Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên Huế

Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên Huế

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Đề tài nghiên cứu được thực hiện với các vật liệu sau:

- Vật liệu thực vật: Loài Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.), thuộc chi

Cồ nốc (Curculigo), họ Hạ trâm (Hypoxidaceae), bộ Măng tây (Asparagales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp thực vật một lá mầm (Liliopsida) Cây Sâm cau được thu hái tại Thừa Thiên Huế phục vụ nghiên cứu có độ tuổi ≥ 3 tuổi Cây Sâm cau được định danh dựa trên các đặc điểm hình thái học bởi Thầy Trần Minh Đức, hiện đang công tác tại Khoa Lâm nghiệp, trường Đại học Nông lâm, Đại học Huế.

- Vật liệu động vật: Chuột Swiss đực, 8 tuần tuổi được mua từ Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, tỉnh Khánh Hòa Chuột sau khi nhận về được nuôi thích nghi với điều kiện thí nghiệm trong 2 tuần và đạt khối lượng 20 - 21 g/con trước khi tiến hành thực nghiệm Chuột được nuôi dưỡng và chăm sóc ở điều kiện phòng thí nghiệm, trong môi trường ổn nhiệt 26ºC ± 2; Lồng nuôi chuột Model TT được phủ đệm lót bằng dăm bào (mùn cưa) sạch, đã được sấy khô, khử khuẩn; Thức ăn doViện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.

ĐỊA ĐIỂM THU MẪU

Cây Sâm cau được thu hái trong tự nhiên và phân bố tại 3 địa điểm khác nhau trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế:

+ Thành phố Huế - Núi Ngự Bình (tọa độ: 16 º 26’34”B, 107 º 35’54”Đ),

+ Huyện Hương Thủy - Núi Thiên Thai (tọa độ: 16 º 24’22”B, 107 º 35’20’’Đ),+ Huyện Hương Trà - Núi Thiên Thọ (tọa độ: 16 º 21’45”B, 107 º 36’49”Đ) Các mẫu Sâm cau thu tại các tỉnh: Lai Châu, Quảng Bình, Quảng Trị, QuảngNam, Kon Tum, Lâm Đồng được tiến hành tách chiết genomic DNA, phục vụ cho phân tích RAPD.

Hình 2.1 Cây Sâm cau tại các địa điểm thu mẫu tại Thừa Thiên Huế

Ghi chú: A Núi Ngự Bình, B Núi Thiên Thọ, C Núi Thiên Thai.

Hình 2.2 Bản đồ thu mẫu Sâm cau tại Thừa Thiên Huế

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học

- Các đặc điểm hình thái, sinh trưởng và phát triển của cây Sâm cau được mô tả theo phương pháp của Nguyễn Nghĩa Thìn (2006) có cải tiến [29] gồm các chỉ tiêu:

+ Các chỉ tiêu về lá: chiều dài và chiều rộng của lá, chiều dài cuống lá được xác định trực tiếp bằng thước Lá được chọn trong nghiên cứu là lá thứ 3 - 5 trên cây (thường là lá lớn nhất) Tại mỗi khu vực phân bố Sâm cau, xác định 50 mẫu lá tươi/khu vực đang trong giai đoạn ra lá trong năm.

Các thông số liên quan đến rễ củ bao gồm chiều dài và đường kính được đo trực tiếp bằng thước Các mẫu rễ củ được thu thập và đánh giá tại thời điểm thu hoạch trong năm.

50 mẫu rễ củ tươi/khu vực được sử dụng để xác định.

+ Chỉ tiêu về nhánh: số nhánh/cây được đáng giá vào cuối thời kỳ ra lá trong năm, xác định 50 mẫu cây tươi/khu vực.

+ Các chỉ tiêu về hoa: màu sắc hoa, số cánh và nhị trên mỗi hoa được xác định vào thời kỳ nở rộ, xác định trên 10 cây/khu vực.

+ Các chỉ tiêu về quả, hạt: hình dáng quả, số lượng hạt /quả, xác định trên 10 cây/khu vực.

