất huyết

Dengue ngày càng được phát hiện ở nhiều nơi như Thái Lan (1953), Philipine

(1953), Việt Nam (1958) và trở thành một bệnh lưu hành ngày càng rộng rãi tại các

nước châu Á, đặc biệt là Đông Nam Á Từ châu Á, châu Phi, sốt xuất huyết Dengue

lan sang các nước châu Mỹ như Cuba (1981), Ethiopi (1981), Venezuela (1990)

(WHO, 1992).

Tại Việt Nam, vu dịch xuất huyết Dengue được ghi nhận lần dau ở Hà nội

(Mihov, C.Tuong, 1959) với 68 bệnh nhân Sau đó các vụ dịch được thông báo ở

các tỉnh phía Nam, với tỷ lệ tử vong lớn xảy ra tại 19 tỉnh thành phía Bắc (Vũ Thị

Phan và cộng sự, 1973; Vũ Đức Hương, 1984; WPRO,1992) Cũng từ đó sốt xuất

huyết Dengue trở thành một bệnh lưu hănh và thường xuyên xảy dịch ở hầu hết các

tỉnh thành của nước ta trừ một số vùng núi và hải đảo xa xôi Do vùng lưu hànhrộng, dịch thường xảy ra, số người mắc lớn, tử vong cao, sốt xuất huyết Dengue thật

sự trở thành một vấn đề y tế to lớn, đòi hỏi được tập trung giải quyết.

Từ rất lâu nay ta đã biết Ae aegypti và Ae albopictus cùng với một số loài

Aedes khác tham gia vào việc truyền virus Dengue song đóng vai trò quan trọngnhất vẫn là Ae aegypti (Carrole, 1929; Wallis, Tabachnick, 1990) Nhiều tác gia

cho rằng cùng với sự xâm nhập của Ae aegypti vào châu Á cũng như khả năng

thích ứng và mở rộng vùng phân bố của chúng vào sâu trong nội địa, sốt xuất huyết

ngày càng lan tràn và mở rộng phạm vi lưu hành tại các nước trong vùng Tại Việt

Nam, trong các vụ dịch sốt xuất huyết của năm 1969 đã khẳng định được Ae.

aegypti là vector truyền virus Dengue chủ yếu ở Việt Nam (Vũ Thị Phan, Phạm HuyTiến và cộng sự, 1973) -

Cùng với quá trình phát triển giao lưu, đô thị hoá, là quá trình mở rộng vùng

phân bố của Ae aegypti và kèm theo đó, sốt xuất huyết lan tràn và trở thành lưu

hành trên phần lớn lãnh thổ nước ta Có thể nói, Ae.aegypti đóng vai trò hết sức

quan trọng trong việc phát tán và lưu hành sốt xuất huyết Ngoài khả năng truyền

virus Dengue, Ae aegypti còn tham gia vào việc truyền bệnh khác như sốt vàng,

chikungunia, giun chỉ; có khả năng truyền Viêm não Nhật Bản B, là trung gian

truyền bệnh sốt rét chim (Vũ Đức Hương, 1984; Wallis, Tabachnick, 1990).

Bệnh giun chỉ do Brugia và Wuchereria gây ra, phân bố chủ yếu ở các nước

nhiệt đới thuộc châu Á (De Maillon, Sebastian, 1967; Ramalingam et al., 1968;

WHO, 1984 ) Với 2 loài ky sinh trùng quan trọng là B malayi và W bancrofti Ở

các vùng lưu hành giun chỉ, tỷ lệ mắc cao, biến chứng nặng nề như phù voi, đái

dưỡng chất và dẫn tới mất sức lao động Ở Việt Nam, những nghiên cứu về giun chỉ

được tiến hành ngay từ năm 1910, 1911 (Mathis, Lenger, 1910) Theo báo cáo của

Nguyễn Duy Toàn (1975) bệnh lưu hành tại 19 tỉnh thành phía Bắc với tính chất khu

trú thành các ổ rõ ràng Tại các ổ lưu hành, tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng giun chỉ rất

cao, dao động từ 2,69%-20,7% người xét nghiệm Ví dụ tại Thanh hà (Hải Dương)

tỷ lệ nhiễm lên tới 15% (Sery, P.V Nông, 1958) Vector của giun chỉ Brugia và

Wuchereria thuộc giống muỗi Mansonia, Culex và Anopheles Tại Việt nam đã xác

định vector chủ yếu của giun chỉ là Mansonia annulifera, Culex quinquefasciatus,

ngoài ra còn có các loài truyền bệnh thứ yếu khác là Mansonia india, An sinensis

(Trần Đức Hinh và cộng sự, 1987).

Viêm não Nhật Bản B là bệnh do Arbovirus gây nên Bệnh chỉ xảy ra ở trẻ em

dưới 13 tuổi với tỷ lệ tử vong rất cao (Nguyen et al., 1990; WHO, FAO, UNEP,

1991), thậm chí tới 28% (FAO, 1984) Những trường hợp cứu chữa được để lại di

chứng não rất nặng nề, đứa trẻ trở nên tàn tật và mất sức lao động Bệnh phân bố

chủ yếu tại các nước trong vùng Đông Nam Á (FAO,1984; WHO, FAO, UNEP,

Việt Nam nằm trong vùng lưu hành của bệnh với trọng điểm là các tỉnh đồng

bằng và trung du miền Bắc (Nguyen et al., 1990; Tien et al., 1991) Dịch thường xảy

ra vào các tháng nóng trong năm (6-7) (Nguyen et al., 1990) Vector truyền bệnh là

-_ Culex tritaeniorhynchus, đóng vai trò truyền virus gây bệnh từ động vật nuôi sang

người Ngoài ra một số loài muỗi khác cũng tham gia vào việc truyền bệnh từ động

vật và chim hoang dại cho động vật nuôi như C tarsalis, C nigripalpus (Nayar và

Knight, 1981) Loài C.tritaeniorhynchus không những là vector chủ yếu của một

bệnh rất nguy hiểm là Viêm não Nhật Bản B mà còn có khả năng truyền một số

bệnh khác như Chikungunia, sốt Sindbis, giun chỉ W bancrofti, B malayi

(Stojanovich và Scott, 1966).

Như đã trình bày ở trên, Việt nam là nước có nhiều bệnh nguy hiểm do côn

trùng truyền, lưu hành ở mức độ nặng và trên nhiều vùng của đất nước Những bệnh

này thường xuyên gây ra cho con người những thiệt hại to lớn về tính mạng, sức

khoẻ, ảnh hưởng to lớn tới kinh tế và xã hội Phòng chống các bệnh kể trên là một

nhiệm vụ vô cùng cấp thiết Tuy nhiên cũng như phòng chống nhiều bệnh do côn

trùng truyền khác, phòng chống sốt rét, sốt xuất huyết, giun chỉ, Viêm não Nhật Bản

B là vô cùng phức tạp và khó khăn Khó khăn lớn nhất gặp phải chính là giải quyết

khâu lan truyền mầm bệnh hay nói cách khác là giải quyết khâu vector truyền bệnh.

Trong khi đó, một số bệnh như Dengue xuất huyết vừa không có thuốc điều trị

đặc hiệu, vừa không có vaccin phòng bệnh, việc phòng chống bệnh chủ yếu làphòng chống vector.

Trong công tác phòng chống vector hiện nay, mặc dù các biện pháp phòng

chống ngày càng phong phú, hoá chất diệt côn trùng ngày càng đa dạng và hiệu lực,

phương tiện sử dụng hoá chất ngày càng hiện đại Các phương pháp phối hợp như

môi trường, sinh học ngày càng được áp dụng rộng rãi Kinh phí bỏ ra tại các quốc

gia rất lớn song hiệu quả không mang lại như mong muốn Sốt rét vẫn đang phục

hồi và lan rộng, sốt xuất huyết tiếp tục lưu hành, gây dịch và ngày càng có xu hướng

mở rộng Một trong những nguyên nhân dẫn đến tình trạng hiện nay là những hiểu

biết về sinh lý, sinh thái vector chưa đầy đủ, toàn diện Chính nhằm khắc phục

những thiếu sót trên, công tác nghiên cứu về sinh lý, sinh thái vector ngày càng

được phát triển Cùng với nó, những nghiên cứu về kỹ thuật và các phương phấp sử

dụng trong nghiên cứu ngày càng được quan tâm như các phương pháp nghiên cứu

tuổi sinh lý côn trùng, phương pháp nghiên cứu tập tính hút máu và trú đậu tiêu máu

của các loài truyền bệnh

Việc xác định tuổi sinh lý côn trùng y học nói chung và muỗi hút máu nói

riêng có ý nghĩa cả về thực tiễn và lý lúận Những dẫn liệu về tuổi sinh lý của con

cái được dùng để đánh giá mức độ nguy hiểm dịch tễ học và hiệu quả của biện pháp

phòng trừ.

Những công trình nghiên cứu đầu tiên trong lính vực này cần được lưu ý là của

Perry (1912), Mer (1932), Detinova (1945), Polovodova (1947,1949), Gillies (1956,

Có nhiều phương pháp xác định tuổi sinh lý côn trùng khác nhau (Southwood,

1978) Như Perry (1912) chia con cái ra 4 nhóm theo độ xơ của diềm cánh; Mer

(1932) chia nhóm tuổi con cái theo sự thay đổi kích thước ampul của ống dẫn trứng

chung Detinova (1945) theo hình dạng của vi khí quản trong buồng trứng Nhưng

nói chung, có thể xếp thành 3 nhóm chính:

- Nhém I Những thay đổi trong bưồng trứng và trong hệ ống thở bao quanh

buồng trứng (Detinova, 1962); giảm độ mắn đẻ (Morky, 1980a); những dấu hiệugiao phối khác (Usinger, 1966).

- Nhớm II Những thay đổi ở mức độ mô, tế bào liên quan đến tuổi như thay

đổi ở thể béo (Waloff, 1958), cơ (Neville,1983), ống Malpighi (Haydak, 1957)

(Remirez-peslz et al., 1976), phân (Rosay,1961) (Laveissiere, 1975) và sự tích lũy

hợp chất phát quang trong các té bào đặc biệt (Eltershank et al., 1983) (Mail et al.,

- Nhớm III Gồm những thay đổi bên ngoài do kết quả mòn và rách diềm cánh

(Jackson, 1946), hàm và ống chân (Luff, 1973; Tyndale-Biscoe, 1978).

