Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên Huế

Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên Huế

TỔNG QUANTÀILIỆU

GIỚI THIỆU CHUNG VỀSÂMCAU

Cây Sâm cau (Curculigo orchioidesGaertn.) thuộc chi Cồ Nốc (Curculigo) Trước đây, chiCurculigoxếp vào họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) [11], nhưng hiện nay được xếp vào họ Tỏi voi lùn (hay còn gọi là họ Hạ trâm, Hypoxidaceae), Bộ Măng tây (Asparagale) [195], [260].

Hình 1.1 Cây (A) và rễ củ (B) của Sâm cau ( Curculigo orchioides Gaertn.) [46], [195] 1.1.2 Đặcđiểm của họHypoxidaceae

Hypoxidaceae là một họ thực vật hạt kín, gồm có 9 chi và khoảng 220 loài, chủ yếu phân bố tại các khu vực thuộc Nam Bán cầu, vùng nhiệt đới chấu Á và Bắc Mỹ[224].TạiViệtNamcó2chilàchiCồnốc(Curculigo)vàchiHạtrâm(Hypoxis) với khoảng 10 loài [260] Các loài thực vật thuộc họ này đều có đặc điểm chung là cây thảo, rễ củ hoặc rễ củ dạng củ Lá hình lưỡi mác mọc từ gốc giống như lá cau non, có gân song song và nổi rõ Hoa mọc thành cụm hoa, và được mọc từ gốc Hoa thuộc mẫu 3, bầu dưới Noãn nhiều đính thành 2 hàng trên giá noãn trụ giữa Hạt có mỏ nhỏ ở bên [46],[260].

Hệ thống phân loại học thực vật của Anh cũng mô tả các đặc điểm của thực vật thuộc họ Hypoxidaceae bản địa là những loại thảo mộc lâu năm có lá giống cỏ mọc từ thân ngầm Các lá nguyên vẹn, có gân song song, không có răng và có lông trắng Cụm hoa được mọc trên một cuống không có lá Hoa có 6 đài hoa, có hình dạngđốixứngtỏatrònvàcómàuvàng;cácláđàiđínhphíatrênbầunhụy(tứclàbầu nhụyởdưới)vàcólôngởmặtngoài/mặtdướicó6nhị.Quảcóhìnhdạngnhưlàmột viên nang khô Các loài trong họ này trước đây được coi là thuộc về Liliaceae Hiện nay ở Anh quốc, họ Hypoxidaceae chỉ có 1 chi và 1 loài trong khu vực [224],[259].

ChiCurculigotrên thế giới có khoảng hơn 20 loài Theo Phạm Hoàng Hộ (2003),chiCurculigoởViệtNamhiệncó7loài[11].TheocôngbốcủaLãĐìnhMỡi vàcs(2005) [22]vàcơsởdữliệucậpnhậttrênTrungtâmdữliệuthựcvậtViệtNam

[260],hiệnnaychiCurculigoởViệtNamgồmcó9loài:C.annamiticaGagnep.(tên tiếngViệt:CồNốcTrungbộ),C.capitulata(Lour.)O.Kuntze(têntiếngViệt:CồNốc hoa đầu, Sâm cau lá dừa; tên khác:Leucoium capitulataLour.;Curculigo recurvataDryan.),C.disticha(Gagnep.)(têntiếngViệt:CồNốcsongđính),C.gracilis(Kurz) Wall ex Hook.f (tên tiếng Việt: Cồ Nốc mảnh, Lòng thuyền; tên khác:MolinieragracilisKurz),C latifoliaDryand ex Ait (tên tiếng Việt: Cồ Nốc lá rộng, Sâm cau lá rộng),Curculigo orchioidesGaertn (tên tiếng Việt: Cồ Nốc lan, Sâm cau, Ngải cau, Nam sáng ton, Soọng ca, Thài léng),C sinensisS.C Chen, C. tonkinensisGagnep (tên tiếng Việt: Cồ Nốc Bắc bộ),C conocGagnep (tên tiếng

C crassifolia(Baker) (tên tiếng Việt: Cỏ lá dừa trắng).

ChiCurculigocó nguồn gốc từ Ấn Độ và có thể tìm thấy nhiều nơi trên thế giới,phânbốởđộcaolêntới2.300msovớimựcnướcbiển,đặcbiệtởcácvùngnúi đá vôi Các loài thực vật thuộc chiCurculigolà loài cây thân thảo, sống lâu năm, thường có thân rễ dạng củ.

Lá dẹt có gốc bẹ, thường có phủ lông Cụm hoa mọc gần gốc Hoa màu vàng, có bầu nhụy ẩn trong bẹ lá; bao hoa, nhụy và bao phấn nhô cao lênphíatrênbầunhụytrênmộtốnghẹpthondài(ốngbaohoa).Quảnangcóhạtmàu đen, bóng [11] Thực vật thuộc chiCurculigochứa thành phần các chất chuyển hoá thứ cấp đa dạng và phong phú với nhiều hoạt tính sinh học Vì vậy,Curculigođược sử dụng trong y dược học nhằm giúp điều hoà miễn dịch, loại bỏ các gốc tự do và chống oxy hoá, điều chỉnh vị giác, chống viêm [34], [37]; kích thích tình dục, điều chỉnhhànhvitìnhdụcvàhormonesinhdục[50],[58],[200];bảovệthầnkinh[250]; chống loãng xương; chống viêm; chống khối u [233]; ổn định tế bào mast và kháng histamin [214]; cũng như hoạt tính chống đái tháo đường[114].

1.1.4 Đặcđiểm thực vật học của Sâmcau

Trong dân gian Sâm cau còn được gọi với nhiều tên khác nhau, nhưKali

MusalihaySiyah Muslitheo hệ thống y học Ayurvedic [102], [125], [181] hoặc Cồ nốc lan, Ngải cau, Nam sáng ton, Soọng ca, Thài léng, Tiên mao, Ngãi sâm, Cỏ mắt vàng,

… [11],[27],[260].Sâmcaulàmộtloàithảomộc,sốnglâunăm,thânngầmcănhànhhình trụ, cao

3 - 10 cm, mọc thẳng hoặc hơi cong queo, hai đầu thót lại, mang nhiều rễ phụ [3],đườngkính0,6-1,2cm.Mặtngoàirễcủcóvỏthômàunâuhoặcnâuđen,cócáclỗ sẹo rễ con và nhiều vết nhăn ngang, bên trong có nạc màu vàng ngà Chất cứng vàgiòn, dễ bẻ gãy, mặt gãy không phẳng, màu nâu nhạt tới nâu hoặc nâu đen ở giữa Mùi thơm nhẹ, vị đắng và cay Lá (10 - 45 × 0,5 - 3,5 cm) mọc thành đám ở thân ngắn với các bẹ láởgốc,xếpnếptựanhưláCau,dài20-50cm,rộng2,5- 3,0cm;phiếnlácóhìnhmũi mác hẹp có gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn gần như cùng màu, gân song song rấtrõ; bẹ lá to và dài, cuống lá có thể dài đến 10 cm [11], [46],[125].

Sâm cau có hoa quanh năm, hoa màu vàng nhạt, lưỡng tính Phát hoa ở mặt đất, cụm hoa nằm trên một trục ngắn và mảnh giữa các bẹ lá, gồm 3 - 5 hoa; baohoa nằm trên một phần kéo dài của bầu hình thoi có lông rậm kéo dài thành mỏ Lá bắc hình trái xoan nhọn, lá đài 3 có lọng dài ở lưng; tràng 3 cánh nhẵn; nhị 6 xếp thành hai dãy, chỉ nhị ngắn; đầu nhụy hình trái xoan, chia 3 nhánh mập Noãn nhiều trên mỗi ô, đường kính 2 mm, đầu nhụy 3, thuỳ dài ra Quả nang, thuôn, dài 1,2 - 2,0cm, rộng 8 mm, chứa 1 - 4 hạt [11], [65], [181], có khi lên đến 8 hạt [46], [192], [195] Hạt màu đen, hình cầu, đường kính 1-2 mm, ở đầu hơi phình còn phía dưới có một phầnphụhìnhliềm,cómỏ,khoétsâuthànhcácđườnglượnsóng[3],[192].Câysinh trưởng tốt trong mùa mưa ẩm, mùa hoa quả từ tháng 5 - 7[3].

Curculigolà một chi thực vật có hoa trong họ Hypoxidaceae, được mô tả lần đầu tiên vào năm 1788 Nó phổ biến trên khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Á,châu Phi, châu Úc và châu Mỹ trong các khu rừng râm mát [94], [111].TrongchiCurculigothìloàiCurculigoorchioidesGaertn.(2n6)làmộtloạithuốc quan trọng trong hệ thống y học Ayurvedic và Unani, được sử dụng dưới tên “KaliMusli”và “Siyah Musl i” Cáccâynày được phâ nbốở Ra jas tha n, ẤnĐ ộ, Trung

Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Philippines, Indonesia, Pakistan, Papua New Guinea, …[63], [260] và xuất hiện rộng rãi ở vùng cận nhiệt đới Himalaya [181] Ở nước ta,Curculigo orchioidesGaertn (hay còn gọi là Sâm cau đen, Ngải cau, Tiên mao,…), phân bố rải rác ở các khu vực ẩm ướt tại các vùng núi như Lai Châu, Tuyên Quang, Sơn La, Cao Bằng, Lạng Sơn, Ba Vì, Hòa Bình, Ninh Bình, Hà Nam, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, KonTum, Lâm Đồng, Bà Rịa-Vũng Tàu [7],[11].

CâySâmcauthườngphânbốtrênnềnđấtẩmvenrừng,nhấtlàcácvùngrừng đá vôi hoặc trên nương rẫy của Việt Nam, nơi có độ cao lên tới 1.500 m [1] Ở Java, có thể gặp Sâm cau trên các đồng cỏ trảng nắng hoặc dưới bóng che nhẹ, tại những khu vực có một mùa khô hạn hoặc dưới tán các rừng Tếch, ở độ cao 400 m so với mực nước biển [22] Ở vùng núi cận nhiệt đới của miền Trung dãy Himalaya có thể thấySâmcauphânbốtrongcáckhurừngthưa,nhưnghiếmgặptrongrừngrậmởđộ cao 2.250 m đến2.300 m so với mực nước biển [32], [102], [138] Sâm cau được xemlàloàicâybảnđịacủaẤnĐộvàxuấthiệnrộngrãinhiềukhuvựckhácnhưvùng Mahabharat (Nepal),Khasia Hills, Assam, Arunachal, Manipur, Bengal; Western Ghats từ Konkan về phía nam-BangMaharashtra, Kanara, Nilghiris, Madras đến Cape Comorin, Tích Lan, Trung Quốc, Nhật Bản vàNepal, … [51],[192].

MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐADẠNGDITRUYỀN

Thuật ngữ DNA mã vạch (DNA-barcoding, DNA barcode) lần đầu tiên được Arnot và cs sử dụng vào năm 1993 trong một bài báo mà không nhận được sự chú ý nhiềutừcộngđồngkhoahọc.Đếnnăm2002,thôngquanghiêncứucủaHebertvàcs phản ánh mối quan hệ gần gũi của 200 loài sinh vật thuộc bộ cánh vảy với độ chính xác 100% bằng cách sử dụng gene ty thể cytochrome-c oxidase tiểu đơn vị I (COI), DNA mã vạch bắt đầu có tầm ảnh hưởng lớn mạnh Để thúc đẩy việc sử dụng DNA mã vạch cho tất cả sinh vật nhân chuẩn sống trên hành tinh này, CBOL (Consortium fortheBarcodeofLife)đãđượcthànhlậpvàotháng5năm2004,gồmhơn120tổ chức từ 45 quốc gia, với mục tiêu ban đầu là xây dựng một thư viện trực tuyến trình tự mã vạch (barcode) cho tất cả các loài chưa được biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ mẫu DNA nào [20], [55] Với sự hỗ trợ của CBOL, cũng như Trung tâm công nghệ thông tin Quốc gia (National Center for Biotechnology Information - NCBI) của GenBank, DNA mã vạch ngày càng phát triển và là một côngcụditruyềnhữuíchđượchệthốnghóađểthựchiệnchínhxácviệcxácđịnhvà định danh cho mọi loài [71], [154],[212].

Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng một hoặc nhiều trình tự gene ngắn (200 - 900 bp) được lấy từ một phần chuẩn hóa của hệ gene để hỗ trợ các loài trongnhậndạngvàkhámphábằngcáchsửdụngphânkỳtrìnhtựdựatrênsựliênkết nucleotide [73], [84], [92] Đặc điểm quan trọng nhất của DNA mã vạch là phải phổ biếnvàđặchiệutrongcácbiếndịvàdễdàngsửdụng,dễdàngkhuếchđạibằngPCR [71], [243] Trong những năm gần đây, một số vùng gene lục lạp (cpDNA), và vùng gene nhân (ITS-rDNA) đang được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại (phylogeny), phân loại (taxonomy) và nhận dạng loài (identity) ở thực vật [55], [84], [238].