- Các đặc điểm cấu trúc vi phẫu được thực hiện theo phương pháp nghiên cứu hiển vi của Trần Công Khánh (2005) và Dược điển Việt Nam (2017) [5], [16]:

Để chuẩn bị các mẫu vi phẫu từ lá, cuống lá và rễ củ, các lát cắt được ngâm trong dung dịch javel để loại bỏ nội dung tế bào Các lát cắt được xử lý bằng chlorhydrate để loại bỏ javel, sau đó được acid hóa bằng acid acetic để loại bỏ chlorhydrate dư Các mẫu sau đó được nhuộm màu bằng iodine green và carmine, giúp tăng cường độ tương phản dưới kính hiển vi quang học Mẫu được đặt trong glycerine và quan sát để nghiên cứu cấu trúc vi mô.

+ Đối với mẫu bột: Lá và rễ củ Sâm cau sau khi rửa sạch được tách riêng, sấy khụ, tỏn thành bột Rõy qua rõy kớch thước 150 àm lấy phần bột mịn Tiếp theo, dùng kim mũi mác cho một lượng nhỏ bột Sâm cau lên lam kính có sẵn giọt nước khử ion, đậy lamen Quan sát các đặc điểm cấu tạo giải phẫu bột dược liệu bằng kính hiển vi.

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền cây Sâm sau

2.3.2.1 Kỹ thuật DNA mã vạch

Tại 3 khu vực thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế (núi Ngự Bình, núi Thiên Thai, núi

DNA tổng số của 15 mẫu lá Sâm cau tươi được tách chiết bằng kit TopPURE Plant DNA Extraction Kit (ABT, Việt Nam) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Tiến hành điện di kiểm tra DNA tổng số thu được trên gel argarose 1%.

Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt (SimpliAmp, Thermo Fisher Scientific, USA) với cặp primer trnL-trnF-F (5’-

AACCATCTCGTCTCCTGA-3’) [13] Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 1 àL DNA tổng số (100 ng/àL), 0,5 àL mồi/loại (10 pmol), 5 àL 2 x GoTaq Green Master Mix (Promega, Mỹ), 3 àL nước khử ion, tổng thể tớch phản ứng là 10 àL Quy trỡnh phản ứng PCR được trỡnh bày ở Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Quy trình nhiệt của phản ứng khuếch đại PCR

Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số chu kỳ

Phương pháp phân tích số liệu thí nghiệm

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được phân tích trình tự nucleotide ở công ty 1st BASE (Apical Scientific Sdn Bhd, Malaysia) Kết quả giải trình tự DNA được xử lý bằng phần mềm Bioedit (v7.2.5), DnaSP (v6.0) và MEGA 11 Mức độ tương đồng và độ bao phủ của các trình tự DNA được đánh giá bằng cách đối chiếu với các trình tự có sẵn trên cơ sở dữ liệu nr-nt của NCBI bằng công cụ BLAST (Basic local Alignment Search Tool) với các tham số mặc định Tiếp đó, các trình tự DNA được sắp xếp gióng cột bằng chức năng Clustal W trên phần mềm MEGA 11với các tham số mặc định Cây phát sinh loại được xây dựng dựa trên phương pháp Maximum Likelihood với giá trị bootstrap 1000 [202].

Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thu thập mẫu lá tươi của cây Sâm cau phân bố tại 7 tỉnh/thành phố khác nhau trên khu vực miền Bắc Việt Nam, bao gồm: Hà Nội, Thái Nguyên, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hưng Yên, Thái Bình và Nam Định.

Bộ và Tây Nguyên, bao gồm: Lai Châu, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Kon Tum, Lâm Đồng Tất cả 92 mẫu lá được thu thập để phân tích và ký hiệu như trình bày ở Bảng 2.2.

Bảng 2.2 Danh sách các xuất xứ Sâm cau được sử dụng trong nghiên cứu STT Địa điểm thu mẫu Số lượng mẫu Ký hiệu mẫu

DNA tổng số của Sâm cau được dùng làm khuôn để khuếch đại PCR-RAPD. Hỗn hợp phản ứng gồm: 20 pmol mồi, 10 àL PCR Master Mix 2ì (M7502, Promega); 50 ng DNA khuụn mẫu với tổng thể tớch phản ứng là 20 àL Phản ứng RAPD-PCR được thực hiện theo Quang và cs (2016) với 6 mồi oligonucleotide decamer ngẫu nhiên (Operon Technologies, USA) có chiều dài 10 nucleotide (Bảng 2.3) [166].