Theo Tyndale-Biscoe (1984) Trong số các phương pháp đã được sử dụng để

xác định tuổi sinh lý của con cái, có 2 phương pháp có độ tin cậy cao hơn cả Đó là

những phương pháp dựa trên các dấu hiệu về sự phát triển của cơ, lần đầu được

Neville (1963) mô tả và sự tích lũy sản phẩm Phollicle trong buồng trứng sau các

lần đẻ, lần đầu được Povolodova (1941,1949) mô tả Một số chỉ tiêu như độ mòn

của cánh không đảm bảo độ tin cậy về tuổi của chúng Tuy nhiên khi dùng kếthợp với chỉ tiêu khác như mức độ đẻ , có thể giúp phân tích chỉ tiết hơn cấu trúc

tuổi của côn trùng Cũng cần phải kể đến những kỹ thuật của WHO (1975 a và b),

Service (1976), Charldwood et al (1970), Challier (1982), Neville (1983) Song các

kỹ thuật này chủ yếu giúp cho so sánh đánh giá các kỹ thuật với nhau và tạo ếƠ sởxác định các kỹ thuật tiến bộ (Tyndale-Biscoe, 1984).

Có thể điểm một số phương pháp trong lịch sử nghiên cứu về tuổi sinh lý côn

trùng để thấy rõ hơn ưu thế và nhược điểm của các phương pháp đã được đề cập:

* Phương pháp dựa trên những thay đổi liên quan đến sự mòn và rách của

theo thời gian, từ đó có thể biết được một cách tương đối tuổi của côn trùng Về

phương pháp này có các công trình của các tác giả: Perry, Jackson, Saunders

Perry (1912) chia con cái ra 4 nhóm theo độ xơ của diềm cánh.

Jackson (1946) chia con đực Glossina morsitans thành 6 nhóm vì theo tác giả

con đực luôn hoạt động hơn con cái và do vậy, nhanh rách hơn.

Saunders (1962) cho rằng độ mòn của cánh đã phản ánh chính xác hơn tuổi

bưồng trứng ở con cái G pallidipes Phương pháp nay đã được áp dụng nghiên cứu

ở thực địa Bằng cách đánh dấu con cái G morsitans submorsitans, G morsitans, G.

pallidipes sau 59 ngay tai Zimbabuwe, Vale et al (1976) đã cho thấy độ mòn cánh

tăng theo tuổi và không thấy khác nhau về mức độ mòn ở 3 loài rưồi trên Những cá

thể thuộc một nhóm tuổi chiếm 90%.

Phelps và Vale (1978) đã xếp độ mòn của cánh con đực 2 loài ruồi

G.morsitans và G pallidipes thành 6 nhóm Nhưng Ford (1969) và Ford et al.

(1972) khi nghiên cứu trên G morsitans và G.m submorsitans, Newsteed đã gộp 6

nhóm thành 2 nhóm cùng với nhóm ruồi mới nở Như vậy Ford et al chỉ phân con

cái thành 3 nhóm tuổi theo độ mòn của cánh.

Mulligan (1970), Jordan (1974), Challier (1982) cũng sử dụng phượng pháp

này để xác định tuổi sinh lý của ruồi tsetse.

Phương pháp "độ mòn cánh" đơn giản song cần lưu ý đến mùa hoạt động khi

đánh giá thành phần tuổi Ryan et al (1980) khi nghiên cứu trên G.palpalis

gambiensis ở Thượng Volta đã đi đến kết luận rằng: vào mùa khô con cái hoạt động

hơn mùa mưa và đã ảnh hưởng khác nhau tới độ mòn của cánh Mặt khác một số tác:

giả còn cho thấy tuổi trung bình của con cái già G.tachinoides khác nhau khi sử

dụng đồng thời cả hai phương pháp: buồng trứng và độ mòn cánh.

* Phương pháp dựa trên độ mòn của cuticle: Cuticle cũng mòn theo thời gian.

Dựa trên chỉ số này Launois và Launois -Luong (1980) đã xếp độ mòn lông ngực

- của Locusta migratoria migratorioides thành 6 nhóm: từ không rách là nhóm non

đến rách hoàn toàn là nhóm già.

Phương pháp này nhanh, dễ làm và đưa ra được thang tuổi thọ trung bình của

đối tượng nghiên cứu so với phương pháp buồng trứng song cũng phải cẩn thận khi

sử dụng vì có những thay đổi cá thể theo hoạt động mùa Những nghiên cứu của

Launois và Launoi Luong (1980) đã cho thấy, thời gian tính theo ngày của nhóm

côn trùng này ở Madagasca trong mùa nóng ẩm lớn gấp 3 lần so với mùa lạnh khô.

-Dijk (1979) sử dụng độ mòn lông đầu, hàm và độ tối (xam lại) của cánh trước

côn trùng trong xác định tuổi sinh lý của một số loài Tác giả đã xếp các cá thể của

Pterostichus caerulescens (L.) và Calathús melanocephalus (L.) thành các nhóm non

và già theo độ mòn lông đầu.

Ống chân của bọ hung (Scarabaeidae) dùng để đào và răng trên của chúng

cũng mòn theo tuổi Tyndale - Biscoe (1973) đã chia con cái thành 4 nhóm theo độ

mòn của ống chân Tác giả đã sử dụng phương pháp này cùng với điều kiện sinh sản

để xác định tuổi của con cái Onthophagus granulatus và cho thấy chúng chỉ sống

được một năm.

Hauston (1981) dùng chỉ số "Độ mòn của hàm" để xác định tuổi Carabus

glabratus và C problematicus ở Bắc Anh và cho rằng chúng sống được 3 năm Mặc

dù vậy, Van Dijk (1979) lại cho rằng khó xác định 2-3,4 năm tuổi ở bọ hung theo

cách này Vì độ mòn lông đầu và cuticle là một đặc điểm thay đổi luôn luôn, phụthuộc vào loại địa thế, hoạt động của cá thể và thời tiết (Tyndale - Biscoe, 1958;

Launois và Launois - Luong, 1980) nên chỉ có thể giúp xác định tuổi của các cá thể

trong một quần thể đồng nhất.

* Những thay đổi ở mức độ mô như sự phát triển cơ, thể phát quang, màu đốt

bụng đã được các tác gia Neville (1963), Tyndale - Biscoe va Kitching (1974),

Akey và Potter (1979), Sharma et al (1983) sử dụng để xác định tuổi côn trùng.

Người đầu tiên đề nghị sử dụng chỉ số các lớp endocuticle trong cuticle cho

việc xác định tuổi của côn trùng cho cả con cái và con đực là Neville (1963) Theo

tác giả, các lớp cuticle tăng theo thời gian tính bằng ngày Các lớp này thấy rõ ởngực trước, cánh ngoài, râu, đùi côn trùng Song tuỳ loài các lớp cuticle được thấy

rõ ở bộ phận nào Như Oryctes rhinoceros (L.) - ngực trước, đùi, (Zelazny và

Neville, 1972; Zelany,1975) Nhờ mối tương quan lớp cuticle với tuổi ở ngực trước

các tác giả trên đã có thể xác định tuổi ở Bọ rùa (Coccinellidae) đến 32 ngày tuổi.

Kích thước mấu lồi trong (apodeme) ở cánh trong của côn trùng cũng được sử

dụng trong xác định tuổi côn trùng (Neville, 1983).

Bổ sung cho phương pháp của Neville (1963, 1967, 1983) bên cạnh việc tính

số lớp endocuticle, Prew (1969); Tyndalle -Biscoe va Kitching (1974) còn tính số

băng phát triển, đo độ sâu hoặc các vùng vách ngăn của endocuticle để xác địnhtuổi của các đối tượng nghiên cứu Các tác giả trên đã xếp các cá thể của một số loài

côn trùng nghiên cứu thành nhóm non (sau nở) và già theo số băng endocuticle như

nhóm non của Anopheles (Diptera) gồm các cá thể có số lượng băng endocuticle

trung bình là 10-14 (Schlein, 1979a); 10-11 băng ở giống Culex va Aedes (Schlein |

và Gratz,1972); khoảng 12 băng ở Sarcophaga (Schlein,1972a)

Phương pháp trên có thể cho biết tuổi thọ trực tiếp của loài nghiên cứu trong

điều kiện phòng thí nghiệm cũng như thực địa Tuy nhiên do chịu ảnh hưởng của

nhệt độ, ánh sáng (Neville,1965); Dingle et al., 1969; Zelazny va Neville, 1972;Schlein, 1972b, 1975, 1979a; Johnson và Ellison, 1982) và phụ thuộc điều kiện nở,

cho nên phương pháp trên chưa đảm bảo độ chính xác Phương pháp "sự phát triển

cuticle" chỉ áp dụng tốt nhất cho côn trùng còn non (Schlein, 1979a).

* Các phương pháp dựa trên các vật thể phát quang trong cơ thể côn trùng

được một số tác giả đề nghị sử dụng trong đánh giá tuổi (Yurgenson và Teplykh,

1972) Dựa vào việc phân tích các phức hợp phát quang trong buồng trứng con cáiAedes aegypti, Ctenophthalmus orientalis (Wagner), Yurgenson và Teplykh, (1972)

đã xếp con cái ra 5 nhóm tuổi - 3 nhóm tuổi đầu tiên (II, II) cho những con cái

non chưa đẻ, nhóm IV - con cái bắt đầu đẻ, nhóm V - con cái già.

Dựa vào tính chất của sắc tố phát quang có tên là lipofuscin (Sheldahl và

Tappel, 1974) tích luỹ trong các tế bào sau mitose (ở tim, não, ống malpighi, đầu,

thể béo, ngực, mô bụng) của nhiều loại côn trùng, nhiều tác giả đã phân ra các

nhóm tuổi sinh lý cho các đối tượng nghiên cứu Như Musca domestica (Sohal et

al., 1977; Sohal và Allison,1971; Sohal va Sharma, 1972; Sohal, 1973; Sohal va

Donato, 1979), Sarcophaga bullata Parker (Etter Sank et al., 1983)

* Phương pháp dựa trên "mau sắc và tấm lung bung (tergit)" đã được Dyce

(1969) đề nghị sử dụng trong xác định tuổi sinh lý của côn trùng, đặc biệt là ởCulicoides (Diptera) Phương pháp này dựa trên việc nhận biết các dải mô có sắc tố

đỏ (màu rượu vang đỏ) ở vách bụng trong thời gian phát triển phollicle Mau sắc

phát triển trong chu kỳ tiêu sinh đầu tiên và hiện màu rõ khi phollicle phát triển ở

giai đoạn Christophers III và tang theo lứa dé Mau sắc này thấy ở con cái được hút

máu cũng như glucoza Bản chất của sắc tố vẫn chưa rõ nhưng không liên hệ với sự

tiêu hoá máu vì nó phát triển cả ở một số loài tự sinh (Birley và Boorman, 1982);

sắc tố phát triển song song với thể béo ở đường vách ngăn đốt bụng và như vậy có

thể sản sinh chất tiết (Dyce, 1969).

Sắc tố đốt bụng đã được coi như một dấu hiệu để xác định tuổi sinh lý ở

Culicoides marmoratus (Kay, 1973) và C variipenis (Walker, 1977; Mullens vàSchmidtmamn, 1982) Phương pháp này đã được đánh giá là tiến bộ hơn so với

phương pháp nút và ống thở của Detinova-Povolodova vì không cần mổ, nhanh

(hơn 1000 con/ giờ) và có thể áp dụng cho mẫu sống, mẫu để lạnh, mẫu cố định

trong cồn cũng như mẫu đã được gắn trong Bom Canada.

