XÁC ĐỊNH ĐỘ MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN E COLI VÀ SALMONELLA TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÊ GIAI ĐOẠN BÚ SỮA VÀ THỬ NGHIỆM MỘT SỐ PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ

Y Tế - Sức Khỏe - Nông - Lâm - Ngư - Khoa Học - Science ĐẠI HỌC HUẾ TRỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC HUẾ XÁC ĐỊNH ĐỘ MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN E. COLI VÀ SALMONELLA TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÊ GIAI ĐOẠN BÚ SỮA VÀ THỬ NGHIỆM MỘT SỐ PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ Mã số: DHH2019-02-121 Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Nguyễn Xuân Hòa Thừa Thiên Huế, 82021 ĐẠI HỌC HUẾ TRỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC HUẾ XÁC ĐỊNH ĐỘ MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN E. COLI VÀ SALMONELLA TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÊ GIAI ĐOẠN BÚ SỮA VÀ THỬ NGHIỆM MỘT SỐ PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ Mã số: DHH2019-02-121 Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên) PGS. TS. Nguyễn Xuân Hòa Thừa Thiên Huế, 82021 1 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA Họ và tên Đơn vị công tác CN.Lê Trần Hoàn ộ m n Th y Trƣ ng Đ i học N ng L m Đ i học Huế TS.Trần Quang Vui ộ m n Th y Trƣ ng Đ i học N ng L m Đ i học Huế ThS.Thƣợng Thị Thanh Lễ Ph ng tổ chức HC Trƣ ng Đ i học N ng L m Đ i học Huế TS.Phan Vũ Hải ộ m n Th y Trƣ ng Đ i học N ng L m Đ i học Huế TS.Lê Quốc Việt C ng ty TNHH Dinh Dƣỡng Quốc Tế Việt Đức i MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU .............................................................................................................1 1. SỰ CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ..................................................................................1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................................2 3. ĐỐI TỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ............................................................ 2 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................................... 2 3.2. Ph m vi nghiên cứu ..................................................................................................2 3.3. Th i gian thực hiện:..................................................................................................2 CHƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ...............................................3 1.1. Tình hình nghiên cứu về E. coli và Salmonella g y tiêu chảy ở bê .........................3 1.1.1. Trên thế giới ..........................................................................................................3 1.1.2. T i Việt Nam .........................................................................................................4 1.2. Những nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy ............................................................... 4 1.3. Nguyên nh n g y ra hội chứng tiêu chảy .................................................................5 1.3.1. Do vi sinh vật .........................................................................................................5 1.3.2. Do nguyên nhân khác ............................................................................................ 7 1.4. Vi khuẩn E. coli và Salmonella ................................................................................8 1.4.1. Vi khuẩn E. coli .....................................................................................................8 1.4.2.Vi khuẩn Salmonella ............................................................................................ 20 1.5. Tổng quan về phƣơng pháp PCR ...........................................................................32 CHƠNG 2. ĐỐI TỢNG NỘI DUNG VÀ PHƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......35 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 35 2.1.1. Mục tiêu tổng thể: ................................................................................................ 35 2.1.2. Các mục tiêu cụ thể ............................................................................................. 35 2.2. Đối tƣợng và ph m vi nghiên cứu ..........................................................................35 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................................... 35 2.2.2. Ph m vi nghiên cứu ............................................................................................. 35 2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 35 ii 2.3. Cách tiếp cận và phƣơng pháp nghiên cứu............................................................. 36 2.3.1. Cách tiếp cận .......................................................................................................36 2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................................36 CHƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................42 3.1. Xác định sự biến động về số lƣợng của vi khuẩn E. coli và vi khuẩn Salmonella trong ph n của bê bị tiêu chảy nghi do E. coli hay Salmonella và mẫu ph n kh ng tiêu chảy ...42 3.1.1. Tình hình bệnh tiêu chảy trên bê sữa nu i ở n ng hộ t i huyện Đức Trọng tỉnh L m Đồng ......................................................................................................................42 3.1.2. Sự khác nhau về số lƣợng (CFUg) của vi khuẩn E. coli và vi khuẩn Salmonella trong ph n của bê bị tiêu chảy và kh ng tiêu chảy .......................................................... 44 3.1.3. Kết quả ph n lập vi khuẩn E. coli và Salmonella ................................................45 3.1.4. Đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn E. coli ph n lập đƣợc .......................47 3.1.5. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella ph n lập đƣợc ..........48 3.2. Kết quả xác định độc lực và tính mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella ph n lập đƣợc ..................................................................................49 3.2.1. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn ph n lập đƣợc .......................49 3.2.2. Kết quả xác định tính mẫn cảm kháng sinh của một số mẫu vi khuẩn E. coli và Salmonella mang gene độc tố ph n lập đƣợc ................................................................ 54 3.3. Kết quả xác định phác đồ điều trị phù hợp ............................................................. 55 CHƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 58 4.1. Kết luận...................................................................................................................58 4.2. Kiến nghị ................................................................................................................58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 59 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli. (TCVN 8400-16:2011) ...........10 Bảng 1.2. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella ...........................................23 Bảng 1.3. Th i gian sống của Salmonella trong các lo i m i trƣ ng....................24 Bảng 2.1. Tên gene, mồi dùng và kích thƣớc sản phẩm cho phản ứng PCR.........38 Bảng 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR xác định gen độc ........................... 39 Bảng 2.3. Tiêu chuẩn đánh giá tính mẫn cảm các lo i kháng sinh theo quy đị nh của nhà sản xuất.....................................................................................40 Bảng 3.1a. Tỉ lệ bệnh tiêu chảy trên bê nuôi ở nông hộ t i huyện Đức Trọng .......42 Bảng 3.1b. Tỉ lệ bê bị bệnh tiêu chảy theo tháng tuổi .............................................43 Bảng 3.1.2. Kết quả xác định số lƣợng (CFUg) vi khuẩn trong mẫu phân ............44 Bảng 3.1.3. Tỉ lệ vi khuẩn phân lập đƣợc trong phân không tiêu chảy và tiêu chảy 46 Bảng 3.1.4. Giám định một số đặc tính sinh vật học các chủng E. coli phân lập đƣợ c ...............................................................................................................47 Bảng 3.1.5 Đặc tính sinh hóa các chủng Salmonella phân lập đƣợc .......................48 Bảng 3.2.1.1. Kết quả xác định gene mã hóa độc tố của vi khuẩn E. coli ...................49 Bảng 3.2.1.2. Kết quả PCR xác định gene mã hóa độc tố ở vi khuẩn Salmonella ......50 Bảng 3.2.1.3. Kết quả kiểm tra độc lực của chủng vi khuẩn E. coli mang gene độc tố ...............................................................................................................52 Bảng 3.2.1.4. Kết quả kiểm tra độc lực vi khuẩn Salmonella mang gene độc tố bằ ng tiêm truyền động vật thí nghiệm............................................................ 53 Bảng 3.2.2.1. Kết quả đánh giá tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli..........54 Bảng 3.2.1.2. Kết quả đánh giá tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn Salmonella ..55 Bảng 3.3. Kết quả điều trị bệnh tiêu chảy ở bê ......................................................56 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ phản ứng PCR (Lộc và nnk., 2007). .........................................33 Hình 1.2. Các chu kỳ phản ứng PCR (Lộc và nnk., 2007)..................................33 Hình 3.2.1.1. Kết quả xác định mang gene mã hóa độc tố của vi khuẩn E. coli bằ ng phản ứng PCR .....................................................................................50 Hình 3.2.1.2. Kết quả xác định gene mã hóa độc tố của vi khuẩn Salmonella bằng phƣơng pháp PCR ...............................................................................51 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Cụm từ viết tắt Tên tiếng anh ADN Acid Deoxyribonucleic ARN Acid Ribonucleic bp Base pair dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kDa Kilo Dalton LB Luria Broth OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis TAE Tris-Acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus vi ĐẠI HỌC HUẾ TRỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC HUẾ 1. Thông tin chung 1.1. Tên đề tài: Xác định độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli và Salmonella trong hội chứng tiêu chảy ở bê giai đoạn bú sữa và thử nghiệm một số phác đồ điều trị. 1.2. Mã số: DHH2019-02-121 1.3. Chủ nhiệm: PGS.TS. Nguyễn Xu n H a 1.4. Cơ quan chủ trì: Trƣ ng Đ i học N ng L m - Đ i học Huế 1.5. Thời gian thực hiện:Từ tháng 01 năm 2019 đến tháng 12 năm 2020 2. Mục tiêu Đánh giá đƣợc tình hình bệnh tiêu chảy trên bê giai đo n b sữa ở các trang tr i n ng hộ ở các tỉnh miền trung và xác định độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli và Salmonella và thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy trên bê giai đo n b sữa. 3. Tính mới và sáng tạo Đ y là nghiên cứu đầu tiên về bệnh tiêu chảy trên bê sữa t i tỉnh L m Đồng Việt Nam. 4. Các kết quả nghiên cứu thu đƣợc Sau khi tiến hành khảo sát tình hình chăn nu i bê sữa trên 21 hộ chăn nu i ở huyện Đức Trọng tỉnh L m Đồng ch ng t i nhận thấy tỉ lệ bê sữa bị bệnh tiêu chảy rất cao (51 25). Đặc biệt bê dƣới 1 tháng tuổi có tỉ lệ tiêu chảy cao nhất (75 61). Trong các mẫu ph n bê tiêu chảy số lƣợng vi khuẩn E. coli ph n lập đƣợc trung bình là 271,4 x 106 CFUgam cao hơn 11 7 lần so với ph n bình thƣ ng (231 6x 105 CFUgam). Số lƣợng vi khuẩn Salmonella trung bình trong ph n tiêu chảy 71 9 x 104 CFUgam ph n cao hơn 59 4 lần so với ph n bình thƣ ng (121 x 102 CFUgam). Trong tổng số 74 mẫu ph n thu thập đƣợc tiến hành ph n lập vi khuẩn kết quả có 73 chủng vi khuẩn E. coli và 38 chủng vi khuẩn Salmonella phâ n lập đƣợc mang đầy đủ các đặc tính sinh hóa nhƣ các tài liệu đã m tả. Hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella ph n lập đƣợc từ các mẫu ph n tiêu chảy đều mang gene độc tố đƣ ng ruột và yếu tố bám dính. Trong khi đó các vi vii khuẩn đƣợc ph n lập từ ph n kh ng tiêu chảy đều m tính với các gen độc kiểm tra. Hầu hết những chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella dƣơng tính với các gene độc kiểm tra đều có biểu hiện độc lực cao khi g y chết 100 động vật thí nghiệm. Điều này chứng tỏ hầu hết các gene mã hóa độc lực đều đƣợc biểu hiện kiểu hình tƣơng ứng. Vi khuẩn E. coli ph n lập đƣợc mẫn cảm cao 90 với enrofloxacin gentamicin và ceftiofur 80; trong khi đó đề kháng với amoxicillin doxycycline và oxytetracycline. Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm cao với 2 lo i kháng sinh gentamycin và enrofloxacin (80- 90); trung bình với amoxicillin doxycycline và ceftiofur; trong khi đó đề kháng hoàn toàn kháng sinh oxytetracycline. Kết quả điều trị cho thấy kháng sinh thích hợp để điều trị bệnh tiêu chảy trên bê sữa ở L m Đồng là ceftiofur và enrofloxacin. 5. Các sản phẩm của đề tài 5.1. Sản phẩm khoa học: 01 bài báo trên t p chí Khoa học Đ i học Huế và 01 bài báo trên T p chí Th y. Nguyễn Xuân Hòa, Phạm Đăng Tuấn, Lê Trần Hoàn, Lê Quốc Việt, Lê Văn Phƣớc, Nguyễn Đức Danh, Phan Vũ Hải, 2020.Độc lực độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn Salmonella spp. ph n lập từ bê giai đo n b sữa bị tiêu chảy t i huyện Đức Trọng tỉnh L m Đồng T p chí KHĐHH tập 129 số 3D. Nguyễn Xuân Hòa, Phạm Đăng Tuấn, Lê Trần Hoàn, Lê Quốc Việt, Thƣợng Thị Thanh Lễ, Phan Vũ Hải, Trần Quang Vui, 2020 . Độc lực và tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli ph n lập từ bê sữa bị bệnh tiêu chảy T p chí KHKTTY tập 27 số 7. 5.2. Sản phẩm đào tạo: 02 ác sĩ th y : Xác định độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn Salmonella spp. ph n lập từ bê giai đo n b sữa bị tiêu chảy t i huyện Đức Trọng tỉnh L m Đồng (Nguyễn Thủy Tiên, 2020) Xác định độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli ph n lập từ bê giai đo n b sữa bị tiêu chảy t i huyện Đức Trọng tỉnh L m Đồng (Nguyễn Thị Thùy Dung 2020) 01 Th c sĩ Xác định độc lực độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. ph n lập từ bê giai đo n b sữa bị tiêu chảy t i một số trang tr i b sữa. (Ph m Đăng Tuấn 2020) viii 5.3. Sản phẩm ứng dụng: - 01 phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy do E. coli và Salmonella trên bê giai đo n b sữa. 5.4. Sản phẩm khác: 01 chuyên đề: Thực tr ng bệnh tiêu chảy ở bê giai đo n b sữa do vi khuẩn E. coli và Salmonella (đã nghiệm thu: Đ t) 01 áo cáo tổng kết 01 poster về đề tài nghiên cứu: Xác định độc lực độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. Trong hội chứng tiêu chảy ở bê giai đo n b sữa và thử nghiệm một số phác đồ điều trị (đã nghiệm thu : Đ t) 6. Các đóng góp, khả năng ứng dụng và phƣơng thức chuyển giao kết quả nghiên cứu Kết quả nghiên cứu đã và đang đƣợc chuyển giao cho các th ý trong địa bàn huyện Đức Trọng tỉnh L m Đồng để tiến hành điều trị bệnh tiêu chảy do E. coli và Salmonella trên bê bị bệnh tiêu chảy. Thừa thiên Huế ngày 20 tháng 8 năm 2021 Cơ quan chủ trì (ký, họ và tên, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (ký, họ và tên) PGS.TS. Nguyễn Xu n H a ix MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING HUE UNIVERSITY INFORMATION ON STUDY RESULTS RESEARCH PROJECT ASSIGNED BY HUE UNIVERSITY 1. General information of project 1.1. Project title: Determination of antibiotic susceptibility of E. coli and Salmonella isolated from calf with diarrhea syndrome and dairy beef calves and testing some treatment regimens 1.2. Projectcode: DHH2019-02-121 1.3. Coordinator: Assoc. Prof. Dr. Nguyen Xuan Hoa 1.4. Implementing institution: University of Agriculture and Forestry, Hue University 1.5. Implementingduration: From May 2019 to December 2020 2. Study objective (s) Evaluating the situation of diarrhea in dairy beef calves in industrial farms and households’s farms in Vietnam central and determining antibiotic susceptibility of E. coli and Salmonella bacteria and testing some treatment regimens towards diarrhea on lactating calves. 3. Novelty and creativeness of the study This is the first study on diarrhea of dairy beef calves in Vietnam central. 4. Main study results After conducting a survey on the raising of dairy beef calves in 21 households in Ductrong district, Lamdong province, we found that the rate of dairy beef calves suffering from diarrhea was very high (51.25). In particular, the diarrhea rate of calves under 1-month-old was highest (75.61). In the diarrhea feces samples, the average number of E. coli was 271.4 x 106 CFUgram, which was 11.7 times higher than the non diarhea group (231.6x 105 CFUgram). The average number of Salmonella in the diarrhea group was 71.9 x 104CFUgram, which was 59.4 times higher than the non diarrhea group (121x 102 CFUgram). Of the total studied 74 samples, 73 E. coli were isolated strains, and 38 isolated strains Salmonella, which expressed biochemical properties as described. Most E. coli and Salmonella s trains, isolated from diarrhea fecal samples, carried toxin genes encoded intestinal toxin and adhesion factors. Meanwhile, the bacteria isolated from non diarrhea feces were negative for the test toxin genes. Most x strains of E. coli and Salmonella that were positive for the toxin genes expressed high virulence which was lethal to 100 of experimental animals. This demonstrates that most of the genes encoding virulence are phenotyped accordingly. All E. coli isolates showed a highly susceptibility 90 to enrofloxacin, 80 gentamicin and ceftiofur; meanwhile, resistant to amoxicillin, doxycycline, and oxytetracycline. Salmonella isolates showed a highly susceptibility to two antibiotics examined including gentamicin and enrofloxacin; moderate susceptibility to amoxicillin and doxycycline (75) and enrofloxacin (100); gentamicin (87) meanwhile these strains showed completely resistance to oxytetracycline. The treatment results showed that the appropriate antibiotics to treat diarrhea in dairy beef calves in Lam Dong were ceftiofur and enrofloxacin. 5. Project output 5.1. Publication: 01 paper has published on Hue University Science Journal and 01 paper has published on National Veterinary Journal. 5.2. Training and education: 02 Veterinarians and 01 Master thesis 5.3. Applied product: 01 therapy diarrhea caused by E. coli and Salmonella in lactating beef calves. 