Hiện nay, các ứng viên mã vạch tiêu chuẩn chính giúp phân biệt các loàithực vật với độ chính xác cao gồm có:ITS,matK,rbcL,psbA-trnH vàtrnL-trnF Trong đó,trnL-trnF là mã vạch chiếm ưu thế nhờ tính đa vị trí DNA mã vạch và độ biến thiên cao, giúp nhận diện một cách chính xác thực vật ở cấp độ loài và dưới loài Số lượngấnphẩmvềtrnL- trnFgiatănghàngnămvàđạttrên10.000vàonăm2021[93], [253] VùngtrnL-trnF là vùng là chất đệm giữa 2 gene tRNA-Leucine và tRNA- Phenylalanine, nằm trong vùng sao chép đơn lớn của bộ gene lục lạp [118], [177] Vùng gene này có tỷ lệ chuyển đổi nucleotide cao, khả năng tạo biến thể di truyền tương đối cao và cung cấp các thông tin phân loại có tính hệ thống hơn Sử dụng mã vạch này để phân tích có thể ảnh hưởng đến việc đọc trình tự ở một số loài do việc lặp lại mononucleotide, nhưng nhìn chung rất đơn giản để giải trình tự [93], [253] Ngoàira,sựphânbốkhônggianđadạngcủacácnucleotidedọctheovùngtrnL-trnF còn giúp xác định sự tiến hóa khác nhau giữa các loài sinh vật[248].

DNA mã vạch là một công cụ chẩn đoán hiện đại với các ứng dụng ngày càng tăng trong phân loại học, sinh học hệ thống và nghiên cứu sinh thái DNA mã vạch cóthểdễdàngkhắcphụcnhữnggiớihạncủaviệcphânloạiloàithôngthườnggâyra do các mẫu nghi ngờ có thể bị hư hỏng hoặc không đầy đủ chỉ với một phần mô khả thi để nhận dạng; giảm thiểu được tình trạng DNA bị phân mảnh trong môi trường [71], [84].TínhhữuíchcủaDNAmãvạchkhôngchỉgiớihạntrongnghiêncứukhoa học về đa dạng sinh học mà còn liên quan đến bảo tồn, sức khỏe cộng đồng và an toàn sinh học [71], [196], [228],[232].

1.2.1.2 Ứngdụng kỹ thuật DNA mã vạch trong nghiên cứu đa dạng di truyền câythuốc

Trong nghiên cứu của Yu và cs (2017), vùngITS2 được đánh giá trên 127 trình tự đại diện cho 101 mẫu cây thuốc thu thập từ 14 tỉnh thành khác nhau tại Trung Quốc(Trachelospermum jasminoides, F pumila,F tikouavàE fortui) Kết quả cho thấy, tỷ lệ khuếch đại thành công của các vùngITS2 cho tất cả 101 mẫu là 100% và các trình tự hai chiều đều có chất lượng cao Trình tựITS2 của các loài nghiên cứu tương đối khác nhauvớiđộdàiđượccănchỉnhlà270bpvàtồntại126vịtríbiếnđổichiếmtỷlệ46,7% Ngoài ra, trong nghiên cứu chỉ có một kiểu đơn bội của loàiT jasminoidesđược tìm thấy,khôngquansátthấycácvịtríbiếnđổivàkhoảngcáchgiữacácloàiT.jasminoideslà 0,000; trong khi đó khoảng cách với các loài còn lại rất cao và khoảng cách mã vạch rõ ràng được ghi nhận dao động trong khoảng từ 0,488 - 0,607 Như vậy, vùngITS2 có thể thay đổi và phù hợp với sự khác biệt cao giữa các loài trong cây thuốc[243]. Ứng dụng kỹ thuật DNA mã vạch, Phạm Văn Kiền và cs (2018) đã địnhdanh chínhxácđượctrong6mẫudượcliệumangtênBakíchđượcthuthậptạimộtsốtỉnh ởViệtNam,trongđó4/6mẫulàthuộcloàiBakíchMonrindaofficinalis,và2/6mẫu không phải là Ba kích nhưng thuộc chiPolygala, họ Viễn chí[18].

ChiBlumealàmộttrongnhữngchicónhiềuloàiđượcsửdụnglàmthuốcthảo dược hoặc trong ngành công nghiệp hóa chất với giá trị kinh tế cao ở Trung Quốc Tuy nhiên, người ta biết rất ít về mối quan hệ phát sinh loài và tiến hóa phân tử của chinàyởTrungQuốc.Vìvậy,Zhangvàcs(2019)đãtiếnhànhphântích16mẫucủa 12 loài thuộc chiBlumeaở Trung Quốc bằng trình tự DNA ribosome hạch nhân(nrDNA)vàDNAlụclạp(cpDNA)trnL-Fđểtáicấutrúcmốiquanhệphátsinhgene và ước tính thời gian phân kỳ Kết quả chỉ ra rằng, chiBlumealà đơn ngành vàđược chia thành 2 nhánh khác nhau về môi trường sống, hình thái, loại nhiễm sắc thể và thành phần hóa Trong đó, nhánh I gồm 3 loài thuộc phân chiMacrophyllae(B.aromatica,B densiflora,B balsamifera) và 1 loài thuộc phân chiPaniculatae(B.lanceolaria); 8 loài còn lại đều thuộc nhánh II [248]. Để đánh giá quan hệ họ hàng của các loài trong chi nhân sâm (Panax), Vũ Đình Duy và cs (2020) đã tiến hành thu thập và phân tích các mẫu sâm thu tại núi Phu Xai Lai Leng và vườn Dược liệu của công ty TH (Kỳ Sơn, Nghệ An) Mã vạch DNA vùng gene nhân (ITS-rDNA) và vùng gene lục lạp (matK) đã được sử dụng Kết quả cho thấy 100% vùng geneITS-rDNA vàmatK đều được khuyếch đại PCR và trình tự đọc hai chiều với độ dài trình tự nucleotide tương ứng là 616 bp và 1433 bp So sánh với dữ liệu trên ngân hàng gene thế giới (NCBI), tất cả 32 mẫu sâm tự nhiênđềucómốiquanhệchặtchẽvớiloàiTamthấthoang(P.stipuleanatus)(MLBS

= 99%, BPP = 100%), 19 mẫu sâm tại vườn dược liệu đều có mối quan hệ chặt chẽ với loài Tam thất (P notoginseng) (MLBS = 100%, BPP = 100%) Sự khác biệt di truyền giữa các loài trong chiPanaxthay đổi từ 0,2 - 7,9%, trung bình 4% đối với vùngITS- rDNAvàtrungbình1,2%(0,1-2,9%)đốivớivùngmatK.Nghiêncứunày đã chỉ ra rằng các loài trong chiPanaxcó cùng nguồn gốc tiến hóa, giúp xác định mối quan hệ di truyền của các loài/thứ trong chiPanaxvà ghi nhận Tam thất hoang có phân bố tại núi Phu Xai Lai Leng, xã Na Ngòi, Kỳ Sơn, Nghệ An, trên cở sở đó chính thức mở rộng vùng phân bố của loài này ở Việt Nam[8].

Huỳnh Thị Thu Huệ và cs (2021) đã tiến hành giải trình tự, phân tích chỉ thị DNA vùngtrnL-trnF có kích thước 1.075 bp từ 10 mẫu lá khô của cây Cà gai leo (Solanum procumbensLour.) Kết quả cho thấy 100% đoạn gene từ 10 mẫu nghiên cứu đều tương đồng với các công bố của loàiSolanum procumbensLour Khoảng cách di truyền dựa trêntrnL-trnF của các mẫu so với một số loài trong chiSolanumdaođộngvớibiênđộthấp,từ0,0082đến0,0399.Cácsốliệuthuđượctừnghiêncứu đã cung cấp thêm thông tin cho những nghiên cứu đa dạng di truyền về chi Cà (Solanum) cũng như cây thuốc của Việt Nam [13] Ở một nghiên cứu khác trên cây Bách bộ thu được từ vùng núi miền Bắc Việt Nam, hai chỉ thị DNA mã vạch gồmrbcLvàtrnLđãđượcsửdụngđểthựchiện.Kếtquảnghiêncứukhoảngcáchditruyền và cây phát sinh chủng loại cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa các mẫu Bách bộ nghiên cứu với trình tự của loàiStemona tuberosaLour Vùng genetrnL (1100 bp) cho thấy khả năng phân biệt các loài Bách bộ tốt hơn so với vùng generbcL (600 bp).NhữngkếtquảnàylàtiềnđềchonhữngnghiêncứutiếptheovềloàiBáchbộvà những loài cây thuốc quý khác, phục vụ cho nghiên cứu khoa học và thực tiễn như phân loại đánh giá đa dạng và bảo tồn[12].

Nghiên cứu dựa trên 3 vùng gene DNA mã vạch làrbcL,ITS,ycf1 và vị trí codon mã hoá đầu tiên (ScoT) đã được Hasim và cs (2021) sử dụng để tìm ra mối quanhệphátsinhgenecủa9loàicâythuốcnguycấpđặchữucónguycơtuyệtchủng ở vùng Saint Kathrine, bán đảo Sinai 19 trình tự mã vạch mới đã được đưa vào cơ sở dữ liệu NCBI DNA mã vạch có hiệu quả cao trong việc xác định mối quan hệ di truyền giữa 9 loài nghiên cứu, và có thể phân cụm các loài được nghiên cứu thành các nhóm thích hợp ở cấp phân loại chi và loài một cách hiệu quả Trong khi đó, chỉ thị phân tử SCoT không thể nhóm các loài thực vật thuộc cùng một chi lại với nhau, nó chỉ có thể nhóm các loài thực vật thuộc cùng một họ[91].

Năm 2022, Chen và cs đã phân tích trình tựITScủa cây Gừng đenDistichochlamys citreacó nguồn gốc từ Bạch Mã (Thừa Thiên Huế, Việt Nam) Kết quảđiệnditrêngelagarosechothấycácbộkhuếchđạibởicácđoạnmồiITScókích thước khoảng 750 bp So sánh dựa trên BLAST giữa 15 trình tựITSnghiên cứu với các các trình tự tham chiếu trên GenBank cho thấy các trình tự hình thành cụm với các trình tựITScủa cùng loài

(AF478744, AY424757, AJ388282, và AB552946), táchbiệtvớicácloàikháctronghọZingiberaceae[60].Cũngtrongnămnày,loàihoa đặc hữu ở Sa Pa, tỉnh Lào Cai, Việt Nam làLilium poilaneithuộc chiLilium, họ Liliaceae đã được đánh giá các đặc điểm hình thái và dữ liệu trình tự DNA bao gồm các đoạn DNA ribosome nhân củaITS,ITS2 và plastidmatK,psbA-trnH vàrbcL, rpoC1đãđượcápdụng.Kếtquảchothấymộtsốchitiếthìnhtháicủahoaloakènđã đượcphântíchcụthểvàcảhaichỉthịITS2vàrpoC1đềuchothấysựvượttrộitrong việc phân biệtL. polinaneivới điểm tương đồng 100% và có số gia nhập mới là KR632775.1 và

KR632777.1 được đăng ký tại NCBI GenBank.Những dữ liệu chi tiếtvềloàinàycóthểđónggópvàosựpháttriểnbềnvữnghơnnữacủacácchiến lược nhân giống hoa loa kèn và góp phần vào các cuộc điều tra đa dạng sinh học và bảo tồn sinh học của loài hoa loa kèn quý hiếm [100].

Bêncạnhđó,cácloàithựcvậtthuộcchiDóbầu(Aquilaria)làloàithựcvậtcó nhiều tác dụng dược lý, đặc biệt là tác dụng trị đái tháo đường và nhuận tràng Itovà cs (2022) đã xác định được 3 loài Dó bầu:A rugosa,A sinensisvàA crassnanhờ sửdụngtrìnhtựmatKvàtrnL- trnF.Đồngthời,phântíchmẫulábằngkỹthuậtHPLC và LC/MS, nhóm tác giả đã cho thấy sự khác biệt về hàm lượng và thành phần hóa học của 3 loài Dó bầu, cũng như phân biệt được sự khác biệt về hoạt tính ức chế và cường độ ức chế α-glucosidase trong dịch chiết lá[104].

(2022)đểxácđịnh20loàithựcvậtquantrọngvềmặtyhọcthuộcchiCaryophyllales Kết quả chỉ ra rằngITS2 đã thành công trong việc phân biệt các loài được kiểm tra, vàcóthểđượcsửdụngđểpháthiệntạpnhiễmbẩnởnhữngcâythuốcnày.Hơnnữa, nghiên cứu này cho thấy rằng sự kết hợp của nhiều phương pháp có thể hỗ trợ giải quyết các phân loại tương tự về mặt hình thái hoặc có liên quan chặt chẽ[105].

KỹthuậtRAPD(RandomLyAmplifiedPolymorphicDNA)làkỹthuậtchỉthị phân tử được William và cs công bố lần đầu tiên vào năm 1990 Hiện nay, RAPD được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật[20].