Tuy nhiên phương pháp "dùng màu sắc và kiểu tấm lưng bụng" của Dyce

(1969) cũng còn hạn chế nhất định Nó chỉ được áp dụng chủ yếu ở Culicoides spp.

và chỉ phân biệt được con cái chưa đẻ và đã đẻ chứ không thể nào xác định được số

chu kỳ tiêu sinh (Walker, 1977, Akey và Potter, 1979) mà con cái đã thực hiện.

Về việc sử dụng chỉ tiêu "những thay đổi mức độ m6" trong xác định tuổi sinh

lý côn trùng cần phải kể đến thể béo và một vài chỉ số khác Phương pháp này áp

dụng cho cả con cái và con đực Dùng chỉ số này có thể phân biệt những cá thể non

với già, như ở Musca vetustissima (Tyndale -Biscoe va Hughes, 1969), Lucilia

cuprina (Vogt et al., 1974), Simulium ornatum Meigen (Danies, 1977) hoặc có thể

dùng thể béo xác định được ruồi Zaprionus indianus Gupta (Cited as Z paravittiges,

Godbole và Vaidya) sống ở 13 ngày tuổi (Sharma et al., 1983)

Cơ cánh không phát triển ở con cái mới nở Pterohelaeus darlingensis (Allsopp,

1979) Dùng chỉ số này Allsopp (1979) đã phân con cái thành các nhóm: non - cơ

cánh không phát triển; trung bình - cơ cánh phát triển thành bó và già - cơ cánh phát

triển thành khối nhiều hình thù.

10

Self và Sebastian (1971), Graham và Bradley (1972) đã phân biệt con cái muỗi

Culex trưởng thành còn non (mới nở 2-3 ngày) theo màu xanh ở phần nối ngực

bụng Như vậy, các phương pháp nêu ở trên nhằm xác định tuổi sinh lý của con cái_ vẫn chưa thể cho biết số chu kỳ tiêu sinh con cái đã thực hiện Trong y học, số chu

- kỳ tiêu sinh liên quan chặt chẽ với sự hút máu vat chủ và như vậy mang ý nghĩa

dịch tễ rõ rệt ' :

* Các phương pháp liên quan đến cơ quan sinh sản: Những thay đổi trong hệ

sinh sản được sử dụng nhiều trong những phương pháp xác định tuổi sinh lý của con

cái, đặc biệt là sản phẩm còn lại của phollicle (FR) :

- Độ mắn đẻ đã được sử dụng như một phương pháp xác định tuổi sinh lý của

côn trùng.

Waloff (1958) đã nhận thấy rằng số trứng ở Lepidoptera giảm so với tuổi.

Morky (1980a) đã sử dụng phương pháp giảm độ mắn đẻ với tuổi để đánh giátuổi của quần thể Simulium damnosum.

Số lượng trứng được đếm và xếp thành 5 nhóm khác nhau Nhóm có số lượng

trứng lớn nhất thuộc nhóm con cái non, chưa đẻ và các nhóm khác thuộc các nhóm

con cái có mức độ đẻ khác nhau Ca 2 loài ruồi mà Morky (1980b) nghiên cứu: S.

vittatum Zetterstedt và Prosimulium mixtum, tác giả đều thấy độ mắn đẻ ở chu kỳ

tiêu sinh thứ 2 ít hon chu kỳ tiêu sinh thứ 1 |

Tuy nhiên độ mắn đẻ phụ thuộc nhiều vào điều kiện sống, kích thước cơ thểcon cái nên cần phải lưu ý tới điều này khi sử dụng phương pháp "Giảm độanắn

dé" (Nayar và Sauerman, 1975; Edman và Lynn, 1975).

- Cac chi s6 khac:

Lewis et al (1970) đã nhận thấy tuyến phụ sinh dục của muỗi cát Lutzomyia

flaviscutellata (Mangabeira) không có hạt khi chúng chưa đẻ Dựa vào đặc điểm

này, tác giả đã phân biệt con cái thành 2 nhóm: đẻ và non, chưa đẻ Nhiều tác giả

ủng hộ phương pháp này so với phương pháp nút khi phân biệt 2 nhóm con cái non,

chưa đẻ và đã đẻ.

Fenemore (1971) đã dùng chỉ tiêu "hình dạng của phần phụ giao cấu, mức độ

phát triển và số lượng trứng" để xếp con cái loài Costelystra zealandica (White)

thành các nhóm tuổi sinh lý non, trung bình và già.

Trong số các phương pháp đã được sử dụng để xác định tuổi sinh lý của côn

trùng, phải kể đến phương pháp của Gillies (1956b) va Gillett (1957a).

Theo Gillies (1956b), con cái Anopheles gambiae sau khi giao phối tạo nên cái

gọi là "túi chứa tinh” Ở một số con cái có 2 túi như thế, chứng tỏ chúng đã được

1]

giao phối lặp lại Tác giả đề nghị dùng chỉ số này để xác định tuổi quần thể và đánh

giá hiệu quả của biện pháp phòng trừ Tuy nhiên phương pháp Gillies chỉ phân biệt

được con cái vừa mới được giao phối chứ không thể nào xác định được phần trăm

con cái chưa đẻ © :

Gillett (1957a) đề nghị xác định tuổi sinh lý con cái Taeniorhynchus

(Mansonioides) africanus theo sự có mặt hay không ấu trùng Hydrachnidae trong cơ

thể của chúng Tác giả cho thấy muỗi trưởng thành nhiễm Hydrachnidae trong thời

gian chúng nở từ quăng Do đó sự có mặt của Hydrachnidae trong cơ thể

Taeniorhynchus cho thấy chúng chưa đẻ Khi đẻ trứng, Taeniorhynchus đưa ấu

trùng Hydrachnidae trở lại môi trường nước chuẩn bị cho giai đoạn lột xác của

_ mình Song nhiều nghiên cứu cho thấy mức độ nhiễm Hydrachidae đồng thời với

tuổi sinh lý của con cái loài Myaluracarus globatoro Người ta đã gặp Hydrachnidae

trên những con cái đã đẻ.

- Kích thước của ampul trong buồng trứng con cái được Mer (1932) và sau đó

Polovodova (1941) bổ sung sử dụng để xác định tuổi sinh lý.

Mer (1932) phân biệt nhóm con cái non theo ampul có kích thước nhỏ.

Polovodova (1941) đã chứng minh rằng ampul tăng kích thước ở 3 chu ký tiêu sinh

đầu Do đó theo phương pháp của Mer thì không thể tách được nhóm con cái già.

Polovodova đã phân biệt nhóm con cái già với ampul có kích thước lớn, nhóm con

cái non với ampul có kích thước nhỏ Phương pháp Mer (1932) chỉ cho phép xácđịnh thời gian bay của các cá thể ở thế hệ thứ 1 với các thế hệ tiếp sau và việc tách

con cái thành nhóm non theo kích thước ampul nhỏ là có thể được ,

Theo Polovodova (1941) và sau đó là Swellengrebel: dựa vào kích thước

ampul có thể đánh giá độ già quần thể theo phần trăm con cái có ampul lớn Quần

thể qua đông theo phần trăm con cái có ampul nhỏ.

Capuksh và Polejaeva (1941) đã đề nghị đánh giá hiệu quả của phương pháp

song cần kiểm tra lại để tăng sức thuyết phục Theo kích thước, màu sắc, nếp nhăn

trên ampul, các tác giả trên đã phân biệt con cái theo 3 nhóm:+ Con cái non (ampul trong suốt; không nếp gấp)

+ Con cái đẻ ít (ampul vàng nhạt, có nếp ngang) |

+ Con cái đẻ nhiều (ampul nâu nhạt, có | số nếp gấp không đều)

Phương pháp này khó áp dụng trong thực tế và đến nay, hầu như không được

sử dụng.

- Xác định tuổi sinh lý con cái theo hệ ống thở của buồng trứng: Hai bưồng

trứng của con cái có hệ ống thở chia thành từng bó nhỏ cuộn chặt lại trên màng

buồng trứng khi chúng chưa đẻ Do sự đàn hồi của màng buồng trứng, các bó ống

12

thở giãn ra theo sự phát triển của phollicle và không bao giờ co lại trạng thái từng

bó cuộn chặt ban đầu Dựa vào đặc điểm này Detinova (1962) đã đề nghị sử dụngtrong phương pháp đánh giá tuổi sinh lý của con cái Phương pháp này nhanh, có

thể kiểm tra một số lượng lớn con cái trong một ngày (300 - 400 con: Detinova,

1962) và chỉ cần dùng một buồng trứng cho sự đánh giá đúng mức độ đẻ Tuy nhiên

phương pháp Detinova (1962) chỉ áp dụng cho côn trùng bai cánh (Diptera) và chỉ

phân biệt được 2 nhóm con cái non chưa đẻ và đã đẻ.

Phương pháp này (FR) chỉ được sử dung cho con cái dựa trên sự thay đổi xảy

ra trong bưồng trứng do kết quả của sự phát triển hoặc thoái hoá trứng Theo

Tyndale - Biscoe (1984) trong buồng trứng côn trùng, mỗi ống trứng gồm phần sinhsản ở phía trên - nơi sinh ra các phollicle và phần dinh dưỡng ở phía dưới - nơi

phollicle lớn lên và phát triển Mỗi ống trứng có bao ống trứng, sát bao ống trứng là

màng đàn hồi (tunica propria) (Bonhag và Armold, 1961; Clements,1963; Koch et

al., 1967) hoặc nội mô (intima) (Nicholson, 1921; Beklemishev et al., 1959;

Detinova, 1962; Giglioli, 1965) Mỗi oocyte được bao quanh bằng lớp biểu mô

phollicle Khi phollicle gần thành thục, các tế bào dinh dưỡng được tách khỏi oocyte

bởi cầu tế bào phollicle (Adams, 1974) Lúc này tế bào dinh dưỡng bị thoái hoá Sau

khi đẻ, trứng để lại bao nội mô cùng với các tế bào biểu mô phollicle và tế bào đinh

dưỡng thoái hoá Do nội mô co lại sau đẻ, các mảnh tế bào cũng co lại và hình

thành nên cái gọi là FR Tuy nhiên sự hình thành FR khác nhau tuỳ loài (Bellamy

và Corbet, 1974) Đặc điểm của FR là ở nhiều loài, chúng tồn tại đến cuối đời vàkích thước, số lượng tăng theo số lần đẻ của con cái Chính vì thế mà nhiều nhà

nghiên cứu sinh lý côn trùng đã đề nghị dùng làm chỉ số xác định tuổi sinh lý eôn

Willimzik (1930) đã tìm thấy tế bào biểu mô phollicle thoái hoá ở con cái già

loài Colobopterus fossor (L.) (Cited as Aphodius fossor) và tác gia đã coi đó là dấu

hiệu của sự đẻ Điều này cũng được Heymons (1930) tìm thấy ở Scarabaeus sacer

L; Gillies và Wilker (1965), Rosay (1969a), Kay (1979) tìm thấy ở Anopheles vàCulex; Trueman và Mc Iver (1983) tìm thấy ở Coquillettidia perturbans (Walker)

Can cứ vào bản chất nội mô, Tyndale - Biscoe (1984) đã chia FR thành 3

Nhoém I Nội mô hình thành một ống dẫn riêng rẽ phía sau phollicle đã phát

triển đầy đủ Sau mỗi lan dé sẽ có một nút hình thành và như vậy, ống trứng đẻ

nhiều lần sẽ có một chuỗi các nút (Lineva, 1953) và số nút liên quan tới số trứng đẻ

hoặc khả năng đẻ và thoái hoá, cũng như số lần đẻ của con cái.