Bảng 2.3 Trình tự các mồi dùng trong PCR-RAPD STT Mồi Trình tự nucleotide (5’-3’)

Phản ứng được thực hiện trong máy luân nhiệt (SimpliAmp, Thermo FisherScientific, USA) với qui trình khuếch đại RAPD-PCR được trình bày trong Bảng2.4 Sản phẩm PCR-RAPD được phân tích trên gel điện di agarose 1,4% ở hiệu điện thế 40 V trong khoảng 6 giờ [166] Gel agarose được nhuộm bằng dung dịch đệm tải 6×

GelRed TM (ABT, Việt Nam) Hình ảnh điện di được thu nhận trên bàn đọc UV Các mẫu thiếu band trên gel agarose được khuếch đại lần hai để xác nhận.

Bảng 2.4 Quy trình nhiệt của phản ứng khuếch đại RAPD-PCR

Nhiệt độ (ºC) Thời gian (phút) Số chu kỳ

Phổ điện di sản phẩm PCR-RAPD của các mẫu với các mồi được phân tích theo nguyên tắc các band DNA có xuất hiện hay không Phân tích tọa độ phân bố di truyền, xây dựng cây phả hệ và phân tích cụm theo thuật toán ma trận nhị phân bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 (Exeter Software, Mỹ) dựa trên hệ số tương đồng di truyền Jaccard (1908) Kích thước của các điểm đánh dấu RAPD được ước tính bằng kích thước DNA tiêu chuẩn (Gene Ruler 1kb DNA Ladder, Thermo Science).

Hệ số tương đồng di truyền được tính bằng hai lần số band chung của hai mẫu trên tổng số band thu được của hai mẫu đó (S = 2N AB /(N A + N B )) Hai mẫu hoàn toàn giống nhau nếu hệ số thu được là 1,0, và bằng 0,0 khi hai mẫu không có điểm chung nào Cây quan hệ di truyền giữa các mẫu được xây dựng theo phương pháp UPGMA (Unweighted PairGroup Method with Arithmetical Averages) Hệ số đa dạng di truyền và khoảng cách di truyền giữa các quần thể được thể hiện bằng cách sử dụng khoảng cách di truyền của Nei [148] Các thông số di truyền được tính bằng số lượng band đa hình, tỷ lệ phần trăm của các band đa hình (PPB), số lượng allele quan sát được (na), số lượng allele hiệu quả (ne), đa dạng gene của Nei (h), chỉ số thông tin của Shannon (I

PHÂN TÍCH THỐNG KÊ

Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần để tính giá trị trung bình, biểu diễn dưới dạng **giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (X ± SD)** Các số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 18.0 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi **p < 0,05** Các số liệu hình thái, giải phẫu, hóa sinh được phân tích bằng phần mềm Duncan's test Các dữ liệu có phân phối chuẩn được phân tích bằng kiểm định Student's test Dữ liệu không có phân phối bình thường được phân tích bằng thử nghiệm Mann-Whitney U không tham số Đánh giá hoạt tính chống ung thư còn sử dụng kết hợp phần mềm GraphPad Prism 5.0.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY SÂM CAU TẠI THỪA THIÊN HUẾ

3.1.1 Đặc điểm thực vật học của cây Sâm cau

Cây Sâm cau tại Thừa Thiên Huế phân bố dưới tán rừng Thông hai lá và Thông ba lá ở núi Ngự Bình (thành phố Huế), núi Hương Thọ (huyện Hương Trà) và núi Thiên Thai (huyện Hương Thủy) Khu vực phân bố có nhiệt độ trung bình 24,0 - 25,2 º C, lượng mưa trung bình năm 2.600 - 2.800 mm và độ ẩm 83 - 84%.

Hình 3.1 Hình ảnh điều tra vùng phân bố cây Sâm cau tại Thừa Thiên Huế

Ghi chú: A: Núi Ngự Bình; B: Núi Thiên Thai; C: Núi Thiên Thọ.