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦASÂMCAU

Thành phần hóa học của Sâm cau luôn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.Cácnghiêncứuhiệntạichothấysựhiệndiệncủacácthànhphầnhóathựcvậttrong cây Sâm cau rất phong phú và đa dạng, gồm: flavonoid, saponin, glycoside, terpenoid, steroid và glycoside [61], [109], [256]; các hợp chất aliphatic hydroxyl ketone[208],các saponin thuộc nhóm cycloartan và nhóm ursan [138], [161]; flavone eudesmane và alkaloid[150].Bêncạnhđócâycònchứacácthànhphầnkhác:steroid;đườngtựdonhư glucose, manose, xylose;mucilage;hemicellulose; polysaccharide và glucoronic acid [108], [195]. Hợp chất hoạt tính sinh học được khám phá nhiều nhất là curculigoside, một glycoside phenolic được phân lập chủ yếu từ rễ củ của cây[125].

1.3.1 Hợpchấtglycoside ĐâylànhómhợpchấtchínhtrongSâmcau.Theocácnghiêncứutrênthếgiới, nhóm phenolic glycoside trong cây thường tồn tại dưới dạng các loại đường khácnhaunhư glucose, manose, xylose và glucoronic acid[109].

Phân tích thành phân hóa học của Sâm cau, các nhà khoa học đã phân lập vàlàm sáng tỏ thành phần phenolic glycoside trong rễ củ của cây này gồm có curculigoside A, và curculigoside C, curculigoside B và 2, 6-dimethoxylbenzoic acid[122].

NguyễnDuyThuầnvàNguyễnThịPhươngLan(2001)đãxácđịnhđượcởrễcủ củaloàiSâmcauhoangdạithuthậpởSơnDương,HàGiangcóchứaphytosterol,đường khử,saponin,chấtbéo,carotene.Đồngthời,cáctácgiảcũngđãphânlậpđượcđượcmột hợp chất tinh khiết 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid từ dịch chiết acetone[30].

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số chất glycoside trong Sâm cau

[230] Ghi chú: orcinol glucoside (1), orcinol-1-O-β-D-glucopyranosyl-

(1→6)-β-D-glucopyranoside (2), orcinol-1-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)- β-D- glucopyranoside (3), curculigoside (4), curculigoside B (5), curculigoside C

(6),2,6-dimethoxyl benzoic acid (7) và syringic acid (8).

Bằng phương pháp quang phổ, Wu và cs (2005) đã khẳng định sự tồn tạic ủ a

7 thành phần đã biết của Sâm cau là: orcinol glucoside (1), orcinol-1-O-β-D- glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (2), curculigoside (4), curculigoside B (5), curculigoside C (6), 2,6-dimethoxyl benzoic acid (7) và syringic acid (8) Ngoài ra, nhóm nghiên cứu còn xác định được thêm 1 loại glucoside mới từ rễ củ Sâmcau: orcinol-1-O-β-D- apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (3) (Hình 1.3)[230].

Valls và cs (2006) đã phân lập được từ cây Sâm cau hai phenolic đã biết là curculigoside A, curculigoside B và 2 phenolic mới là curculigoside C và curculigoside D [213].

Năm 2009, dẫn xuất mới của syringic acid và glycoside phenol là curculigoside E và orchioside D đã được phân lập từ cây Sâm cau thu thập tại quận Nawalparasi (Nepal). Cấu trúc hoá học của các hợp chất này được làm sáng tỏ bằng các phương pháp quang phổ, trong đó curculigoside E có công thức hoá học là 3,5- Dimethoxy-4-O-[β-D- glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside]-benzoic acid 5- methyl-2-O-β-D-glucopyr- anoside-phenyl ester [64] Tiếp đó, 4 loại glycoside phenolicmớilàorcinosideD,E,FvàGcũngđãđượcphânlậptừrễcủcủaSâmcau Dựa trên các phân tích quang phổ toàn diện bao gồm: IR, FAB-MS, HR-ESI-MS, 1D-và 2D NMR (HSQC, HMBC), cấu trúc của chúng được làm sáng tỏ là: orcinol- 1-O-beta-D-xylopyranoside, orcinol- 1-O-beta-D-apiofuranosyl-(1→ 2)-beta-D-glu- copyranoside, orcinol-3-O-beta-D- apiofuranosyl-1-O-beta-D-glucopyra-noside, và 1-O-beta-D-glucopyranosyl-4-ethoxyl-3- hydroxymetylphenol[257].

Trongmôitrườnginvitro,phântíchmẫurễcủcủaSâmcauđượcnuôicấylắc trong bình, Valls và cs (2010) đã thu được glycoside mới là curculigoside C và curculigosideDcùngvới2hợpchấtđãbiết:curculigosideAvàcurculigosideB.Cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ trên cơ sở bằng chứng quang phổ, đặc biệt là bằng cách sử dụng phương pháp 2DNMR [213] Cũng trong năm này, Zuo và cs (2010) đã phân lập được thêm ba loại phenolic glycoside mới, curculigoside F-H Cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ dựa trên các phân tích quang phổ toàn diện bao gồm IR, MS, 1D-và 2D NMR (HSQC, COZY và HMBC)[256].

TừchiếtxuấtethanolmẫurễcủcủacâySâmcau,Wuvàcs(2013)đãsửdụng các kỹ thuật quang phổ phối hợp với phương pháp HPLC và xác định được 5 loại chlorophenolic glycoside mới là: curculigine E, curculigine F, curculigine C, curculigineH,curculigineIvàmộtphenolicglycosidemới,orcinosideH[225].Tiếp tục sử dụng các kỹ thuật quang phổ mở rộng (IR, UV, MS, 1D và 2D NMR), một số nhà khoa học đã làm sáng tỏ và bổ sung vào danh sách các hoạt chất của Sâm cau thêm glycoside mới, trong đó gồm 3 chất thuộc nhóm chlorophenolic glycoside

(curculigineK,curculigineL,curculigineJ)và1chấtthuộcnhómphenolicglycoside (curculigoside I) [218].

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của ba loại curculigoside (F, G, H) [256]

Sử dụng kỹ thuật HPLC, Pham và cs (2022) đã xác định được lượng orcinol- β-D- glucoside có trong rễ củ Sâm cau phân bố tại Thừa Thiên Huế (Việt Nam) dao động trong khoảng từ 1,27 ± 0,0020 đến 9,16 ± 0,0189 mg/g [163].

Triterpenoidlànhómchấthữucơtựnhiêncócấutrúcđadạng,đượcđặctrưng bởi khung steroid. Trong Sâm cau, các triterpenoid thường được tìm thấy đa phần thuộc nhóm cycloartene, ngoài ra còn có 31-methyl-3-oxo-20-ursen-28-oic acid thuộc nhóm ursan [3],[150].

Misra (1990) đã phân lập được curculigol từ rễ củ Sâm cau và bằng phương pháp phân tích quang hóa đã xác định cấu trúc của hợp chất này là: 24- methylcycloart-7-en-3β,

Năm 2012, Zuo và cs đã phân lập từ rễ củ của Sâm cau 2 loại cycloartane triterpenoid glycoside mới tên là curculigosaponin N và curculigosaponin O [255].

Jiao và cs (2013) đã ìm thấy 1 loại cycloartane mới là triterpenoid ketone cùng với 4 hợp chất đã biết trước đây (curculigine A, curligoside B, syringic acid, orcinol glucoside) từ chiết xuất ethanol của Sâm cau [109].

Năm2022,KimvàcsđãtiếnhànhphântíchrễcủSâmcaubằngphươngpháp khốiphổ(MS).Thôngquanghiêncứu,cáctácgiảđãxácđịnhđượccấutrúchoáhọc của6loạicycloartanetriterpenoidgồm:curculigoneA-Evà(24S)-9,19-cyclolanost- ane-3β,12α,16β,24- tetrol[117].

Ngoài những hợp chất kể trên, một lượng lớn các acid béo được phân lập từ dịchchiếtdầucủarễSâmcaugồm:palmitic,oleiclinoleic,arachidicvàbehenicacid [192], [235].Ngoàira,phântíchthànhphầnhoáhọctrongrễcủSâmcauchothấycó sự hiện diện của các steroid như sitosterol, stigmasterol, yuccagenin và hợp chất lignan [149],[195].

Bên cạnh đó, trong rễ củ Sâm cau còn có chứa các hợp chất aliphatic hydroxycenhư:3-(2-methoxypropyl)-4-methylnonacosan-2-on;4-acetyl-2-methoxy

-5-methyltriacontane; 27-hydroxy triacontan-6-on ; 23-hydroxytriacontan-2-on; 21- hydroxy tetracontan-20-on; 4-methylheptadecanoic acid [22], [150].

Dode và cs (2009) còn cho thấy, trong Sâm cau ngoài các hợp chất carbohydrate, steroid, triterpenoide, flavonoide và glycoside còn có tannin, alkaloid [67], [133], [192].

Ngoài ra, trong Sâm cau các hợp chất chứa nitrogen khác cũng đã được tìmthấy như: N,N,N’,N’-tetramethylsuccinamide (C8H16N2O2), Methyl-N-acetyl-N-hydroxy carbamate, 3-acetyl-5-carbomethoxy-2,3,4,5,6-tetrahydro-1,2, 3,5,6- oxatetrazine, 2- methoxy-4-acetyl-5-methyltriacontane [192].

Hình 1.5 Cấu trúc của lycorine (1) và N,N,N’,N’-tetramethylsuccinamide (2) [192]

Loạialkaloidđầutiênđược Rao và cs (1978) phân lập từ Sâm cau là lycorine Các nghiên cứu sau đó trên rễ củ của Sâm cau cũng khẳng định sự hiện diện của lycorine [88], [102], [186] Tuy nhiên, hàm lượng alkaloid này ở chiCurculigovẫn chưa được nghiên cứu kỹ [174], [192].

Wang và cs (2017) đã sử dụng phần mềm ChemDraw để tiến hành phân tích nhận dạng các thành phần dược chất có trong Sâm cau từ nguồn dữ liệu thu thập ở Trung Quốc. Kết quả nhận diện được 77 loại dược chất trong đó có lycorine [221].

Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu về tác dụng của lycorine và các dẫn xuất của lycorine ngày càng được chú ý hơn, đặc biệt là trong điều trị một số bệnh thời đại như ung thư, Alzheimer hay việc chống khối u, chốngv i r u s , T h ô n g qua nghiên cứu chuyên sâu và nỗ lực không ngừng, các nhà khoa học đang cố gắng pháttriểncáchợpchấtgốclycorinevàcácdẫnxuấtcủanóthànhcácloạithuốcmới, mang lại lợi ích kinh tế đáng kể và giá trị học thuật to lớn[106].

DƯỢC TÍNH CỦASÂMCAU

CácnghiêncứuvềđộctínhcấpcủaMadhavanvàcs(2007)trênchiếtxuấtcồn và nước của rễ củ Sâm cau cho thấy, chuột uống dịch chiết đều cho giá trị liều gâychết trung bình LD 50 cao hơn 3 g/ kg thể trọng và không thấy có bất kỳ phản ứng độchại có khả năng gây chết sau 21 ngày uống[134].

Trong nghiên cứu năm 2010, Yokosuka và cs (2010) đã tiến hành đánh giá hoạt tính của các hợp chất cycloartane glycoside mới và aglycone thu được từ rễ củ Sâm cau lên dòng tế bào ung thư máu HL-60 ở người Kết quả cho thấy: hợp chấtaglyconegõyđộctếbàoởmứcđộvừaphảivớigiỏtrịIC 50= 3,9àg/mL,trongkhiđú9 glycoside được tìm thấy trong nghiên cứu này lại không thể hiện tính gây độc đối vớidòngtếbàoHL- 60ngaycảởnồngđộmẫulà20àg/mL[240].Sửdụngdịchchiết methanol với liều 300 mg/kg, Rathod và cs (2010) đã khẳng định không thấy dấu hiệu độc tính nào[176].

Theo nghiên cứu của Asif và cs (2010), Sâm cau có độc tính và liều lâm sàngkhuyếncáochongườitrưởngthànhlà3g-9g/ngày.LiềuLD 50của dịchchiếtethanol(ECO)là215,9g/ kg,gấp1439lầnliềukhuyếncáolâmsàng[47].Nghiêncứuvềđộc tínhcấpcủaSâmcautrênchuộtcốngtrắng,mộtsốtácgiảnhưAsifvàKumar(2010) hayElumalaivàcs(2013)đềucôngbốkếtquảgiốngnhaulàMECOvớimứcliều đến 200 mg/kg thể trọng chuột không có chuột nào bị chết cũng như không có dấu hiệu bị ngộ độc [47], [72]. Để đánh giá độc tính cấp của cây Sâm cau, nhóm nghiên cứu của Anandakirouchenane và cs (2013) đã tiến hành xác minh sự tiềm ẩn độc tố của dịch chiếtmethanoltừrễcâytrong28ngàyởchuộtWistarAlbino.Kếtquảchothấykhông cótrườnghợptửvonghoặcdấuhiệunhiễmđộcnàoliênquanđếnđiềutrịđượcquan sát thấy khi sử dụng dịch chiết methanol của Sâm cau (MECO) Trong nghiên cứu liều lặp lại, không quan sát thấy sự khác biệt đáng kể về thay đổi khối lượng cơ thể và huyết học giữa nhóm đối chứng và nhóm MECO Ngược lại, có sự giảm nồng độ glucose và cholesterol trong huyết thanh và tăng nồng độ protein ở chuột được điều trị so với đối chứng Kiểm tra tổng quát và xét nghiệm mô bệnh học không thấy có dấu hiệu bất thường hay bệnh lý nào xuất hiện ở chuột uống MECO ở liều khuyến cáo Tuy nhiên, nếu uống nhiều trong khoảng thời gian dài có thể xuất hiện một số tác dụng như ra mồ hôi lạnh, tê cóng chân tay Vì vậy, chỉ sử dụng ở mức liều màđã chắc chắn tính an toàn của chế phẩm Chống chỉ định với những người thiếu âm,nội nhiệt,nhữngngườibịnhiễmlạnhdocáctácnhânngoạicảnh[40].Đồngthời,kếtquả nghiên cứu của Wang và cs (2013) trên chuột cống cũng cho kết quả tương tự khisử dụng Sâm cau kéo dài ở liều 30 g/kg hay 60 g/kg và không thấy bất kỳ độc tính nào xuất hiện[225].