Nhom IL Chỉ có một nút Thuộc về nhóm này, FR chỉ được dùng để phân biệtcon cái đẻ hoặc chưa đẻ :

13

Nhớm II Nội mô là một ống rỗng bên cạnh (ở chân) phollicle phát triển tiếp

sau FR này sẽ tích luỹ dưới chân phollicle trong calyx ở dạng hạt hay thể sau mỗi

lần đẻ hoặc thoái hoá Số lượng của nó liên quan đến ít nhất một số lần đẻ đầu tiên.

Dựa vào kích thước của nó có thể nhận biết số lần đẻ đã thực hiện.

Hiện nay những phương pháp sử dụng các dấu hiệu liên quan tới các biến đổipholicle và ống trứng vẫn là những phương pháp quan trọng Phương pháp này (FR)

đã áp dụng thành công ở nhiều loài côn trùng với các tên gọi khác nhau Hầu hết

các công bố trước đây đã sử dụng tên gọi “corpus luteum" cho FR (Willimzik,

1930; Lewis, 1957; Singh, 1958) Tên này được mượn từ tên một cơ quan nội tiếtcủa thú (Peters và Mc Natty, 1980) Song bản chất của FR không phải là chất nội

tiết và vì thế tên gọi trên cho FR là khô:g đúng (Descamps và Wintrebert, 1961;

Phipps, 1966) Một cái tên khác cũng được dùng khá phổ biến là "thể vàng".

(Kuzina, 1942; Lineva, 1953) Tên này được sử dụng trong trường hợp FR nằm ở

gốc ống trứng và có màu vàng Anderson (1964), Miller và Truce (1968) đã đề nghị

cái tên FR khi gặp FR không có màu vàng Tên FR được dùng thường xuyên cho

các nút mà Polovodova (1949) và nhiều tác giả khác dùng tên FR bất kể gặp thấy

chúng ở vi trí nào trong buồng trứng Một số tên khác cũng được dùng cho FR như

là một thể phollicle còn lại "follicular residual body" (FRB) (Giglioli, 1959), "thé

còn lai" (residual body) (Saunders, 1967), "dau vết phollicle" (folliculiar remnauts)

(Smith, 1968), "chat còn lại bình thường và không bình thường” (normal and

abnormal relics) (Ovazza et al., 1965), "sản phẩm phollicle từng chuỗi" (serial

follicular relics" (Saunders, 1962), "sản phẩm phollicle tích luy" (multiple follicle

relics) (Walker, 1977) _

Rõ ràng FR được gọi cho một hiên tượng chung do kết quả của sự đẻ trứng.

Song được dùng với các tên khác nhau theo vị trí tim thấy trong buồng trứng.

Tyndale - Biscoe (1984) đã đề nghị các tên sau: "nút phollicle" nếu FR có dạng hình

chuông, "nút phollicle đơn độc” nếu chỉ có một FR thấy trong nội mô, "thể vàng"

nếu FR thấy ở chân phollicle bất kể màu sắc trừ cào cào (Tettigoniidae), châu chấu

(Acrididae) Ở cào cào, châu chấu nếu phollicle thoái hoá, FR có tên "thể thoái

hoá", và đẻ trứng, FR có tên "thể đẻ" (tên này đã dùng ở hầu hết các công trình

nghiên cứu thuộc bộ Orthoptera).

Thuộc về nhóm 1:( Các nút phollicle) - gồm các công trình nghiên cứu trênnhóm Diptera của một số tác giả như Anopheles maculipennis Meigen (Polovodova,1949; Detinova, 1949, 1953); An quadrimaculatus Say, An.gambiae Giles, An.

furnestus Giles, An squamosus Theobald và An coustani Laveran (Giglioli, 1959,

1963; Detinova va Gillies, 1964); Mansonia uniformis (Cited as Mansonioides

uniformis) va M annulifera (Bertram va Samarawickrema, 1958), Culicoides

grisescens Edwards (Glukhova, 1958) va Musca domestica (Lineva, 1953).

14

Trong nhóm Diptera, muỗi là đối tượng được nghiên cứu, xác định tuổi sinh lýnhiều nhất vì tầm quan trọng dịch tễ của chúng, đặc biệt là sau công trình của

Detinova (1962) về phương pháp nhóm tuổi côn trùng hai cánh.

Theo Polovodova (1947, 1949) và Detinova (1962), sau đẻ muỗi cái (Diptera)

để lại trên ống trứng một bao trứng Bao trứng co lại thành nút Số nút tương ứng với

số lần đẻ, với sản phẩm tế bào dinh dưỡng bên trong gọi là "thể vàng" Tên gọi này

trước đây đã có những nhầm lẫn Muller (1825), Mernhikop (1876) và Brandta

(1876, 1878) đã chỉ ra rằng "thể vàng" có mặt ở nhiều côn trùng Mernhikop

(1866,1867), Verhein (1921) và Derbeneva -Ukhova (1935) đã chứng minh rằng khi

trứng chín, tế bào dinh dưỡng giảm đần kích thước, tiêu giảm và hình thành cái gọi

là corpus luteum, có màu vàng hay nâu Sau đó Steinberga (1932) khi nghiên cứu

trên Loxostege sticticalis L va Ivanova và Meserckoi (1935) nghiên cứu trên.Blattodea đã cho thấy rằng tế bào dinh dưỡng không mất đi mà chỉ co lại, tích lại

_ thành cục màu vàng trên ống trứng Dựa vào đó biết được con cái đã hay chưa dé.

Điều này cũng thấy ở Musca domestica L (Verhein, 1921; Derebenva - Ukhova,

1935), ở Stomoxys calcitrans (Kuzina, 1942), ở An maculipennis (Beklemishev,

Các nút chứa sản phẩm còn lại của tế bào dinh dưỡng được Colless (1958) mô

tả ở dạng hạt màu vàng sau khi đẻ Sau đó là Spencer (1974, 1979) cũng thấy ở

Anopheles farauti Laveran, mỗi ống trứng dài thêm sau các lần đẻ cùng với thể vàng

dạng hạt, mảnh hay khối.

Phương pháp Polovodova - Detinova đã được áp dụng ở nhiều đối tượng thuộc

Diptera để nghiên cứu thành phần tuổi của chúng ngoài thực địa như Mansonioides

(Bertram và Samarawickrama, 1958), Lucilia cuprina (Vogt et al., 1974) với con cái

đẻ 16 lần (16 nit)

- Thuộc nhóm 2:( Các nút đơn độc)- có các công trình nghiên cứu chủ yếu

thuộc nhóm Diptera như Anopheles melas Theobald (Giglioli, 1965); Simulium

damnosum Theobald (Lewis, 1960); Prosimulium fuscum (Syme, Davies, 1961) va

P mixtum Syme va Davies (Davies, 1961); Culicoides barbosai Wirth va Blantan,

C furens (Poly) (Linley, 1966); một số loài thuộc Tabanidae (Duke, 1960) và

Glossina spp (Saunders, 1960, 1962; Challier, 1965).

Trong buồng trứng con cái mà các tác giả nghiên cứu, chỉ thấy một nút trên

ống trứng Nút này có thể thấy ở dạng một bao phồng trước khi intima co lại hoàn

toàn sau khi dé hoặc một nút phollicle đã co lại Và một số tác giả khác còn cho |

thấy chỉ có một nút trên ống trứng của các con cái đã đẻ nhiều lần (Giglioli, 1965;Snow và Wilker, 1977; Thomson et al.,1979; Wall va Doane, 1980 ) Phương pháp

này chi cho phép phân biệt 2 nhóm con cái đã đẻ và chưa đẻ.

nổ

- Thuộc nhóm 3:( Thể vàng)- Dấu hiệu này được sử dụng trong xác định tuổi

sinh lý của nhiều nhóm côn trùng như Musca domestica (L.) (Anderson, 1964;Smith, 1968), M autumnalis (Miller và Treece, 1968), Haematobosca stimulans

(Meigen) và Stomoxys calcitrans (Kuzina, 1942) Ở nhiều loài thể vàng tăng theo

số lần đẻ của con cái như Delia coarctata (Cited as Leptohylemyia coarctata) (

Jones, 1971), Musca vetustissima (Tyndale- Biscoe và Hughes, 1969), S calcitrans

(Charldwood và Lopes,1980)

Tuy nhiên ở một số ít loài thuộc Coleoptera, thể vàng không tăng theo số lần

dé như Onitis alexis Klug Ở loài này, do sự đẩy phollicle vào ống dẫn trứng

(Tyndale - Biscoe và Wattson, 1977) mà hầu hết sản phẩm còn lại cũng bị trôi theo.

Cuối cùng trên ống dẫn trứng hay trong calyx chỉ còn lại rất ít thể vàng.

Như vậy theo phương pháp dùng chỉ số thể vàng ở trên chỉ phân biệt được con

cái theo 2 nhóm: non - chưa đẻ và đã đẻ.

Phương pháp xác định tuổi sinh lý côn trùng được sử dụng phổ biến nhất là

phương pháp dựa vào những thay đổi trong ống trứng của Polovodova (1949) và

Detinova (1945, 1962) Phương pháp Polovodova - Detinova dựa trên việc tính số

nút trên ống trứng được hình thành từ bao trứng và liên quan chặt chẽ với số chu kỳ

tiêu sinh con cái đã hoàn thành (Anufreiva và Artemev, 1981) Việc phân tích những

thay đổi trong ống trứng được tiến hành trên mẫu vật tươi và đòi hỏi kỹ thuật mổ

con cái phải rất thành thạo (Vanden Assem, 1959; Gillies và Wilkes, 1965).

Sự tạo thành nút trong ống trứng đặc trưng cho nhóm Diptera hút máu có sự

hoà hợp tiêu sinh, cũng thấy ở nhóm Diptera không có sự hoà hợp tiêu $Sinh

(Hippoboscidae) và thậm chí ở cả nhóm côn trùng hai cánh không hút máu (M.

domestica L.).