(Nguồn: Kết quả điều tra năm 2017) Đặc điểm chung của cây Sâm cau tại khu vực nghiên cứu đều phân bố ở vùng núi thấp, nơi chuyển tiếp từ vùng núi cao xuống vùng đồng bằng ven biển Độ cao tìm thấy nằm trong khoảng từ 41 - 57 m so với mực nước biển, với số cây dao động từ 44 - 108 cây/ha; độ tàn che từ 0 - 45%, tuy nhiên độ tàn che từ 0 - 5% thì có số

A B C lượng cây/ha cao nhất và đạt từ 105 - 108 cây/ha, điều đó chứng tỏ Sâm cau có nhu cầu ánh sáng lớn Ngoài ra, Sâm cau cũng có thể phân bố ở độ dốc từ nơi đất bằng (0 độ) đến nơi đất rất dốc (trên 30 độ) (Bảng 3.1).

Thực bì cũng là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tái sinh từ đó ảnh hưởng đến sự phân bố của Sâm cau Kết quả khảo sát cho thấy ở những địa điểm phân bố khác nhau thì có sự khác nhau về độ che phủ và chiều cao thực bì. Đối với khu vực có mật độ cây/ha nhiều như tại vùng núi Thiên Thai và núi Thiên Thọ thì độ che phủ và chiều cao thực bì thấp hơn tại núi Ngự Bình (Bảng 3.1). Ngoài ra, vùng núi Ngự Bình có độ tàn che đạt 45%, cao hơn nhiều so với ở vùng núi Thiên Thai (0%) và vùng núi Thiên Thọ (5%).

Bảng 3.1 Đặc điểm phân bố, thực bì và phẫu diện đất tại các vùng nghiên cứu

Chỉ tiêu Núi Ngự Bình Núi Thiên Thai Núi Thiên

Thọ Độ cao (m) 41 57 54 Độ dốc (độ) ≥ 30 ≤ 30 ≤ 30 Độ tàn che (%) 45 0 5

N (cây/ha) 44 108 105 Độ ẩm tầng 0 - 30 cm (%) 30 - 40 45 - 50 30 - 40 Độ dầy tầng thảm mục (cm) 0,2 - 1,2 0,1 - 0,4 0,2 - 0,4 Độ che phủ thực bì (%) 20 - 30 10 - 20 15 - 20

Màu sắc đất Đỏ nâu Vàng nhạt Xám

Loại đất Đất Leptosols Đất Leptosols Đất Acrisols

(Nguồn: Kết quả điều tra năm 2017) Bên cạnh đó, loại đất và đá mẹ cũng là vấn đề quan trọng quyết định đến sự thành bại của các thí nghiệm trồng cũng như sản xuất Kết quả điều tra các phẫu diện đất cho thấy Sâm cau trong tự nhiên phân bố trên nền đất Leptosols có màu vàng (ở núi Ngự Bình) hoặc màu đỏ nâu (ở núi Thiên Thai); hoặc đất Acrisols có màu xám (ở núi Thiên Thọ) Các loại đất này có đặc điểm chung là thường lẫn nhiều sỏi sạn và tầng mặt thường bị xói mòn trơ sỏi đá từ 20 - 70% (Bảng 3.1).

Địa lý phân bố của cây Sâm cau trong tự nhiên cho thấy loài cây này có thể thích nghi được trên nhiều độ cao khác nhau Ở Thừa Thiên Huế, Sâm cau phân bố chủ yếu ở độ cao dưới 57 m so với mực nước biển Tuy nhiên, tại các khu vực khác, độ cao phân bố của Sâm cau có thể lên tới 2.250 m, như ở vùng núi cận nhiệt đới của miền Trung dãy Himalaya Trong khi đó, ở Java, Sâm cau mọc ở độ cao 400 m và ở Ấn Độ, loài cây này được tìm thấy ở độ cao từ mực nước biển đến 2.300 m, phân bố khắp các vùng từ Konkan đến Cape Comorin Ngoài ra, Sâm cau cũng ưa thích các khu rừng râm mát, ẩm ướt và giàu mùn tại châu Á, với khoảng cách tối ưu giữa 2 củ là 10 × 10 cm.