Jiao và cs (2013) đã lần đầu tiên tiến hành đánh giá tác dụng gây độc gan của hợpchấttriterpenoidketonecótrong(ECO).Thửnghiệmtrêndòngtếbàoganngười cho thấy khả năng tồn tại của dòng tế bào HL-7702 ở nồng độ dịch chiết 125 và 500 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL lần lượt là 86,20 ± 3,57% và 130,64 ± 2,30% Đồng thời, sử dụng các hợp chất này không gây nên độc tính nào cho gan [109] Bên cạnh đó, việc sử dụngngắn hạn (14 ngày) MECO với liều lên tới 250 mg/kg thể trọng cũng được Murali và cs (2015) xác định là không gây tử vong hoặc thay đổi nào về hành vi cũng như chức năng gan và thận khi so sánh với động vật bình thường[143].

Trên lâm sàng, chế phẩm Sâm cau dưới dạng trà Tiên mao hoà tan (3 g/gói) dokhoaDượcbệnhviệnYhọccổtruyềnTrungươngsảnxuấtđãđượcDươngMinh

Tiên mao tăng dần từ liều 10 g/kg đến 30 g/kg thể trọng, đa số chuột chỉ giảm hoạt động,nằmvàngủtrong2-3giờ,sau24giờhoạtđộngnhanhnhẹntrởlại.Đồngthời, thử nghiệm trên thỏ với liều uống 9 g/3 lần/ngày trong 6 tuần cũng không ghi nhận cósựthayđổinàovềtìnhtrạngchung,chứcnăngtạomáucùngchứcnănggan,thận của thỏ ở lô thử với lô chứng trước và sau thử nghiệm [25] Nghiên cứu độc tínhcấp của chế phẩm trà Tiên mao của Sâm cau cũng được Trần Quốc Bình và cs tiến hành vào năm 2011 tại khoa ngoại bệnh viện Y học cổ truyền Trung ương Kết quả khảo sáttrên31bệnhnhânbịmắcbệnhrốiloạncươngdươngchothấyuốngtràTiênmao không gây ra tác dụng không mong muốn, không làm thay đổi các chỉ số cận lâm sàng, huyết học, sinh hóa[4].

Tuy nhiên, dịch chiết lá được Kushalan và cs (2022) chứng minh là gây ảnh hưởng đến sự phát triển của loàiDrosophila Độc tính cấp của dịch chiết phản ảnh qua hiện tượng suy giảm các đặc điểm phát triển hình thái và sự sinh sản kém cùng với sự suy giảm tỷ lệ sống sót [126].

Sâm cau vị cay tính ấm, độc vào hai kinh tỳ và thận, có tác dụng thêm sức nóng làm tan lạnh, cường dương, mạnh gân xương [7], [21].

Sâm cau đã được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị liệt dương, tê nhức chân tay, viêm khớp thắt lưng và đầu gối, trị tiêu chảy Rễ củ có thể nấu với thịt trị chứng bất lực và ù tai; có thể ngâm trong rượu vang trị đái dầm, hoặc nghiền thành bột mịn dùng với rượu vang trị chảy máu tử cung; hoặc điều trị áp xe nhọt, đau do chấn thương và nhiễm trùng [54], [151].

Trong Y học cổ truyền Ấn Độ, Sâm cau là một vị thuốc khá quan trọng, có mặt trong đa số các công thức Ayurvedic Sâm cau có tác dụng giảm đau, lợi tiểu và tác dụng cường dương, giúp bồi bổ cơ thể [43], [115], [119], [125] Sâm cau kếthợp vớicácloạithảomộckhácđểđiềutrịhomạntính,viêmphếquản,hensuyễnvàviêm gan Sâm cau còn có tác dụng kích thích tiêu hóa, kích thích sự thèm ăn; các chế phẩm của thảo dược này rất hữu ích trong việc điều trị trĩ và hội chứng ruột kích thích Rễ củ Sâm cau ép lấy nước có tác dụng chống nhiễm trùng, làm lành vết thương, hoặc có thể trộn lẫn với nước ép tỏi dùng nhỏ mắt để trị mù lòa.

Lá củaSâm cauđượcbiếtlàcóđặctínhchốngungthư.CácthầylangẤnĐộđãsửdụngSâmcauđểđiềutrịrốiloạ nniệunhưtiểukhó,tiểuramáu,lậuvàgiangmai.RễcủSâmcaunghiền cùng với quả ajwain (1 loại quả của loàiTrachyspermuma m m i , F a m Umbelliferae),đemsắc,uốngcótácdụngchốngbấttỉnh ởtrẻem.TạiMariana,Sâmcauđượcsửdụngnhư1loạithựcphẩm.TạiPhilippine,rễcủSâmcauđ ượcsửdụngđơn độc hoặc phối hợp với các loại thuốc khác và được dùng như một loạithuốc bổ,lợitiểuvàkíchthíchtìnhdục;rễcủgiãnátđắptrêndađểtrịngứa[53],[151], [185].Tại Việt Nam, cây Sâm cau được trồng làm cảnh, rễ củ được dùng làmthuốc. Thường dùng chữa nam giới tinh lạnh, liệt dương, phụ nữ đái đục, bạch đới; người giàđáisón,lạnhdạ,kémăn;thầnkinhsuynhược;phongthấp,lưnggốilạnhđau,vận động khó khăn [3], [7],[11].

1.4.3 Hoạttính sinh học của Sâmcau

Venukumarvàcs(2002)đãnghiêncứuvềhoạttínhchốngoxyhoácủaMECOtừrễcủthôngquachỉ sốnhiễmđộccarbontetrachloride(CCI4)trongganchuột.Sau90 ngày liên tục được uống MECO liều 70 mg/kg thể trọng, các thông số sinh hoá của enzyme chống oxy hoá như superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) glutathione peroxidase (GPX), glutathione reductase (GPD), glutathione transferase(GTS) ở chuột bị nhiễm CCI 4 thay đổi và dần trở về mức bình thường Điều nàychứng tỏ MECO thực sự có hiệu quả chống oxy hoá[215].

HoạttínhcủahợpchấtphenolvàphenolicglycosidetừSâmcauđãđượcWuvàcs(2005)nghiênc ứu.Kếtquảchothấy,cácgốchydroxyltừH2O2/Fe2vàgốcanionsuperoxidetừcáchệxathine/ xanthineoxidaseđãđược loạibỏđángkểvới giá trị

IC50tươngứngđạt1,84mMvà0,88mM,tươngđươngvớichấtchốngoxyhoáepigallocatechinallate(E GCG).Tác dụngchốngoxy hoá của Sâm cau còn được thể hiện bởi hoạt động thay thếC- 2methoxyl,nhómglucopyranosyltốthơnsovớinhómapiofurannosyl,…[230].

Trong nghiên cứuin vitrocủa Bafna và Mishra (2005) đã cho thấy MECO có hiệuquảrấttốttrongviệcdọnsạchcácgốctựdonhómsuperoxide,cótácdụngtrung bìnhđốivớicácgốctựdoDPPH,nitricoxide(NO)vàứcchếquátrìnhperoxidehoá lipid [49].Bằng kỹ thuật HPTLC (sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao), Rathod và cs(2010)cũngchothấykếtquảtươngtựđốivớikhảnăngbảovệcủadịchchiếtSâm cau chống lại sự phá hủy hồng cầu do superoxide [176] Việc phục hồi mức độ của cácenzymechốngoxyhoácủacáctếbàothầnkinhởvùnghồihảimãcũngđượcghi nhận, nhờ đó ngăn ngừa được những tổn thương lên màng tế bào và bảo vệ được sự toàn vẹn của tế bào thần kinh [170],[249].

Trong nghiên cứu năm 2015, Murali và cs đã cũng đã khẳng định hợp chất curculigoside trong Sâm cau có khả năng loại bỏ các gốc hydroxyl được tạo ra bởi phản ứng Fenton và cũng ức chế quá trình peroxy hóa lipid trong ống nghiệm Hợp chất này cũng giúp loại bỏ hiệu quả các gốc superoxide, DPPH (1, 1-diphenyl-2- picrylhydrazyl)vànitricoxide(NO).Bêncạnhđó,sửdụngcurculigosidetheođường uốngởnồngđộ20mg/mLlàmgiảmđángkểcácgốcsuperoxideđượctạorabởinatri caseinat trong quá trình kích hoạt với phorbol-12-myristate-13-acetate của các đại thực bào với tỷ lệ ức chế là 50,6% (p

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Duy Thuần và Nguyễn Thị Phương Lan(2001)cũngđãchỉrõtácdụngchốngoxyhóainvitrocủapolyphenolchiếttừrễ củ Sâm cau là tương đối cao [30] Nghiên cứu của Vũ Thị Thu Lê và cs (2022) cũng khẳng định khả năng chống oxy hoá của các dịch chiết rễ củ Sâm cau bằng phươngpháp DPPH, với mức oxy hoá trung bình đạt giá trị SC5036,85 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL[19].

1.4.3.2 Tácdụng bảo vệ, chống độc chogan

Qua công bố năm 2004, Rao và cs đã cho thấy Sâm cau có tác dụng chống nhiễm trùng và bảo vệ gan nhờ vào tính đối kháng với một số chất có khả năng gây độc cho gan như rifampicin [172].

Nghiên cứu của Venukurma và Latha (2002) thực hiện trên chuột cống đãđược tiêm carbon tetrachloride (CCl4), sau đó cho dùng MECO cho thấy có sự hồiphụcvềnồngđộcủacácenzymechốngoxyhóa,chẳnghạnnhưsuperoxidedismutase (SOD), catalase(CAT), glutathione peroxidase (GPX), glutathione reductase(GRD) và glutathione transferase (GTS) Điều này cho thấy hiệu quả của MECO trong việc chống lại stress oxy hóa do tổn thương gan Ngoài ra, Venukurma còn chỉ ra cơ chế bảovệgancủaMECOlàthôngquacáctácdụngổnđịnhmàngtếbàogan;ngănchất độc từ ngoài nhiễm vào; tăng cường tổng hợp rRNA và protein nhằm thúc đẩy phục hồi các tế bào gan bị tổn thương, kích thích sự phát triển các tế bào gan mới; ức chế sự biến đổi gan thành tổ chức xơ,giảm sự hình thành các sợi collagen[215].

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU

VẬT LIỆUNGHIÊN CỨU

Đề tài nghiên cứu được thực hiện với các vật liệu sau:

- Vật liệu thực vật: Loài Sâm cau (Curculigo orchioidesGaertn.), thuộc chi

Cồ nốc (Curculigo), họ Hạ trâm (Hypoxidaceae), bộ Măng tây (Asparagales), phân lớpHành(Liliidae),lớpthựcvậtmộtlámầm(Liliopsida).CâySâmcauđượcthuhái tại Thừa Thiên Huế phục vụ nghiên cứu có độ tuổi ≥ 3 tuổi Cây Sâm cau được định danh dựa trên các đặc điểm hình thái học bởi Thầy Trần Minh Đức, hiện đang công tác tại Khoa Lâm nghiệp, trường Đại học Nông lâm, Đại họcHuế.

- Vật liệu động vật: Chuột Swiss đực, 8 tuần tuổi được mua từ Viện Vắc xin vàSinhphẩmYtế,tỉnhKhánhHòa.Chuộtsaukhinhậnvềđượcnuôithíchnghivới điềukiệnthínghiệmtrong2tuầnvàđạtkhốilượng20-21g/contrướckhitiếnhành thực nghiệm.Chuột được nuôi dưỡng và chăm sóc ở điều kiện phòng thí nghiệm, trong môi trường ổn nhiệt 26ºC ± 2; Lồng nuôi chuột Model TT được phủ đệm lót bằngdămbào(mùncưa)sạch,đãđượcsấykhô,khửkhuẩn;ThứcăndoViệnVệsinh dịch tễ Trung ương cungcấp.