Trong quá trình sử dung phương pháp Polovodova - Detinova để xác định tuổi

sinh lý con cái Simulidae, Beltukova (1953), Drokopheva (1957) đã tìm thấy những

con cái có số nút tương ứng với chu kỳ tiêu sinh; Dolmatova (1942) đã áp dụng chỉ

số nút để xác định thành phần tuổi quần thể Phlebotomus và phân biệt 2 nhóm con

cái dé - có bao trứng ( ngay sau đẻ) hoặc nút và chưa đẻ - chân ống trứng mảnh;

Glukhova (1956, 1958) và Buanova (1957, 1958) đã cho thấy quần thể Heleidae

chủ yếu gồm những cá thể có 4 chu kỳ tiêu sinh

Cũng trong quá trình áp dụng phương pháp Polovodova - Detinova, một số tác

giả đã gặp hiện tượng khác thường ở côn trùng mà phương pháp trên không thể giải

thích được Như Giglioli (1965) đã thấy An melas Theobald chỉ có một nút gốc duy

nhất; Service (1977) thấy con cái Ae.cantans Meigen chỉ có một nút mặc dù đã biếtrõ là chúng đẻ 2 lần; Charldwood và Lopes (1980) thấy S calcitrans chỉ có một nút

dù chúng đã đẻ nhiều lần Phần trăm số ống trứng có số nút trùng với số lần đẻ

16

giảm theo sự tăng của tuổi a ly (Sokolova , 1981, Hóc Š⁄Ä "Chatldwood, 1996).

Nút được hình thành ngay cả khi con cái không được hút tấu ( dang và Hoc, 198%

(1974, 1975a, 1975b, 1981, 1990) bằng những nghiên cứu về mô và tế bào Theo

Lange va Hoc, bao trứng không bao gid co lại thành nút và nút chỉ hình thành do sự

thoái hoá phollicle :

Cho đến nay, theo Hoc và Charldwood (1990) với những loài muõi mắn đẻ, tất

cả các ống trứng đều xảy ra quá trình phát triển trứng và đẻ, bằng kỹ thuật bơm đầu

bưồng trứng vẫn không thể xác định được tuổi sinh lý của côn trùng, đặc biệt là

muỗi :

Như vậy cho tới nay ,việc tìm kiếm một phương pháp tin cậy cho việc xác

định tuổi sinh lý côn trùng vẫn là vấn đề thời sự Các phương pháp trước đây hoặcdựa trên các chỉ số nhiều biến động, nhiều phụ thuộc vào điều kiện phát triển hoặc

dựa trên các chỉ số mà bản chất hình thành nó đang là vấn đề tranh cãi Cũng tuỳ

mục đích nghiên cứu mà việc sử dụng một phương pháp xác định tuổi sinh lý côn

trùng trở nên phù hợp hay không phù hợp Chẳng hạn trong những nghiên cứu ứng

dụng như đánh giá vai trò dịch tễ của một loài, việc xác định thành phần tuổi quầnthể của loài lại cần sử dụng các phương pháp có liên quan tới các lần hút máu hay

tổng quát hơn là sự thực hiện các chu kỳ tiêu sinh.

Tuy nhiên trong quá trình sinh sản của côn trùng có những dấu hiệu thực thể

ton tại trong quá trình sinh sản là thể vàng, các nút, bao trứng Từ những hiéu"biétmới nhất về bản chất các thực thể trên, tham khảo các chỉ dẫn của các tác giả đi

trước, chúng tôi mong muốn xác định một phương pháp có thể tin cậy nhằm ứng

dụng trong xác định thành phần tuổi một số quần thể muỗi có ý nghĩa dịch tễ quan

trọng ở Việt Nam.

ma f wie Agr A 60

Phần B

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

1 Thời gian nghiên cứu:

Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được thực hiện từ 1989-1991 Các

nghiên cứu tại thực địa được tiến hành từ 1991 - 1993.

2 Địa điểm nghiên cứu:

Các thí nghiệm và phân tích xử lý mẫu được thực hiện tại phòng thí nghiệm

của Tổ bộ môn động vật không xương sống, Tổ bộ môn di truyền khoa sinh học

-Trường Đại học tổng hợp Hà Nội Các nghiên cứu thực địa được tiến hành tại:

- Xã Trung Văn, huyện Từ Liêm, Hà Nội.

- Xã Đồng Quang, huyện Quốc Oai, tỉnh Hà Tây.

- Xã Tân Minh, huyện Thường Tin, tinh Hà Tây.

- Xã Liên Châu, huyện Thanh Oai, tỉnh Hà Tây.

Ngoài ra có tham khảo mẫu được thu về từ các địa điểm khác theo đối tượng

nghiên cứu tại các vùng lưu hành dịch và vùng có dịch xảy ra như Ba Vì (Hà Tây);Mỹ Văn (Hải Hưng) và của các cơ quan: Viện sốt rét, ky sinh trùng và côn

trùng, Trung tâm vệ sinh phòng dich tinh Hà Tây, Viện vệ sinh dich tễ học - Hà

3 Đối tượng nghiên cứu: ,

Tại phòng thí nghiệm :

- Aedes aegypti Linnaeus, 1762.

- Culex quinquefasciatus Say, 1823.

- Anopheles sinensis Wiedemann, 1828.

Tai thuc dia:

- Aedes aegypti Linnaeus, 1762.

- Culex quinquefasciatus Say, 1823.

- Anopheles sinensis Wiedemann, 1828.

- Culex tritaeniorhychus Giles, 1901.

Đối tượng nghiên cứu được định loại qua các bước:

- Định loại bằng phương pháp hình thể học theo các khoá phân loại cần thiết.

- Xác định bộ nhiễm sắc thể nguyên phân của các đối tượng nghiên cứu.

18

- Sit dụng kỹ thuật điện di enzym với 2 loại men ODH (octanol

dehydrogenaza) và EST ( Esteraza) Kết quả xác định loài được trình bày trong

một phần riêng của luận án: " Xác định loài nghiên cứu".

4 Các phương pháp nghiên cứu:

4.1 Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm:

4.1.1 Nguồn mẫu vật xử lý:

Có 2 nguồn mẫu vật sử dụng trong nghiên cứu:

+ Muỗi nuôi thuần chủng trong phòng thí nghiệm: Aedes aegyti, chủng phòng

thí nghiệm của Viện sốt rét ký sinh trùng và côn trùng Hà Nội Sử dụng muỗi thuộcđời sau F59

+ Muỗi bắt từ thực địa , chuyển về phòng thí nghiệm như :

Ae aegypti từ thực địa xã Tân Minh (Thường Tín - Hà Tây)

Anopheles sinensis từ thực địa xã Đồng Quang (Quốc Oai - Hà Tây) và xã

Trung Văn (Từ Liêm- Hà Nội)

Culex quinquefasciatus từ thực dia xã Đồng Quang (Quốc Oai - Hà Tây), xã

Tân Minh (Thường Tín - Hà Tây), xã Trung Văn (Từ Liêm - Hà Nôi).

Culex tritaeniorhynchus từ thực địa xã Đồng Quang (Quốc Oai - Hà Tây).

4.1.2 Phương pháp vân chuyển mẫu sống:

Muối bắt tại thực dia bằng ống hút Sau khi định loại sơ bộ, tất cả các cấ thểcủa một loài nghiên cứu cho vào một lông vải màn kích thước (15 x 15 x 15 cm),

hoặc cốc giấy, cốc nhựa bịt vải màn (đường kính 7 cm) Những cá thể cái no máu

được tách ra một lồng riêng Mỗi lồng đều có nhãn ghi rõ ngày, giờ và địa điểm bat.

Trong các lồng, cốc cho hút glucoza 10% Trong khi chờ chuyển về phòng thí

nghiệm những lồng, cốc muỗi này được để ở chỗ mát và có phủ khăn ẩm để đảm

bảo độ ẩm Khi vận chuyển muỗi bằng các phương tiện cơ giới về phòng thínghiệm, cần bảo đảm độ ẩm và tránh nóng bằng cách phủ khăn ẩm và để xa động

cơ xe Tại phòng thí nghiệm, các lồng muỗi được ch"yển vào phòng có nhiệt độ và

độ ẩm phù hợp.

4.1.3 Nhân số lương muỗi để dùng trong nghiên cứu:

Tại phòng thí nghiệm, các muỗi cái no mau tiếp tục được nuôi cho tới khi đẻ

trong các lồng vải màn kích thước (50 x 50 x 50 cm), (20 x 20 x 20 cm) hoặc (15 x

15 x 15 cm) Trong lồng đặt các cốc thủy tinh hoặc đĩa petri có chứa nước để làm ổ

đẻ cho muỗi Sau khi muỗi đẻ, muỗi mẹ được cắm tiêu bản và định loại lần cuối để

xác định tên loài.

19

Trứng muỗi được giữ cho tới khi nở thành bo gậy Bọ gậy của 1 muỗi me được

nuôi bằng nước máy trong bocan có kích thước đường kính bằng 10 cm Bọ gậyđược cho ăn bằng: bột gan, bột tôm, bột đậu xanh, bột bánh mỳ theo tỷ lệ 1:1:1:1

Sau khi bọ gậy tuổi 4 nở thành quăng, những quăng này được để trong các cốcnhựa 100C có chứa nước và đặt trong lồng vải màn để chờ nở thành muỗi Một số

bọ gậy tuổi IV được giữ lại cho các nghiên cứu về nhiễm sắc thể và điện di enzym

nhằm có thêm cơ sở để khẳng định loài Một số được làm tiêu bản giữ cùng con

trưởng thành mẹ Các muỗi trưởng thành được sử dụng trong nghiên cứu sau khi cho

hút máu và đẻ.

4.1.4 Kỹ thuật cho muỗi hút máu vật chủ:

Cho muỗi hút máu chuột nhất trắng, gà, thỏ Với chuột nhắt trắng: kẹp trong

cũi lưới sắt nhỏ, đặt vào trong lồng muỗi; Với gà: cho gà vào cũi lưới sắt, đặt vào

trong lồng muỗi, lồng kích thước ( 50 x 50 x 50 cm); Với thỏ: cho thỏ vào cũi gỗ.

Tai thỏ được để ra ngoài và áp lồng muỗi vào tai thỏ.

Sau khi cho hút máu vật chủ, những con cái no máu được tách riêng khỏinhững con cái còn đói hoặc chưa hút máu.

4.1.5 Kỹ thuật làm tiêu bản muỗi và bo gây:

- Lam tiêu bản muỗi:

Tiêu bản muỗi trưởng thành được cắm bằng kim thủy tinh và giữ trong ốngthủy tinh có chứa băng phiến, đậy bằng nút lie, tráng 1 lớp paraphin mỏng lên nút

4.1.6 Phân loại muỗi trưởng thành và bo gay:

- Phân loại theo đặc điểm hình thái: Dựa vào các dẫn liệu hình thái của Reid

(1953), Stojanovich va Scott (1966), Viện sốt rét ký sinh trùng và côn trùng (1968),

Harritson va Scanlon (1975).