5.4. Other products: 01 Thematic report 01 Final report 01 Poster 6. Contribution, applicability and delivery method of research results The study results have been applied for the treatment of lactating beef calves’ diarrhea caused by E. coli and Salmonella at dairy farm in Duc Trong of Lam Dong province. Date:Thua Thien Hue, 20th August 2021 Implementation institution (sign, full name and seal) Project coordinator (sign and full name) Nguyen Xuan Hoa Associate Professor, Dr. Veterinary medicine 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1. SỰ CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Chăn nu i b ngoài cung cấp thịt sữa sức kéo c n đem l i nguồn thu nhập lớn cho nhiều hộ gia đình nhiều hộ đã thoát nghèo nh chăn nu i b . Song với việc phát triển đàn b ph ng và trị bệnh cũng lu n đƣợc coi trọng. Trong khi một số các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhƣ: lở mồm long móng tụ huyết trùng nhiệt thán ... đã đƣợc khống chế và tiến dần đến việc thanh toán thì bệnh tiêu chảy chƣa đƣợc quan t m đ ng mực dẫn đến thiệt h i kh ng nhỏ cho ngƣ i chăn nu i b nhất là bê giai đo n b sữa. Hội chứng tiêu chảy ở gia s c nói chung và ở bê nói riêng là một hiện tƣợng bệnh lý rất phức t p g y ra bởi sự tác động tổng hợp của nhiều nguyên nh n. Các tác nh n g y tiêu chảy phổ biến nhƣ: điều kiện ngo i cảnh bất lợi g y ra stress cho cơ thể (chăm sóc quản lý kém th i tiết vận chuyển ... ) và do bản th n con vật có sức đề kháng yếu sẽ t o điều kiện thuận lợi cho việc cho việc x m nhập các vi sinh vật g y bệnh vào vật chủ đặc biệt là các vi sinh vật g y bệnh ở đƣ ng tiêu hoá dẫn tới sự nhiễm khuẩn và lo n khuẩn. Tỉ lệ lƣu hành của từng mầm bệnh và tỉ lệ mắc bệnh có thể khác nhau tùy theo vùng sinh thái phƣơng thức quản lý trang tr i và quy m đàn. Theo Cho Yoon (2014) hội chứng tiêu chảy ở động vật do nhiều nguyên nh n g y ra cho nên việc kiểm soát gặp nhiều khó khăn kém hiệu quả. Tiêu chảy do các tác nh n có thể truyền nhiễm là nguyên nh n quan trọng nhất làm tăng tỉ lệ mắc và tử vong ở bê sữa sơ sinh. Nguyên nh n chính g y tử vong của bê sơ sinh là do mắc các bệnh nhƣ tiêu chảy và viêm phổi (Khan và nnk. 2009 Shimizu Nagatoma 1978). Tỉ lệ tử vong ở bê sơ sinh trong tháng tuổi đầu tiên chiếm khoảng hơn 80 tổng tỉ lệ tử vong ở giai đo n theo mẹ (Jenny vànnk., 1981 – trích dẫn bởi Anwarullah vànnk. 2014). Theo Chí (1995) thì ở bê 70 - 80 tổn thất trong th i kỳ nu i dƣỡng và 80 - 90 trong số đó là hậu quả của bệnh tiêu chảy g y ra. Còn theo h ệ thống theo dõi sức khỏe động vật quốc gia (NAHMS) năm 2007 đối với sữa Hoa Kỳ (USDA. Dairy 2007) đã báo cáo rằng 57 tỉ lệ tử vong của bê là do tiêu chảy và hầu hết các trƣ ng hợp xảy ra ở bê dƣới 1 tháng tuổi. Theo kết quả nghiên cứu của Hur và cộng sự (2013) cũng cho thấy bê giai đo n b sữa dễ bị tiêu chảy và tỉ lệ tử vong có thể đến 53 4. Ngoài các yếu tố m i trƣ ng và quản lý thì các vi khuẩn g y tiêu chảy ở bê gồm có E. coli, Salmonella, C. perfringens, Streptococcus ;các lo i ký sinh trùng virus ... đƣợc xem là những yếu tố g y bệnh phổ biến. Xét về nguyên nh n vi khuẩn học trực khuẩn đƣ ng ruột nhƣ E. coli và Salmonella là tác nh n g y bệnh tiêu chảy phổ biến nhất và tác g y tổn thất kinh tế nghiêm trọng trong chăn nu i (House và nnk., 1978). Năm 2006 thiệt h i kinh tế liên quan bê chết ở Na Uy là khoảng 10 triệu USD nơi sản xuất 280.000 con bê mỗi năm (Østerås 2007). Những thiệt h i kinh tế kh ng 2 chỉ do tử vong mà c n do các chi phí khác bao gồm điều trị chẩn đoán đỡ đẻ can thiệp th y và giảm số lần thay thế đàn cũng nhƣ hiệu quả tăng trƣởng bệnh mãn tính và suy giảm khả năng phát triển sau đó ( azeley 2003). Sử dụng thuốc kháng sinh đƣợc xem nhƣ giải pháp hữu hiệu nhất khi bệnh tiêu chảy do nhiễm khuẩn xảy ra. Tuy nhiên do sử dụng kháng sinh kh ng hợp lý dẫn đến tình tr ng kháng thuốc kháng sinh ngày càng tăng làm giảm hiệu quả trong điều trị thậm chí kh ng có tác dụng nhƣ mong muốn. Nhằm đánh giá tình hình tiêu chảy ở bê sữa nu i ở các trang tr i của tỉnh L m Đồng do vi khuẩn E. coli và Salmonella gây ra và chọn lựa đƣợc kháng sinh phù hợp ch ng t i tiến hành nghiên cứu: Xác định độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli và Salmonella trong hội chứng tiêu chảy ở bê giai đoạn bú sữa và thử nghiệm một số phác đồ điều trị. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Đánh giá đƣợc tình hình bệnh tiêu chảy trên bê thịt giai đo n b sữa nu i ở các trang tr i n ng hộ ở miền trung Việt Nam; xác định độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli và Salmonella và thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy trên bê giai đo n b sữa. 3. ĐỐI TỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Vi khuẩn E. coli và Salmonella ph n lập đƣợc từ các mẫu ph n bê thịt giai đo n b sữa bị tiêu chảy. 3.2. Phạm vi nghiên cứu Mẫu thu thập từ một số trang tr i và n ng hộ chăn nu i bê giai đo n b sữa t i huyện một số tỉnh Nghệ An Hà Tĩnh và L m Đồng (Tuy nhiên do tình hình dịch bệnh dịch tả lợn Ch u Phi và dịch Covid 19 diễn biến phức t p nên t i Nghệ An và Hà Tĩnh năm 2019-2020 kh ng thể triển khai thu mẫu toàn bộ mẫu đƣợc thu t i huyện Đức Trọng tỉnh L m Đồng (đính kèm giải trình ở phụ lục). 3.3. Thời gian thực hiện: từ tháng 1 năm 2019 đến tháng 12 năm 2020. 3 CHƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Tình hình nghiên cứu về E. coli và Salmonella gây tiêu chảy ở bê 1.1.1. Trên thế giới ệnh tiêu chảy ở bê giai đo n b sữa do vi khuẩn E. coli và Salmonella gây ra rất phổ biến ở các tr i chăn nu i b sữa. Vi khuẩn E. coli và Salmonella thƣ ng ký sinh trong ruột già của động vật và nó duy trì một số lƣợng nhất định c n bằng với các hệ vi sinh vật có lợi. Vì vậy khi sức đề kháng của cơ thể giảm do các yếu tố th i tiết khí hậu biến động do tách hoặc nhập đàn thức ăn nƣớc uống dẫn đến số lƣợng E. coli và Salmonella tăng lên đột biến sản sinh độc tố làm rối lo n trao đổi nƣớc và các chất điện giải g y ra tình tr ng tiêu chảy. Nghiên cứu về các độc tố của vi khuẩn E. coli ph n lập từ bê tiêu chảy cho thấy hai lo i độc tố chịu nhiệt và kh ng chịu nhiệt là thành phần chính của các độc tố đƣ ng ruột (Enterotoxin). Vi khuẩn Salmonella có khả năng sản sinh nội độc tố g y tổn h i đến d dày ruột của động vật (Smith 1963). ệnh tiêu chảy do vi khuẩn E. coli sản sinh các độc tố đƣ ng ruột (Enterotoxigenic E. coli ETEC) là bệnh nhiễm khuẩn của bê xảy ra từ những ngày đầu sau sinh. ETEC sản sinh độc tố đƣ ng ruột gi p ch ng phát triển ở ruột và t o ra Enterotoxin (Raybould và nnk. 1987). Nghiên cứu của Janke nnk. (1989) cho thấy tuổi của bê nghé cảm nhiễm độc tố bám dính (Adherencia Enteropathogenic E. coli, AEEC) từ 2 đến 4 tháng tuổi sự cảm nhiễm với AEEC dƣ ng nhƣ là nguyên nh n duy nhất của bệnh tiêu chảy và nguyên nh n tử vong của một số gia s c. Hiện tƣợng xuất huyết đƣ ng ruột kéo theo các tổn thƣơng từng đám nhỏ trên các vết thƣơng lớn lan rộng khắp màng nhầy ruột là do quá trình bám dính của vi khuẩn g y ra. Các đặc điểm sinh hóa đặc biệt của vi khuẩn này là di động và sản sinh enzyme ph n giải urê. Các serotype huyết thanh của ch ng là O5: Các chủng E. coli kh ng điển hình ph n lập từ bê có sản sinh Verotoxin nhƣng kh ng sản sinh độc tố chịu nhiệt và kh ng chịu nhiệt (ST và LT). Otoi Hashimoto (1990), đã nghiên cứu sự cảm nhiễm E. coli có mang kháng nguyên K99 ở bê và kết quả điều trị bằng kháng huyết thanh cho thấy có 11 mẫu E. coli mang K99. Các mẫu E. coli ph n lập đƣợc từ ph n của 50 bê bị tiêu chảy các mẫu này đều có khả năng sản sinh độc tố chịu nhiệt ST nhƣng kh ng sản sinh độc tố kh ng chịu nhiệt LT và có 9 mẫu mang kháng nguyên O9 2 m u có kháng nguyên O8. Nghiên cứu huyết thanh học của 100 gia s c từ 92 trang tr i kết quả cho thấy sau 6-9 tháng có 34100 gia s c có đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên K99 với hiệu giá cao gấp 4 lần so với đối chứng. Kết quả nghiên cứu của Janke và nnk. (1989) cho thấy vi khuẩn E. coli g y hội chứng tiêu chảy ở bê chủ yếu đều cƣ tr ở đo n kết tràng ch ng g y ra các tổn thƣơng đặc biệt bao gồm viêm kết tràng xuất huyết ở manh tràng. Có đến 90 bê cảm nhiễm với vi khuẩn E. coli là sơ sinh tuổi trung bình bị cảm nhiễm là 11 8 ngày sau sinh khi đó xuất hiện hiện rối lo n trao đổi nƣớc và các chất điện giải g y ra tiêu chảy. 4 1.1.2. Tại Việt Nam Trên bê nghé có tới 70 - 80 tổn thất do bệnh tật là trong th i kỳ nu i dƣỡng bằng sữa đầu và trong đó 80 - 90 là do tiêu chảy g y ra (Chí 1995). Sửu (2005) đã nghiên cứu t i các tỉnh miền n i phía ắc cho thấy có sự sai khác rõ rệt về số lƣợng vi khuẩn E. coli ở bê nghé tiêu chảy so với bê nghé kh ng tiêu chảy. Nghiên cứu về vai tr của Salmonella và E. coli trong hội chứng tiêu chảy của b bê cho thấy E. coli và Salmonella bội nhiễm với tỉ lệ cao số lƣợng E. coli tăng gấp 3 lần Salmonella tăng 1 98 lần so với những con kh ng bị tiêu chảy (Quang 2004). Nghiên cứu trên bê nu i t i các tỉnh miền n i phía ắc khi bị tiêu chảy có số lƣợng E. coli là 17,79 x 106 CFUg ph n cao hơn so với 9 84 x 106 CFUg ph n ở bê kh ng tiêu chảy (Sửu 2005). Trong khi đó Hiên và nnk. (2001) nghiên cứu sự biến động số lƣợng vi khuẩn E. coli trong ph n bê tiêu chảy cho thấy số lƣợng E. coli tăng 279 so với ph n bê bình thƣ ng. Quang và nnk. (2007) cho rằng khi bê nghé bị tiêu chảy thì tỉ lệ ph n lập và số lƣợng Salmonella cũng cao hơn 1 87 lần so với ph n bình thƣ ng trong đó tỉ lệ ph n lập 72 66 so với 47 11 số lƣợng vi khuẩngram ph n 2,80 x 106 CFUgam so với 1 50 x 106 CFUgram. Nghiên cứu của Thìn và nnk.(2009) cho biết khi kiểm tra 55 mẫu Salmonella với yếu tố x m nhiễm (InvA) và độc tố đƣ ng ruột (Stn) có tỉ lệ lần lƣợt là InvA 2555 chủng chiếm tỉ lệ 45,45; Stn 1955 chủng chiếm tỉ lệ 34,55. Kiểm tra độc lực của Salmonella cho thấy 810 mẫu có khả năng giết chết 100 chuột thí nghiệm 210 mẫu giết chết 50 chuột thí nghiệm th i gian chết chuột là từ 12 đến 36 h. Hƣơng và nnk. (2008) đã ph n lập vi khuẩn từ mẫu ph n bê sữa bị tiêu chảy và bê bình thƣ ng t i thành phố Hồ Chí Minh và Đồng Nai cho thấy tất cả 103 mẫu ph n bê đƣợc xét nghiệm đều nhiễm E. coli. Tuyên (1995), tỉ lệ nhiễm Salmonella trong hội chứng tiêu chảy ở bê nghé t i các tỉnh phía ắc là 61 95. Khi nghiên cứu t i các tỉnh Nam Trung ộ Quang (2004) cho rằng 40 54 b bê tiêu chảy là do Salmonella. Ng n (2008) đã ph n lập đƣợc Salmonella trong 154251 (61 35) mẫu ph n bê tiêu chảy. Nghiên cứu của Quang và nnk. (2006) cho thấy khi bê bị tiêu chảy thì số lƣợng và tỉ lệ các mẫu vi khuẩn E. coli, Salmonella ph n lập đƣợc mang các yếu tố g y bệnh và sản sinh độc tố cao hơn so với bê kh ng bị tiêu chảy. Điều này khẳng định vi khuẩn E. coli và Salmonella có vai tr đặc biệt quan trọng trong hội chứng tiêu chảy ở bê. 1.2. Những nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy Hội chứng tiêu chảy bê là một tình tr ng bệnh lý phổ biến đã và đang g y thiệt h i lớn cho ngành chăn nu i. Hội chứng tiêu chảy g y chết với tỉ lệ thấp nhƣng tác h i của nó làm biến đổi cấu tr c niêm m c ruột non dẫn đến giảm khả năng hấp thu thức ăn làm cho bê c i cọc tăng tiêu tốn thức ăn1 kg tăng trọng. Nguy hiểm hơn nguyên nh n của hội chứng tiêu chảy rất phức t p đã g y ra sự nhầm lẫn trong chẩn đoán và điều trị.Qua nhiều nghiên cứu cho thấy hội chứng tiêu chảy là một hiện tƣợng bệnh lý 5 ở đƣ ng tiêu hóa có liên quan đến rất nhiều các yếu tố có yếu tố là nguyên nh n nguyên phát có yếu tố là nguyên nh n thứ phát. Xuất phát từ nguyên nh n hay triệu chứng l m sàng căn cứ vào đặc điểm th i gian hoặc tính chất của bệnh mà có các tên gọi khác nhau: Hội chứng tiêu chảy bệnh tiêu chảy kh ng nhiễm trùng bệnh tiêu chảy ở gia s c sơ sinh bệnh ph n sữa. Các nghiên cứu bệnh lý tiêu chảy ở gia s c cho thấy biểu hiện bệnh lý chủ yếu là mất nƣớc và chất điện giải cuối cùng con vật bị tr ng độc kiệt sức và chết. Vì vậy trong điều trị hội chứng tiêu chảy việc bổ sung nƣớc và chất điện giải là yếu tố cần thiết. Đối với gia s c non tỉ lệ chết do hội chứng tiêu chảy tƣơng đối cao. Theo Chí (1995) hội chứng tiêu chảy làm cho bê nghé giảm khả năng sinh trƣởng c i cọc tỉ lệ tử vong cao. Theo Lƣơng (1993) Thịnh (1985) Chí (1995) cho biết lợn bị tiêu chảy thƣ ng mất nƣớc mất điện giải và kiệt sức. Những gia s c khỏi bệnh thƣ ng c i cọc thiếu máu chậm lớn tỉ lệ nu i sống thấp.Đó cũng là nguyên nh n làm cho hiệu quả chăn nu i kh ng cao. Do điều kiện khí hậu nƣớc ta thay đổi phức t p hội chứng tiêu chảy xảy ra quanh năm đặc biệt khi th i tiết thay đổi đột ngột l nh ẩm độ ẩm kh ng khí cao. Theo T m (1987); Ninh (1993); T o và nnk. (1993) ở nƣớc ta tiêu chảy trên gia s c xảy ra quanh năm đặc biệt vào vụ đ ng xu n khi th i tiết thay đổi đột ngột và th i điểm chuyển mùa quanh năm. 1.3. Nguyên nhân gây ra hội chứng tiêu chảy Trong lịch sử nghiên cứu hội chứng tiêu chảy nhiều tác giả đã đƣa ra kết quả cho thấy nguyên nh n g y hội chứng tiêu chảy rất phức t p và thậm chí c n khác nhau theo th i gian địa điểm và giai đo n phát triển của con vật. Tuy nhiên hội chứng tiêu chảy là một bệnh lý ở đƣ ng tiêu hóa liên quan đến nhiều yếu tố: Có yếu tố là nguyên n h n nguyên phát có yếu tố là nguyên nh n thứ phát. Vì vậy việc ph n biệt giữa các nguyên nh n g y ra tiêu chảy là rất khó khăn (Th ch 1996). Các nhà khoa học đã tổng hợp những nguyên nh n chính g y ra hội chứng tiêu chảy ở gia s c nhƣ sau: 1.3.1. Do vi sinh vật 1.3.1.1. Vi khuẩn Nguyên nh n tiêu chảy do vi sinh vật là một trong những nguyên nh n phổ biến đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu chứng minh. Trong đƣ ng ruột của gia s c có rất nhiều lo i vi khuẩn nhƣ: E. coli, Salmonella, Shigella, … khu tr ở d ng một hệ sinh thái. Hệ sinh thái vi sinh vật đƣ ng ruột ở tr ng thái c n bằng động theo hƣớng có lợi cho cơ thể vật chủ. Ho t động sinh lý của gia s c chỉ diễn ra bình thƣ ng khi mà hệ sinh thái đƣ ng ruột lu n ở tr ng thái c n bằng. Dƣới tác động của các yếu tố g y bệnh tr ng thái c n bằng bị phá vỡ dẫn đến lo n khuẩn và hậu quả là gia s c bị tiêu chảy. Nhiều tác giả nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy đã chứng minh: Khi gặp điều kiện thuận lợi những vi khuẩn thƣ ng gặp ở đƣ ng tiêu hóa sẽ tăng độc tính phát triển với số lƣợng lớn trở thành có h i và g y bệnh. 6 Ngữ và nnk. (1979); Quang (2005) cho rằng do một số tác nh n nào đó tr ng thái c n bằng của hệ sinh thái đƣ ng ruột bị phá vỡ tất cả hoặc chỉ một lo i nào đó sinh sản lên quá nhiều sẽ sinh ra hiện tƣợng lo n khuẩn. Lo n khuẩn đƣ ng ruột là nguyên nh n chủ yếu g y ra bệnh đƣ ng tiêu hóa và đặc biệt là hội chứng tiêu chảy. Nghiên cứu của V n (2007) cho thấy tr u bị tiêu chảy có tỉ lệ nhiễm Salmonella cao hơn so với tr u bình thƣ ng tƣơng ứng với tỉ lệ là 27,50 và 18,87. Theo Đ t và nnk. (1996), E. coli chiếm tỉ lệ cao nhất (45 6) trong số các vi khuẩn đƣ ng ruột g y tiêu chảy. Trong khi vi khuẩn yếm khí Cl. perfringens g y bệnh khi có điều kiện thuận lợi và khi nó trở thành vai tr chính. Nam và nnk. (1997); Archie (2000) khẳng định rằng vi khuẩn đƣ ng ruột có vai tr kh ng thể thiếu đƣợc trong hội chứng tiêu chảy. Thành phần vi khuẩn trong ph n bê nghé bị tiêu chảy tập trung có 4 lo i chính: E. coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella trong đó chủ yếu là E. coli và Salmonella có tỉ lệ nhiễm tƣơng ứng là (72 48 và 51 32). Nghiên cứu của Đ t T m (1995) cho thấy tr u nghé khỏe m nh có tỉ lệ nhiễm Salmonella từ 23 3- 30 07 nhƣng trong trƣ ng hợp tiêu chảy tỉ lệ này tăng lên 37 5 (ở tr u) và 71 43 (ở nghé). Quang (2004) nghiên cứu vai tr của Salmonella và E. coli trong hội chứng tiêu chảy của b bê cho thấy E. coli và Salmonella bội nhiễm với tỉ lệ cao số lƣợng E. coli tăng gấp 3 lần Salmonella tăng 1 98 lần. Sửu (2005) nghiên cứu ở ba tỉnh miền n i phía ắc đã kết luận: Vi khuẩn E. coli, Salmonella và Cl. perfringens thấy ở bê nghé bị tiêu chảy cao hơn bê nghé ở tr ng thái bình thƣ ng. Minh Ph (1999) nghiên cứu về E. coli và Salmonella g y tiêu chảy trên lợn cho biết tỉ lệ phát hiện E. coli độc trong ph n là 80 - 90 trong số mẫu xét nghiệm. Nhƣ vậy E. coli, Salmonella, Clostridium perfringens là những vi khuẩn thƣ ng gặp trong các lo i vi khuẩn g y tiêu chảy cho gia s c nói chung và bê nghé nói riêng. 1.3.1.2. Virus Virus cũng là một trong những nguyên nh n g y ra hội chứng tiêu chảy ở gia s c. Đã có nhiều nghiên cứu kết luận một số virus nhƣ: Rotavirus, TGE, Enterovirus, Parvovirus, Adenovirus cũng có vai tr nhất định g y ra hội chứng tiêu chảy. Virus là tổn thƣơng niêm m c đƣ ng tiêu hóa suy giảm sức đề kháng của cơ thể và g y tiêu chảy ở thể cấp tính. Virus TGE có sự liên hệ đặc biệt với các tế bào ruột non. Khi x m nhập vào tế bào và phá hủy tế bào trong v ng đến 5 tiếng. Trong đó sữa kh ng đƣợc tiêu hóa nƣớc kh ng đƣợc hấp thu dẫn đến tiêu chảy mất dịch chất điện giải và con vật có thể bị chết. Rotavirus thƣ ng g y ra hội chứng tiêu chảy cho lợn b và ngƣ i. Lợn con từ 1 đến 6 tuần tuổi thƣ ng hay mắc với các biểu hiện l m sàng kém ăn bỏ ăn tiêu chảy nhiều lần trong ngày gầy s t do mất nƣớc và nằm bẹp ở một chỗ. Giai đo n cuối con vật biểu hiện thiếu máu trụy tim m ch và chết. Lecce và nnk.(1976) Nilson (1984) đã xác định vai tr của Rotavirus trong hội chứng tiêu hóa ở lợn. 7 1.3.1.3. Ký sinh trùng Ký sinh trùng ký sinh trong đƣ ng tiêu hóa là một trong những nguyên nh n g y ra hội chứng tiêu chảy.Ngoài tác động lấy đi chất dinh dƣỡng của vật chủ ký sinh trùng c n làm tổn thƣơng niêm m c đƣ ng tiêu hóa. Đ y là cơ hội cho các vi sinh vật có h i g y nhiễm trùng. Theo Th ch (1998) gia s c bị mắc bệnh do giun tr n g y ra có biểu hiện gầy yếu ăn uống kém da và niêm m c nhợt nh t do thiếu máu tiêu chảy ở mức độ trung bình kh ng liên tục. Nguyễn Thị Kim Lan và nnk.