ĐỊA ĐIỂMTHU MẪU

Cây Sâm cau được thu hái trong tự nhiên và phân bố tại 3 địa điểm khác nhau trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế:

+ Thành phố Huế - Núi Ngự Bình (tọa độ: 16 º 26’34”B, 107 º 35’54”Đ), + Huyện Hương Thủy - Núi Thiên Thai (tọa độ: 16 º 24’22”B, 107 º 35’20’’Đ), + Huyện Hương Trà - Núi Thiên Thọ (tọa độ: 16 º 21’45”B, 107 º 36’49”Đ) Các mẫu Sâm cau thu tại các tỉnh: Lai Châu, Quảng Bình, Quảng

Trị,Q u ả n gNam, Kon Tum, Lâm Đồng được tiến hành tách chiết genomic DNA, phục vụ cho phân tích RAPD.

Hình 2.1 Cây Sâm cau tại các địa điểm thu mẫu tại Thừa Thiên Huế

Ghi chú: A Núi Ngự Bình, B Núi Thiên Thọ, C Núi Thiên Thai.

PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU

2.3.1 Phươngpháp nghiên cứu các đặc điểm sinhhọc

- Các đặc điểm hình thái, sinh trưởng và phát triển của cây Sâm cau được mô tảtheophươngphápcủaNguyễnNghĩaThìn(2006)cócảitiến[29]gồmcácchỉtiêu:

+ Các chỉ tiêu về lá: chiều dài và chiều rộng của lá, chiều dài cuống lá được xác định trực tiếp bằng thước Lá được chọn trong nghiên cứu là lá thứ 3 - 5 trêncây (thường là lá lớn nhất) Tại mỗi khu vực phân bố Sâm cau, xác định 50 mẫu lá tươi/khu vực đang trong giai đoạn ra lá trongnăm.

+ Các chỉ tiêu về rễ củ: chiều dài và đường kính rễ củ được xác định trực tiếp bằng thước Các mẫu rễ củ được thu và đánh giá vào giai đoạn thu hoạch trong năm 50 mẫu rễ củ tươi/khu vực được sử dụng để xác định.

+ Chỉ tiêu về nhánh: số nhánh/cây được đáng giá vào cuối thời kỳ ra lá trong năm, xác định 50 mẫu cây tươi/khu vực.

+Cácchỉtiêuvềhoa:màusắchoa,sốcánhvànhịtrênmỗihoađượcxácđịnh vào thời kỳ nở rộ, xác định trên 10 cây/khuvực.

+ Các chỉ tiêu về quả, hạt: hình dáng quả, số lượng hạt /quả, xác định trên 10 cây/khu vực.

-Cácđặcđiểmcấutrúcviphẫuđượcthựchiệntheophươngphápnghiêncứu hiển vi của Trần Công Khánh (2005) và Dược điển Việt Nam (2017) [5],[16]:

+ Đối với các mẫu lá, cuống lá và rễ củ: Lát cắt vi phẫu được ngâm vào dung dịch javel trong 20 phút để loại hết các chất chứa trong tế bào Rửa sạch javel bằng nướckhửion.Tiếpđó,ngâmcáclátcắtviphẫuvàothuốcthử50%chlorhydrate(v/v) trong10phút,rồirửasạchbằngnướckhửionđểloạibỏlượngchlorhydratedưthừa Tiếp đó, acid hóa các mẫu bằng 1% acetic acid (w/v) trong 2 phút, rồi rửa lại bằng nướckhửionđểloạibỏaciddư.Tiếnhànhnhuộmcáclátcắtbằng0,3%iodinegreen (w/v)trongtrong1- 1,5phút,rồidùngnướckhửionrửasạchthuốcnhuộm.Tiếptục nhuộm các lát bằng 1% carmine (w/v) trong 8 phút, sau đó loại sạch thuốc nhuộm bằng nước khử ion Nhỏ 1 giọt glycerine lên phiến kính, đặt các mẫu vi phẫu đã nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển vi quanghọc.

+ Đối với mẫu bột: Lá và rễ củ Sâm cau sau khi rửa sạch được tách riêng,sấy khụ,tỏnthànhbột.Rõyquarõykớchthước150àmlấyphầnbộtmịn.Tiếptheo,dựng kimmũimácchomộtlượngnhỏbộtSâmcaulênlamkínhcósẵngiọtnướckhửion, đậy lamen Quan sát các đặc điểm cấu tạo giải phẫu bột dược liệu bằng kính hiểnvi.

2.3.2 Phươngpháp nghiên cứu đa dạng di truyền cây Sâmsau

Tại 3 khu vực thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế (núi Ngự Bình, núi Thiên Thai, núiThiên Thọ), chúng tôi tiến hành thu 5 mẫu lá/khu vực để tiến hành tách chiết DNA.

DNA tổng số của 15 mẫu lá Sâm cau tươi được tách chiết bằng kit TopPURE Plant DNA Extraction Kit (ABT, Việt Nam) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Tiến hành điện di kiểm tra DNA tổng số thu được trên gel argarose 1%.

PhảnứngPCRđượcthựchiệntrongmáyluânnhiệt(SimpliAmp,ThermoFisher Scientific,USA)vớicặpprimertrnL-trnF-F(5’-TGGCGAAATTGGTAGACGC-3’)vàtrnL- trnF-R (5’- AACCATCTCGTCTCCTGA-3’)[13] Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 1àLDNA tổng số (100 ng/àL), 0,5àLmồi/loại (10 pmol), 5àL2 x GoTaq GreenMasterMix(Promega,Mỹ),3àLnướckhửion,tổngthểtớchphảnứnglà10 àL Quy trỡnh phản ứng PCR được trỡnh bày ở Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Quy trình nhiệt của phản ứng khuếch đại PCR Nhiệt độ(ºC) Thời gian Số chu kỳ

Phương pháp phân tích số liệu thí nghiệm

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được phân tích trình tự nucleotide ở công ty 1stBASE(ApicalScientificSdnBhd,Malaysia).KếtquảgiảitrìnhtựDNAđượcxử lýbằngphầnmềmBioedit(v7.2.5),DnaSP(v6.0)vàMEGA11.Mứcđộtươngđồng vàđộbaophủcủacáctrìnhtựDNAđượcđánhgiábằngcáchđốichiếuvớicáctrình tự có sẵn trên cơ sở dữ liệu nr-nt của NCBI bằng công cụ BLAST (Basic local Alignment Search Tool) với các tham số mặc định Tiếp đó, các trình tự DNA được sắp xếp gióng cột bằng chức năng Clustal W trên phần mềm MEGA 11với các tham số mặc định Cây phát sinh loại được xây dựng dựa trên phương pháp Maximum Likelihood với giá trị bootstrap 1000[202].

Sâmcauphânbốtại7tỉnh/thànhphốkhácnhau,đạidiệnchokhuvựcBắcBộ,Trung

Bộ và Tây Nguyên, bao gồm: Lai Châu, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Kon Tum, Lâm Đồng Tất cả 92 mẫu lá được thu thập để phân tích và ký hiệu như trình bày ở Bảng 2.2.

Bảng 2.2 Danh sách các xuất xứ Sâm cau được sử dụng trong nghiên cứu STT Địa điểm thu mẫu Số lượng mẫu Ký hiệu mẫu

DNA tổng số của Sâm cau được dùng làm khuôn để khuếch đại PCR-RAPD. Hỗnhợpphảnứnggồm:20pmolmồi,10àLPCRMasterMix2ì(M7502,Promega); 50 ng DNA khuụn mẫu với tổng thể tớch phản ứng là 20 àL Phản ứng RAPD-PCR được thực hiện theo Quang và cs (2016) với 6 mồi oligonucleotide decamer ngẫu nhiên (Operon Technologies, USA) có chiều dài 10 nucleotide (Bảng 2.3)[166].

Bảng 2.3 Trình tự các mồi dùng trong PCR-RAPD STT Mồi Trình tự nucleotide (5’-3’)

Phản ứng được thực hiện trong máy luân nhiệt (SimpliAmp, Thermo FisherScientific,USA)vớiquitrìnhkhuếchđạiRAPD-PCRđượctrìnhbàytrongBảng2.4 Sản phẩm PCR-RAPD được phân tích trên gel điện di agarose 1,4% ở hiệu điện thế 40 V trong khoảng 6 giờ [166].Gel agarose được nhuộm bằng dung dịch đệm tải6×

Phương pháp phân tích số liệu thí nghiệm

GelRed TM (ABT, Việt Nam) Hình ảnh điện di được thu nhận trên bàn đọc UV Các mẫu thiếu band trên gel agarose được khuếch đại lần hai để xác nhận.

Bảng 2.4 Quy trình nhiệt của phản ứng khuếch đại RAPD-PCR

Nhiệt độ(ºC) Thời gian(phút) Số chu kỳ

Phổ điện di sản phẩm PCR-RAPD của các mẫu với các mồi được phân tích theo nguyên tắc các band DNA có xuất hiện hay không Phân tích tọa độ phân bố di truyền, xây dựng cây phả hệ và phân tích cụm theo thuật toán ma trận nhị phânbằng phầnmềmNTSYSpc2.1(ExeterSoftware,Mỹ)dựatrênhệsốtươngđồngditruyền Jaccard (1908). Kích thước của các điểm đánh dấu RAPD được ước tính bằng kích thướcDNAtiêuchuẩn(GeneRuler1kbDNALadder,ThermoScience).Hệsốtương đồng di truyền được tính bằng hai lần số band chung của hai mẫu trên tổng số bandthu được của hai mẫu đó (S = 2N AB /(N A + N B )) Hai mẫu hoàn toàn giống nhau nếuhệ số thu được là 1,0, và bằng 0,0 khi hai mẫu không có điểm chung nào Cây quan hệ di truyền giữa các mẫu được xây dựng theo phương pháp UPGMA (Unweighted PairGroup Method with Arithmetical Averages) Hệ số đa dạng di truyền và khoảng cách di truyền giữa các quần thể được thể hiện bằng cách sử dụng khoảng cách di truyền của Nei [148] Các thông số di truyền được tính bằng số lượng band đa hình, tỷ lệ phần trăm của các band đa hình (PPB), số lượng allele quan sát được (na), số lượng allele hiệu quả (ne), đa dạng gene của Nei (h), chỉ số thông tin của Shannon(I

), tổng đa dạng kiểu gene trong quần thể (Ht), tổng đa dạng kiểu gene trong quầnthể (Hs), hệ số trung bình của sự khác biệt gene (Gst) và ước tính dòng gene (Nm) cho dữ liệu RAPD bằng phần mềm POPGENE[239].

2.3.3 Phươngpháp nghiên cứu các đặc điểm hoá sinh của Sâmcau

2.3.3.1 Xácđịnh độẩm Độẩmcủacâyđượctínhdựavàotỷlệnướccótrongmẫutươi.Lấy25gmẫu tươi (lá/rễ củ) đã được rửa sạch, ráo nước cho vào tờ giấy kẽm đã biết trước khối lượng.Đặtcácmẫucùngtờgiấykẽmvàotủsấyở105ºCtrong1giờsauđósấymẫu ởnhiệtđộ50ºCchođếnkhốilượngkhôngđổi.Cânkhốilượngmẫusaukhisấy[23]. Độ ẩm của mẫu thực vật được tính theo côngthức:

N (%) = [(a - b)/a] ×100 Trong đó: - N: phần trăm hàm lượng nước trong mẫu tươi (độ ẩm)

2.3.3.2 Địnhlượng vitamin C bằng phương pháp sử dụngI 2

KẾT QUẢ VÀBÀNLUẬN

ĐẶCĐIỂMTHỰCVẬTHỌCVÀĐADẠNGDITRUYỀNCỦACÂYSÂMCAU TẠI THỪATHIÊNHUẾ

3.1.1 Đặcđiểm thực vật học của cây Sâmcau

Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi ghi nhận tại tỉnh Thừa Thiên Huế có sự phân bố loài Sâm cau trong tự nhiên Các cây Sâm cau tại Thừa Thiên Huế đượctìm thấy dưới tán rừng trồng của các loài Thông hai lá (Pinus merkusii) và Thông ba lá (Pinus kesiya) sống lâu năm ở ngay thành phố Huế (núi Ngự Bình) cũng như các huyện lân cận thuộc huyện Hương Trà (núi Hương Thọ) và huyện Hương Thủy (núi Thiên Thai) (Hình 3.1) Đặc điểm khí hậu nơi có Sâm cau phân bố: nhiệt độ trung bình 24,0 - 25,2 º C, lượng mưa trung bình trong năm khoảng 2.600 - 2.800 mm vàđộ ẩm 83 -84%.

Hình 3.1 Hình ảnh điều tra vùng phân bố cây Sâm cau tại Thừa Thiên Huế

Ghi chú: A: Núi Ngự Bình; B: Núi Thiên Thai; C: Núi Thiên Thọ.

(Nguồn: Kết quả điều tra năm2017) Đặc điểm chung của cây Sâm cau tại khu vực nghiên cứu đều phân bố ở vùng núi thấp, nơi chuyển tiếp từ vùng núi cao xuống vùng đồng bằng ven biển Độ cao tìm thấy nằm trong khoảng từ 41 - 57 m so với mực nước biển, với số cây dao động từ44-108cây/ ha;độtànchetừ0-45%,tuynhiênđộtànchetừ0-5%thìcósố lượng cây/ha cao nhất và đạt từ 105 - 108 cây/ha, điều đó chứng tỏ Sâm cau có nhu cầuánhsánglớn.Ngoàira,Sâmcaucũngcóthểphânbốởđộdốctừnơiđấtbằng(0 độ) đến nơi đất rất dốc (trên 30 độ) (Bảng3.1).