- Lam tiêu ban nhiễm sắc thể:

Bo gậy tuổi IV được dùng để nghiên cứu nhiếm sắc thể và điện di enzym.

- Phương pháp làm tiêu bản nhiễm sắc thể nguyên phân:

Tiêu bản nhiễm sắc thể nguyên phân của Ae aegypti, An sinensis, C.

quinquefasciatus được làm theo phương pháp của French và cộng sự (1975) có cải

_tiến Bọ gậy tuổi IV được lấy ra khỏi nước bằng Pipet Dùng giấy thấm mềm thấmkhô nước còn bám trên bọ gậy Sau đó xử lý trong dung dịch Colchicine 0,1 trong2 giờ Não bọ gậy được mổ trong dung dịch nhược trương Citrat natri 1% Tiếp đó

để mô não trong dung dịch nhược trương khoảng 5 phút rồi chuyển sang giọt thuốc

nhuộm lact - acepo - orcein 2% Dùng lamen sạch đậy lên giọt thuốc nhuộm nằm

trên lam kính và ép nhẹ Tiêu bản tạm thời có thể được gắn bằng paraphin hoặc keodán Lerro Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1500 lần.

- Phương pháp đo và chụp ảnh nhiễm sắc thể:

Nhiễm sắc thể được phân tích dưới kính hiển vi Olympus Bộ nhiễm sắc thể

nguyên phân làm từ não bọ gậy tuổi IV được đo bằng trắc vi thị kính và trắc vi vật

kính, hoặc đo trên ảnh với độ phóng đại tương ứng Nhiếm sắc thể được chụp bằng

phim chụp hiển vi Agfa 25 của Cộng hoà Liên bang Đức Kích thước nhiễm sae thể

được đo theo các chỉ tiêu sau:

Chiều dài tuyệt đối tính bằng micromet, chiều dài tương đối (Lr) được tính

bằng tỷ số giữa chiều dài một nhiễm sắc thé trên chiều dài tổng số của bộ nhiễm

sắc đơn bội (chiều đài nhiễm sắc thể X cộng chiều dài của 2 nhiễm sắc thể thường)

nhân với 100 Chỉ số tâm động được tính bằng tỷ số phần trăm giữa chiều dài nhánh

ngắn trên chiều dài của cả nhiễm sắc thể (chiều dài nhánh ngắn p cộng nhánh dài

-q) Các số liệu đo đạc được xử lý thống kê.

- Phương pháp điện di enzym: Sử dụng phương pháp điện di trên gel

polyacrylamid của C.A Green (1990) có sửa đổi cho phù hợp với điều kiện phòng

thí nghiệm Đọc kết quả trên enzym đồ theo các nguyên tắc đã được Steiner W etal (1979) mô tả.

cài

4.2 Kỹ thuật mổ buồng bite nguyên ven trong dung dịch đỏ trung tinh.

4.2.1 Muc dich:

Xác định tuổi sinh lý muỗi.

4.2.2 Chuẩn bi dung cu và hoá chất.

- Dung dịch nước muối sinh lý 9/1000

- Ether, bông, giấy thấm.

4.2.3 Lưa chon muỗi mổ theo thời gian yêu cầu:

- Để theo dõi sự co lại của bao trứng và sự tích lũy của thể vàng sau khi muỗi

đẻ: Những con cái có cùng 1 lần đẻ được tách thành 1 nhóm hoặc riêng từng con,

ghi rõ ngày giờ đẻ lần cuối Kể từ lúc muỗi đẻ xong, cứ 5 giờ một lần lại mổ 1 số cá

- Để theo dõi sự biến đổi và thoái hoá của phollicle trong các chu kỳ tiêu

sinh, chọn muỗi đã biết rõ số lần đẻ, giờ đẻ, cứ sau 24 giờ kể từ lúc đẻ lại mổ 1 số cá

thể, những cá thể còn lại tiếp tục cho hút máu và một số lại được mổ theo chu kỳ 24

giờ cho đến khi có 1 số cá thé đẻ thêm 1 lần nữa.

- Để nghiên cứu các nút "giả" hay "thoái hoá" : Muỗi sau nở của cùng 1 lần

dé chỉ được hút glucoza Cứ sau 5 ngày mổ 1 số cá thé và kéo dài trong 2 - 3

32

4.2.4 Mồ muỗi: ©

Muỗi được gây mê nhẹ bằng Ether và đặt trong 1 giọt nước muối sinh lý

9/1000 trên lam kính Đặt lam kính dưới loup 2 mắt và mổ tách đốt bụng IX khỏi

cơ thé bằng kim mổ muỗi Dùng kim mổ lấy 2 buồng trứng ra và chuyển sang giọt

dung dịch đỏ trung tính 1/8000 trong 30 giây Dùng giấy thấm hút hết dung dịch đỏtrung tính còn lại và giỏ tiếp vào tiêu bản một giọt nước muối sinh lý 9/1000 Tách

2 bưồng trứng để riêng Một buồng để nguyên Một bưồng tách từng ống trứng Đặtnhẹ lamell và quan sát dưới kính hiển vi thường, phản pha hay huỳnh quang tùy yêu

cầu quan sát.

4.3 Các nghiên cứu ở thực dia:

4.3.1 Nghiên cứu biến đông mật độ các loài muỗi:

Để nghiên cứu biến động mật độ 1 loài muỗi nào đó tại 1 điểm, đã tiến hành

điều tra định kỳ mật độ muỗi mỗi tháng 2 lần và liên tục trong 12 tháng trong năm.

Tùy từng loài, đã áp dụng phương pháp thu bắt trong nhà ban ngày hoặc ban đêm,trong nhà hay ngoài nhà, khu nhà ở hoặc chuồng gia súc hoặc phối hợp các phương

Trong mỗi phương pháp, việc thu bắt và xử lý muỗi, tính toán mật độ muỗi

theo qui định của Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 1975) và của Viện sốt rét ký sinh

trùng và côn trùng Hà Nội như giờ bắt, vị trí bắt

Mật độ muỗi được tính như sau:

- Với An sinensis:

+ Phương pháp soi bắt trong nhà và chuồng gia súc ban ngày và ban đêm:con/ nhà (chuồng).

+ Phương pháp điều tra bằng mỗi người : con/giờ/người.

+ Phương pháp điều tra bằng bấy đèn CDC: con/bẫy.

- Với Ae aegypti:

+ Phương pháp soi bắt trong nhà : banh:

+ Phương pháp điều tra bằng mồi người: con/ giờ/người.

- Với C quinquefasciatus: tương tự với An sinensis.

4.3.2 Nghiên cứu thành phần tuổi quần thể:

Khi nghiên cứu tuổi quần thể 1 loài ở địa điểm nào đó, chúng tôi đã thu bắtmuỗi bằng các phương pháp như trên định kỳ mỗi tháng 2 lần và liên tục trong 12

23

Muỗi bắt được tiến hành phân loại sơ bộ, ghi rõ địa điểm, thời gian bắt và

chuyển về phòng thí nghiệm Tại đây muỗi cái được tiến hành mổ và xác định tuổi

sinh lý cá thể.

4.3.3 Nghiên cứu hiéu quả của biên pháp phòng chống:

Chọn 2 điểm có sinh cảnh và cấu trúc gần giống nhau và tương đối cách biệt.

Một điểm sử dụng-làm đối chứng, một điểm tiến hành các biện pháp phòng chống.

Điều tra mật độ loài nghiên cứu và cấu trúc tuổi quần thể loài đó ở cả 2 điểm

trước và sau khi tiến hành các biện pháp phòng chống.

Vào các thời điểm 1, 2, 3 tháng tiến hành điều tra mật độ và đánh giá cấu

trúc tuổi quần thể loài ở cả 2 điểm đối chứng và nghiên cứu Hiệu quả của biện pháp

phòng chống được so sánh trên cơ sở mật độ và cấu trúc tuổi quần thể loài giữa 2

điểm với nhau _

4.3.4 Nghiên cứu các tap tính hút máu:

Căn cứ vào sự tiêu máu và sự phát triển trứng thể hiện qua đốt bụng con cái.Theo phương pháp tủa Samarawickrema (1967), Cheong (1985), có sửa đổi chophù hợp điều kiện nghiên cứu Đã sử dụng 4 mức độ tiêu máu và phát triển trứng

+ Muỗi hoàn toàn đói (U)

+ Muối vừa được hút no máu (FF).

+ Muỗi có từ 0 + < 2/3 đốt bụng chứa trứng (HG)

-+ Muỗi có > 2/3 đốt bụng chứa trứng (G).

5 Giới thiệu một số thực địa :

Mot số địa bàn nghiên cứu chính liên quan đến kết quả nghiên cứu:

- Xã Đồng Quang (huyện Quốc Oai, tỉnh Hà Tây) thuộc vùng trên của đồng

bằng sông Hồng Đây là xã nông nghiệp canh tác lúa thuần túy, xen giữa 2 vụ lúa là

màu (ngô, khoai lang, khoai tây, đậu tương và rau) Trồng trọt và chăn nuôi đều khá

phát triển.

Đồng Quang là một xã lưu hành bệnh viêm não Nhật Bản B, hàng năm có các

cháu mắc hội chứng não cấp và tại thời điểm nghiên cứu trong xã có một số người

với di chứng viêm não JEB điển hình Trong 2 năm 1989-1990 dịch viêm não xảy

ra tại xã với 12 trường hợp tử vong và 2 trường hợp để lại di chứng (bệnh nhân 36

tháng tuổi trở xuống) Xã có 3 thôn, bệnh JEB tập trung ở một thôn (thôn Yên Nội).Tình hình vệ sinh môi trường của xã không tốt, mật độ dân số cao, nguồn nước ănvà sinh hoạt sạch thiếu trầm trọng, 100% hố xí và chuồng gia súc không hợp vệ

24

sinh, tập quán dùng phân bắc bón ruộng là phổ biến, chuồng lợn làm sát nhà ở Dân

sống chủ yếu bằng nghề làm ruộng và chăn nuôi lợn nái Diện tích trồng lúa khá

- Xã Tân Minh (huyện Thường Tín, tỉnh Hà Tây), nam cách Hà Nội khoảng 25

km về phía đông nam với 6000 dân Dân sống chủ yếu bằng nghề trồng lúa màu,

thường xuyên buôn bán giao lưu với vùng xung quanh Cách xã khoảng 2 km đường

làng là một xã có nghề làm giấy và thường xuyên xảy ra dịch Dengue xuất huyết.Xã gồm 3 thôn, năm 1992 dịch Dengue xuất huyết có mặt ở cả 3 thôn, trong đó

mạnh nhất là thôn Phúc La Sinh hoạt chật chội, dụng cụ đựng nước nhỏ, dụng cụ

_ phế thải nhiều Vệ sinh môi trường kém.