(2006) các lo i ký sinh trùng g y tiêu chảy cho tr u b thƣ ng gặp là Nematode, Strongyloides, Ascaris suum, Fasciola hepatica . Qua việc nghiên cứu tình hình nhiễm giun sán của tr u b : Theo kết quả của Lăng và nnk. (2006) có 16 lo i giun ký sinh trong đƣ ng tiêu hóa của tr u b ở Đắc Lắc trong đó có một 1 lo i ký sinh ở gan 11 lo i ở d cỏ 1 ở d m i khế 2 lo i ở ruột non và 1 lo i ở ruột già. Lo i g y tác h i nặng nhất là Fasciola sp. ký sinh ở ống dẫn mật làm rối lo n chức năng sinh lý của gan làm cho gia s c gầy yếu rối lo n tiêu hóa. Giun đũa Toxocara vitulorum thƣ ng g y tiêu chảy ph n trắng cho bê nghé non từ 1 đến 3 tháng tuổi. Sán lá gan Fasciola gigantica trong quá trình ký sinh tiết độc tố g y tiêu chảy cho bê non. Ký sinh trùng thƣ ng là nguyên nh n tiền phát cho nhiễm trùng và tiêu chảy nặng ở bê (Lăng T o 2002). Theo Năm (2004) lợn con bê nghé nhiễm cầu trùng thƣ ng đƣợc chẩn đoán không chính xác nên 30- 50 gia s c non bị chết số c n l i c i cọc và chậm lớn.Lăng T o (2002) cho biết: Giun đũa Ascaris suum trƣởng thành cƣ tr ở ruột non g y viêm niêm m c ruột g y loét niêm m c làm gia s c đau bụng và tiêu chảy. 1.3.2. Do nguyên nhân khác 1.3.2.1. Thời tiết khí hậu Ngo i cảnh là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sức đề kháng của cơ thể động vật nói chung và đối với vật nu i nói riêng đặc biệt là gia s c non. Theo nghiên cứu Phƣớc (1978); Đ t (1996) nƣớc ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa th i tiết đƣợc chia làm 4 mùa rõ rệt trong mỗi mùa đều có sự biến đổi th i tiết nhiệt độ độ ẩm ánh sáng … và các thay đổi về chăm sóc nu i dƣỡng. Những sự thay đổi đó là điều kiện thuận lợi cho các mầm bệnh g y h i phát triển g y chết nhiều gia s c trong đó phổ biến là các bệnh về đƣ ng tiêu hóa. Trong các yếu tố th i tiết thì sự thay đổi về nhiệt độ và ẩm độ cao là hai yếu tố g y ảnh hƣởng nhiều nhất tới sức khỏe đàn vật nu i. L nh và ẩm g y rối lo n hệ thống điều h a th n nhiệt ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi chất làm giảm sức đề kháng khi đó hệ vi sinh vật đƣ ng tiêu hóa có điều kiện thuận lợi tăng số lƣợng độc lực và g y bệnh. Các tác giả Niconxki (1986); Ninh (1993); Nam và nnk. (1997) khi gia s c chịu l nh ẩm kéo dài hệ miễn dịch suy giảm do đó gia s c dễ bị vi khuẩn cƣ ng độc g y bệnh. Theo Dung (2004) các yếu tố nóng l nh mƣa nắng hanh ẩm thay đổi bất 8 thƣ ng và điều kiện chăm sóc nu i dƣỡng ảnh hƣởng trực tiếp đến cơ thể lợn nhất là cơ thể lợn con chƣa phát triển hoàn chỉnh các phản ứng thích nghi c n yếu. 1.3.2.2. Kỹ thuật chăm sóc nuôi dưỡng Chăm sóc nu i dƣỡng có vai tr hết sức quan trọng trong chăn nu i. Việc thực hiện đ ng quy trình chăm sóc nu i dƣỡng sẽ đem l i sức khỏe và sự tăng trƣởng cho gia s c. Khi chất lƣợng thức ăn thấp kém chuồng tr i kh ng đảm bảo kỹ thuật nu i chăm sóc kh ng phù hợp là nguyên nh n làm giảm sức đề kháng gia s c dễ mắc bệnh. Theo nghiên cứu Thịnh (1985); Nam và nnk. (1997) khẩu phần ăn cho vật nu i kh ng thích hợp tr ng thái thức ăn kh ng tốt thức ăn kém chất lƣợng nhƣ: Mốc thối và nhiễm các t p chất các vi sinh vật có h i dẫn đến rối lo n tiêu hóa kèm theo viêm ruột tiêu chảy ở gia s c. T hay đổi thức ăn đột ngột đặc biệt là tăng hàm lƣợng đ m và chất béo thƣ ng làm cho bê nghé rối lo n tiêu hóa dẫn đến viêm ruột thức ăn thiếu các chất khoáng vitamin cần thiết cho cơ thể gia s c đồng th i phƣơng thức cho ăn kh ng phù hợp sẽ làm giảm sức đề kháng của gia s c và t o cơ hội cho các vi khuẩn g y hội chứng tiêu chảy (Lăng T o 2002). Nhƣ vậy có thể nói hội chứng tiêu chảy của bê nghé là một hội chứng bệnh lý rất phức t p ở đƣ ng tiêu hóa do nhiều nguyên nh n nhiều yếu tố tác động. Trong ph m vi nghiên cứu của đề tài ch ng t i xin trình bày vai tr của vi khuẩn E. coli, Salmonella g y bệnh tiêu chảy trên đàn bê sữa. 1.4. Vi khuẩn E. coli và Salmonella 1.4.1. Vi khuẩn E. coli Vi khuẩn E. coli đƣợc Theodor Escherich ph n lập năm 1885 từ ph n trẻ em. E. coli thƣ ng xuất hiện rất sớm trong hệ tiêu hóa của ngƣ i và động vật sau khi đƣợc sinh ra và tồn t i đến khi con vật chết. Trong đƣ ng ruột động vật E. coli chiếm khoáng 80 tổng số các vi khuẩn hiếu khí. Các chủng vi khuẩn E. coli thuộc nhiều serotype khác nhau. Cho đến nay đã phát hiện đƣợc 279 serotype trong đó có 25 serotype có độc lực và có vai tr quan trọng trong một số bệnh của gia s c. 1.4.1.1. Đặc tính hình thái Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia, loài coli là trực khuẩn hình gậy ngắn kích thƣớc 2 – 3 μm x 0 5 μm hai đầu tr n. Trong cơ thể động vật vi khuẩn có hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ đ i khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong m i trƣ ng nu i cấy có khi quan sát thấy những trực khuẩn dài 4 – 8 μm và thƣ ng gặp trong canh khuẩn già. Phần lớn vi khuẩn E. coli có khả năng di động do có l ng roi và l ng xung quanh th n. Vi khuẩn bắt màu Gram m có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu kh ng sinh nha bào và có thể có giáp m (Sơn 2002; Thanh và nnk., 1997). 9 1.4.1.2. Đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện có thể sinh trƣởng ở phổ nhiệt độ khá rộng (5 - 400C) nhiệt độ thích hợp là 370 C và cũng thích hợp với pH từ 7 2 - 7,4. Vi khuẩn E. coli dễ dàng phát triển đƣợc trên m i trƣ ng nu i cấy th ng thƣ ng một số chủng có thể phát triển ở m i trƣ ng tổng hợp nên ngƣ i ta chọn ch ng để nghiên cứu về sinh vật học. Để ph n lập thƣ ng nu i cấy khởi đầu trên m i trƣ ng tuyển lựa nhƣ m i trƣ ng Istrati MacConkey Endo desoxycholate,... Trên m i trƣ ng th ch thƣ ng ở 35 – 37 oC sau 12 - 18 gi hình thành khuẩn l c tr n lồi kh ng trong suốt bóng láng.Nu i l u khuẩn l c có màu n u nh t và mọc rộng ra có thể quan sát thấy cả khuẩn l c d ng R (Rough) và d ng M (Mucous). Trên m i trƣ ng th ch máu sau 24 gi nu i cấy ở 37o C hình thành khuẩn l c to ƣớt lồi viền kh ng gọn màu sáng đa số chủng kh ng g y dung huyết nhƣng cũng có chủng dung huyết. Trên m i trƣ ng nƣớc thịt sau 24 gi nu i cấy ở 37oC vi khuẩn phát triển rất nhanh m i trƣ ng đục có cặn màu tro trắng lắng xuống đ i khi có váng xám nh t trên mặt m i trƣ ng. Trên m i trƣ ng MacConkey sau 24 gi nu i cấy ở 37oC khuẩn l c có màu cánh sen tr n nhỏ hơi lồi kh ng nhầy rìa gọn kh ng làm chuyển màu m i trƣ ng (Thanh và nnk., 1997). Trên m i trƣ ng EM (Eosin Methylene lue):Sau 24 gi nu i cấy ở 37oC, vi khuẩn hình thành những khuẩn l c màu tím đen có ánh kim. Trên m i trƣ ng th ch SS: E. coli phát triển thành các khuẩn l c có màu đỏ. Trên m i trƣ ng th ch rilliant Green Agar: Sau 24 gi nu i cấy ở 37oC, vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn l c d ng S (Smooth) màu vàng chanh. Trên m i trƣ ng Endo: Sau 24 gi nu i cấy ở 37o C vi khuẩn hình thành khuẩn l c màu đỏ mận chín có hoặc kh ng có ánh kim. 1.4.1.3. Đặc tính sinh hóa E. coli có phản ứng indol dƣơng tính methyl red (MR) dƣơng tính Voges Proskauer (VP) m tính phản ứng sử dụng citrate m tính phản ứng sinh H2 S âm tính, di động dƣơng tính,lysine decarboxylase dƣơng tính lên men lactose và mannitol (Sơn 2002). Phản ứng lên men đƣ ng: Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi các lo i đƣ ng lactose, fructose, glucose, levulose, galactose, xylose, mannitol . Hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli đều lên men đƣ ng lactose nhanh và sinh hơi. 10 Bảng 1.1. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli. (TCVN 8400-16:2011) Phản ứng sinh hóa Biểu hiện Lactose + Indol + Urê - Sucrose + H2S - Mannitol + Sinh indol + Đỏ methyl + Voges Proskauer - Khả năng sử dụng citrat - “Nguồn: Tiêu chuẩn Việt Nam 8400-16: 2011”. 1.4.1.4. Sức đề kháng Cũng nhƣ các lo i vi khuẩn kh ng sinh nha bào khác E. coli kh ng chịu đƣợc nhiệt độ đun 50oC trong 1 gi 60oC trong 30 phút, và 100o C vi khuẩn chết ngay. Các chất sát trùng th ng thƣ ng: axit phenic, biclorua thủy ng n formol (0 2) diệt vi khuẩn sau 5 ph t. Ở m i trƣ ng bên ngoài các chủng E. coli độc tố có thể tồn t i đến 4 tháng.Vi khuẩn E. coli có khả năng đề kháng với sự sấy kh và hun khói. Trong đất và nƣớc E. coli sống đƣợc khoảng vài tháng. Ch ng có độ nh y cảm cao với nhiều lo i kháng sinh (Đ t và nnk. 1995). 1.4.1.5. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli Cấu tr c kháng nguyên của vi khuẩn E. coli g y bệnh trên gia s c rất đa d ng và phức t p với 4 nhóm kháng nguyên chính là các kháng nguyên O (kháng nguyên th n) chịu nhiệt kháng nguyên H (kháng nguyên l ng) kh ng chịu nhiệt kháng nguyên K (kháng nguyên giáp m ) và kháng nguyên F (kháng nguyên bám dính) chịu nhiệt ở mức độ trung gian. Sự đa d ng về tính kháng nguyên này g y rất nhiều khó khăn cho c ng tác ph ng chống bệnh trên gia s c (Sơn 2002). 11 Kháng nguyên O (xuất phát từ chữ Ohne Hauch - kh ng có màng hơi) là các hợp chất lipopolysaccharide có trong thành phần vách tế bào là chất g y sốt rất độc đối với động vật chịu nhiệt (100 o C hơn 2 gi ) kh ng bị ethanol 50 phá hủy nhƣng bị formol 0 5 làm biến tính. Các kháng nguyên th n đều nằm trên bề mặt nên có thể tiếp x c với hệ thống miễn dịch của cơ thể động vật trừ một số trƣ ng hợp bị kháng nguyên bề mặt che lấp. Khi trộn kháng nguyên th n với kháng thể tƣơng ứng thì xuất h iện phản ứng ngƣng kết gọi là ngƣng kết O: Th n tế bào vi khuẩn dính với nhau hình thành những h t nhỏ lắc rất khó tan huyền dịch vi khuẩn trong. Kháng nguyên H (xuất phát từ chữ Hauch - màng hơi) là những ph n tử protein flagellin gần giống myosin trong cơ của động vật kh ng chịu nhiệt dễ bị ethanol 50 và enzyme proteinase phá hủy nhƣng bảo tồn trong formol 0 5. Khi gặp kháng thể tƣơng ứng kháng nguyên H hình thành ngƣng kết gọi là phản ứng lên b ng do các tế bào vi khuẩn dính nhau gián tiếp qua các l ng roi nên hình thành các khối nhỏ kh ng bền dễ vỡ khi lắc. Kháng nguyên K (xuất phát từ chữ Kapsule - vỏ bọc) là kháng nguyên bao bọc th n vi khuẩn. Tuy gọi là kháng nguyên vỏ bọc nhƣng về mặt hình thái học l i có nguồn gốc từ những hợp chất có trên bề mặt tế bào chứ kh ng phải trong thành phần của vỏ nhầy. Điều đáng ch ý là những kháng nguyên này ức chế phản ứng ngƣng kết O rất m nh vì vậy khi thí nghiệm với các kháng thể O phải rất lƣu ý. Hiện nay ngƣ i ta phát hiện đƣợc rằng bản chất của nhiều kháng nguyên K là các sợi l ng nhung (hay Fimbria) có thuộc tính gi p vi khuẩn bám dính nên ngƣ i ta gọi các kháng nguyên nhóm này là kháng nguyên F (F antigen từ chữ Fimbria - lông nhung), là kháng nguyên bám dính hay yếu tố bám dính (Adhesin) vì vậy xuất hiện các ký hiệu F1 F2 … (Sơn 2013). Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae - kháng nguyên bám dính): Hầu hết các chủng E. coli g y bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính. Các chủng kh ng g y bệnh thì kh ng có kháng nguyên bám dính. Kháng nguyên bám dính gi p vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu m ruột và trên lớp màng nhầy để x m nhập và g y bệnh đồng th i chống l i khả năng đào thải vi khuẩn của nhu động ruột. Một số lo i kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli thuộc nhóm ETEC (EnterotoxigenicE. coli) g y bệnh chủ yếu cho lợn là F4 F18 và F41 (Carter và nnk.,1995). Thìn và nnk. (2011) cũng đã tách chiết thành c ng kháng nguyên bám dính F4 F18 từ mẫu vi khuẩn E. coli GIS 26 và F10786 bằng phƣơng pháp phá vỡ cơ học kết hợp với ly t m và kết tủa. Tác giả cho thấy nồng độ kháng nguyên sau chiết tách đ t 0 68 mgml (kháng nguyên F4) và 0 46 mgml (kháng nguyên F18). Điện di sản phẩm trên th ch SDS - polyacrylamide cho thấy chỉ có 1 v ch với trọng lƣợng ph n tử 26 kDa đối với kháng nguyên F4 và 1 v ch với 15 kDa đối với kháng nguyên F18. 12 1.4.1.6. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli Các nh n tố g y bệnh ở vi khuẩn họ này gồm có tính kết bám (adhesiveness) hay bám dính vào niêm m c ký chủ khả năng x m nhập (invasiveness) khả năng sản sinh các độc tố ruột độc tố g y chết khả năng dung huyết khả năng kháng khuẩn. Những đặc tính này hoặc bị chi phối bởi các gen trên nhiễm sắc thể vi khuẩn hoặc bởi các plasmid và thực khuẩn thể (bacteriophage). Các chủng vi khuẩn E. coli không có các yếu tố trên thì kh ng có khả năng g y bệnh. Dựa vào các yếu tố g y bệnh nói trên ngƣ i ta đã ph n lo i vi khuẩn E. coli thành các lo i sau (Sơn 2006). E. coli g y bệnh nguyên đƣ ng ruột (enteropathogenic E. coli - EPEC) thuộc vào một nhóm huyết thanh học riêng biệt có tính kết bám (bám dính). E. coli x m lấn đƣ ng ruột (enteroinvasive E. coli - EIEC) có khả năng x m nhập đƣ ng ruột do plasmid chi phối. E. coli độc tố nguyên đƣ ng ruột (enterotoxigenic E. coli - ETEC) có năng lực hình thành các kháng nguyên l ng F2 (tên cũ CFAI) F3 (CFAII) F4 (K88) F5 (K99) F6 (987P) và các độc tố ruột (enterotoxin) do plasmid chi phối. E. coli sinh độc tố tế bào vero (verocytotoxin - producing E. coli - VTEC) hay E. coli xuất huyết ruột (enterohemorrhagic E. coli - EHEC) có năng lực sản sinh độc tố vero g y độc tế bào do bacteriophage chi phối. Tất cả các vi khuẩn trên đều g y bệnh cục bộ. Ngoài ra đ i khi E. coli xâm nhập kết bám và phát bệnh ở các cơ quan khác nhau ngoài đƣ ng ruột (Sơn 2006). Trong đó các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC và VTEC thƣ ng g y bệnh tiêu chảy cho lợn con sơ sinh và lợn sau cai sữa (Fairbrother, 1992). ● Yếu tố bám dính của E. coli Là một trong những yếu tố quan trọng của vi khuẩn đƣ ng ruột gi p vi khuẩn bám đƣợc vào tế bào vật chủ yếu tố bám dính c n gọi là kháng nguyên bám dính. Khi vi khuẩn cƣ tr trong đƣ ng tiêu hóa trong quá trình di động xảy ra hiện tƣợng tiếp x c giữa vi khuẩn và tế bào nhung mao ruột. Sự tiếp x c này là tình c và ngẫu nhiên nếu gặp điều kiện thuận lợi trên bề mặt tế bào niêm m c ruột thì sự tiếp x c này sẽ tăng tính bền vững và vi khuẩn sẽ ở l i l u trong lớp nhầy. Tiếp theo là sự tiếp x c và sự hấp phụ của vi khuẩn lên bề mặt niêm m c ruột và yếu tố bám dính (Fimbriae type I) của vi khuẩn sẽ bám vào điểm tiếp nhận của tế bào nhung mao. Quá trình bám dính của vi khuẩn lên tế bào nhung mao đƣợc thực hiện có sự phù hợp giữa cấu tr c ph n tử điểm tiếp cận (Nagy Fekete, 1999). Trong trƣ ng hợp kh ng thể bám dính vi khuẩn sẽ bị bài khứ khỏi tổ chức bởi lớp dày niêm dịch và thể dịch. Sau khi bám dính vi khuẩn hình thành khuẩn l c nhỏ và bắt đầu giai đo n tiếp theo của quá trình cảm nhiễm. Trên bề mặt của tế bào cũng 13 nhƣ bề mặt vi khuẩn có những ph n tử bề mặt phản ứng tƣơng bổ một cách đặc hiệu (Sơn 2006). Các chủng ETEC đều có mang 1 hoặc nhiều yếu tố bám dính nhƣ F4(K88), F5(K99), F6 (K987p), F17, F18, F41, F42 và F165. ● Yếu tố xâm nhập của E. coli Là một khái niệm dùng để chỉ quá trình chƣa đƣợc xác định một cách rõ ràng mà nh đó vi khuẩn E. coli qua đƣợc hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy (mucosa) trên bề mặt niêm m c để x m nhập vào tế bào biểu m (Epithel) đồng th i sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này. Trong khi đó những vi khuẩn khác kh ng có khả năng x m nhập khôn g thể qua đƣợc hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua đƣợc hàng rào này sẽ bị giữ l i bởi tế bào đ i thực bào của tổ chức h niêm m c (Giannella, 1976). Tính x m nhập đƣợc chi phối bởi một gen duy nhất của nhiễm sắc thể và độc lập với những gen cần thiết cho việc phát huy tính g y bệnh của vi khuẩn do plasmid chi phối (Sơn 2006). ● Yếu tố dung huyết (Hly) của E. coli Vi khuẩn đƣ ng ruột phát triển trong tổ chức cơ quan sắt đƣợc cung cấp cho sự dinh dƣỡng phụ thuộc vào chất Siderophore do vi khuẩn sản sinh ra chất này có khả năng ph n huỷ sắt liên kết trong tổ chức vật chủ th ng qua sự phá vỡ hồng cầu giải phóng sắt dƣới d ng hợp chất HEM để vi khuẩn sử dụng. Sự ph n huỷ hồng cầu chủ yếu vẫn là do hemolysis của vi khuẩn đảm nhiệm vì vậy việc sản sinh ra hemolysis g y dung huyết của vi khuẩn có thể coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn. Có bốn kiểu dung huyết của E. coli (α- haemolysin β- haemolysin γ- haemolysin và €- haemolysin ) nhƣng quan trọng nhất là kiểu α và β. Kiểu β phá vỡ hồng cầu hoàn toàn vì vậy hình thành một v ng sáng xung quanh khuẩn l c trong suốt và rộng. Kiểu α phá vỡ hồng cầu kh ng hoàn toàn do đó v ng dung huyết m nh t hơn (Quinn, 1994 ). Một số tài liệu đã chứng minh đƣợc rằng mức độ g y chết của hemolysin trên chuột trên ph i trứng g y ho i tử trên da thỏ trên tế bào sơ ph i gà tế bào thận chuột. Khối lƣợng ph n tử của hemolysin khoảng 300.000 Dalton đƣợc cấu t o chủ yếu là protein và c n có cả hydratcacbon (Cavalieri Snyder 1982). Quá trình tổng hợp và giải phóng hemolyzin phải tiến hành đồng th i hai quá trình: Quá trình thứ nhất: Giải phóng hemolyzin đã tổng hợp qua màng rồi tập hợp thành những t i nhỏ trong khoảng trống của màng cytoplasm ngo i vi quá trình này cần năng lƣợng. Quá trình thứ hai: Xảy ra kh ng cần năng lƣợng nhƣng phụ thuộc vào nhiệt độ là quá trình giải phóng hemolyzin qua màng. ● Yếu tố kháng khuẩn Colicin V của E. coli (ColV) Nhiều chủng vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt các lo i vi khuẩn khác gọi là Colicin V. Vì vậy yếu tố 14 này cũng đƣợc coi là một trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli (Smith Halls, 1967). ● Tính kháng thuốc kháng sinh của E. coli Sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh là một trong những biện pháp quan trọng nhất để làm giảm tỉ lệ chết ở gia s c. Tuy nhiên trong những năm gần đ y vi khuẩn có khả năng kháng l i với một hoặc nhiều lo i kháng sinh đặc biệt là đối với những lo i kháng sinh đƣợc sử dụng rộng rãi trong chăn nu i và th y (Pritchard nnk., 2003). Việc sử dụng nhiều kháng sinh kh ng những t o áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn g y bệnh mà c n ảnh hƣởng đến hệ vi sinh vật trong đƣ ng tiêu hóa làm cho vi khuẩn trở nên đề kháng với kháng sinh. Cơ chế tác động của kháng sinh: Theo Sơn (2006) kháng sinh là những lo i thuốc có khả năng ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật. Kháng sinh tác động vào các enzyme (bản chất là protein) làm nhiệm vụ x c tác quá trình trao đổi chất của vi khuẩn làm gián đo n quá trình đó của vi khuẩn. Nói chung mỗi lo i kháng sinh tác động vào một hay vài lo i vi khuẩn khác nhau và tác động một trong các cơ chế sau: - Ngừng tổng hợp màng vi khuẩn: Các kháng sinh có tác dụng ngăn trở sự hình thành Murein (một thành phần cấu t o của vi khuẩn) nên màng ngoài của vi khuẩn kh ng đƣợc tổng hợp điển hình gồm có kháng sinh: Penicilline cycloserine, bacitracin, ... - Tác động vào màng vi khuẩn làm rối lo n tính thấm hoặc phá vỡ màng tế bào: Các chất kháng sinh tác động làm thay đổi cấu tr c của màng tế bào vi khuẩn do đó quá trình trao đổi chất của vi khuẩn bị ức chế điển hình gồm có: Polimycine nystatin. - Làm rối lo n ức chế quá trình tổng hợp protein: Một số kháng sinh trong nhóm này nhƣ tetracycline ph n bố các men tổng hợp protein hay ngăn trở sự dẫn truyền th ng tin của ADN đến ribôxôm, là m ngăn trở quá trình tổng hợp protein. Đa số các lo i kháng sinh c n l i đều g y rối lo n cơ chế h hấp ở mức ph n tử t o phức kh ng tan với ADN làm tổn thƣơng màng và các lo i nucleotide có khi làm rối lo n protein. - Làm ức chế tổng hợp axit nucleic của nh n vi khuẩn: Kháng sinh tác động trực tiếp vào quá trình tổng hợp axit nucleic của nh n t o phức bền vững với ADN của vi khuẩn. Những kháng sinh này rất độc đối với cơ thể sống chỉ sử dụng khi cần thiết. Hosoda và nnk. (1990) đã nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn E. coli và các plasmid - R của vi khuẩn này ph n lập đƣợc từ bê tiêu chảy. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ kháng với tetracyclin là