Thực bì cũng là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tái sinh từđóảnhhưởngđếnsựphânbốcủaSâmcau.Kếtquảkhảosátchothấyởnhữngđịa điểmphânbốkhácnhauthìcósựkhácnhauvềđộchephủvàchiềucaothựcbì.Đối với khu vực có mật độ cây/ha nhiều như tại vùng núi Thiên Thai và núi Thiên Thọ thì độ che phủ và chiều cao thực bì thấp hơn tại núi Ngự Bình (Bảng 3.1) Ngoài ra, vùng núi Ngự Bình có độ tàn che đạt 45%, cao hơn nhiều so với ở vùng núi Thiên Thai (0%) và vùng núi Thiên Thọ(5%).

Bảng 3.1 Đặc điểm phân bố, thực bì và phẫu diện đất tại các vùng nghiên cứu

Chỉ tiêu Núi Ngự Bình Núi Thiên Thai NúiThiênThọ Độ cao (m) 41 57 54 Độ dốc (độ) ≥ 30 ≤ 30 ≤ 30 Độ tàn che (%) 45 0 5

N (cây/ha) 44 108 105 Độ ẩm tầng 0 - 30 cm (%) 30 - 40 45 - 50 30 - 40 Độ dầy tầng thảm mục (cm) 0,2 - 1,2 0,1 - 0,4 0,2 - 0,4 Độ che phủ thực bì (%) 20 - 30 10 - 20 15 - 20

Màu sắc đất Đỏ nâu Vàng nhạt Xám

Loại đất Đất Leptosols Đất Leptosols Đất Acrisols

(Nguồn: Kết quả điều tranăm2017)Bêncạnhđó,loạiđấtvàđámẹcũnglàvấnđềquantrọngquyếtđịnhđếnsựthà nhbạicủacácthínghiệmtrồngcũngnhưsảnxuất.Kếtquảđiềutracácphẫudiệnđất cho thấy Sâm cau trong tự nhiên phân bố trên nền đất Leptosols có màuv à n g (ởnúiNgựBình)hoặcmàuđỏnâu(ởnúiThiênThai);hoặcđấtAcrisolscómàuxám

(ởnúiThiênThọ).Cácloạiđấtnàycóđặcđiểmchunglàthườnglẫnnhiềusỏisạnvà tầng mặt thường bị xói mòn trơ sỏi đá từ 20 - 70% (Bảng 3.1).

Tại Thừa Thiên Huế, cây Sâm cau tìm thấy trong tự nhiên phân bố ở các tiểu vùng sinh thái có độ cao từ 41 - 57 m so với mực nước biển, thấp hơn rất nhiều so vớimộtsốkhuvựctrongnướcvàtrênthếgiới.Ởmộtsốvùngđấtẩmvenrừng,nhất làcácrừngđávôihoặctrênnươngrẫycủaViệtNam,Sâmcauthườngmọcởđộcao tới 1.500 m [1] Ở Java, Sâm cau phân bố trên các đồng cỏ trảng nắng hoặc bị che bóng nhẹ, tại những khu vực có một mùa khô hạn hoặc dưới tán các rừng Tếch, ởđộ cao 400 m so với mực nước biển [22] Ở vùng núi cận nhiệt đới của miền Trung dãy HimalayacóthểthấySâmcauphânbốởđộcaolêntới2.250m[102].Sâmcauđược xemlàloàicâybảnđịacủaẤnĐộvàxuấthiệnrộngrãinhiềukhuvựckhácnhưvùng Mahabharat (Nepal), Khasia Hills, Assam, Arunachal, Manipur, Bengal; Western Ghats từ Konkan về phía nam-Bang Maharashtra, Kanara, Nilghiris, Madras đến Cape Comorin, Tích Lan, Trung Quốc, Nhật Bản và Nepal ở độ cao từ mực nước biển đến 2.300 m [94], [155] Ngoài ra, trong nghiên cứu tổng quan của Hiba và cs (2020) còn cho thấy loại thảo mộc nhỏ này được phân bố rộng rãi và phát triển tốt trên nền đất ẩm và giàu mùn trong các khu rừng râm mát ở châu Á Khoảng cách tối ưu giữa 2 củ là 10 × 10 cm[94].

3.1.1.2 Đặcđiểm hình thái của Sâmcau

Quátrìnhđiều tra thực địa tại mộtsốkhu vựcthuộctỉnh ThừaThiênHuế,chúngtôinhậnthấycâySâmcaucócácđặcđiểmhìnhtháiđượcmôtảởHình3.2vàBả ng3.2nhưsau:Sâmcau(CurculigoorchioidesGaerrtn.)làcâythânthảosốnglâunăm,thườngphânb ốtrêncácvùngđồinúi.Câycóthểphânthànhnhiềunhánh,khoảng1-10nhánh.Loài cây này có rễ củ nằm ẩn dưới mặt đất, mặt ngoài sần sùi có màuvàngnâuđậm,mặtcắtmàukem;bềmặtcónhiềunếpnhănvàvếtnứtngangnông;mùikhôngrõrệt; cótínhnhầyvàvịhơiđắng.Rễcủhìnhtrụ,cóchiềudàikhoảng1,5-13,5cm,đườngkínhkhoảng0,5-

2,0cm.Từrễcủmọctỏaraxungquanhcácrễphụnhỏhình tròn, có màu trắng đục hoặc màu vàng nâu.

Láđơn,mọccách,thuôndàihìnhmũimác,chópláthườngnhọnhoặchơitù,dàikhoảng9-

2,8cm.Lácó6gânchính,3gânnổilêntrênvà3gânnổidưới,cácgânchínhsongsongvớinhau.Trênbềmặt lácóphủlôngtơ.Lácóbẹlábaophủxungquanhrễcủ.Cuốnglácómàuxanhhoặctímxanh,dàikhoảngtừ2,0-18,5cm.

Hình 3.2 Hình thái cây Sâm cau tại tỉnh Thừa Thiên Huế

Ghichú:A.CâySâmcauC.orchioidesGaertn.;B.Lá;C.Rễcủ;D.Tiếtdiệnngangcủacủ;E.Tiết diện dọc của củ;F.Cây mang hoa;G.Một hoa hoànchỉnh;H.Mặttrướccủahoa;I.Mặtsaucủahoa;K.Mộtquảhoànchỉnhkhinon;L,M.Quảg ià;N.Hạt.

Hoacóhìnhdángđẹp,màuvàngsáng.Hoacó6cánhvới3láđàivàtrànghoa Đài hoa 3 cánh nhẵn có phủ lớp lông mềm Nhị hoa 6 xếp thành 2 dãy, chỉ nhị ngắn, bầu hình thoi Mỗi cuống hoa chứa 3 đến 4 hoa, trong đó 1 - 2 hoa đầu là lưỡngtính, còn lại là đơntính.

Quả nang, nằm ẩn trong bẹ lá Quả màu trắng xốp, chứa từ 2 - 14 hạt Hạt có lông tơ bao phủ, khi còn non có màu trắng và chuyển dần sang màu vàng nâu đến màuđensángbónglúcgià.Vỏhạtcứng,trênbềmặthạtcórãnhsâutheođườnglượn sóng Đầu tận cùng của hạt cong cong hình móckhóa.

Bảng 3.2 Đặc điểm thực vật học của cây Sâm cau tại các vùng nghiên cứu Chỉ tiêu Núi Ngự Bình Núi Thiên Thai Núi Thiên Thọ

Chiều dài rễ củ (cm) 9,77 a ± 3,11 6,60 b ± 2,59 5,80 c ± 2,36 Đường kính rễ củ (cm) 1,25 a ± 0,35 0,9 b ± 0,19 0,73 c ± 0,12 Chiều dài cuống lá (cm) 5,24 c ± 2,52 5,67 b ± 3,39 3,00 a ± 0,53 Chiều dài lá (cm) 24,30 b ± 9,64 40,54 a ± 11,03 14,97 c ± 3,33 Đường kính lá (cm) 1,85 a ± 0,34 1,54 b ± 0,36 1,22 c ± 0,35

Quả Thuôn dài chứa hạt

Hạt Có rãnh sâu theo đường lượnsóng

Ghi chú: Các chữ cái a, b, c theo sau trong cùng một hàng chỉ sự sai khác cóý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05 (Duncan’s test)

Như vậy, cây Sâm cau phân bố tại tỉnh Thừa Thiên Huế tương đồng về đặc điểm thực vật học, chỉ khác biệt về kích thước của lá, rễ củ, hoa, quả và hạt Tuy nhiên,câySâmcauthuthậpđượctạivùngnúiNgựBìnhvớiđộtànchecũngnhưđộ dày tầng thảm mục cao nhất, phân bố trên nền đất dốc trên 30 độ (Bảng 3.1) Kích thước rễ củ, đường kính lá của cây Sâm cau tại vùng núi này lớn hơn so với cácmẫu thu thập được tại hai vùng núi Thiên Thai và núi ThiênThọ; còn chiều dài cuống lá và chiều dài lá Sâm cau cao nhất ở vùng núi Thiên Thai, số nhánh cây Sâm cau cao nhất ở vùng núi Thiên Thọ(Bảng3.2).

Qua phân tích đối chiếu với các dẫn liệu nghiên cứu được công bố trong và ngoài nước, chúng tôi nhận thấy các mẫu cây Sâm cau phân bố trong tự nhiên tại Thừa Thiên Huế có sự đồng nhất cao về các đặc điểm thực vật học.

3.1.1.3 Đặcđiểm vi phẫu của Sâmcau Đặc điểm vi phẫu của lá Sâmcau

Lá cây Sâm cau có đặc điểm chung của hầu hết các cây thực vật một lá mầm là thường xếp thẳng đứng, hai mặt của lá được chiếu sáng tương đối đồng đều nhau, dođócócấutạotươngđốiđồngnhất.Quansátdướikínhhiểnviquanghọcchothấy tiết diện ngang của lá gồm các phần chính được mô tả trong Hình3.3.

Hình 3.3 Cấu trúc vi phẫu của lá cây Sâm cau

Ghi chú: A Trục giữa của lá; B Phiến lá; C Mép lá; D Cuống lá;

AbE - Biểu bì xa trục; AdE - Biểu bì hướng trục; AdG - Rãnh đính trục; APh - Phloem đính trục; BS - Bao mạch; Ep - Biểu bì; LM - Mép lá; MR - Gân giữa; MT

- Nhu mô đồng hoá; MX - Metaxylem; Ph - Phloem; PX - Protoxylem; Sc - Cương mô; St - Khí khổng; Xy – Xylem.

- Phiến lá (Leaf-blade): bao phủ ngoài cùng ở cả mặt trên và mặt dưới của lá là các tế bào của lớp biều bì (Epidermis - Ep) có hình chữ nhật Nằm xen kẽ với các tếbàobiểubìcủaphiếnlácòncócáctếbàolỗkhí(Stomata-St).Ngoàira,ởmặt trêncủaphiếnlácònthấycókíchthướclớnhơncáctếbàobiểubìvàxếpthànhhình rẻ quạt, được gọi là các tế bào trương nước (tế bào động cơ, tế bào vận động, Bulliform cell - BC) Các tế bào BC này sẽ giúp cho cây hạn chế được sự thoát hơi nướckhitrờikhônónghoặccâybịchiếusángquámạnhthôngquahiệntượngtếbào bịmấtnướcvàxẹpxuống,méptrêncủalácolạivàlàmchophiếnlácuốnthànhống.

- Cuống lá (Peduncle): có cấu tạo tương tự phiến lá, bao gồm các tế bào biều bì Ep bên ngoài, trong là lớp nhu mô đồng hoá (Ground Tissue - GT) và các bó dẫn chồng chất kín xếp thành vòng cung theo độ cong của cuốnglá.

- Thịtlá(Nhumôđồnghoá,MesophyllTissue-MT):Nằmphíatronglớpbiểu bì, bao gồm các tế bào có hình tròn hoặc hình có cạnh tròn xếp sát nhau và đượcbao quanh bởi các khoảng gianbào.