-_ 6 Phương pháp xử lý dẫn liệu:

- Trong nghiên cứu có sử dụng số trung bình Williams (Williams, 1937,

Haddow, 1960; Corbet, 1963) Số trung bình Williams (Mw) là số trung bình hình

học được sửa đổi cho phép sự có mặt của số 0 trong dẫn liệu.

Công thức như sau:

3 log(n + 1)

log(Mw + 1) =

Trong đó N: Tổng số các nghiên cứu.

n: Số các nghiên cứu riêng rẽ

Trong đó:

X: Biến ngẫu nhiên :

a = E(x) : Số trung bình (theo Lê Khánh Trai và Hoàng Hữu Như (1979),

Trong đó Pa : Phần trăm quần thé muỗi đã đẻ.

n : Số ngày của 1 chu kỳ tiêu sinh.

- Đánh giá tỷ lệ chết theo công thức: 100 (1 - P)

Trong đó, P là tốc độ sinh sản.

25

- Xác định tỷ lệ nhiễm theo công thức của Macdonald (1952):

Tổng số muỗi nhiễm ký sinh trùng

pa-l =

Thời gian phát triển của ky sinh tring

Trong đó: _n: Thời gian hoàn thành một chu kỳ phat triển

26

Phần C

Kết quả nghiên cứu

CHƯƠNG I

Phương pháp xác định tuổi sinh lý muỗi bằng kỹ thuật mổ- nhuộm

buồng trứng nguyên vẹn trong dung dịch đỏ trung tính 1/8000.

I CƠ SỞ KHOA HỌC CUA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TUỔI SINH LÝ MUỖI

Để có cơ sở khoa học cho việc xác định tuổi sinh lý muỗi trê các loài nghiên cứu, đã

tiến hành các bước sau :

- Xác định tên loài cho các đối tượng nghiên cứu bằng phương pháp hình thái học, di

truyền và men học.

- Mổ, xác định các đặc điểm hình thái và cấu tạo buồng trứng, ống trứng, bao trứng trêncác đối tượng nghiên cứu.

- Đánh gía khả năng sử dụng phương pháp xác định tuổi sinh lý bằng nút trên ống trứng.

1.1 XÁC ĐỊNH VỊ TRÍ PHAN LOẠI CUA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Muỗi là một họ côn trùng lớn thuộc bộ hai cánh (Diptera).Cho đến nay, vị trí phân loại

của muỗi đã được thống nhất theo hệ thống sau :

Ngành chân khớp : Arthropoda

Lớp côn trùng : Insecta

Bộ hai cánh : Diptera

Bộ phụ râu dài : Nematocera

Họ muỗi (muỗi chính thức) : Culicidae

Đôi tượng nghiên cứu của luận án đều thuộc họ Culicidae và bao gồm các loài sau :

Anopheles sinensis

Culex quinquefasciatus

Aedes aegypti.

Muỗi bắt từ thực dia về được phân loại theo tiêu chuẩn loài sinh hoc (Mayr, 1979) dựa

vào các dẫn liệu hình thái của Reid (1953), Stojanovich và Scot (1966), Viện sốt rét

KST-CT (1968), Harrison (1980) )Tuy vậy hiện có nhiều ý kiến về các loài đồng hình, về các

27

enzym đa hình của một số phức loài muỗi như An minimus, An.gambiae, An.hyrcanus,

Ae.aegypti.(Tabachnick W.J., et al,1979; Baimai, V.et al, 1987; Frank,H et al, 1988; Gp.

Wallis & Tabachnick W.J, 1990 ) Các phức loài này giống nhau về hình thái nhưng chúng

lại khác nhau rõ rệt với tư cách là vector truyền bệnh Để đảm bảo kết quả thí nghiệm phản

ánh đúng các đặc tính sinh học của loài nghiên cứu, ngoài các dấu hiệu hình thái, chúng thôi

còn sử dụng các dấu hiệu về tế bào, điện di enzym để ghi nhận các các đặc điểm của cácquần thể muỗi trước khi đưa vào thí nghiệm Dưới đây là các kết qủa thu được.

L1.1 Anopheles sinensis Wiedemann, 1828.L1.1.a Vi tri phân loại :

Dựa theo các tài liệu nêu ở trên, chúng tôi đã đối chiếu đặc điểm hình thái của các mẫu

An sinensis thu được tại xã Đồng Quang (Quốc Oai Hà Tây) và xã Trung Văn (Từ Liêm

-Hà Nội) từ 1-12/1992 trên tất cả các giai đoạn phát triển cá thể : trưởng thành, bọ gậy,

quăng và trứng Từ phân tích đặc điểm hình thái cuả mẫu vật (phụ lục 1 : Đặc điểm hình tháiAn.sinensis, cho phép kết luận đối tượng nghiên cứu có vị trí phân loại như sau :

Họ muỗi :Culicidae

Ho phụ muỗi sốt rét : Anophelinae.

Giống muỗi Sốt rét : Anopheles Meigen, 1918Phân giống : Anopheles Meigen, 1918.

Nhóm loài : Anopheles hyrcanus Reid, 1952 a

Loài : Anopheles (Anopheles) sinensis Weidemamn, 1828.

Sau khi phân tích những quần thé muỗi An sinensis bắt được tại xã Đồng Quang (Quốc

Oai-Hà tây) và xã Trung Văn (Từ Liêm-Hà nội) từ tháng 1 đến tháng 12/92, chúng tôi đã

ghi nhận được những đặc điểm hình thái, nhiễm sắc thể cũng như điện di enzym như sau.

L1.1.b Kiểu nhân của muỗi An.sinensis :

Muỗi An.sinensis là một loài muỗi phân bố khá rộng trong vùng đông phương.Mặc dù

có rất nhiều công trình nghiên cứu về nhóm loài An hyrcanus và loài An.sinensis nói riêng

(Reid,1953, 1968; Harrison et al; 1972,1973, 1975; Ma, 1964, 1966, 1981 ), nhưng cho

đến nay An sinensis vẫn xem như một phức loài có thể gồm nhiều loài đồng hình khác

nhau Trong điều kiện còn hạn hẹp, chúng tôi chỉ có thể tiến hành những nghiên cứu sơ bộ

về bộ nhiễm sắc thể quần thể An.sinensis Hà Nội, Hà Tây (Việt nam) Cùng với những mô

tả về hình thái, kết quả nghiên cứu về bộ nhiễm sắc thể của An sinensis sẽ giúp khang

định về loài An sinensis ở Việt Nam mà chúng tôi chọn làm 1 trong 3 đối tượng nghiên cứu.

28

Nghiên cứu dựa trên bộ nhiễm sắc thể nguyên phân từ não bọ gậy của 2 quần thể muỗi : Hà

Nội, Hà Tây.

Bang 1 Kích thước nhiễm sắc thể nguyên phân của An.sinensis.*

2.01|2.86 + 0.25

1.99|2.19 + 0.221.73|3.27 + 0.181.963.66 + 0.19

* Số tiêu ban phân tích n = 35.

Kết qua cho thấy, về mặt số lượng, bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội(2n) của An sinensis

gồm 6 chiếc như các loại muỗi khác Số lượng này rất ổn định trong số các tiêu ban phân

tích Các nhiễm sắc thể tương đồng luôn bắt đôi với nhau.

Về hình thái, cả 3 nhiễm sắc thể có thể phân biệt được với nhau Cặp nhiễmsắc thể giới

tính ngắn nhất và thuộc loại tâm cận nút (subtelocentric) Ở con cái hai nhiễm sắc thể có

hình dạng và kích thước hoàn toàn giống nhau (ký hiệu XX.h.1) Chiều dài tuyệt đối của

nhiễm sắc thể X là 2,86 p (nhánh ngắn : 0,85 kh ; nhánh dài: 2,01 p ) Chỉ sốtâm động

29,72 % Chiều dai tương đối 29,21 %) (bang 1) Ở con đực, hai nhiễm sắc thể giới tính

khác nhau về hình dạng Nhiễm sắc thể tâm lệch là nhiễm sắc thể Y Nhánh ngắn của

nhiễm sắc thể Y như một chấm tròn (h 1) Chiều dài tuyệt đối của nhánh dài đo được là

1,00 ; của nhánh ngắn là 0,2 jt Chiều dài nhánh ngắn của nhiễm sắc thé Y cũng giao

động ít nhiều tuỳ theo cá thể Nhiễm sắc thể số 2 lớn nhất Đây là nhiễm sắc thể thuộc

loại tâm gần giữa nhưng không hoàn toàn gần tâm Nhánh dai có kích thước 1,96 bị, nhánhngắn 1,70 p Nhiễm sắc thể số 3 có kích thước nhỏ hơn số 2 và thuộc loại tâm giữa.

Chiều dài tuyệt đối cả nhiễm sắc thể 3,27 ụ.

Kết quả này phù hợp kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Lập (1993) trên An.sinensis

(quần thể Hà Nội) Khi nghiên cứu trên nhiễm sắc thể khổng lồ An sinensis Quần thé

Hà Nội, tác giả cho thấy trên nhiễm sắc thể thường có một số vùng không tiếp hợp hoàn

toàn (asynapsis) Theo Kanda & Oguma (1978), số lượng và hình thái của bộ nhiễm sắc

thể nêu trên thuộc loài An sinensis.

29

An sinensis bằng phương pháp điên di trên Gel Polyacrylamid đã thu được kết quả sau :

- Hệ Izozym ODH : Trên enzym đồ đã phát hiện được ODH có 3 cấu tử tương ứng với

Từ phân tích các cấu tử điện di đã cho thấy Odh của An.sinensis nghiên cứu do một loài

locut gen gồm 2 alen xác định, đó là Odh 1 a và Odh 1b Những cá thể đồng hợp là

Odha/Odha biểu hiện bởi một băng vơi Rf= 2,9 Cá thể đồng hợp là Odhb/Odhb biểu hiên

bởi một bằng ứng với Rf = 2,2 và những cá thể di hợp gồm có 3 băng ứng với Rf=2,2; 2,5

và 2,9.

Như vậy cấu trúc phân tử enzym ODH của An sinensis là dimer (hai sợi).

- Hệ Izozym EST: Phân tích Izozym EST ở An sinensis nghiên cứu thấy có 2 vùng

hoạt tính 1

Vùng 1 : Gồm 3 cấu tử tương ứng Rf=6; 6,5; 6,7 (h.3) va có 6 loại phenotyp tương

ứng 3 dạng đồng hợp có một băng và 3 dạng dị hợp có 2 băng Như vậy vùng 1 do mộtlocut gen Est-1 gồm 3 alen Est-la, Est-1b và Est-1c xác định.

Vùng 2 Gồm 2 cấu tử tương ứng Rf=3,5; 3,7 Có 2 loại đồng hợp và một loại dị hợp.

Những cá thể đồng hợp biểu hiện bởi một băng; dị hợp biểu hiện bởi 2 băng Như vậy vùng2 do một locut gen Est-2 và 2 alen Est-2 a và Est-2b xác định.