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC HUẾ

XÁC ĐỊNH ĐỘ MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN E COLI VÀ SALMONELLA TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÊ GIAI ĐOẠN

BÚ SỮA VÀ THỬ NGHIỆM MỘT SỐ PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ

Mã số: DHH2019-02-121

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Nguyễn Xuân Hòa

Thừa Thiên Huế, 8/2021

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC HUẾ

XÁC ĐỊNH ĐỘ MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN E COLI VÀ SALMONELLA TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÊ GIAI ĐOẠN

BÚ SỮA VÀ THỬ NGHIỆM MỘT SỐ PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ

Mã số: DHH2019-02-121

Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên)

Thừa Thiên Huế, 8/2021

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA

CN.Lê Trần Hoàn ộ m n Th y Trƣ ng Đ i học N ng L m Đ i học Huế TS.Trần Quang Vui ộ m n Th y Trƣ ng Đ i học N ng L m Đ i học Huế ThS.Thƣợng Thị Thanh Lễ Ph ng tổ chức HC Trƣ ng Đ i học N ng L m Đ i học Huế

TS.Phan Vũ Hải ộ m n Th y Trƣ ng Đ i học N ng L m Đ i học Huế TS.Lê Quốc Việt C ng ty TNHH Dinh Dƣỡng Quốc Tế Việt Đức

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU 1

1 SỰ CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

3.1 Đối tượng nghiên cứu 2

3.2 Ph m vi nghiên cứu 2

3.3 Th i gian thực hiện: 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tình hình nghiên cứu về E coli và Salmonella g y tiêu chảy ở bê 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 T i Việt Nam 4

1.2 Những nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy 4

1.3 Nguyên nh n g y ra hội chứng tiêu chảy 5

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 35

2.1.1 Mục tiêu tổng thể: 35

2.1.2 Các mục tiêu cụ thể 35

2.2 Đối tượng và ph m vi nghiên cứu 35

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 35

2.2.2 Ph m vi nghiên cứu 35

2.2 Nội dung nghiên cứu 35

2.3 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu 36

2.3.1 Cách tiếp cận 36

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Xác định sự biến động về số lượng của vi khuẩn E coli và vi khuẩn Salmonella trong ph n của bê bị tiêu chảy nghi do E coli hay Salmonella và mẫu ph n kh ng tiêu chảy 42

3.1.1 Tình hình bệnh tiêu chảy trên bê sữa nu i ở n ng hộ t i huyện Đức Trọng tỉnh L m Đồng 42

3.1.2 Sự khác nhau về số lượng (CFU/g) của vi khuẩn E coli và vi khuẩn Salmonella trong ph n của bê bị tiêu chảy và kh ng tiêu chảy 44

3.1.3 Kết quả ph n lập vi khuẩn E coli và Salmonella 45

3.1.4 Đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn E coli ph n lập được 47

3.1.5 Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella ph n lập được 48

3.2 Kết quả xác định độc lực và tính mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn E coli và Salmonella ph n lập được 49

3.2.1 Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn ph n lập được 49

3.2.2 Kết quả xác định tính mẫn cảm kháng sinh của một số mẫu vi khuẩn E coli và Salmonella mang gene độc tố ph n lập được 54

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E coli (TCVN 8400-16:2011) 10

Bảng 1.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella 23

Bảng 1.3 Th i gian sống của Salmonella trong các lo i m i trư ng 24

Bảng 2.1 Tên gene, mồi dùng và kích thước sản phẩm cho phản ứng PCR 38

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR xác định gen độc 39

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn đánh giá tính mẫn cảm các lo i kháng sinh theo quy định của nhà sản xuất 40

Bảng 3.1a Tỉ lệ bệnh tiêu chảy trên bê nuôi ở nông hộ t i huyện Đức Trọng 42

Bảng 3.1b Tỉ lệ bê bị bệnh tiêu chảy theo tháng tuổi 43

Bảng 3.1.2 Kết quả xác định số lượng (CFU/g) vi khuẩn trong mẫu phân 44

Bảng 3.1.3 Tỉ lệ vi khuẩn phân lập được trong phân không tiêu chảy và tiêu chảy 46 Bảng 3.1.4 Giám định một số đặc tính sinh vật học các chủng E coli phân lập được 47

Bảng 3.1.5 Đặc tính sinh hóa các chủng Salmonella phân lập được 48

Bảng 3.2.1.1 Kết quả xác định gene mã hóa độc tố của vi khuẩn E coli 49

Bảng 3.2.1.2 Kết quả PCR xác định gene mã hóa độc tố ở vi khuẩn Salmonella 50

Bảng 3.2.1.3 Kết quả kiểm tra độc lực của chủng vi khuẩn E coli mang gene độc tố 52

Bảng 3.2.1.4 Kết quả kiểm tra độc lực vi khuẩn Salmonella mang gene độc tố bằng tiêm truyền động vật thí nghiệm 53

Bảng 3.2.2.1 Kết quả đánh giá tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E coli 54

Bảng 3.2.1.2 Kết quả đánh giá tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn Salmonella 55

Bảng 3.3 Kết quả điều trị bệnh tiêu chảy ở bê 56

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ phản ứng PCR (Lộc và nnk., 2007) 33 Hình 1.2 Các chu kỳ phản ứng PCR (Lộc và nnk., 2007) 33 Hình 3.2.1.1 Kết quả xác định mang gene mã hóa độc tố của vi khuẩn E coli bằng

phản ứng PCR 50 Hình 3.2.1.2 Kết quả xác định gene mã hóa độc tố của vi khuẩn Salmonella bằng

phương pháp PCR 51

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC HUẾ 1 Thông tin chung

1.1 Tên đề tài: Xác định độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E coli và Salmonella trong hội chứng tiêu chảy ở bê giai đoạn bú sữa và thử nghiệm một số

phác đồ điều trị

1.2 Mã số: DHH2019-02-121

1.3 Chủ nhiệm: PGS.TS Nguyễn Xu n H a

1.4 Cơ quan chủ trì: Trư ng Đ i học N ng L m - Đ i học Huế

1.5 Thời gian thực hiện:Từ tháng 01 năm 2019 đến tháng 12 năm 2020

2 Mục tiêu

Đánh giá được tình hình bệnh tiêu chảy trên bê giai đo n b sữa ở các trang tr i

n ng hộ ở các tỉnh miền trung và xác định độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E coli và Salmonella và thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy trên bê giai đo n

b sữa

3 Tính mới và sáng tạo

Đ y là nghiên cứu đầu tiên về bệnh tiêu chảy trên bê sữa t i tỉnh L m Đồng

Việt Nam

4 Các kết quả nghiên cứu thu được

Sau khi tiến hành khảo sát tình hình chăn nu i bê sữa trên 21 hộ chăn nu i ở huyện Đức Trọng tỉnh L m Đồng ch ng t i nhận thấy tỉ lệ bê sữa bị bệnh tiêu chảy rất cao (51 25%) Đặc biệt bê dưới 1 tháng tuổi có tỉ lệ tiêu chảy cao nhất (75 61%)

Trong các mẫu ph n bê tiêu chảy số lượng vi khuẩn E coli ph n lập được trung bình

là 271,4 x 106 CFU/gam cao hơn 11 7 lần so với ph n bình thư ng (231 6x 105

CFU/gam) Số lượng vi khuẩn Salmonella trung bình trong ph n tiêu chảy 71 9 x 104

CFU/gam ph n cao hơn 59 4 lần so với ph n bình thư ng (121 x 102

CFU/gam) Trong tổng số 74 mẫu ph n thu thập được tiến hành ph n lập vi khuẩn kết quả có 73

chủng vi khuẩn E coli và 38 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được mang đầy đủ

các đặc tính sinh hóa như các tài liệu đã m tả

Hầu hết các chủng vi khuẩn E coli, Salmonella ph n lập được từ các mẫu ph n

tiêu chảy đều mang gene độc tố đư ng ruột và yếu tố bám dính Trong khi đó các vi

khuẩn được ph n lập từ ph n kh ng tiêu chảy đều m tính với các gen độc kiểm tra

Hầu hết những chủng vi khuẩn E coli, Salmonella dương tính với các gene độc kiểm

tra đều có biểu hiện độc lực cao khi g y chết 100% động vật thí nghiệm Điều này chứng tỏ hầu hết các gene mã hóa độc lực đều được biểu hiện kiểu hình tương ứng

Vi khuẩn E coli ph n lập được mẫn cảm cao 90 % với enrofloxacin

gentamicin và ceftiofur 80%; trong khi đó đề kháng với amoxicillin doxycycline và oxytetracycline

Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm cao với 2 lo i kháng sinh gentamycin và

enrofloxacin (80-90%); trung bình với amoxicillin doxycycline và ceftiofur; trong khi đó đề kháng hoàn toàn kháng sinh oxytetracycline

Kết quả điều trị cho thấy kháng sinh thích hợp để điều trị bệnh tiêu chảy trên bê sữa ở L m Đồng là ceftiofur và enrofloxacin

5 Các sản phẩm của đề tài

5.1 Sản phẩm khoa học: 01 bài báo trên t p chí Khoa học Đ i học Huế và 01

bài báo trên T p chí Th y

Nguyễn Xuân Hòa, Phạm Đăng Tuấn, Lê Trần Hoàn, Lê Quốc Việt, Lê Văn Phước, Nguyễn Đức Danh, Phan Vũ Hải, 2020.Độc lực độ mẫn cảm kháng

sinh của vi khuẩn Salmonella spp ph n lập từ bê giai đo n b sữa bị tiêu chảy t i

Xác định độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn Salmonella spp ph n lập từ bê

giai đo n b sữa bị tiêu chảy t i huyện Đức Trọng tỉnh L m Đồng (Nguyễn Thủy Tiên, 2020)

Xác định độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E coli ph n lập từ bê giai đo n b

sữa bị tiêu chảy t i huyện Đức Trọng tỉnh L m Đồng (Nguyễn Thị Thùy Dung 2020) 01 Th c sĩ

Xác định độc lực độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E coli và Salmonella spp ph n lập từ bê giai đo n b sữa bị tiêu chảy t i một số trang tr i b sữa (Ph m

Đăng Tuấn 2020)

5.3 Sản phẩm ứng dụng:

- 01 phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy do E coli và Salmonella trên bê giai đo n

b sữa

5.4 Sản phẩm khác:

01 chuyên đề: Thực tr ng bệnh tiêu chảy ở bê giai đo n b sữa do vi khuẩn E

coli và Salmonella (đã nghiệm thu: Đ t)

01 áo cáo tổng kết

01 poster về đề tài nghiên cứu: Xác định độc lực độ mẫn cảm kháng sinh của vi

khuẩn E coli và Salmonella spp Trong hội chứng tiêu chảy ở bê giai đo n b sữa và

thử nghiệm một số phác đồ điều trị (đã nghiệm thu : Đ t)

6 Các đóng góp, khả năng ứng dụng và phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu đã và đang được chuyển giao cho các th ý trong địa bàn

huyện Đức Trọng tỉnh L m Đồng để tiến hành điều trị bệnh tiêu chảy do E coli và

Salmonella trên bê bị bệnh tiêu chảy

Thừa thiên Huế ngày 20 tháng 8 năm 2021

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING

HUE UNIVERSITY

INFORMATION ON STUDY RESULTS

RESEARCH PROJECT ASSIGNED BY HUE UNIVERSITY 1 General information of project

1.1 Project title: Determination of antibiotic susceptibility of E coli and Salmonella isolated from calf with diarrhea syndrome and dairy beef

calves and testing some treatment regimens

1.2 Projectcode: DHH2019-02-121

1.3 Coordinator: Assoc Prof Dr Nguyen Xuan Hoa

1.4 Implementing institution: University of Agriculture and Forestry, Hue

University

1.5 Implementingduration: From May 2019 to December 2020

2 Study objective (s)

Evaluating the situation of diarrhea in dairy beef calves in industrial farms and

households’s farms in Vietnam central and determining antibiotic susceptibility of E

coli and Salmonella bacteria and testing some treatment regimens towards diarrhea on

lactating calves

3 Novelty and creativeness of the study

This is the first study on diarrhea of dairy beef calves in Vietnam central

4 Main study results

After conducting a survey on the raising of dairy beef calves in 21 households in Ductrong district, Lamdong province, we found that the rate of dairy beef calves suffering from diarrhea was very high (51.25%) In particular, the diarrhea rate of calves under 1-month-old was highest (75.61%)

In the diarrhea feces samples, the average number of E coli was 271.4 x 106

CFU/gram, which was 11.7 times higher than the non diarhea group (231.6x 105

CFU/gram) The average number of Salmonella in the diarrhea group was 71.9 x

104CFU/gram, which was 59.4 times higher than the non diarrhea group (121x 102

CFU/gram) Of the total studied 74 samples, 73 E coli were isolated strains, and 38 isolated strains Salmonella, which expressed biochemical properties as described

Most E coli and Salmonellas trains, isolated from diarrhea fecal samples,

carried toxin genes encoded intestinal toxin and adhesion factors Meanwhile, the bacteria isolated from non diarrhea feces were negative for the test toxin genes Most

strains of E coli and Salmonella that were positive for the toxin genes expressed high

virulence which was lethal to 100% of experimental animals This demonstrates that most of the genes encoding virulence are phenotyped accordingly

All E coli isolates showed a highly susceptibility 90% to enrofloxacin, 80%

gentamicin and ceftiofur; meanwhile, resistant to amoxicillin, doxycycline, and oxytetracycline

Salmonella isolates showed a highly susceptibility to two antibiotics examined

including gentamicin and enrofloxacin; moderate susceptibility to amoxicillin and doxycycline (75%) and enrofloxacin (100%); gentamicin (87%) meanwhile these strains showed completely resistance to oxytetracycline

The treatment results showed that the appropriate antibiotics to treat diarrhea in dairy beef calves in Lam Dong were ceftiofur and enrofloxacin

5 Project output

5.1 Publication: 01 paper has published on Hue University Science

Journal and 01 paper has published on National Veterinary Journal

5.2 Training and education: 02 Veterinarians and 01 Master thesis

5.3 Applied product: 01 therapy diarrhea caused by E coli and Salmonella in

lactating beef calves

5.4 Other products:

01 Thematic report

01 Final report 01 Poster

6 Contribution, applicability and delivery method of research results

The study results have been applied for the treatment of lactating beef calves’ diarrhea

caused by E coli and Salmonella at dairy farm in Duc Trong of Lam Dong province

Date:Thua Thien Hue, 20th August 2021

Implementation institution

(sign, full name and seal)

Project coordinator

(sign and full name)

Nguyen Xuan Hoa

Associate Professor, Dr Veterinary medicine

PHẦN MỞ ĐẦU 1 SỰ CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Chăn nu i b ngoài cung cấp thịt sữa sức kéo c n đem l i nguồn thu nhập lớn cho nhiều hộ gia đình nhiều hộ đã thoát nghèo nh chăn nu i b Song với việc phát triển đàn b ph ng và trị bệnh cũng lu n được coi trọng Trong khi một số các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như: lở mồm long móng tụ huyết trùng nhiệt thán đã được khống chế và tiến dần đến việc thanh toán thì bệnh tiêu chảy chưa được quan t m đ ng mực dẫn đến thiệt h i kh ng nhỏ cho ngư i chăn nu i b nhất là bê giai đo n b sữa

Hội chứng tiêu chảy ở gia s c nói chung và ở bê nói riêng là một hiện tượng bệnh lý rất phức t p g y ra bởi sự tác động tổng hợp của nhiều nguyên nh n Các tác nh n g y tiêu chảy phổ biến như: điều kiện ngo i cảnh bất lợi g y ra stress cho cơ thể (chăm sóc quản lý kém th i tiết vận chuyển ) và do bản th n con vật có sức đề kháng yếu sẽ t o điều kiện thuận lợi cho việc cho việc x m nhập các vi sinh vật g y bệnh vào vật chủ đặc biệt là các vi sinh vật g y bệnh ở đư ng tiêu hoá dẫn tới sự nhiễm khuẩn và lo n khuẩn Tỉ lệ lưu hành của từng mầm bệnh và tỉ lệ mắc bệnh có thể khác nhau tùy theo vùng sinh thái phương thức quản lý trang tr i và quy m đàn Theo Cho & Yoon (2014) hội chứng tiêu chảy ở động vật do nhiều nguyên nh n g y ra cho nên việc kiểm soát gặp nhiều khó khăn kém hiệu quả Tiêu chảy do các tác nh n có thể truyền nhiễm là nguyên nh n quan trọng nhất làm tăng tỉ lệ mắc và tử vong ở bê sữa sơ sinh

Nguyên nh n chính g y tử vong của bê sơ sinh là do mắc các bệnh như tiêu chảy và viêm phổi (Khan và nnk 2009 Shimizu & Nagatoma 1978) Tỉ lệ tử vong ở bê sơ sinh trong tháng tuổi đầu tiên chiếm khoảng hơn 80% tổng tỉ lệ tử vong ở giai

đo n theo mẹ (Jenny vànnk., 1981 – trích dẫn bởi Anwarullah vànnk 2014) Theo Chí

(1995) thì ở bê 70 - 80% tổn thất trong th i kỳ nu i dưỡng và 80 - 90% trong số đó là hậu quả của bệnh tiêu chảy g y ra Còn theo hệ thống theo dõi sức khỏe động vật quốc gia (NAHMS) năm 2007 đối với sữa Hoa Kỳ (USDA Dairy 2007) đã báo cáo rằng 57% tỉ lệ tử vong của bê là do tiêu chảy và hầu hết các trư ng hợp xảy ra ở bê dưới 1 tháng tuổi Theo kết quả nghiên cứu của Hur và cộng sự (2013) cũng cho thấy bê giai đo n b sữa dễ bị tiêu chảy và tỉ lệ tử vong có thể đến 53 4% Ngoài các yếu tố m i

trư ng và quản lý thì các vi khuẩn g y tiêu chảy ở bê gồm có E coli, Salmonella, C

perfringens, Streptococcus;các lo i ký sinh trùng virus được xem là những yếu tố

g y bệnh phổ biến Xét về nguyên nh n vi khuẩn học trực khuẩn đư ng ruột như E

coli và Salmonella là tác nh n g y bệnh tiêu chảy phổ biến nhất và tác g y tổn thất

kinh tế nghiêm trọng trong chăn nu i (House và nnk., 1978)