- Hệ dẫn (Conducting System): gồm các bó dẫn (Vascular Strand - VS) phân bố song song với nhau trong nhu mô đồng hoá thành hàng tương ứng với hệ gân lá. Xung quanh các bó mạch có các tế bào bao mạch (PericapillaryCell). Đặc điểm vi phẫu của rễ củ Sâmcau

Vi phẫu theo mặt cắt ngang của rễ củ Sâm cau có hình tròn và phân bố từ ngoàivàotrongđượcbiểudiễnởHình3.4nhưsau:baophủbênngoàicủarễcủSâm cau là gồm 4 - 10 lớp tế bào hoá bần (Cork - Ck) có thành dày, hình chữ nhật xếp thành dãy đồng tâm hoặc xuyên tâm thuộc lớp vỏ ngoài (Epidermis - Epi) Tiếp đến là phần mô mềm vỏ (Parenchymal Tissue - PT) chiếm hơn ẵ bỏn kớnh vi phẫu, gồm cỏc tế bào phớa ngoài hỡnh trũn hoặc đa giỏc, cỏc tế bào phía trong hình đa giác hoặc hơibầudụcxếpsátnhauvàđượcgiớihạnbởicáckhoảnggianbào.Rảirácgiữacác tế bào mô mềm là các ống tiết (Secretory Canal - SC) và các bó mạch (Vascular Bundle - VB) là vết tích của các rễ phụ, đồng thời còn có các bó tinh thể calcium oxalate hình kim (Raphide - Ra) và các hạt tinh bột (Starch Grain - SG) Nội bì (Endodermis-End)gồm1lớptếbàohìnhchữnhậtnhỏxếpsátnhautạothànhvòng liên tục bao quanh phần trung trụ Các bó Phloem - Xylem nằm ngay dưới lớp trụ bì hình đa giác, phân hoá hướng tâm thành từng cụm hình bầu dục, khôngđều.

Hình 3.4 Cấu trúc vi phẫu của rễ củ Sâm cau

Ghi chú: A Rễ củ rễ Sâm cau; B Tiết diện ngang của rễ củ Sâm cau; C - G. Viphẫu Sõm cau dưới kớnh hiển vi ở kớch thước 40 àm (C) và400 àm (D - G);

Ck - Bần; End - Nội bì; Epi - Ngoại bì; Id - Dị bào; Ph - Phloem (Libe); PT

- Nhu mô (Parenchymal Tissue); Ra - Tinh thể Calci oxalate (Raphide); SC - Ốngtiết (Secretory Canal); SG - Hạt tinh bột; VB - Bó mạch; Xy - Xylem (Gỗ).

NghiêncứucấutrúcviphẫuSâmcauchothấy,rễcủcủacâyđượcbaobởi1 lớp bần hẹp, gồm

ĐẶC ĐIỂM HOÁ SINH CỦA CÂY SÂM CAU TẠI THỪA THIÊN HUẾ80 1 Một số chỉ tiêu hóa sinhcơbản

3.2.1 Mộtsố chỉ tiêu hóa sinh cơbản

CácmẫulávàmẫurễcủcủaSâmcauthuđượcởcáckhuvựcphânbốtạiThừa Thiên Huế được tiến hành phân tích định lượng các chỉ tiêu về độ ẩm (hàm lượng nước), hàm lượng tro, cellulose, vitamin C, lipid tổng số, và protein tổng Kết quả phân tích được trình bày ở Bảng3.13.

Qua kết quả phân tích định lượng cho thấy, hàm lượng của các chỉ tiêu có sự saikhácgiữacácphânbố.CácmẫulávàrễcủcủaSâmcauphânbốởvùngnúiNgự Bình cho chỉ số cao nhất về hàm lượng tro (ở lá: 10,800 ± 0,196 %, ở rễ củ: 9,180 ± 0,263%) và hàm lượng lipid tổng (ở lá: 10,420 ± 0,03%, ở rễ củ: 8,170 ± 0,04%), nhưnghàmlượngproteintổngthấp(ởlá:0,166±0,022mg/g,ởrễcủ:1,780±0,042 mg/g) Các mẫu Sâm cau phân bố ở vùng núi Thiên Thai có chỉ số về hàm lượng vitamin C (0,147 ± 0,013% ở rễ củ và 0,172 ± 0,006% ở lá) và hàm lượng protein tổng (3,480 ± 0,069 mg/g ở rễ củ và 0,350 ± 0,013 mg/g ở lá); các giá trị này là cao nhất trong các mẫu phân tích của 3 vùng nghiên cứu.

Các mẫu Sâm cau tại vùng núi

0,067%),trongkhicácchỉsốvềđộẩm,vitaminCvàhàmlượnglipidtổnglàthấp nhất.Hàmlượngnước(độẩm)củamẫuđượcxácđịnhbởisựchênhlệchkhốilượng của mẫu thực vật tươi trước khi sấy và sau khi sấy khô tuyệt đối Giữa mẫu rễ củ và lá trong cùng một cây Sâm cau thu tại cùng 1 địa điểm thì mẫu rễ củ luôn có độ ẩm caohơn.ĐốivớimẫuSâmcauthuởcácđịađiểmkhácnhauthìcóđộẩmkhácnhau, trong đó mẫu thu tại núi Ngự Bình có độ ẩm cao nhất (79,853% ở rễ củ, 78,833% ở lá) và thấp nhất là mẫu thu tại núi Thiên Thọ (78,016% ở rễ củ, 77,778% ởlá).

Bảng 3.13 Một số chỉ tiêu hóa sinh cơ bản của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu

Chỉ tiêu Mẫu Địa điểm

Núi Ngự Bình Núi Thiên Thai Núi Thiên Thọ Độ ẩm

Ghi chú: Các chữ cái a, b, c theo sau trong cùng một hàng chỉ sự sai khác cóý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05 (Duncan’s test)

Các thông số hóa lý có ý nghĩa quan trọng trong việc kiểm tra chất lượng thuốc, thành phần vô cơ và các tạp chất khác có trong thuốc, hoặc có thể biết được chấtđất.Sonivàcs(2011)khiphântíchcácmẫurễcủcủaSâmcaucónguồngốctừ vùng núi thuộc Jabalpur và Chhindwada (Ấn Độ) đã xác định được một số chỉ tiêu hóalýcủacây,trongđókếtquảđịnhlượngvềđộẩmlà10,32%[194].Trongkhiđó, rễcủcâ ySâmca utừ vù ng Badlapur, Maha ras ht ra, ẤnĐộ cũngđ ượ c Patil và cs

(2012) xác định là 74,40% [158] Phân tích của Raj và cs (2018) trên các mẫu Sâm cau hoang dại, trồng trang trại hay nuôi cấyin vitrocho các giá trị về độ ẩm lần lượt là 7,67%, 8,13% và 8,32% [169] Như vậy, rễ củ Sâm cau phân bố tại Ấn Độ đều có độẩmthấphơncácgiátrịmàchúngtôithunhậnđược.Ngoàira,độẩmcủacâySâm cau thu hái tại Na Hang - Tuyên Quang cũng cho giá trị về độ ẩm (đạt 60,1%) thấp hơn so với các mẫu nghiên cứu tại Thừa Thiên Huế[19].

Dựa vào đặc tính bền không tan trong môi trường acid và kiềm, hàm lượng celluloseđượcxácđịnhthôngquakhốilượngcònlạicủamẫusaukhixửlý.Kếtquả thu được cho thấy hàm lượng cellulose của cây Sâm cau thu hái tại Thừa Thiên Huế tương đương với các mẫu thu tại các địa điểm khác như: Kottayam, Muvattupuzha, Emakulam, Thrissur [46] Tuy nhiên, lượng cellulose trong các mẫu rễ củ ở nghiên cứu của chúng tôi thu được lại cao hơn so với các mẫu thu hái tại Na Hang - Tuyên Quang, chỉ đạt 15,1%[19].

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng tro, lipid và protein ở các mẫu thí nghiệm là cao hơn kết quả của Arinathan [44] Sau khi hóa tro trong lò nung, kết quả thuđượcchothấykhốilượngcònlạicủamẫuláSâmcauthutạicùng1địađiểmcao hơnsovớimẫurễcủ(Bảng3.13).MẫutạinúiThiênThaicóhàmlượngtrothấpnhất (8,08% ở rễ củ, 8,78% ở lá), còn mẫu tại núi Ngự Bình có hàm lượng tro cao nhất (9,18% ở rễ củ, 10,80% ở lá) và cao hơn các mẫu rễ củ Sâm cau tại Ấn Độ dược nghiên cứu (8,46% - 8,6%) [36], [44],[53].

Soni và cs (2011) khi phân tích các mẫu rễ củ của Sâm cau có nguồn gốc từ vùng núi thuộc Jabalpur và Chhindwada (Ấn Độ) đã xác định được hàm lượng tro tổng số đạt 4,68% [194] Tỉ lệ tro tổng số của rễ củ cây Sâm cau thu thập từ vùng Badlapur, Maharashtra, Ấn Độ được Patil và cs (2012) xác định là 8,0% [158] Hàm lượngtrotrongcácmẫurễcủcủacâySâmcauhoangdại,hoặcđượcnuôitrồngtrong tựnhiênhaynuôicấyinvitrotheonghiêncứucủaRajvàcs(2018)đượcxácđịnhcó giátrịtươngứnglà4,15%,10,88%,7,18%[169].NghiêncứucủaVũThịThuLêvà cs (2022) trên câySâm cau thu hái tại Na Hang-Tuyên Quang cho giá trị về hàm lượngtrođạt6,9%[19].Nhưvậy,kếtquảchothấyphântíchtrênmẫurễcủSâmcau trong tự nhiên ở các thí nghiệm trên đều cho hàm lượng tro thấp hơn các giá trị mà chúng tôi thu nhận được.

Kết quả phân tích hàm lượng tro tổng số trong mẫu rễ củ của cây Sâm cau ở vùngnúiThiênThaivàvùngnúiThiênThọđềuchogiátrịkhôngvượtquá9%,tương đồng với báo cáo của Bhangi và cs (2020)[51].

Bên cạnh đó, dựa vào tính chất dễ tan trong nước và tính khử đối với các chất màu, chúng tôi đã định lượng vitamin C trong nguyên liệu Kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng vitamin C trong các mẫu lá thu được cao hơn so với mẫu rễ củ, tuy nhiên sự chênh lệch hàm lượng này không lớn Mẫu ở núi Thiên Thai cho giá trị vitamin C cao nhất(0,147%ởrễcủ,và0,172%ởlá),trongkhiđóSâmcauởnúiThiênThọlạicóhàm lượng vitamin

C thấp nhất (0,088% ở rễ củ và 0,103% ở lá) (Bảng 3.13) Hàm lượng vitaminCcósựchênhlệchlớngiữacácđịaphươngvàthấphơnkếtquảnghiêncứucủa Arinathan và cs (2009) [44] và kết quả của Vũ Thị Thu Lê và cs (2022)[19].

3.2.2 Phântích định tính một số dược chất trong Sâm cau ở Thừa ThiênHuế

- Phản ứng với dung dịch 10% NaOH: sau khi bổ sung dung dịch 10% NaOH vàodịchchiếtSâmcau,kếtquảdungdịchchuyểndầnsangmàuvàngđậm,chothấy mẫu có phản ứng dương tính với dung dịch 10% NaOH (Hình 3.12b, Hình3.13b).

- Phản ứng với FeCl 3 : sau khi bổ sung dung dịch 5% FeCl3vào dịch chiết Sâmcau, kết quả là dung dịch chuyển từ màu vàng trong sang màu xanh đen, cho thấymẫu có phản ứng dương tính với FeCl 3 (Hình 3.12c, Hình3.13c).

Kết luận: Các mẫu Sâm cau nghiên cứu có chứa flavonoid.

- Phản ứngBenedict:khi chothuốcthửBenedictvào ốngnghiệmchứa dịchchiết ethanolcủaSâmcauthìsau5phútthấyxuấthiệnkếttủamàuvàngđếnvàngcam,chứngtỏmẫuc óphảnứngdươngtínhvớithuốcthửBenedict(Hình3.12d,Hình3.13d).

- Phản ứng Felling: đun sôi cách thủy dịch Sâm cau với thuốc thử Felling thì thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch, chứng tỏ mẫu có phản ứng dương tính với thuốc thử Felling (Hình 3.12e, Hình3.13e).

Kết luận: Trong cây Sâm cau Thừa Thiên Huế có thành phần polysaccharide.

- Dựatrêntínhchấttạobọt:LắcmạnhhỗndungdịchchứabộtSâmcautrong5 phút, có hiện tượng tạo bọt nhưng khôngbền.

- DựavàophảnứngLiebermann-Burchard,kếtquảchothấyởmặttiếpxúcgiữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng phân cách màu hồng đến tím đỏ Kết quả này chứng tỏ mẫu có phản ứng dương tính với saponin triterpenoid (Hình 3.12f, Hình3.13f).

Kết luận: Trong cây Sâm cau Thừa Thiên Huế có chứa hoạt chấtsaponin.

Hình 3.12 Phân tích định tính các mẫu lá Sâm cau tại khu vực nghiên cứu Ghi chú: a Dịch chiết lá Sâm cau; b Dịch chiết sau khi thêm 10% NaOH; c Dịchchiết sau khi thêm FeCl 3 ; d Dịch chiết sau khi thêm thuốc thử Benedict và đunsôi; e Dịch chiết sau khi thêm dung dịch Felling và đun sôi; f Dịch chiết với thuốc thửLiebermann-Burchard; g Dịch chiết sau khi thêm Mayer; h Dịch chiết sau khi thêm Dragendorff; i Dịch chiết sau khi thêm Bouchardat.