Qua phân tích di truyền nhiễm sắc thể và enzym có thể thấy rằng An sinensis quần

thể Hà Nội, Hà tây có đặc điểm hình thái như trên tương ứng vơi loài An sinensis mà T.

Kanda (1968), T Kanda và Oguma (1978), Phạm văn Lập (1993) đã xác định.

31

1.1.2 Aedes aegypti Linnaeus, 1762.

LI1.2a Vi tí phân loại :

Họ muỗi : Culicidae

Giống : Aedes Meigen, 1918.

Phân giống : Stegomia Theobald, 1901.

Loài : Aedes (.) aegypti (L.) 1762.

(Đặc điểm hình thái các giai đoạn phát triển cá thé cud đối tượng nghiên cứu, xem phụ

lục 2).

L12.b Kiểu nhân của Ae.aegypti :

Bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội Ae.aegypti nghiên cứu bao gồm 6 nhiễm sắc thể Cả 3 cặpnhiễm sắc thể đều thuộc loại tâm giữa (metacentric) Các cặp nhiễm sắc thể dược đánh

số theo MC Donald, và Rai (1970) Cặp ngắn nhất là nhiễm sắc thể giới tính (số 1) Hai cặp

nhiễm sắc thể thường (autosome)được đánh số 2 và 3 Kích thước các nhiễm sắc thể nguyên

phân được trình bay ở bang 2.

Bảng 2 : Kích thước nhiễm sắc thể nguyên phân của Ae.aegypti *.

Chỉ sốChiều đài tuyệt đối ( 1)

2 3.70

* Số lượng tiêu bản phân tích : (n=40)

Các nhiễm sắc thể giới tính (số 1) ở con đực và cái giống hệt nhau về hình đáng và kích

thước Cặp nhiễm sắc thể số 1 có nhánh ngắn 2,76 ps; nhánh dài 2,78 pv và chiều dai tuyệt

đối 5,54 pp Cặp số 2 lớn nhất với nhánh ngắn; 3,70 ps ; nhánh dài 3,73 p và chiều dài

tuyệt đối 7,43 p Cặp nhiễm sắc thể số 3 có kích thước trung bình với chiều dài tuyệt đối là

6,83 p Các nhiễm sắc thể tương đồng luôn nằm cạnh nhau.

Kết quả nghiên cứu ở trên phù hợp với dẫn liệu của Phạm Văn Lập (1993) Theo

MCDonal và Rai (1970) Phạm Văn Lập (1993),bộ nhiễm sắc thể có hình dạng như hình

(4) và kích thước ở bảng 2 là thuộc loại Aedes aegypti.

22

Hình 4 : Bộ nhiễm sắc thể nguyên phân của Aedes aegypti1.L2.c Kết quả điện di 2 enzym ODH và EST :

Phân tích loại enzym ODH và EST của muỗi Ae.aegypti nghiên cứu bằng phương pháp

điên di trên gel polyacrylamid đã cho thấy kết quả sau :

- Hệ izozym ODH : Có hai vùng hoạt tính (h.5)

Hình 5 : Phổ hoạt tính ODH của bọ gậy Aedes aegypti

3a

Vùng 1 Có 2 cấu điện tử tương ứng với Rf=3,1, 3,2 và 3 loại phenotyp Những cá thể

đồng hợp có 1 băng; dị hợp có 2 băng Như vậy vùng 1 do một locut gen có 2 alen Odh-la

và Odh-1b xác định.

Vùng 2 Có 1 cấu tử tương ứng Rf= 2,5 Tất cả các cá thể trên đều có một băng Như

vậy vùng 2 dollocut gen đơn hình (mono morphic) xác định.

- Hệ izozym EST: Phân tích điện di EST của Ae.aegypti nghiên cứu thấy có 4 vùng

hoạt tính (h.6).

Vùng 1 có 2 cấu tử ứng với Rf=7,0; 7,2 và 3 loại phenotyp, 2 loại đồng hợp có 1 băng

và một loại dị hợp có 2 băng Như vậy vùng 1 do một locut gen Est-1 có 2alen Est-la va

Est-1b xác định.

_ Vùng 2 và 3 : Cũng biểu hiện tương tự do 1 locut gen có 2 alen xác định là Est-2a va

Est-2b; Est-3a và Est-3b.

Vùng 4 Có 1 cấu tử ứng với Rf=3,5 Tất cả các cá thể đều có 1 băng Như vậy vùng 4

đo 1 locut gen đơn hình (monomorphic) xác định.

34

Qua phân tích di truyền 2 hệ enzym ODH va EST ở một số quần thé Ae aegypti Hà

nội, Hà tây chúng tôi thấy tương tự với kết quả của Trebatoski & Craig (1969),

Tabachnick & Powell (1979); Wallis G.P & Tabachnick,(1990), khi nghiên cứu trên các

quần thể Ae aegypti có nguồn gốc từ nhiều nơi trên thế giới Vậy loài muỗi có hệ enzymmô ta ở trên là thuộc loài Ae aegypti.

I.1.3 Culex quinquefasciatus Say, 1823.

L1.3a Vi bí phân loại :

- Họ muỗi : Culicidae

Giống : Culex |

Loài : Culex quinquefasciatus Say,1823.

Tên đồng vật (theo Belkin,1962)

Culex fatigansWiedemann,1828

Culex acer, 1848

Culex pipiens fatigans

(Đặc điểm hình thái các giai đoạn phát triển cá thể của đối tượng nghiên cứu, xem phụ

lục 3).

L1.3.b Kiểu nhân của muỗi Culex quinquefasciatus; `

Bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội của Cquinguefasciatus: _ nghiên cứu gồm 6 nhiễm sắc thể.

Cả 3 cặp nhiễm sắc thể đều thuộc loại tâm giữa (metacentric) Cặp nhiễm sắc thể số 1 ngắnnhất Hai cặp số 2 và 3 dài xấp xỉ nhau Kích thước các nhiễm sắc thể nguyên phân được

trình bày ở bảng 3.

quinquefasciatus *

Chỉ số Chiều dàitâm động | tương đối

(%) (%)

Bang 3 : Kích thước nhiễm sắc thể nguyên phân của Culex

Nhiễm sắc Chiều dài tuyệt đối ( p)

35

* Số lượng tiêu ban phân tích : n = 42

Kết quả trên cho thấy hoàn toàn phù hợp với ý kiến của Rai (1963) Mukherjee (1966),T.Kanda (1968) khi nghiên cứu nhiễm săc thể của loài Culex quiquefasciatus bằng phương

pháp tế bào hoc mô tỉ àn, buồ ứng và dinh dưỡng (h.7).

Hình 7: Bộ nhiễm sắc thế nguyên phân của Culex quinquefasciatus

L1.3.c Kết quả điện di enzym ở Culex quinquefasciatus.

Kết quả điện di enzym EST của Culex DI, a ey được thể hiện ở hình 8.Trén

enzym đồ đã phát hiện 3 vùng hoạt tính.

36

Ving I : Đã phát hiện 3 cấu tử có Rf :0,61; 0,65; 0,68 và 6 loại Phenotyp Trong 6

Phenotyp này có 3 loại một băng và 3 loại có hai băng Loại một băng tương ứng với cá

thể đồng hợp; loại 2 băng tương ứng với cá thể đị hợp Như vậy vùng I do một locut gen

Est-1 có 3 alen Est-la, Est-1b và Est-1c xác định.

Vùng H: Trong vùng này phát hiện được 3 cấu tử điện di có Rf: 0,51; 0,45; 0,40 và 6

Phenotyp, trong đó 3 loại một băng; 3 loại 2 băng Như vậy vùng II cũng do một locut Est-2

có 3 alen.

Vùng II : Dựa vào cường độ bắt mầu trên bảng gel đã thấy vùng này có 3 loại

Phenotyp :

- Phenotyp với cấu tử có Rf = 0,36 có cường độ bắt mầu đậm.

- Phenotyp với cấu tử có Rf = 0,36 có cường độ bắt mầu nhạt.

- Phenotyp không có hoạt tính biểu hiện không có băng Như vậy vùng III do một locut

Est-3 có 2 alen Est-3a và Est-3 null xác định.

Theo Tào Minh Tuấn (1991) có thể xem như vùng này chỉ có một cấu tử điện di với Rf =0,36 Căn cứ vào số vùng hoạt tính của Esteraza và tốc độ di chuyển của các cấu tử từng

vùng, chúng tôi thấy hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Beclulini et al., (1974)

khi nghiên cứu 34 quần thể muỗi Culex ở Châu Uc; Villani et al., (1983) khi nghiên cứu

trên Culex quinquefasciatus ; Vũ Thị Loan (1989), Tào Minh Tuấn (1991) khi nghiên cứuenzym kháng thuốc trên quần thể C quinquefasciatus: của Việt nam Theo các tác giả,đối tượng nghiền cứu của chúng tôi thuộc loài Culex quinquefasciatus `

Như vậy thông qua các dẫn liệu hình thái, tập tính sinh học, cấu trúc bộ nhiễm sắc thể

và điện đi enzym có thể khẳng định các đối tượng nghiên cứu trong luận án thuộc 3 loài :

- Anopheles sinensis- Aedes (S.) aegypti

- Culex quinquefasciatus.

37

L2 CẤU TẠO HÌNH THÁI CƠ QUAN SINH SAN CAI.

“Để có cơ sở khoa học cho việc xây dựng kỹ thuật mổ xác định tuổi sinh lý các loài

muỗi nghiên cứu và ứng dụng trong việc xác dịnh tuổi quần thể, luận án đã sử dụng tư

„liệu của các công trình có liên quan, đối chiếu với 3 loài muỗi nghiên cứu về các mặt

„ L2.1- HÌNH THÁI VÀ MÔ TẢ CẤU TẠO BUÔNG TRUNG, ỐNG TRUNG,BAO

TRUNG ;

12.1.a Cấu tao buông trứng.

Hệ sinh san muỗi cái cũng như ở đa số côn trùng, gồm 2 buồng trứng, ống dẫn

trứng riêng và ống dẫn trứng chung ( common oviduct ), túi chứa tinh, tuyến phụ sinh

dục và màng đè trứng Mỗi buồng trứng có từ 40-60 ống trứng, khác nhau tùy loài và

thay đổi giữa các lần dé Phần ngọn của mỗi ống trứng là vùng sinh sản (germarium),phần gốc là vùng tạo trứng( vitellarium) Germarium sẽ sinh ra tế bào trứng đầu tiên và

khi trứng chín sẽ được chuyên xuống vùng vitellarium Vách ống dẫn trứng được phủ

- một lớp tế bào biéu mô phollicle Bao quanh là một cấu trúc lớp mỏng gọi 1a filament.

Các filament từ các ống trứng liên kết lại với nhau và tạo nên phần ngọn của buồng

G - Vùng sinh sản (germarium).

II - CS Thân ống trứng vói Phollicle II.I - CS Thân ống trúng với Phollicle I NC Các tế bào dinh dưỡng.