Năm 2006 thiệt h i kinh tế liên quan bê chết ở Na Uy là khoảng 10 triệu USD

chỉ do tử vong mà c n do các chi phí khác bao gồm điều trị chẩn đoán đỡ đẻ can thiệp th y và giảm số lần thay thế đàn cũng như hiệu quả tăng trưởng bệnh mãn tính và suy giảm khả năng phát triển sau đó ( azeley 2003)

Sử dụng thuốc kháng sinh được xem như giải pháp hữu hiệu nhất khi bệnh tiêu chảy do nhiễm khuẩn xảy ra Tuy nhiên do sử dụng kháng sinh kh ng hợp lý dẫn đến tình tr ng kháng thuốc kháng sinh ngày càng tăng làm giảm hiệu quả trong điều trị thậm chí kh ng có tác dụng như mong muốn Nhằm đánh giá tình hình tiêu chảy ở bê

sữa nu i ở các trang tr i của tỉnh L m Đồng do vi khuẩn E coli và Salmonella gây ra

và chọn lựa được kháng sinh phù hợp ch ng t i tiến hành nghiên cứu: Xác định độ

mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E coli và Salmonella trong hội chứng tiêu chảy

ở bê giai đoạn bú sữa và thử nghiệm một số phác đồ điều trị 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Đánh giá được tình hình bệnh tiêu chảy trên bê thịt giai đo n b sữa nu i ở các trang tr i n ng hộ ở miền trung Việt Nam; xác định độ mẫn cảm kháng sinh của vi

khuẩn E coli và Salmonella và thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy trên

bê giai đo n b sữa

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn E coli và Salmonella ph n lập được từ các mẫu ph n bê thịt giai đo n

b sữa bị tiêu chảy

3.2 Phạm vi nghiên cứu

Mẫu thu thập từ một số trang tr i và n ng hộ chăn nu i bê giai đo n b sữa t i huyện một số tỉnh Nghệ An Hà Tĩnh và L m Đồng (Tuy nhiên do tình hình dịch bệnh dịch tả lợn Ch u Phi và dịch Covid 19 diễn biến phức t p nên t i Nghệ An và Hà Tĩnh năm 2019-2020 kh ng thể triển khai thu mẫu toàn bộ mẫu được thu t i huyện Đức

Trọng tỉnh L m Đồng (đính kèm giải trình ở phụ lục)

3.3 Thời gian thực hiện: từ tháng 1 năm 2019 đến tháng 12 năm 2020

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Tình hình nghiên cứu về E coli và Salmonella gây tiêu chảy ở bê 1.1.1 Trên thế giới

ệnh tiêu chảy ở bê giai đo n b sữa do vi khuẩn E coli và Salmonella gây ra rất phổ biến ở các tr i chăn nu i b sữa Vi khuẩn E coli và Salmonella thư ng ký

sinh trong ruột già của động vật và nó duy trì một số lượng nhất định c n bằng với các hệ vi sinh vật có lợi Vì vậy khi sức đề kháng của cơ thể giảm do các yếu tố th i tiết

khí hậu biến động do tách hoặc nhập đàn thức ăn nước uống dẫn đến số lượng E coli và Salmonella tăng lên đột biến sản sinh độc tố làm rối lo n trao đổi nước và các chất

điện giải g y ra tình tr ng tiêu chảy

Nghiên cứu về các độc tố của vi khuẩn E coli ph n lập từ bê tiêu chảy cho thấy

hai lo i độc tố chịu nhiệt và kh ng chịu nhiệt là thành phần chính của các độc tố

đư ng ruột (Enterotoxin) Vi khuẩn Salmonella có khả năng sản sinh nội độc tố g y tổn h i đến d dày ruột của động vật (Smith 1963) ệnh tiêu chảy do vi khuẩn E

coli sản sinh các độc tố đư ng ruột (Enterotoxigenic E coli ETEC) là bệnh nhiễm

khuẩn của bê xảy ra từ những ngày đầu sau sinh ETEC sản sinh độc tố đư ng ruột gi p ch ng phát triển ở ruột và t o ra Enterotoxin (Raybould và nnk 1987) Nghiên cứu của Janke & nnk (1989) cho thấy tuổi của bê nghé cảm nhiễm độc tố bám dính

(Adherencia Enteropathogenic E coli, AEEC) từ 2 đến 4 tháng tuổi sự cảm nhiễm với

AEEC dư ng như là nguyên nh n duy nhất của bệnh tiêu chảy và nguyên nh n tử vong của một số gia s c Hiện tượng xuất huyết đư ng ruột kéo theo các tổn thương từng đám nhỏ trên các vết thương lớn lan rộng khắp màng nhầy ruột là do quá trình bám dính của vi khuẩn g y ra Các đặc điểm sinh hóa đặc biệt của vi khuẩn này là di động và sản sinh enzyme ph n giải urê Các serotype huyết thanh của ch ng là O5:

Các chủng E coli kh ng điển hình ph n lập từ bê có sản sinh Verotoxin nhưng kh ng

sản sinh độc tố chịu nhiệt và kh ng chịu nhiệt (ST và LT) Otoi & Hashimoto (1990),

đã nghiên cứu sự cảm nhiễm E coli có mang kháng nguyên K99 ở bê và kết quả điều trị bằng kháng huyết thanh cho thấy có 11 mẫu E coli mang K99 Các mẫu E coli

ph n lập được từ ph n của 50 bê bị tiêu chảy các mẫu này đều có khả năng sản sinh độc tố chịu nhiệt ST nhưng kh ng sản sinh độc tố kh ng chịu nhiệt LT và có 9 mẫu mang kháng nguyên O9 2 m u có kháng nguyên O8 Nghiên cứu huyết thanh học của 100 gia s c từ 92 trang tr i kết quả cho thấy sau 6-9 tháng có 34/100 gia s c có đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên K99 với hiệu giá cao gấp 4 lần so với đối chứng Kết

quả nghiên cứu của Janke và nnk (1989) cho thấy vi khuẩn E coli g y hội chứng tiêu

chảy ở bê chủ yếu đều cư tr ở đo n kết tràng ch ng g y ra các tổn thương đặc biệt bao gồm viêm kết tràng xuất huyết ở manh tràng Có đến 90% bê cảm nhiễm với vi

khuẩn E coli là sơ sinh tuổi trung bình bị cảm nhiễm là 11 8 ngày sau sinh khi đó

xuất hiện hiện rối lo n trao đổi nước và các chất điện giải g y ra tiêu chảy

1.1.2 Tại Việt Nam

Trên bê nghé có tới 70% - 80% tổn thất do bệnh tật là trong th i kỳ nu i dưỡng bằng sữa đầu và trong đó 80% - 90% là do tiêu chảy g y ra (Chí 1995) Sửu (2005) đã nghiên cứu t i các tỉnh miền n i phía ắc cho thấy có sự sai khác rõ rệt về số lượng vi

khuẩn E coli ở bê nghé tiêu chảy so với bê nghé kh ng tiêu chảy Nghiên cứu về vai tr của Salmonella và E coli trong hội chứng tiêu chảy của b bê cho thấy E coli và

Salmonella bội nhiễm với tỉ lệ cao số lượng E coli tăng gấp 3 lần Salmonella tăng

1 98 lần so với những con kh ng bị tiêu chảy (Quang 2004)

Nghiên cứu trên bê nu i t i các tỉnh miền n i phía ắc khi bị tiêu chảy có số

lượng E coli là 17,79 x 106

CFU/g ph n cao hơn so với 9 84 x 106 CFU/g ph n ở bê kh ng tiêu chảy (Sửu 2005) Trong khi đó Hiên và nnk (2001) nghiên cứu sự biến

động số lượng vi khuẩn E coli trong ph n bê tiêu chảy cho thấy số lượng E coli tăng

279% so với ph n bê bình thư ng Quang và nnk (2007) cho rằng khi bê nghé bị tiêu

chảy thì tỉ lệ ph n lập và số lượng Salmonella cũng cao hơn 1 87 lần so với ph n bình

thư ng trong đó tỉ lệ ph n lập 72 66% so với 47 11% số lượng vi khuẩn/gram ph n 2,80 x 106 CFU/gam so với 1 50 x 106 CFU/gram

Nghiên cứu của Thìn và nnk.(2009) cho biết khi kiểm tra 55 mẫu Salmonella với yếu tố x m nhiễm (InvA) và độc tố đư ng ruột (Stn) có tỉ lệ lần lượt là InvA 25/55 chủng chiếm tỉ lệ 45,45%; Stn 19/55 chủng chiếm tỉ lệ 34,55% Kiểm tra độc lực của

Salmonella cho thấy 8/10 mẫu có khả năng giết chết 100% chuột thí nghiệm 2/10 mẫu

giết chết 50% chuột thí nghiệm th i gian chết chuột là từ 12 đến 36 h

Hương và nnk (2008) đã ph n lập vi khuẩn từ mẫu ph n bê sữa bị tiêu chảy và bê bình thư ng t i thành phố Hồ Chí Minh và Đồng Nai cho thấy tất cả 103 mẫu ph n

bê được xét nghiệm đều nhiễm E coli Tuyên (1995), tỉ lệ nhiễm Salmonella trong hội

chứng tiêu chảy ở bê nghé t i các tỉnh phía ắc là 61 95% Khi nghiên cứu t i các tỉnh

Nam Trung ộ Quang (2004) cho rằng 40 54% b bê tiêu chảy là do Salmonella Ng n (2008) đã ph n lập được Salmonella trong 154/251 (61 35%) mẫu ph n bê tiêu

chảy Nghiên cứu của Quang và nnk (2006) cho thấy khi bê bị tiêu chảy thì số lượng

và tỉ lệ các mẫu vi khuẩn E coli, Salmonella ph n lập được mang các yếu tố g y bệnh

và sản sinh độc tố cao hơn so với bê kh ng bị tiêu chảy Điều này khẳng định vi khuẩn

E coli và Salmonella có vai tr đặc biệt quan trọng trong hội chứng tiêu chảy ở bê

1.2 Những nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy

Hội chứng tiêu chảy bê là một tình tr ng bệnh lý phổ biến đã và đang g y thiệt h i lớn cho ngành chăn nu i Hội chứng tiêu chảy g y chết với tỉ lệ thấp nhưng tác h i của nó làm biến đổi cấu tr c niêm m c ruột non dẫn đến giảm khả năng hấp thu thức ăn làm cho bê c i cọc tăng tiêu tốn thức ăn/1 kg tăng trọng Nguy hiểm hơn nguyên nh n của hội chứng tiêu chảy rất phức t p đã g y ra sự nhầm lẫn trong chẩn đoán và điều trị.Qua nhiều nghiên cứu cho thấy hội chứng tiêu chảy là một hiện tượng bệnh lý

ở đư ng tiêu hóa có liên quan đến rất nhiều các yếu tố có yếu tố là nguyên nh n nguyên phát có yếu tố là nguyên nh n thứ phát Xuất phát từ nguyên nh n hay triệu chứng l m sàng căn cứ vào đặc điểm th i gian hoặc tính chất của bệnh mà có các tên gọi khác nhau: Hội chứng tiêu chảy bệnh tiêu chảy kh ng nhiễm trùng bệnh tiêu chảy ở gia s c sơ sinh bệnh ph n sữa

Các nghiên cứu bệnh lý tiêu chảy ở gia s c cho thấy biểu hiện bệnh lý chủ yếu là mất nước và chất điện giải cuối cùng con vật bị tr ng độc kiệt sức và chết Vì vậy trong điều trị hội chứng tiêu chảy việc bổ sung nước và chất điện giải là yếu tố cần thiết

Đối với gia s c non tỉ lệ chết do hội chứng tiêu chảy tương đối cao Theo Chí (1995) hội chứng tiêu chảy làm cho bê nghé giảm khả năng sinh trưởng c i cọc tỉ lệ tử vong cao Theo Lương (1993) Thịnh (1985) Chí (1995) cho biết lợn bị tiêu chảy thư ng mất nước mất điện giải và kiệt sức Những gia s c khỏi bệnh thư ng c i cọc thiếu máu chậm lớn tỉ lệ nu i sống thấp.Đó cũng là nguyên nh n làm cho hiệu quả chăn nu i kh ng cao

Do điều kiện khí hậu nước ta thay đổi phức t p hội chứng tiêu chảy xảy ra quanh năm đặc biệt khi th i tiết thay đổi đột ngột l nh ẩm độ ẩm kh ng khí cao Theo T m (1987); Ninh (1993); T o và nnk (1993) ở nước ta tiêu chảy trên gia s c xảy ra quanh năm đặc biệt vào vụ đ ng xu n khi th i tiết thay đổi đột ngột và th i điểm chuyển mùa quanh năm

1.3 Nguyên nhân gây ra hội chứng tiêu chảy

Trong lịch sử nghiên cứu hội chứng tiêu chảy nhiều tác giả đã đưa ra kết quả cho thấy nguyên nh n g y hội chứng tiêu chảy rất phức t p và thậm chí c n khác nhau theo th i gian địa điểm và giai đo n phát triển của con vật Tuy nhiên hội chứng tiêu chảy là một bệnh lý ở đư ng tiêu hóa liên quan đến nhiều yếu tố: Có yếu tố là nguyên nh n nguyên phát có yếu tố là nguyên nh n thứ phát Vì vậy việc ph n biệt giữa các nguyên nh n g y ra tiêu chảy là rất khó khăn (Th ch 1996) Các nhà khoa học đã tổng hợp những nguyên nh n chính g y ra hội chứng tiêu chảy ở gia s c như sau:

1.3.1 Do vi sinh vật

1.3.1.1 Vi khuẩn

Nguyên nh n tiêu chảy do vi sinh vật là một trong những nguyên nh n phổ biến đã được nhiều nhà nghiên cứu chứng minh Trong đư ng ruột của gia s c có rất nhiều

lo i vi khuẩn như: E coli, Salmonella, Shigella, … khu tr ở d ng một hệ sinh thái Hệ

sinh thái vi sinh vật đư ng ruột ở tr ng thái c n bằng động theo hướng có lợi cho cơ thể vật chủ Ho t động sinh lý của gia s c chỉ diễn ra bình thư ng khi mà hệ sinh thái đư ng ruột lu n ở tr ng thái c n bằng Dưới tác động của các yếu tố g y bệnh tr ng thái c n bằng bị phá vỡ dẫn đến lo n khuẩn và hậu quả là gia s c bị tiêu chảy Nhiều tác giả nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy đã chứng minh: Khi gặp điều kiện thuận lợi những vi khuẩn thư ng gặp ở đư ng tiêu hóa sẽ tăng độc tính phát triển với số lượng

Ngữ và nnk (1979); Quang (2005) cho rằng do một số tác nh n nào đó tr ng thái c n bằng của hệ sinh thái đư ng ruột bị phá vỡ tất cả hoặc chỉ một lo i nào đó sinh sản lên quá nhiều sẽ sinh ra hiện tượng lo n khuẩn Lo n khuẩn đư ng ruột là nguyên nh n chủ yếu g y ra bệnh đư ng tiêu hóa và đặc biệt là hội chứng tiêu chảy

Nghiên cứu của V n (2007) cho thấy tr u bị tiêu chảy có tỉ lệ nhiễm Salmonella

cao hơn so với tr u bình thư ng tương ứng với tỉ lệ là 27,50% và 18,87% Theo Đ t và

nnk (1996), E coli chiếm tỉ lệ cao nhất (45 6%) trong số các vi khuẩn đư ng ruột g y tiêu chảy Trong khi vi khuẩn yếm khí Cl perfringens g y bệnh khi có điều kiện thuận

lợi và khi nó trở thành vai tr chính Nam và nnk (1997); Archie (2000) khẳng định rằng vi khuẩn đư ng ruột có vai tr kh ng thể thiếu được trong hội chứng tiêu chảy

Thành phần vi khuẩn trong ph n bê nghé bị tiêu chảy tập trung có 4 lo i chính: E coli,

Salmonella, Shigella, Klebsiella trong đó chủ yếu là E coli và Salmonella có tỉ lệ nhiễm

tương ứng là (72 48% và 51 32%) Nghiên cứu của Đ t & T m (1995) cho thấy tr u

nghé khỏe m nh có tỉ lệ nhiễm Salmonella từ 23 3%-30 07% nhưng trong trư ng hợp

tiêu chảy tỉ lệ này tăng lên 37 5% (ở tr u) và 71 43% (ở nghé)

Quang (2004) nghiên cứu vai tr của Salmonella và E coli trong hội chứng tiêu chảy của b bê cho thấy E coli và Salmonella bội nhiễm với tỉ lệ cao số lượng E

coli tăng gấp 3 lần Salmonella tăng 1 98 lần Sửu (2005) nghiên cứu ở ba tỉnh miền

n i phía ắc đã kết luận: Vi khuẩn E coli, Salmonella và Cl perfringens thấy ở bê

nghé bị tiêu chảy cao hơn bê nghé ở tr ng thái bình thư ng Minh & Ph (1999)

nghiên cứu về E coli và Salmonella g y tiêu chảy trên lợn cho biết tỉ lệ phát hiện E

coli độc trong ph n là 80 - 90% trong số mẫu xét nghiệm

Như vậy E coli, Salmonella, Clostridium perfringens là những vi khuẩn

thư ng gặp trong các lo i vi khuẩn g y tiêu chảy cho gia s c nói chung và bê nghé nói riêng

1.3.1.2 Virus

Virus cũng là một trong những nguyên nh n g y ra hội chứng tiêu chảy ở gia

s c Đã có nhiều nghiên cứu kết luận một số virus như: Rotavirus, TGE, Enterovirus,

Parvovirus, Adenovirus cũng có vai tr nhất định g y ra hội chứng tiêu chảy Virus là

tổn thương niêm m c đư ng tiêu hóa suy giảm sức đề kháng của cơ thể và g y tiêu chảy ở thể cấp tính

Virus TGE có sự liên hệ đặc biệt với các tế bào ruột non Khi x m nhập vào tế bào và phá hủy tế bào trong v ng đến 5 tiếng Trong đó sữa kh ng được tiêu hóa nước kh ng được hấp thu dẫn đến tiêu chảy mất dịch chất điện giải và con vật có thể bị chết

Rotavirus thư ng g y ra hội chứng tiêu chảy cho lợn b và ngư i Lợn con từ 1

đến 6 tuần tuổi thư ng hay mắc với các biểu hiện l m sàng kém ăn bỏ ăn tiêu chảy nhiều lần trong ngày gầy s t do mất nước và nằm bẹp ở một chỗ Giai đo n cuối con vật biểu hiện thiếu máu trụy tim m ch và chết Lecce và nnk.(1976) Nilson (1984) đã

xác định vai tr của Rotavirus trong hội chứng tiêu hóa ở lợn

1.3.1.3 Ký sinh trùng

Ký sinh trùng ký sinh trong đư ng tiêu hóa là một trong những nguyên nh n g y ra hội chứng tiêu chảy.Ngoài tác động lấy đi chất dinh dưỡng của vật chủ ký sinh trùng c n làm tổn thương niêm m c đư ng tiêu hóa Đ y là cơ hội cho các vi sinh vật có h i g y nhiễm trùng

Theo Th ch (1998) gia s c bị mắc bệnh do giun tr n g y ra có biểu hiện gầy yếu ăn uống kém da và niêm m c nhợt nh t do thiếu máu tiêu chảy ở mức độ trung bình kh ng liên tục Nguyễn Thị Kim Lan và nnk.(2006) các lo i ký sinh trùng g y

tiêu chảy cho tr u b thư ng gặp là Nematode, Strongyloides, Ascaris suum, Fasciola

hepatica Qua việc nghiên cứu tình hình nhiễm giun sán của tr u b : Theo kết quả của

Lăng và nnk (2006) có 16 lo i giun ký sinh trong đư ng tiêu hóa của tr u b ở Đắc Lắc trong đó có một 1 lo i ký sinh ở gan 11 lo i ở d cỏ 1 ở d m i khế 2 lo i ở ruột

non và 1 lo i ở ruột già Lo i g y tác h i nặng nhất là Fasciola sp ký sinh ở ống dẫn

mật làm rối lo n chức năng sinh lý của gan làm cho gia s c gầy yếu rối lo n tiêu hóa

Giun đũa Toxocara vitulorum thư ng g y tiêu chảy ph n trắng cho bê nghé non từ 1 đến 3 tháng tuổi Sán lá gan Fasciola gigantica trong quá trình ký sinh tiết

độc tố g y tiêu chảy cho bê non Ký sinh trùng thư ng là nguyên nh n tiền phát cho nhiễm trùng và tiêu chảy nặng ở bê (Lăng & T o 2002)

Theo Năm (2004) lợn con bê nghé nhiễm cầu trùng thư ng được chẩn đoán không chính xác nên 30-50% gia s c non bị chết số c n l i c i cọc và chậm lớn.Lăng