3.2.2.4 Địnhtínhalkaloid Để xác định sự hiện diện của hợp chất alkaloid trong các mẫu rễ củ và lá của câySâmcautạiThừaThiênHuế,chúngtôiđãtiếnhànhkiểmtravới3loạithuốcthử khác nhau và thu được kết quả nhưsau:

- Với thuốc thử Mayer (K 2 HgI4): cho phản ứng dương tính, xuất hiện kết tủamàu vàng (Hình 3.12g, Hình3.13g). a b c d e f g h i

- Thuốc thử Dragendorff (KBiI 4 ): cho phản ứng dương tính, xuất hiện kết tủamàu vàng cam (Hình 3.12h, Hình3.13h).

- ThuốcthửBouchardat(KI 3 ):chophảnứngdươngtính,trongdịchmẫucóxuấthiện kết tủa cho màu nâu đỏ (Hình 3.12i, Hình3.13i).

Kết luận: Có hoạt chất alkaloid tồn tại trong cây Sâm cau tại Thừa Thiên Huế.

Hình 3.13 Phân tích định tính rễ củ Sâm cau tại khu vực nghiên cứu

Ghi chú: a Dịch chiết rễ củ Sâm cau; b Dịch chiết sau khi thêm 10% NaOH; c Dịch chiết sau khi thêm FeCl 3 ; d Dịch chiết sau khi thêm thuốc thử Benedict vàđun sôi; e Dịch chiết sau khi thêm dung dịch Felling và đun sôi; f Dịch chiết với thuốc thử Liebermann-Burchard; g Dịch chiết sau khi thêm Mayer; h Dịch chiết sau khi thêm Dragendorff; i Dịch chiết sau khi thêm Bouchardat.

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦASÂMCAU

Từ các kết quả phân tích hoá sinh ở các phần trên có thể thấy rằng mẫu rễ củ Sâm cau phân bố tại vùng núi Ngự Bình có hàm lượng dược chất cao hơn hẳn hai vùng còn lại, đặc biệt là nồng độ lycorine trong dịch chiết Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu rễ củ Sâm cau (≥ 3 năm tuổi) tự nhiên tại vùng núi Ngự Bình

(thànhphốHuế,tỉnhThừaThiênHuế),tạodịchchiếtnướcvàđánhgiátácdụngdược lý của dịch chiết Sâm cau trên 2 mô hình thựcnghiệm.

3.3.1 Đánhgiá tác dụng ức chế tế bào ung thư dạ dày MKN45 của dịch chiết

3.3.1.1 Tácđộng của dịch chiết Sâm cau lên kiểu hình tế bàoMKN45

Kết quả quan sát sau 48 giờ nuôi cấy các tế bào dòng ung thư dạ dàyMKN45 trong môi trường bổ sung dịch chiết từ rễ củ Sâm cau với các nồng độ khác nhau được trình bày ở Hình 3.14 Ở nồng độ dịch chiết Sâm cau 100 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL cho kết quả tương tự như trên môi trường đối chứng (0 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL) Các tế bào MKN45 không cósự thay đổi đáng kể nào về mật độ và kiểu hình: các tế bào có hình ovan hoặc thon dài phát triển bám dính đồng đều trên bề mặt môi trường nuôicấy.

Hình 3.14 Ảnh hưởng của dịch chiết Sâm cau lên mật độ và kiểu hình của tế bào ung thư dạ dày MKN45 (Thang đo 100 àm) Ởnồngđộdịchchiết200μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mLsau48giờnuôicấychothấy,dịchchiếtSâm cau đã có sự ảnh hưởng đến số lượng và hình dạng tế bào MKN45 Dưới kính hiển visoingược,mộtsốtếbàocóhiệntượngconguyênsinhchấtlàmchothểtíchtếbào nhỏ hơn và đậm màu hơn tế bào bình thường, một số tế bào có kiểu hình của tế bào chết Các tế bào cũng phân bố không đồng đều trên bề mặt môi trường nuôi cấy, số lượngtếbàoquansátđượcchỉđạt80%sovớiđốichứngtrêncùngmộtdiệntíchnuôi cấy Như vậy, ở mức nồng độ dịch chiết 200 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL, dịch chiết nước từ cây Sâmcau đãcónhữngảnhhưởnglàmsuygiảmsốlượngtếbàonuôicấyvàlàmxuấthiệnnhiều các tế bào của kiểu hìnhchết. Ở các nồng độ dịch chiết Sâm cau 500 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL và 1.000 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL, số lượng tế bàoquansátđượctrongcùngmộtdiệntíchnuôicấygiảmmạnhcùngvớisựtănglên của nồng độ dịch chiết được bổ sung thêm vào môi trường Cùng với đó, các tế bào quan sát được đã mất đi khả năng bám dính trên bề mặt nuôi cấy và co cụm thành từng đám tế bào Các tế bào quan sát được hầu hết có kiểu hình của tế bào chết với chất nguyên sinh co lại và có màu đậm hơn so với tế bào bìnhthường.

Từ kết quả phân tích có thể thấy rằng, dịch chiết từ cây Sâm cau có tác độngđến số lượng và kiểu hình của các tế bào nuôi cấy dòng MKN45 Bắt đầu từ nồng đồ 200 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL, dịch chiết đã có tác động đáng kể lên số lượng và hình thái của tế bào nuôicấy.

3.3.1.2 Tácđộng của dịch chiết Sâm cau lên sự tăng sinh tế bàoMKN45

MKN45 là dòng tế bào ung thư dạ dày thuộc thể phân tán và được sử dụng trongnhiềunghiêncứuđộctínhcủacácthuốchoặchợpchấtsinhhọc.Kếtquảnghiên cứu tác động của dịch chiết cây Sâm cau lên sự tăng sinh của dòng tế bào MKN45 được thể hiện ở Hình3.15.

Hình 3.15 Tỷ lệ tăng sinh (A) và tỷ lệ ức chế (B) của tế bào MKN45

Kếtquảnghiêncứuchothấy,ngaytrongmôitrườngnuôicấycóbổsungdịch chiết Sâm cau ở nồng độ 100 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL, sự tăng sinh của tế bào MKN45 đã có sựgiảm thiểu so với đối chứng (p > 0,05) Mức độ suy giảm sự tăng sinh của tế bào MKN45 trongmôitrườngnuôicấytănglênkhinồngđộdịchchiếttăngtừ200-1.000μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL Ở nồng độ cao 1.000 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL, dịch chiết từ cây Sâm cau đã ức chế hoàn toàn sự tăng sinh tế bào MKN45, với tỷ lệ sống sót dưới 20% Như vậy, dịch chiết cây Sâm cau cókhảnăngkìmhãmsựtăngsinhcủatếbàoMKN45trongmôitrườngnuôicấy.Giátrịứcchếsựtăngsinht ếbàoIC50đ ư ợcxácđịnhsau48giờxửlývớidịchchiếtđượcxác định là 221,9μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL.

Junction,NJ,USA)trong48giờcũnggâyảnhhưởnglênhìnhtháitếbào.Tráingược với các tế bào của nhóm đối chứng thể hiện các đặc điểm bình thường với hình thái màngnguyênvẹn,kếtdínhđiểnhình,cácnhómđiềutrịbằngdeguelinchothấyhình thái biến dạng màng rõ ràng với mức độ nghiêm trọng phụ thuộc liều[113].

Trong một nghiên cứu trên loàiCyrtopodion scabrum, Rashidi và cs (2017) đã cho thấy khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào của các dòng tế bào ung thư đườngtiêu hoá khác nhau Kết quả thu được sau 72 giờ nuôi cấy, giá trị IC50ở dòng tế bàoung thư đại tràng SW742, dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 và dòng tế bào ung thưganHepG2đượcxácđịnhlầnlượtlà0,251mg/mL;0,38mg/mLvà0,86mg/mL với khả năng gây độc tương ứng đạt từ 30 - 78%[175].

Một nghiên cứu trước đó của Wei-Yan và cs (2016) đã cho thấy, 5 trong số 7 hợp chất mới thuộc nhóm arbutin được tách chiết và tinh sạch từ câyHeliciopsislobatađềucóảnhhưởngứcchếsựtăngtếbàoungthưbiểumôdạdàyMGC-803vàtế bào biểu mô thực quản HEEC với giá trị IC50> 50 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL Cụ thể, các hợp chấttừ

H lobatađã ức chế phát triển của các tế bào MGC-803 với tỉ lệ từ 24,5% - 43,0% ở nồngđộ20μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL,trongđógrevillicacidchothấykhảnănggâyđộctếbàocaonhất so với tế bào bình thường Thành phần grevillic acid và hydroquinone trong câyH.lobatathể hiện khả năng gây độc tế bào đối với các tế bào MGC-803 với giá trị IC50lần lượt là 44,1 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/mL và 11,3 μg/mL lần lượt là 86,20 ±g/ mL [226] Như vậy có thể thấy rằng, dịch chiết từ các loài thảo dược khác nhau có mức độ tác động lên sự tăng sinh của dòng tế bàoung thư là không giống nhau và thường có giá trị IC50lớn hơn nhiều so với các chấtđã được tinh sạch từ dịchchiết.

Trongnghiêncứunày,chúngtôinhậnthấydịchchiếtrễcủSâmcauvớinồng độ lycorine cao cũng đã ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư dạ dàyMKN45.

Các báo cáo khoa học trước đây cho thấy, lycorine và các dẫn xuất của nó có hoạt tính ức chế và tính kháng chọn lọc đối với các dòng tế bào ung thư khác nhau chống lại đối với các dòng tế bào ung thư khác nhau như A549, TCT116, SK-OV-3, NCT- 11460, K562. MCE-7, UIL-60 Mel-1 Hoạt động hiệu quả của các hợp chất mang các nhóm thế amin khác nhau ở vị trí C2, hay sự hoạt hóa của các protein apoptosis liên quan đã gây nên sự chết của các tế bào Tỷ lệ gây chết tế bào phụ thuộc vào liều lượng và nồng độ của lycorine [107], [127], [160], [222].

Trên cơ sở thành tựu thu được về tác dụng của lycorine đối với việc làm giảm khảnăngtồntạitếbàocủabệnhbạchcầuIIL-60,tếbàoutủyKM3vàsựchếttếbào Li và cs (2012) đã tiếp tục nghiên cứu khả năng điều trị bệnh bạch cầu tủy mãn tinh K562 ở người Phân tích kết quả cho thấy lycorine làm giảm hoạt tính của enzyme histone deacetylase HDAC trong tế bào, dẫn đến ức chế tăng trưởng, ức chế sự gia tăng của tế bào K562 Khi điều trị bằng lycorine thì thấy sự hoạt hóa của protein bị giảm, protein cyclin DI và kinase 4 bị ức chế [129] Điều trị bằng lycorine cũng đã điều chỉnh đáng kể sự biểu hiện của p53 và sản phẩm gene mục tiêu của nó Những kết quả này cho thấy lycorine ức chế hoạt động của HDAC ít nhất là một phần trong việckhởihoạtởphaGo/Gıtrongchukỳtếbàovàcungcấpcơsởdẫnliệuđểtiếptục khám phá, sử dụng lycorine như một tác nhân chống ung thư[132].

3.3.2 Đánhgiá tác dụng của dịch chiết Sâm cau đến quá trình sinh tinh ởchuột

3.3.2.1 Tácđộng của dịch chiết Sâm cau đến nồng độtestosterone

ChúngtôitiếnhànhnghiêncứuảnhhưởngcủadịchchiếtSâmcaulênnồngđộhorm onetestosteronetrongmáuchuộtSwissđựcởđiềukiệnthườngvàdướitácđộngcủastressn hiệt.Kếtquảsau6tuầnthửnghiệmđượctrìnhbàyởBảng3.21vàHình3.16. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi cho chuột Swiss đực uống dịch chiết Sâm cauởcácliềudùng100mg/kg,200mg/kgvà400mg/kgđềuchothấycósựtăngnhẹ vềnồngđộtestosteronetrongmáusovớinhómđốichứng(C-11,320±6,192nmol/L) với giá trị trung bình lần lượt là: 11,401 ± 2,956 nmol/L, 11,786 ± 3,372 nmol/L,12,419±2,618nmol/L;tuynhiênmứctăngnàychưađạtýnghĩathốngkê(p>0,05).

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của dịch chiết Sâm cau đến nồng độ testosterone trong máu của chuột Swiss đực

Nghiêncứucònchothấy,nồngđộtestosteronetrongmáucủacácnhómchuột bị stress nhiệt đều có sự sụt giảm rõ rệt Ở chuột Swiss đực trưởng thành bị stress nhiệt 40ºC (nhóm H), nồng độ testosterone trung bình trong máu là 0,196 ± 0,154 nmol/L, thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng C (p < 0,005) Khi cho chuột bị stress nhiệt ở 40ºC và uống bổ sung dịch chiết Sâm cau 100 mg/kg (nhóm

HC100),200mg/kg(nhómHC200),400mg/kg(nhómHC400),nồngđộtestosterone trungbìnhđềuthấphơncóýnghĩathốngkêsovớinhómCvớicácgiátrịtestosterone thu được lần lượt là: 11,320 ± 6,192 nmol/L ở nhóm HC100 (p < 0,005); 1,303 ± 0,917nmol/LởnhómHC200(p