& T o (2002) cho biết: Giun đũa Ascaris suum trưởng thành cư tr ở ruột non g y

viêm niêm m c ruột g y loét niêm m c làm gia s c đau bụng và tiêu chảy

1.3.2 Do nguyên nhân khác

1.3.2.1 Thời tiết khí hậu

Ngo i cảnh là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sức đề kháng của cơ thể động vật nói chung và đối với vật nu i nói riêng đặc biệt là gia s c non Theo nghiên cứu Phước (1978); Đ t (1996) nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa th i tiết được chia làm 4 mùa rõ rệt trong mỗi mùa đều có sự biến đổi th i tiết nhiệt độ độ ẩm ánh sáng … và các thay đổi về chăm sóc nu i dưỡng Những sự thay đổi đó là điều kiện thuận lợi cho các mầm bệnh g y h i phát triển g y chết nhiều gia s c trong đó phổ biến là các bệnh về đư ng tiêu hóa

Trong các yếu tố th i tiết thì sự thay đổi về nhiệt độ và ẩm độ cao là hai yếu tố g y ảnh hưởng nhiều nhất tới sức khỏe đàn vật nu i L nh và ẩm g y rối lo n hệ thống điều h a th n nhiệt ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất làm giảm sức đề kháng khi đó hệ vi sinh vật đư ng tiêu hóa có điều kiện thuận lợi tăng số lượng độc lực và g y bệnh Các tác giả Niconxki (1986); Ninh (1993); Nam và nnk (1997) khi gia s c chịu l nh ẩm kéo dài hệ miễn dịch suy giảm do đó gia s c dễ bị vi khuẩn cư ng độc g y

thư ng và điều kiện chăm sóc nu i dưỡng ảnh hưởng trực tiếp đến cơ thể lợn nhất là cơ thể lợn con chưa phát triển hoàn chỉnh các phản ứng thích nghi c n yếu

1.3.2.2 Kỹ thuật chăm sóc nuôi dưỡng

Chăm sóc nu i dưỡng có vai tr hết sức quan trọng trong chăn nu i Việc thực hiện đ ng quy trình chăm sóc nu i dưỡng sẽ đem l i sức khỏe và sự tăng trưởng cho gia s c Khi chất lượng thức ăn thấp kém chuồng tr i kh ng đảm bảo kỹ thuật nu i chăm sóc kh ng phù hợp là nguyên nh n làm giảm sức đề kháng gia s c dễ mắc bệnh

Theo nghiên cứu Thịnh (1985); Nam và nnk (1997) khẩu phần ăn cho vật nu i kh ng thích hợp tr ng thái thức ăn kh ng tốt thức ăn kém chất lượng như: Mốc thối và nhiễm các t p chất các vi sinh vật có h i dẫn đến rối lo n tiêu hóa kèm theo viêm ruột tiêu chảy ở gia s c

Thay đổi thức ăn đột ngột đặc biệt là tăng hàm lượng đ m và chất béo thư ng làm cho bê nghé rối lo n tiêu hóa dẫn đến viêm ruột thức ăn thiếu các chất khoáng vitamin cần thiết cho cơ thể gia s c đồng th i phương thức cho ăn kh ng phù hợp sẽ làm giảm sức đề kháng của gia s c và t o cơ hội cho các vi khuẩn g y hội chứng tiêu chảy (Lăng & T o 2002)

Như vậy có thể nói hội chứng tiêu chảy của bê nghé là một hội chứng bệnh lý rất phức t p ở đư ng tiêu hóa do nhiều nguyên nh n nhiều yếu tố tác động Trong

ph m vi nghiên cứu của đề tài ch ng t i xin trình bày vai tr của vi khuẩn E coli,

Salmonella g y bệnh tiêu chảy trên đàn bê sữa

1.4 Vi khuẩn E coli và Salmonella 1.4.1 Vi khuẩn E coli

Vi khuẩn E coli được Theodor Escherich ph n lập năm 1885 từ ph n trẻ em E

coli thư ng xuất hiện rất sớm trong hệ tiêu hóa của ngư i và động vật sau khi được

sinh ra và tồn t i đến khi con vật chết Trong đư ng ruột động vật E coli chiếm

khoáng 80% tổng số các vi khuẩn hiếu khí

Các chủng vi khuẩn E coli thuộc nhiều serotype khác nhau Cho đến nay đã

phát hiện được 279 serotype trong đó có 25 serotype có độc lực và có vai tr quan trọng trong một số bệnh của gia s c

1.4.1.1 Đặc tính hình thái

Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia, loài coli là trực

khuẩn hình gậy ngắn kích thước 2 – 3 µm x 0 5 µm hai đầu tr n Trong cơ thể động vật vi khuẩn có hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ đ i khi xếp thành chuỗi ngắn Trong m i trư ng nu i cấy có khi quan sát thấy những trực khuẩn dài 4 – 8 µm và

thư ng gặp trong canh khuẩn già Phần lớn vi khuẩn E coli có khả năng di động do có

l ng roi và l ng xung quanh th n Vi khuẩn bắt màu Gram m có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu kh ng sinh nha bào và có thể có giáp m (Sơn 2002; Thanh và nnk., 1997)

1.4.1.2 Đặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn E coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện có thể sinh trưởng ở

phổ nhiệt độ khá rộng (5 - 400C) nhiệt độ thích hợp là 370C và cũng thích hợp với pH từ 7 2 - 7,4

Vi khuẩn E coli dễ dàng phát triển được trên m i trư ng nu i cấy th ng

thư ng một số chủng có thể phát triển ở m i trư ng tổng hợp nên ngư i ta chọn ch ng để nghiên cứu về sinh vật học Để ph n lập thư ng nu i cấy khởi đầu trên m i trư ng tuyển lựa như m i trư ng Istrati MacConkey Endo desoxycholate,

Trên m i trư ng th ch thư ng ở 35 – 37 o

C sau 12 - 18 gi hình thành khuẩn l c tr n lồi kh ng trong suốt bóng láng.Nu i l u khuẩn l c có màu n u nh t và mọc rộng ra có thể quan sát thấy cả khuẩn l c d ng R (Rough) và d ng M (Mucous)

Trên m i trư ng th ch máu sau 24 gi nu i cấy ở 37oC hình thành khuẩn l c to ướt lồi viền kh ng gọn màu sáng đa số chủng kh ng g y dung huyết nhưng cũng có chủng dung huyết

Trên m i trư ng nước thịt sau 24 gi nu i cấy ở 37oC vi khuẩn phát triển rất nhanh m i trư ng đục có cặn màu tro trắng lắng xuống đ i khi có váng xám nh t trên mặt m i trư ng

Trên m i trư ng MacConkey sau 24 gi nu i cấy ở 37oC khuẩn l c có màu cánh sen tr n nhỏ hơi lồi kh ng nhầy rìa gọn kh ng làm chuyển màu m i trư ng (Thanh và nnk., 1997)

Trên m i trư ng EM (Eosin Methylene lue):Sau 24 gi nu i cấy ở 37o

C, vi khuẩn hình thành những khuẩn l c màu tím đen có ánh kim

Trên m i trư ng th ch SS: E coli phát triển thành các khuẩn l c có màu đỏ

Trên m i trư ng th ch rilliant Green Agar: Sau 24 gi nu i cấy ở 37oC, vi

khuẩn E coli hình thành khuẩn l c d ng S (Smooth) màu vàng chanh

Trên m i trư ng Endo: Sau 24 gi nu i cấy ở 37oC vi khuẩn hình thành khuẩn l c màu đỏ mận chín có hoặc kh ng có ánh kim

1.4.1.3 Đặc tính sinh hóa

E coli có phản ứng indol dương tính methyl red (MR) dương tính Voges

Proskauer (VP) m tính phản ứng sử dụng citrate m tính phản ứng sinh H2S âm tính, di động dương tính,lysine decarboxylase dương tính lên men lactose và mannitol (Sơn 2002)

Phản ứng lên men đư ng: Vi khuẩn E coli lên men sinh hơi các lo i đư ng

lactose, fructose, glucose, levulose, galactose, xylose, mannitol Hầu hết các chủng vi

khuẩn E coli đều lên men đư ng lactose nhanh và sinh hơi

Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E coli (TCVN 8400-16:2011)

Phản ứng sinh hóa Biểu hiện

Cũng như các lo i vi khuẩn kh ng sinh nha bào khác E coli kh ng chịu được

nhiệt độ đun 50oC trong 1 gi 60oC trong 30 phút, và 100oC vi khuẩn chết ngay Các chất sát trùng th ng thư ng: axit phenic, biclorua thủy ng n formol (0 2%) diệt vi

khuẩn sau 5 ph t Ở m i trư ng bên ngoài các chủng E coli độc tố có thể tồn t i đến 4 tháng.Vi khuẩn E coli có khả năng đề kháng với sự sấy kh và hun khói Trong đất và nước E coli sống được khoảng vài tháng Ch ng có độ nh y cảm cao với nhiều lo i

kháng sinh (Đ t và nnk 1995)

1.4.1.5 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E coli

Cấu tr c kháng nguyên của vi khuẩn E coli g y bệnh trên gia s c rất đa d ng

và phức t p với 4 nhóm kháng nguyên chính là các kháng nguyên O (kháng nguyên th n) chịu nhiệt kháng nguyên H (kháng nguyên l ng) kh ng chịu nhiệt kháng nguyên K (kháng nguyên giáp m ) và kháng nguyên F (kháng nguyên bám dính) chịu nhiệt ở mức độ trung gian Sự đa d ng về tính kháng nguyên này g y rất nhiều khó khăn cho c ng tác ph ng chống bệnh trên gia s c (Sơn 2002)

Kháng nguyên O (xuất phát từ chữ Ohne Hauch - kh ng có màng hơi) là các hợp chất lipopolysaccharide có trong thành phần vách tế bào là chất g y sốt rất độc đối với động vật chịu nhiệt (100 oC hơn 2 gi ) kh ng bị ethanol 50% phá hủy nhưng bị formol 0 5% làm biến tính Các kháng nguyên th n đều nằm trên bề mặt nên có thể tiếp x c với hệ thống miễn dịch của cơ thể động vật trừ một số trư ng hợp bị kháng nguyên bề mặt che lấp Khi trộn kháng nguyên th n với kháng thể tương ứng thì xuất hiện phản ứng ngưng kết gọi là ngưng kết O: Th n tế bào vi khuẩn dính với nhau hình thành những h t nhỏ lắc rất khó tan huyền dịch vi khuẩn trong

Kháng nguyên H (xuất phát từ chữ Hauch - màng hơi) là những ph n tử protein flagellin gần giống myosin trong cơ của động vật kh ng chịu nhiệt dễ bị ethanol 50% và enzyme proteinase phá hủy nhưng bảo tồn trong formol 0 5% Khi gặp kháng thể tương ứng kháng nguyên H hình thành ngưng kết gọi là phản ứng lên b ng do các tế bào vi khuẩn dính nhau gián tiếp qua các l ng roi nên hình thành các khối nhỏ kh ng bền dễ vỡ khi lắc

Kháng nguyên K (xuất phát từ chữ Kapsule - vỏ bọc) là kháng nguyên bao bọc th n vi khuẩn Tuy gọi là kháng nguyên vỏ bọc nhưng về mặt hình thái học l i có nguồn gốc từ những hợp chất có trên bề mặt tế bào chứ kh ng phải trong thành phần của vỏ nhầy Điều đáng ch ý là những kháng nguyên này ức chế phản ứng ngưng kết O rất m nh vì vậy khi thí nghiệm với các kháng thể O phải rất lưu ý Hiện nay ngư i ta phát hiện được rằng bản chất của nhiều kháng nguyên K là các sợi l ng nhung (hay Fimbria) có thuộc tính gi p vi khuẩn bám dính nên ngư i ta gọi các kháng nguyên nhóm này là kháng nguyên F (F antigen từ chữ Fimbria - lông nhung), là kháng nguyên bám dính hay yếu tố bám dính (Adhesin) vì vậy xuất hiện các ký hiệu F1 F2 … (Sơn 2013)

Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae - kháng nguyên bám dính): Hầu hết

các chủng E coli g y bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính

Các chủng kh ng g y bệnh thì kh ng có kháng nguyên bám dính Kháng nguyên bám dính gi p vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu m ruột và trên lớp màng nhầy để x m nhập và g y bệnh đồng th i chống l i khả năng đào thải vi

khuẩn của nhu động ruột Một số lo i kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E coli thuộc nhóm ETEC (EnterotoxigenicE coli) g y bệnh chủ yếu cho lợn là F4 F18 và

F41 (Carter và nnk.,1995)

Thìn và nnk (2011) cũng đã tách chiết thành c ng kháng nguyên bám dính F4

F18 từ mẫu vi khuẩn E coli GIS 26 và F107/86 bằng phương pháp phá vỡ cơ học kết

hợp với ly t m và kết tủa Tác giả cho thấy nồng độ kháng nguyên sau chiết tách đ t 0 68 mg/ml (kháng nguyên F4) và 0 46 mg/ml (kháng nguyên F18) Điện di sản phẩm trên th ch SDS - polyacrylamide cho thấy chỉ có 1 v ch với trọng lượng ph n tử 26 kDa đối với kháng nguyên F4 và 1 v ch với 15 kDa đối với kháng nguyên F18

1.4.1.6 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli

Các nh n tố g y bệnh ở vi khuẩn họ này gồm có tính kết bám (adhesiveness) hay bám dính vào niêm m c ký chủ khả năng x m nhập (invasiveness) khả năng sản sinh các độc tố ruột độc tố g y chết khả năng dung huyết khả năng kháng khuẩn Những đặc tính này hoặc bị chi phối bởi các gen trên nhiễm sắc thể vi khuẩn hoặc bởi

các plasmid và thực khuẩn thể (bacteriophage) Các chủng vi khuẩn E coli không có

các yếu tố trên thì kh ng có khả năng g y bệnh

Dựa vào các yếu tố g y bệnh nói trên ngƣ i ta đã ph n lo i vi khuẩn E coli

thành các lo i sau (Sơn 2006)

E coli g y bệnh nguyên đƣ ng ruột (enteropathogenic E coli - EPEC) thuộc

vào một nhóm huyết thanh học riêng biệt có tính kết bám (bám dính)

E coli x m lấn đƣ ng ruột (enteroinvasive E coli - EIEC) có khả năng x m

nhập đƣ ng ruột do plasmid chi phối

E coli độc tố nguyên đƣ ng ruột (enterotoxigenic E coli - ETEC) có năng lực

hình thành các kháng nguyên l ng F2 (tên cũ CFA/I) F3 (CFA/II) F4 (K88) F5 (K99) F6 (987P) và các độc tố ruột (enterotoxin) do plasmid chi phối

E coli sinh độc tố tế bào vero (verocytotoxin - producing E coli - VTEC) hay E coli xuất huyết ruột (enterohemorrhagic E coli - EHEC) có năng lực sản sinh độc tố

vero g y độc tế bào do bacteriophage chi phối

Tất cả các vi khuẩn trên đều g y bệnh cục bộ Ngoài ra đ i khi E coli xâm

nhập kết bám và phát bệnh ở các cơ quan khác nhau ngoài đƣ ng ruột (Sơn 2006) Trong đó các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC và VTEC thƣ ng g y bệnh tiêu chảy cho lợn con sơ sinh và lợn sau cai sữa (Fairbrother, 1992)

● Yếu tố bám dính của E coli

Là một trong những yếu tố quan trọng của vi khuẩn đƣ ng ruột gi p vi khuẩn bám đƣợc vào tế bào vật chủ yếu tố bám dính c n gọi là kháng nguyên bám dính Khi vi khuẩn cƣ tr trong đƣ ng tiêu hóa trong quá trình di động xảy ra hiện tƣợng tiếp x c giữa vi khuẩn và tế bào nhung mao ruột Sự tiếp x c này là tình c và ngẫu nhiên nếu gặp điều kiện thuận lợi trên bề mặt tế bào niêm m c ruột thì sự tiếp x c này sẽ tăng tính bền vững và vi khuẩn sẽ ở l i l u trong lớp nhầy Tiếp theo là sự tiếp x c và sự hấp phụ của vi khuẩn lên bề mặt niêm m c ruột và yếu tố bám dính (Fimbriae type I) của vi khuẩn sẽ bám vào điểm tiếp nhận của tế bào nhung mao Quá trình bám dính của vi khuẩn lên tế bào nhung mao đƣợc thực hiện có sự phù hợp giữa cấu tr c ph n tử

điểm tiếp cận (Nagy & Fekete, 1999)

Trong trƣ ng hợp kh ng thể bám dính vi khuẩn sẽ bị bài khứ khỏi tổ chức bởi lớp dày niêm dịch và thể dịch Sau khi bám dính vi khuẩn hình thành khuẩn l c nhỏ và bắt đầu giai đo n tiếp theo của quá trình cảm nhiễm Trên bề mặt của tế bào cũng

như bề mặt vi khuẩn có những ph n tử bề mặt phản ứng tương bổ một cách đặc hiệu (Sơn 2006) Các chủng ETEC đều có mang 1 hoặc nhiều yếu tố bám dính như F4(K88), F5(K99), F6 (K987p), F17, F18, F41, F42 và F165

● Yếu tố xâm nhập của E coli

Là một khái niệm dùng để chỉ quá trình chưa được xác định một cách rõ ràng mà

nh đó vi khuẩn E coli qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy (mucosa) trên bề

mặt niêm m c để x m nhập vào tế bào biểu m (Epithel) đồng th i sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này Trong khi đó những vi khuẩn khác kh ng có khả năng x m nhập không thể qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua được hàng rào này sẽ bị giữ l i bởi tế bào đ i thực bào của tổ chức h niêm m c (Giannella, 1976)

Tính x m nhập được chi phối bởi một gen duy nhất của nhiễm sắc thể và độc lập với những gen cần thiết cho việc phát huy tính g y bệnh của vi khuẩn do plasmid chi phối (Sơn 2006)

● Yếu tố dung huyết (Hly) của E coli

Vi khuẩn đư ng ruột phát triển trong tổ chức cơ quan sắt được cung cấp cho sự dinh dưỡng phụ thuộc vào chất Siderophore do vi khuẩn sản sinh ra chất này có khả năng ph n huỷ sắt liên kết trong tổ chức vật chủ th ng qua sự phá vỡ hồng cầu giải phóng sắt dưới d ng hợp chất HEM để vi khuẩn sử dụng Sự ph n huỷ hồng cầu chủ yếu vẫn là do hemolysis của vi khuẩn đảm nhiệm vì vậy việc sản sinh ra hemolysis g y dung huyết của vi khuẩn có thể coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn Có bốn

kiểu dung huyết của E coli (α- haemolysin β- haemolysin γ- haemolysin và €-

haemolysin ) nhưng quan trọng nhất là kiểu α và β Kiểu β phá vỡ hồng cầu hoàn toàn vì vậy hình thành một v ng sáng xung quanh khuẩn l c trong suốt và rộng Kiểu α phá vỡ hồng cầu kh ng hoàn toàn do đó v ng dung huyết m nh t hơn (Quinn, 1994 )

Một số tài liệu đã chứng minh được rằng mức độ g y chết của hemolysin trên chuột trên ph i trứng g y ho i tử trên da thỏ trên tế bào sơ ph i gà tế bào thận chuột Khối lượng ph n tử của hemolysin khoảng 300.000 Dalton được cấu t o chủ yếu là protein và c n có cả hydratcacbon (Cavalieri & Snyder 1982) Quá trình tổng hợp và giải phóng hemolyzin phải tiến hành đồng th i hai quá trình:

Quá trình thứ nhất: Giải phóng hemolyzin đã tổng hợp qua màng rồi tập hợp

thành những t i nhỏ trong khoảng trống của màng cytoplasm ngo i vi quá trình này cần năng lượng

Quá trình thứ hai: Xảy ra kh ng cần năng lượng nhưng phụ thuộc vào nhiệt độ

là quá trình giải phóng hemolyzin qua màng

● Yếu tố kháng khuẩn Colicin V của E coli (ColV)

Nhiều chủng vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn có tác

dụng ức chế hoặc tiêu diệt các lo i vi khuẩn khác gọi là Colicin V Vì vậy yếu tố

này cũng được coi là một trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E coli (Smith &

Halls, 1967)

● Tính kháng thuốc kháng sinh của E coli

Sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh là một trong những biện pháp quan trọng nhất để làm giảm tỉ lệ chết ở gia s c Tuy nhiên trong những năm gần đ y vi khuẩn có khả năng kháng l i với một hoặc nhiều lo i kháng sinh đặc biệt là đối với những lo i kháng

sinh được sử dụng rộng rãi trong chăn nu i và th y (Pritchard & nnk., 2003).

Việc sử dụng nhiều kháng sinh kh ng những t o áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn g y bệnh mà c n ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong đư ng tiêu hóa làm cho vi khuẩn trở nên đề kháng với kháng sinh

Cơ chế tác động của kháng sinh:

Theo Sơn (2006) kháng sinh là những lo i thuốc có khả năng ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật Kháng sinh tác động vào các enzyme (bản chất là protein) làm nhiệm vụ x c tác quá trình trao đổi chất của vi khuẩn làm gián đo n quá trình đó của vi khuẩn Nói chung mỗi lo i kháng sinh tác động vào một hay vài lo i vi khuẩn khác nhau và tác động một trong các cơ chế sau:

- Ngừng tổng hợp màng vi khuẩn: Các kháng sinh có tác dụng ngăn trở sự hình thành Murein (một thành phần cấu t o của vi khuẩn) nên màng ngoài của vi khuẩn kh ng được tổng hợp điển hình gồm có kháng sinh: Penicilline cycloserine, bacitracin,

- Tác động vào màng vi khuẩn làm rối lo n tính thấm hoặc phá vỡ màng tế bào: Các chất kháng sinh tác động làm thay đổi cấu tr c của màng tế bào vi khuẩn do đó quá trình trao đổi chất của vi khuẩn bị ức chế điển hình gồm có: Polimycine nystatin

- Làm rối lo n ức chế quá trình tổng hợp protein: Một số kháng sinh trong nhóm này như tetracycline ph n bố các men tổng hợp protein hay ngăn trở sự dẫn truyền th ng tin của ADN đến ribôxôm, làm ngăn trở quá trình tổng hợp protein Đa số các lo i kháng sinh c n l i đều g y rối lo n cơ chế h hấp ở mức ph n tử t o phức kh ng tan với ADN làm tổn thương màng và các lo i nucleotide có khi làm rối lo n protein

- Làm ức chế tổng hợp axit nucleic của nh n vi khuẩn: Kháng sinh tác động trực tiếp vào quá trình tổng hợp axit nucleic của nh n t o phức bền vững với ADN của vi khuẩn Những kháng sinh này rất độc đối với cơ thể sống chỉ sử dụng khi cần thiết

Hosoda và nnk (1990) đã nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn E coli và

các plasmid - R của vi khuẩn này ph n lập được từ bê tiêu chảy Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ kháng với tetracyclin là 59,7%, chloramphenicol là 21%, streptomycin 52,9%, sulfadimethoxine 37,8%, kanamycin 45,4%, penicillin 43,7% và nalidixic axit 28 6% Có tới 53 7% số chủng kháng thuốc mang các plasmid - R

Theo Hiếu & Tho (1996) tính kháng thuốc của vi khuẩn E coli với một số

kháng sinh thư ng tăng lên rất nhanh một số thuốc có hiệu quả trước đ y với vi khuẩn

E coli hầu như kh ng có tác dụng như: gentamicin streptomycin … và tỉ lệ các chủng E coli kháng nhiều lo i kháng sinh phát triển nhanh có chủng kháng hết các lo i

kháng sinh thư ng dùng

Vi khuẩn E coli ở các lo i gia s c khác nhau cho tỉ lệ kháng thuốc khác nhau: Tỉ lệ chủng E coli ph n lập từ tr u b kháng sulfamid là 23,08 - 33 33% Hiếu & Tho

(1999) đã ph n lập chủng kháng l i 11 lo i kháng sinh đồng th i chứng minh khả

năng di truyền tính kháng thuốc giữa vi khuẩn E coli và Salmonella di truyền plasmid

E coli ph n lập từ lợn con ph n trắng tỉ lệ kháng sulfonamide lên đến 89 97%

Theo kết quả xác định tỉ lệ kháng kháng sinh và các yếu tố g y bệnh của vi khuẩn

E coli ph n lập từ lợn con theo mẹ của Nhiên và nnk (2000) hiện tượng kháng cùng

một l c nhiều lo i kháng sinh là phổ biến trong số các chủng E coli Hầu hết các chủng

đều có tỉ lệ kháng cao với tetracycline amoxicillin streptomycin chloramphenicol (từ 76,42 – 97 17%) Trong khi đó phần lớn các mẫu đều mẫn cảm với các lo i kháng sinh như: amikacin apramycin và ceftiofur với các tỉ lệ tương ứng là 92 45%; 99 06% và 100% Các tác giả cũng cho biết chỉ có 58 49% số mẫu mẫn cảm với Aminoglycosides và 47 17% số mẫu mẫn cảm với neomycin Enrofloxacin là một lo i kháng sinh thuộc thế hệ mới thuộc nhóm Quinolon nhưng có tới 44 34% số mẫu kháng Theo Ph c

(2003) vi khuẩn E coli ph n lập ở Thái Nguyên có tính mẫn cảm khác nhau đối với

ofloxacin norfloxacin và amikacin (với tỉ lệ 100%), gentamicin (88,4%), neomycin (84,6%), kanamycin (66,15%), erythromycin (13,84%) và ampicillin (11,53%)

Quang (2004) ph n lập E coli từ b bê tiêu chảy có khả năng kháng l i các lo i

kháng sinh ampicillin (với tỉ lệ 91,66%), erythromycin (58,33%), rifamycin (33,33%),

trismulfa (25%) và cefotaxime (16 66%) Sửu (2005) đã xác định vi khuẩn E coli

ph n lập từ bê nghé bị tiêu chảy mẫn cảm m nh erythromycin (83 33%) số mẫu nghiên cứu

Quang và nnk (2006) cho rằng khả năng mẫn cảm của E coli ph n lập từ bê

nghé bị tiêu chảy với norfloxacin là 83 33% số mẫu colistin (83,33%) và neomycin (58,33%) Tỉ lệ kháng với ampicillin (83,33%), kanamycin và lincomycin là 66,66%

Nghiên cứu của Nhiên và nnk (2000) cho thấy hầu hết các mẫu vi khuẩn E

coli ph n lập được từ gia s c tiêu chảy có khả năng kháng l i với nhiều lo i kháng sinh

như: chloramphenicol sulfadimethoxine tetracycline

Như vậy có thể thấy qua th i gian và ở các địa điểm khác nhau tính kháng

kháng sinh của vi khuẩn E coli g y bệnh cũng khác nhau

● Độc tố của E coli

Vi khuẩn E coli bám dính vào niêm m c ruột sản sinh ra độc tố đư ng ruột

được xem là một khả năng đặc biệt quan trọng của vi khuẩn E coli Ch ng t o ra hai

lo i độc tố: Nội độc tố và ngo i độc tố (Đ t và nnk 1995)

- Ngoại độc tố: Là những độc tố được vi sinh vật tiết ra bên ngoài tế bào Về

bản chất ngo i độc tố là các protein có ph n tử khối cao có thể g y chết với liều lượng rất nhỏ ch ng dễ bị nhiệt phá hủy ở 56ºC trong v ng 10 - 30 phút

Ngo i độc tố có tính hướng thần kinh và g y ho i tử.Hiện nay việc chiết xuất ngo i độc tố chưa thành c ng mà chỉ có thể phát hiện trong canh trùng của những mẫu ph n lập được Khả năng t o độc tố sẽ mất đi khi các mẫu được lưu giữ l u dài hay được cấy chuyển nhiều lần trên m i trư ng dinh dưỡng (Đ t và nnk 1995)

- Nội độc tố: Là phức chất lipopolysaccharide của vách tế bào vi khuẩn Gram

m bài xuất ra m i trư ng khi tế bào bị dung giải Các chất này chịu nhiệt và có thể chiết xuất bằng phenol (Sơn 2006)

Ngoài ra chúng c n được chiết xuất bằng các phương pháp khác như: Phá vỡ vỏ tế bào bằng cơ học; chiết xuất bằng axit trichloracetic dưới tác dụng của enzyme Nội độc tố được coi là kháng nguyên hoàn toàn và có tính đặc hiệu cao đối với các mẫu của mỗi serotype

Nhóm độc tố đư ng ruột (Enterotoxin): Gồm hai lo i Độc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin - ST):

Độc tố này chịu được xử lý ở nhiệt độ 100oC trong v ng 15 ph t Độc ST chia thành 2 nhóm là: STa và STb dựa trên tính hoà tan trong Methanol và ho t tính sinh

học Cả STa và STb đều có vai tr quan trọng trong việc g y tiêu chảy của các mẫu E

coli g y bệnh ở bê nghé dê cừu lợn con và trẻ sơ sinh

Độc tố kh ng chịu nhiệt (Heat Labile Toxin - LT):

Độc tố này bị v ho t ở nhiệt độ 60ºC trong v ng 15 ph t.LT cũng có hai nhóm phụ LT1 và LT2 nhưng chỉ có LT1 bị trung h a bởi Anti - cholera toxin.LT là một trong những yếu tố quan trọng g y triệu chứng tiêu chảy (Fairbrother, 1992).Cả 2 lo i độc tố ST và LT đều bền vững ở nhiệt độ m thậm chí cả ở nhiệt độ -20ºC

Nhóm độc tố tế bào (Shiga/Verotoxin):

Konowalchuk & nnk (1977) đã phát hiện một lo i độc tố ho t động trong m i trư ng nu i cấy tế bào Vero (nên ch ng được đặt tên là độc tố tế bào Vero) được sản

sinh bởi vi khuẩn E coli g y bệnh tiêu chảy ở ngư i tiêu chảy và bệnh phù đầu ở lợn

con Ảnh hưởng g y bệnh ở tế bào của độc tố Vero rất khác so với ảnh hưởng của độc

tố đư ng ruột kh ng chịu nhiệt cổ điển ở nhóm vi khuẩn E coli g y bệnh đư ng ruột

(ETEC) Độc tố Vero (VTs) hay Shiga (SLTs) là thuật ngữ được sử dụng trước đ y Gần đ y các nhà khoa học đã đề nghị sử dụng tên độc tố Shiga (Stx) cho tất cả những

độc tố tế bào này Stx sản sinh bởi E coli bao gồm 2 nhóm: Stx1và Stx2

Ph và nnk (2000) đã ph n lập được khoảng 60 mẫu E coli trong đó 42 mẫu g y dung huyết trên th ch máu chiếm tỉ lệ 70% có 6 mẫu E coli sản sinh ra cả hai lo i độc tố ST và LT các mẫu E coli mẫn cảm cao nhất với các lo i kháng sinh: nitro

furazolidon (85%), neomycin (80%), sulfonamid (75%)

Theo a và nnk (2012) khi tiến hành xác định một số độc tố Shiga trên 34

mẫu vi khuẩn E coli có 27 mẫu (79 41%) mang gene của độc tố stx1 và 29 mẫu (85 35%) mang gene của độc tố stx2 trong đó có 22 mẫu (64 71%) mang cả 2 gene của độc tố stx1 và stx2 L m và nnk (2014) kết quả nghiên cứu cho thấy trong 118 mẫu STEC có 52 mẫu mang gene Stx1, 58 mâu mang gene Stx2 8 mẫu mang đồng th i 2 gene Stx1 và Stx2 6 mẫu mang gene Eae

1.4.1.7 Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E coli

Vi khuẩn E coli có khả năng g y bệnh cho tất cả các lo i động vật máu nóng Vi khuẩn E coli tồn t i bình thư ng trong ống đư ng tiêu hóa của gia s c gia cầm Dưới ảnh hưởng của một số yếu tố nhất định các mẫu của vi khuẩn E coli có độc lực g y

bệnh liên quan đến tình tr ng tiêu chảy và nhiễm trùng huyết ở gia s c non hoặc g y bệnh h hấp ở gia cầm Các mẫu khác kh ng g y tiêu chảy có thể trở thành căn bệnh khi

điều kiện thuận lợi Vi khuẩn E coli có thể g y bệnh được là do nhiều yếu tố như: Khả

năng bám dính khả năng x m nhập các lo i kháng nguyên yếu tố dung huyết yếu tố kháng khuẩn khả năng kháng kháng sinh và độc tố Nhưng quan trọng nhất là 2 yếu tố độc lực chính: Kháng nguyên bám dính (fimbriae) và độc tố đư ng ruột

Theo Gyles & Thoen (1992) các giai đo n x m nhập và g y bệnh của vi khuẩn

E coli bao gồm:

- X m nhập vào ruột non

- Tăng nhanh số lượng bám dính trên tế bào biểu m niêm m c ruột non

Sản sinh độc tố đư ng ruột tác động lên màng tế bào biểu m niêm m c ruột non của vật chủ dẫn đến quá trình của bệnh lý

Giai đoạn 1:Vi khuẩn x m nhập vào đư ng tiêu hóa vi khuẩn vượt qua hàng

rào bảo vệ ở bề mặt tế bào biểu m đư ng ruột Để x m nhập vi khuẩn phải t o ra chất độc chống l i tế bào thực bào từ đó mới có thể tồn t i và sản sinh phát triển trong tế bào niêm m c ruột của vật chủ Tuy nhiên các yếu tố đề kháng kh ng đặc hiệu của vật chủ như: Dịch vị d dày khả năng nhu động của ruột non dịch nhầy lysozyme và

hệ vi khuẩn có ích trong đư ng ruột làm giảm khả năng kết dính của vi khuẩn E coli với tế bào biểu m ruột bằng cách che phủ các receptor đặc hiệu đối với E coli

Giai đoạn 2: Vi khuẩn tấn c ng vào tế bào biểu m ruột sau khi bám vào

receptor đặc hiệu vi khuẩn E coli g y nên những biến đổi bề mặt tế bào biểu m l ng

nhung sau đó vi khuẩn x m nhập vào bên trong tế bào biểu m nhung mao ruột Vi khuẩn có khả năng nh n lên trong tế bào rồi lan sang các tế bào bên c nh Ho t động

của tế bào thực bào và khả năng vi khuẩn sống sót nh n lên trong tế bào thực bào là yếu tố quyết định trong quá trình sinh bệnh Khi vi khuẩn cư tr bên trong tế bào có

thể tránh được tác động của kháng sinh kháng thể và bổ thể Để tồn t i vi khuẩn E

coli phải chống l i một lo t các yếu tố bất lợi bên trong tế bào thực bào các hợp chất

trung gian của quá trình chuyển hóa pH thấp tình tr ng thiếu sắt

Nh vào quá trình ho t động của phagosome và lysosome ch ng g y biến đổi biểu m ruột qua tác động g y thoái hóa ho i tử tế bào.Vi khuẩn c n phá hủy tế bào tiểu cầu g y lắng đọng Fibrin dẫn đến tổn thương thành m ch Đồng th i vi khuẩn tập trung vào mảng payer thành ruột g y biến đổi bệnh lý t i đ y

Giai đoạn 3: Kích thích bài xuất dịch thể phản ứng viêm đối với quá trình x m

nhập tế bào ruột non của vi khuẩn g y ra là một yếu tố quan trọng kích thích g y bài xuất dịch thể Prostaglandin được giải phóng trong quá trình viêm đã ho t hóa Adenylate Cyclase.Enzym này x c tác chuyển hóa ATP thành AMP v ng AMP v ng nội bào tăng dần dẫn đến quá trình bài xuất Na+

, Cl- và nước ra khỏi tế bào khoang ruột Nước và khí t o ra trong quá trình lên men dưới tác động của vi khuẩn làm ruột căng lên kích thích thần kinh thực vật ở ruột t o nên những cơn nhu động ruột m nh

đẩy nước và ph n ra ngoài Từ tế bào niêm m c ruột vi khuẩn E coli x m nhập vào hệ

thống h ch màng treo ruột vào hệ tuần hoàn dẫn đến nhiễm trùng huyết Trong máu,

vi khuẩn E coli tiếp tục nh n lên sản sinh yếu tố dung huyết phá vỡ hồng cầu g y

thiếu máu tăng tính thấm thành m ch nước từ trong mao quản thẩm xuất ra tích tụ trong các m bào g y phù Theo máu vi khuẩn đến các cơ quan nội t ng sản sinh độc tố phá hủy tế bào tăng tính thấm thành m ch sản sinh độc tố thần kinh phá hủy tế bào thần kinh G y các thể bệnh tr ng thái bệnh và mức độ bệnh khác nhau Song song với quá trình trên các sản phẩm của quá trình viêm cũng đóng vai tr quan trọng trong quá trình kích thích và bài xuất dịch thể từ tế bào dẫn đến bê nghé bị tiêu chảy

1.4.1.8 Tiêu chảy do vi khuẩn E coli gây ra trên bê, nghé

Vi khuẩn E coli là nguyên nh n quan trọng g y bệnh tiêu chảy cho gia s c nói

chung và gia s c non nói riêng Ở gia s c non như bê nghé dê cừu lợn … ngoài g y

ra tiêu chảy vi khuẩn E coli c n g y ra các triệu chứng khác và g y tử vong rất cao

như: i huyết xuất huyết nhiễm trùng huyết… với bê nghé khi mắc hội chứng tiêu

chảy do vi khuẩn E coli g y ra thư ng xuất hiện các triệu chứng bệnh tích đặc trưng

dễ nhầm với các nguyên nh n g y bệnh khác

Triệu chứng

Triệu chứng thư ng gặp là sốt và tiêu chảy Khi sốt con vật kh ng b nằm một chỗ ủ rũ l ng xù mũi kh l đ ít vận động Sau một ngày ph n lỏng dần màu vàng hay trắng xám có khi có bọt có thể có máu.Ph n chua và rất thối có thể vọt cần c u; bụng căng hậu m n bết ph n Gia s c đau bụng rặn nhiều thích nằm đứng dậy miễn cưỡng nhịp tim nhanh và yếu tần số h hấp tăng cao sau đó yếu dần th n nhiệt h xuống dưới mức bình thư ng ch n l nh hốc há mắt lõm và chết nhanh

Th i gian ủ bệnh phụ thuộc vào số lượng và độc tố của vi khuẩn E coli hay sức

đề kháng của con vật Trung bình kéo dài 4-8 ngày bệnh thư ng có ở 2 thể:

Thể cấp tính: bệnh tiến triển kh ng thể quá 5-10 ngày nếu con vật kh ng chết thì th i kỳ phục hồi dài bê khỏi bệnh phát triển c i cọc

Thể mãn tính: ệnh kéo dài hàng tuần hàng tháng và có đặc điểm như: Viêm phổi viêm khớp có khi bệnh tiến triển kh ng thể thấy được

Theo L n & Lăng (1997) bệnh chủ yếu xảy ra ở bê nghé non sau khi mắc bệnh con vật bị tiêu chảy lỏng đầu tiên có ph n sền sệt sau tiêu chảy nặng ph n chỉ là dịch màu xám xanh xám vàng và có mùi tanh ê nghé tiêu chảy nặng có thể 10-15 lần/ngày mất nước rất nhanh làm cho con vật rối lo n điện giải trong máu và chết trong tình tr ng mất nước Trư ng hợp nặng ruột xuất huyết nên ph n có lẫn máu và niêm m c ruột lầy nhầy ê non thư ng chết sau 3-4 ngày với tỉ lệ cao 30-40% nếu kh ng kịp th i điều trị

Theo Lăng & T o (2002) thì việc chẩn đoán bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E coli

g y ra rất phức t p bởi vì những triệu chứng bệnh tích xuất hiện tương tự như hội chứng tiêu chảy do những nguyên nh n vi khuẩn khác các lo i đơn bào hay virus

Hơn nữa vi khuẩn E coli g y bệnh thư ng kết hợp với các mầm bệnh khác Việc nu i

cấy ph n lập từ ph n bê nghé bị bệnh cũng rất dễ dàng nhưng phải tiến hành xem có

phải vi khuẩn E coli g y bệnh hay E coli cộng sinh Vì vậy sau khi ph n lập vi khuẩn

E coli cần phải xác định các yếu tố g y bệnh như: K99 Enterotoxin đồng th i xác

định thêm các lo i mầm bệnh khác như Rotavirus, Coronavirus, Salmonella nhưng cũng có thể căn cứ vào pH của ph n Nếu tiêu chảy do vi khuẩn E coli thư ng pH của

ph n nghiêng về bazơ (pH>7)

Phòng bệnh

Cho b đầy đủ sữa đầu đảm bảo vệ sinh chuồng tr i dụng cụ chăn nu i m i

trư ng s ch kh ng bị nhiễm khuẩn vi khuẩn E coli Tránh các yếu tố stress như mưa l nh đột ngột Trước đ y một số nước dùng vắc xin E coli tiêm cho tr u b chửa để

t o miễn dịch qua sữa đầu nhưng hiệu quả miễn dịch c n có nhiều ý kiến khác nhau Gần đ y bằng kỹ thuật sinh học ph n tử đã chế t o vắc xin chứa các lo i kháng nguyên K99 Enterotoxin d ng tinh khiết tiêm cho tr u b chửa vào th i gian 6 và 3 tuần trước

khi đẻ Kết quả cho thấy bê sinh ra từ b được tiêm vắc xin tỉ lệ bảo hộ 100% và bê sinh ra từ b kh ng được tiêm vắc xin tỉ lệ bảo hộ 10% (Lăng & T o 2002)

Theo Ph c (2003) dựa trên cơ sở ph n lập vi khuẩn E coli ở bê nghé bị tiêu

chảy chọn các mẫu độc lực m nh mang đầy đủ các yếu tố g y bệnh đã kiểm chứng qua thực nghiệm để sản xuất auto vắc xin ph ng bệnh Tiêm 3ml/con cho bê nghé từ 1-12 tháng tuổi hiệu lực bảo hộ được 64%

Theo Quang (2004) dùng vi khuẩn E coli đã được chọn từ các mẫu ph n lập

từ b bê bị tiêu chảy để sản xuất kháng thể từ l ng đỏ trứng gà thử nghiệm cho uống với liều 25 ml/10 kg thể trọng 3 lần ngày thì sau 3-5 ngày điều trị khỏi 100% bê bị tiêu chảy

Điều trị bệnh

Dùng các lo i kháng sinh theo đư ng miệng (uống trộn vào thức ăn) và đư ng tiêm Trước khi dùng kháng sinh điều trị đánh giá khả năng kháng kháng sinh ổ sung nước và các chất điện giải các yếu tố vi lượng bị mất c n bằng bằng cách cho uống hoặc truyền dung dịch nước muối sinh lý 0 9% dung dịch nước đư ng ưu trương 20% uống dung dịch oresol Có thể dùng dung dịch nước muối sinh lý với 5% dextran truyền 250ml vào tĩnh m ch Ngoài ra chống viêm bằng dexamethason; kết hợp với các lo i vitamin K C 1 để chống xuất huyết đư ng tiêu hóa và n ng cao sức đề kháng cho bê nghé (Lăng & T o 2002)

Ph c (2003) dùng 3 lo i kháng sinh: norfloxacin gentamycin và neomycin kết hợp với bổ sung chất điện giải nước sinh lý chống độc cho bê nghé cho kết quả tốt

Sửu (2005) dùng các thuốc kháng sinh norfloxacin kanamycin kết hợp với sử dụng chất điện giải là oresol và thuốc làm se niêm m c ruột chất trợ lực và bổ sung

các vitamin sẽ n ng cao hiệu quả điều trị bệnh tiêu chảy do nhiễm vi khuẩn E coli

1.4.2.Vi khuẩn Salmonella

Năm 1885 vi khuẩn Salmonella lần đầu tiên được phát hiện bởi Salmon và

Smith khi ph n lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm lợn tiêu chảy và xem đ y là nguyên nh n g y ra bệnh dịch tả lợn Đến năm 1903 các nhà khoa học đã xác định được

nguyên nh n g y ra bệnh dịch tả lợn là do virus và cho rằng Salmonella chỉ có vai tr

kế phát (Thanh và nnk 2001)

1.4.2.1 Đặc tính chung của Salmonella

Trực khuẩn Salmonella thuộc bộ Eubacteriales họ Enterobacteriaceae Giống

Salmonella gồm 2 loài: S enterica và S bongori đã được ph n chia thành trên 2000

serotype theo bảng ph n lo i Kauffmann-White trên cơ sở cấu tr c của kháng nguyên th n O kháng nguyên l ng H và đ i khi kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K) Gần đ y

loài S enterica đã được ph n thành 6 ph n lo i đó là: S enterica subsp enterica, S

enterica subsp salamae, S enterica subsp arizonae, S enterica subsp diarizonae, S

enterica subsp houtenae, S enterica subsp indica.Trong đó ph n lo i S enterica subsp enterica gồm phần lớn các mẫu Salmonella là những tác nh n g y bệnh cho

ngư i và động vật (Quinn &., 2002)

● Đặc điểm về hình thái

Theo ergey's (1994) vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn ngắn hai đầu

tr n có kích thước 0 4 - 0,6 × 0,1 - 0 3 µm bắt màu Gram m kh ng hình thành nha

bào và giáp m Đa số loài Salmonella có l ng (flagella) từ 7 - 12 chiếc xung quanh th n (trừ S gallinarum-pullorum)

L ng gi p cho vi khuẩn có khả năng di động L ng có hình tr n dài xuất phát từ màng cytoplasm Do cấu tr c từ các sợi protein hình xoắn nên có thể co giãn và di động nên l ng của ch ng rất khó nhuộm Nếu nhuộm bằng phương pháp Hazchem (1972) thì có thể nhìn thấy ch ng dưới kính hiển vi điện tử (T o 1993) L ng có tính kháng nguyên và do các gen mã hóa tổng hợp protein riêng quy định

Hầu hết các chủng Salmonella đều có khả năng di động nh flagella d ng l ng rung ngo i trừ S gallinarum Trước kia ngư i ta cho rằng S pullorum cũng kh ng có

khả năng di động Nh kính hiển vi điện tử cấu tr c roi của type huyết thanh này cũng

được phát hiện là d ng sợi rất mảnh và có số lượng ít hơn flagella của S enteritidis Các chủng Salmonella đều có Fimbriae (Pili hay l ng nhung ) trừ S paratyphi A

Fimbriae có cấu t o d ng l ng bao phủ trên bề mặt vi khuẩn gi p cho vi khuẩn bám dính vào tế bào chủ Fimbriae được t o thành từ các dưới đơn vị fibrillin chứa lượng lớn amino acid kị nước (40%) (Huyền & Thành 2009)

● Đặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn Salmonella là lo i vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí

tùy tiện dễ nu i cấy Nhiệt độ thích hợp là 37ºC nhưng có thể phát triển được ở nhiệt

độ từ 6 - 42ºC.Nu i cấy ở 43ºC có thể lo i trừ được t p khuẩn mà Salmonella vẫn phát

triển được (Timoney& nnk., 1988) pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 6 - 7, tuy

nhiên vi khuẩn có thể phát triển được ở pH từ 6 - 9

Khi nu i cấy vi khuẩn trên m t trư ng bồi dưỡng (tăng sinh) PW ( uffered Peptone Water) và m i trư ng RV (Rappaport Vassiliadis) sau vài gi nu i cấy thấy m i trư ng vởn đục nhẹ sau 18 đến 24 gi thấy canh trùng đục đều trên mặt m i trư ng có màng mỏng đáy ống nghiệm có cặn

Trên m i trư ng SA ( ismuth Sulfite Agar): Sau 48 gi nu i cấy ở 370

C, vi

khuẩn Salmonella mọc lên những khuẩn l c đặc trưng xung quanh khuẩn l c màu n u

thẫm càng vào giữa khuẩn l c càng đậm chuyển dần sang màu đen khuẩn l c có màu

ánh kim (Thanhvà nnk., 2001)

Trên m i trư ng th ch thư ng vi khuẩn mọc thành khuẩn l c d ng S (Smooth) tr n trong sáng hoặc xám nhẵn bóng rìa gọn hơi lồi ở giữa đư ng kính khoảng từ 1

- 1 5 mm thỉnh thoảng có thể thấy khuẩn l c d ng R (rough) nhám mặt trong m M i trư ng th ch máu vi khuẩn mọc thành khuẩn l c tr n màu xám trơn bóng ở

giữa hơi lồi lên (Thanh và nnk.,2001)

Trên m i trư ng MacConkey (MCK) vi khuẩn mọc thành khuẩn l c tr n kh ng

màu Trên m i trư ng BSA, Salmonella mọc những khuẩn l c đặc trưng: Xung quanh

màu n u sẫm vào giữa màu vàng đậm gần đen khuẩn l c có màu ánh kim (Timoney và nnk., 1988)

Vi khuẩn Salmonella thể hiện tính kiềm hình thành khuẩn l c màu đỏ trên m i

trư ng GA Trong m i trư ng TSI hình thành khuẩn l c nh t màu mặt nghiêng m i trư ng có màu đỏ màu hồng ở đáy cùng sản sinh H2S làm cho m i trư ng chuyển màu đen (Quinn, 1994)

Trên m i trư ng SS (Shigella - Salmonella Agar): Salmonella hình thành

những khuẩn l c tr n bóng có t m đen ở giữa

Trên m i trư ng Kligler: Mặt nghiêng m i trư ng kh ng đổi màu do vi khuẩn kh ng lên men đư ng lactose phần th ch đứng m i trư ng đổi từ màu đỏ tím sang màu vàng chanh xen kẽ trong th ch có các bọt khí do vi khuẩn lên men đư ng glucose làm thay đổi pH của m i trư ng và sinh hơi Trong thực tế do vi khuẩn sinh H2S, nên phần th ch đứng có màu đen nền màu vàng thư ng bị lấn át khó quan sát được bằng mắt thư ng

Nhiệt độ nu i cấy pH m i trư ng và nồng độ muối liên quan chặt chẽ đến sự

phát triển của vi khuẩn Salmonella Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 37ºC Tuy nhiên Salmonella cũng mọc tốt ở nhiệt độ 42ºC.Đặc tính này ứng dụng trong ph n lập Salmonella nhằm ức chế vi khuẩn khác trong bệnh phẩm bị

nhiễm M i trư ng có pH 6 5 - 7 5 là thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn

(Thanh 1990) Tuy vậy Salmonella có thể phát triển được ở pH từ 4 5 - 9 0 Nồng độ muối NaCl 3 - 4% trong m i trư ng có thể ức chế sự phát triển của Salmonella

● Đặc tính sinh hóa

Theo Quinn (2002) giống vi khuẩn Salmonella được chia làm 7 ph n nhóm

mỗi ph n nhóm có khả năng lên men một số lo i đư ng nhất định và kh ng đổi Phần

lớn ph n loài Salmonella enterica subsp enterica g y bệnh cho động vật máu nóng

Ch ng lên men và sinh hơi: glucose manit mantose galactose dulcitol arabinose

sorbitol Cũng ở nhóm này hầu như các chủng Salmonella đều kh ng lên men lactose

và saccharose

Vi khuẩn Salmonella có phản ứng indol m tính MR m tính VP m tính sử

dụng citrat dương tính di động lysine decarboxylase dương tính adonit m tính lên men manit thư ng kh ng lên men lactose saccharose trừ một số ngo i lệ d ng huyết thanh d ng sinh học nhất định (Sơn 2002)

Bảng 1.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella

Phản ứng sinh hóa Biểu hiện

Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với nhiệt độ và các chất sát trùng m nh Ở nhiệt

độ 50ºC trong 1 gi 70ºC trong 20 ph t 100ºC trong 15 ph t hoặc ánh sáng mặt tr i chiếu thẳng trong 5 gi có thể diệt được vi khuẩn

Các chất sát trùng th ng thư ng dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn như: phenol 5% formol 1/500 diệt vi khuẩn trong 15 - 20 phút

Với hóa chất Salmonella tỏ ra có sức chịu đựng cao: Dung dịch MgCl2 1%,

formon 0 2% axit phenic 3% diệt Salmonella trong 15 - 20 ph t Dung dịch muối ăn 19% ở nhiệt độ 8ºC Salmonella tồn t i 4 - 8 tháng Nhưng đối với một số hóa chất như

Cristal violet Malachite Natriumthiosulfat Dixitrat muối mật với những nồng độ vừa

đủ g y độc cho E coli thì kh ng ảnh hưởng đến sự phát triển của Salmonella.Dựa vào

tính chất này ngư i ta chế t o những m i trư ng chọn lọc để kìm hãm sự phát triển của

E coli và giúp cho Salmonella phát triển dễ dàng

Vi khuẩn Salmonella sống được l u trong điều kiện l nh ch ng có thể sống

trong bột thịt 8 tháng nhưng điều kiện m i trư ng pH ≤ 5 ch ng chỉ sống được trong th i gian ngắn

Salmonella chủ yếu ký sinh trong ống tiêu hóa của con ngư i và động vật

Ngoài ra vi khuẩn này c n tìm thấy trong nước thải sinh ho t nước s ng các nguồn nước khác và đất Ch ng có khả năng sống rất l u trong nước (hàng tháng) và trong đất (hàng năm) ( ảng 1.3)

Bảng 1.3.Thời gian sống của Salmonella trong các loại môi trường

28 tháng Ph n của các loài thuộc họ chim

Nguồn: Huyền & Thành (2009)

Vi khuẩn Salmonella tồn t i trong chất độn chuồng tới trên 30 tuần có thể sống

ở độ s u trong đất tới độ s u 0 5 cm trong th i gian 2 tháng Ở sàn gỗ tư ng gỗ trong

điều kiện ít ánh sáng là 87 ngày máng gỗ 108 ngày (Đ t và nnk 1995) Salmonella có

thể sống trong thịt ướp muối (29%) được 4 - 8 tháng ở nhiệt độ từ 6 - 12ºC Xử lý

miếng thịt nhiễm trùng bằng hơ lửa hay nướng ít có tác dụng diệt Salmonella ở bên

trong (Thanh và nnk 1997)

1.4.2.3 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella

Cấu tr c kháng nguyên của Salmonella hết sức phức t p gồm rất nhiều lo i Theo Sơn (2002) Salmonella có hơn 67 lo i kháng nguyên O (có nhiều tài liệu c ng

bố hơn 80 lo i) 94 lo i kháng nguyên H pha 1 hơn 11 kháng nguyên H pha 2 kháng nguyên K là kháng nguyên Vi Cần ph n biệt 3 lo i kháng nguyên của Vi khuẩn

Salmonella là:

- Kháng nguyên O (O-Antigen): kháng nguyên thân - Kháng nguyên H (H-Antigen): kháng nguyên lông - Kháng nguyên K (K-Antigen): kháng nguyên vỏ

● Kháng nguyên thân O (O - Antigen)

Kháng nguyên O nằm ở thành tế bào vi khuẩn có cấu tr c Lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chính cấu t o nên lớp màng ngoài của thành tế bào vi khuẩn Gram m Kháng nguyên O chịu nhiệt (Heat-stable) và kháng cồn bị biến tính khi sử dụng formaldehyde Kháng nguyên O gồm 2 nhóm chính:

Polysaccharide kh ng có nhóm hydro kh ng mang tính đặc trƣng của kháng nguyên và sự chỉ t o sự khác biệt về hình thái khuẩn l c từ d ng S (Smooth) sang d ng R (Rough) và dẫn đến giảm độc lực của vi khuẩn (Selbitz & nnk., 1995)

Polysaccharide nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết định kháng nguyên và đặc trƣng của serotype

Kháng nguyên O đƣợc xem nhƣ một nội độc tố (Endotoxin) mà nó đƣợc cấu t o bởi nhóm hỗn hợp Glyco-polypeptid có thể tìm thấy ở màng ngoài của vỏ bọc vi khuẩn

● Kháng nguyên lông H (H-Antigen)

Kháng nguyên H của Salmonella bản chất là một protein nằm trong phần l ng

của vi khuẩn Là kháng nguyên kh ng chịu nhiệt rất kém bền vững so với kháng nguyên O; bị phá huỷ ở 60ºC trong 1 gi dễ bị phá hủy bởi cồn và axit yếu

Kháng nguyên H kh ng có ý nghĩa trong việc t o ra miễn dịch ph ng bệnh nhƣng có ý nghĩa trong việc ph n lo i định danh vi khuẩn

Kháng nguyên H kh ng quyết định yếu tố độc lực kh ng có vai tr bám dính nhƣng có tác dụng bảo vệ vi khuẩn đƣ ng ruột tránh sự tiêu diệt của đ i thực bào gi p vi khuẩn sống và nh n lên trong tế bào gan thận và ngay cả trong đ i thực bào

(Weinstein và nnk., 1984)

Kháng nguyên H chia làm 2 pha: Pha 1 có tính chất đặc hiệu gồm có 28 kháng nguyên l ng đƣợc biểu thị bằng chữ la tinh thƣ ng: a b c d f g nếu hết cả 28 chữ thì ngƣ i ta sử dụng chữ f và số đứng bên phải chữ f Ví dụ f5 f27

Pha 2 kh ng có tính chất đặc hiệu gồm có 6 lo i đƣợc biểu thị bằng chữ số Ả rập: 1 2 3 4 5 6 Pha 1 và pha 2 đƣợc biểu thị bởi H1 và H2 đƣợc kiểm tra bởi một phát động H2 (Promoter H2) nh sự phát động này mà có thể chuyển ngƣợc l i một mặt th c đẩy H2 và ức chế H1 hoặc H2 bị ức chế c n H1 l i ho t động (Kneckner &

thị bằng các chữ cái A L nh các đặc điểm sinh hoá khác nhau (Chữ K bắt nguồn từ chữ Kapsel trong tiếng Đức)

KN - 5 dễ bị axit HCl phá hủy và tính chất ngưng kết của KN - 5 hoàn toàn bị phá hủy ở nhiệt độ 120ºC nhưng kh ng bị phá hủy bởi cồn

KN - Vi có sức đề kháng cao với cồn và axit HCl KN - Vi không liên quan gì đến độc lực của vi khuẩn nhưng đóng vai tr chính trong việc t o miễn dịch chủ động và thụ động ở động vật và ngư i

1.4.2.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella

Để thực hiện quá trình g y bệnh đối với vật chủ Salmonella sử dụng các yếu tố

kh ng phải là độc tố như một số kháng nguyên (O K H) khả năng bám dính, xâm nhập tổng hợp sắt kháng kháng sinh Các yếu tố là độc tố như độc tố đư ng ruột (Enterotoxin) nội độc tố (Endotoxin)

● Các yếu tố không phải là độc tố

Kháng nguyên O: Chất lượng thành phần hóa học cấu tr c kháng nguyên O đều

ảnh hưởng tới độc lực của vi khuẩn Salmonella Kháng nguyên O là yếu tố độc lực

gi p vi khuẩn chống l i khả năng ph ng vệ của vật chủ gi p vi khuẩn phát triển trong

tổ chức chống l i sự thực bào của đ i thực bào (Morris & nnk., 1976) Kháng nguyên

O kích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng Cơ chế ph ng vệ này gi p cơ thể vật chủ chống l i quá trình tái x m nhập vi khuẩn

Kháng nguyên H: Kháng nguyên H kh ng có ý nghĩa trong việc t o ra miễn

dịch ph ng bệnh cũng kh ng quyết định yếu tố độc lực tuy vậy nó có vai tr bảo vệ cho vi khuẩn kh ng bị tiêu diệt bởi quá trình thực bào gi p vi khuẩn sống và nh n lên trong tế bào đ i thực bào cũng như trong tế bào gan và thận (Weinstein& nnk., 1984)

Kháng nguyên K: T o hàng rào bảo vệ gi p vi khuẩn chống l i ngo i cảnh và

hiện tượng thực bào (Thanh 2001)

Yếu tố bám dính: Là một trong những yếu tố quan trọng của vi khuẩn đư ng

ruột gi p vi khuẩn bám được vào tế bào vật chủ yếu tố bám dính c n là kháng nguyên bám dính Khi vi khuẩn cư tr trong đư ng tiêu hóa trong quá trình di động xảy ra hiện tượng tiếp x c giữa vi khuẩn và tế bào nhung mao ruột Sự tiếp x c này là tình c và ngẫu nhiên nếu gặp điều kiện thuận lợi trên bề mặt tế bào niêm m c ruột thì sự tiếp x c này sẽ tăng tính bền vững và vi khuẩn sẽ ở l i l u trong lớp nhầy Tiếp theo sự tiếp x c là sự hấp phụ vi khuẩn lên bề mặt niêm m c ruột và yếu tố bám dính (Fimbriae type I) của vi khuẩn sẽ bám vào điểm tiếp nhận của tế bào nhung mao Quá trình bám dính của vi khuẩn lên tế bào nhung mao được thực hiện có sự phù hợp giữa cấu tr c ph n tử của điểm tiếp cận (Jones và Richardson, 1981) Theo T o (1993) trên

mỗi tế bào vi khuẩn Salmonella có từ 250-400 fimbriae ch ng gi p vi khuẩn bám dính

vào tế bào nhung mao ruột non để g y bệnh

Khả năng xâm nhập: Vi khuẩn x m nhập được vào trong tế bào biểu m ruột là

bước cần thiết của quy trình g y bệnh Sự x m nhập của Salmonella vào tế bào biểu

m ruột là một quá trình tổng hợp gồm nhiều yếu tố tham gia

Theo Finlay & Falkow (1988) khả năng x m nhập vào tế bào có nh n hoặc lớp

niêm m c của đư ng ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella có độc lực Các biến chủng Salmonella không có khả năng x m nhập vào tế bào thư ng là các chủng

bào vi khuẩn dưới d ng các kh ng bào chứa vi khuẩn Sau đó Salmonella được x m

nhập vào trong tế bào tồn t i tiếp tục phát triển nh n lên với số lượng lớn và phá vỡ tế bào vật chủ sản sinh enterotoxin làm xuất hiện quá trình tiêu chảy của vật chủ Các h ch viêm tích nước biểu hiện viêm h ch có thể là hệ quả của đáp ứng x m nhiễm của

Salmonella (Frost& nnk., 1997)

Khả năng tổng hợp sắt: Theo enjamin và nnk (1985) đ y là một yếu tố gi p

vi khuẩn Salmonella tăng nhanh về số lượng làm suy yếu khả năng chống đỡ của vật chủ do bị thiếu sắt Cũng theo tác giả vi khuẩn Salmonella có phản ứng với sự thay

đổi cơ chế chu chuyển sắt; khi quá trình tổng hợp sắt bị ức chế ch ng sẽ chuyển toàn bộ protein màng điều phối sắt lên bề mặt của tế bào vi khuẩn làm cho khả năng hấp thu sắt tăng cư ng một cách rõ rệt

Khả năng kháng kháng sinh của Salmonella có thể thay đổi phụ thuộc vào địa

phương và th i điểm làm kháng sinh đồ lo i vật nu i

● Các yếu tố là độc tố

Nếu như các yếu tố g y bệnh kh ng phải là độc tố là những tác nh n gián tiếp

quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella thì các yếu tố là độc tố

l i là tác nh n trực tiếp quyết định quá trình sinh bệnh Các yếu tố g y bệnh là độc tố

của Salmonella bao gồm: Nội độc tố (Endotoxin) ngo i độc tố đư ng ruột

(Enterotoxin) và độc tố tế bào (Cytotoxin) (Finlay & Falkow, 1988)