3.1.1.2 Đặc điểm hình thái của Sâm cau

Quá trình điều tra thực địa tại một số khu vực thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế, chúng tôi nhận thấy cây Sâm cau có các đặc điểm hình thái được mô tả ở Hình 3.2 và Bảng 3.2 như sau: Sâm cau (Curculigo orchioides Gaerrtn.) là cây thân thảo sống lâu năm, thường phân bố trên các vùng đồi núi Cây có thể phân thành nhiều nhánh, khoảng 1 -

10 nhánh Loài cây này có rễ củ nằm ẩn dưới mặt đất, mặt ngoài sần sùi có màu vàng nâu đậm, mặt cắt màu kem; bề mặt có nhiều nếp nhăn và vết nứt ngang nông; mùi không rõ rệt; có tính nhầy và vị hơi đắng Rễ củ hình trụ, có chiều dài khoảng 1,5 - 13,5 cm, đường kính khoảng 0,5 - 2,0 cm Từ rễ củ mọc tỏa ra xung quanh các rễ phụ nhỏ hình tròn, có màu trắng đục hoặc màu vàng nâu.

Lá đơn, mọc cách, thuôn dài hình mũi mác, chóp lá thường nhọn hoặc hơi tù, dài khoảng 9 - 67 cm, đường kính 0,7 - 2,8 cm Lá có 6 gân chính, 3 gân nổi lên trên và 3 gân nổi dưới, các gân chính song song với nhau Trên bề mặt lá có phủ lông tơ Lá có

Hình 3.2 Hình thái cây Sâm cau tại tỉnh Thừa Thiên Huế

Ghi chú: A Cây Sâm cau C orchioides Gaertn.; B Lá; C Rễ củ; D Tiết diện ngang của củ; E Tiết diện dọc của củ; F Cây mang hoa; G Một hoa hoàn chỉnh; H Mặt trước của hoa; I Mặt sau của hoa; K Một quả hoàn chỉnh khi non; L, M Quả già; N.

Hoa có hình dáng đẹp, màu vàng sáng Hoa có 6 cánh với 3 lá đài và tràng hoa Đài hoa 3 cánh nhẵn có phủ lớp lông mềm Nhị hoa 6 xếp thành 2 dãy, chỉ nhị ngắn, bầu hình thoi Mỗi cuống hoa chứa 3 đến 4 hoa, trong đó 1 - 2 hoa đầu là lưỡng tính, còn lại là đơn tính.

Quả nang, nằm ẩn trong bẹ lá Quả màu trắng xốp, chứa từ 2 - 14 hạt Hạt có lông tơ bao phủ, khi còn non có màu trắng và chuyển dần sang màu vàng nâu đến màu đen sáng bóng lúc già Vỏ hạt cứng, trên bề mặt hạt có rãnh sâu theo đường lượn sóng Đầu tận cùng của hạt cong cong hình móc khóa.

Bảng 3.2 Đặc điểm thực vật học của cây Sâm cau tại các vùng nghiên cứu Chỉ tiêu Núi Ngự Bình Núi Thiên Thai Núi Thiên Thọ

Chiều dài rễ củ (cm) 9,77 a ± 3,11 6,60 b ± 2,59 5,80 c ± 2,36 Đường kính rễ củ (cm) 1,25 a ± 0,35 0,9 b ± 0,19 0,73 c ± 0,12 Chiều dài cuống lá (cm) 5,24 c ± 2,52 5,67 b ± 3,39 3,00 a ± 0,53 Chiều dài lá (cm) 24,30 b ± 9,64 40,54 a ± 11,03 14,97 c ± 3,33 Đường kính lá (cm) 1,85 a ± 0,34 1,54 b ± 0,36 1,22 c ± 0,35

Quả Thuôn dài chứa hạt

Hạt Có rãnh sâu theo đường lượn sóng

Ghi chú: Các chữ cái a, b, c theo sau trong cùng một hàng chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05 (Duncan’s test)

Như vậy, cây Sâm cau phân bố tại tỉnh Thừa Thiên Huế tương đồng về đặc điểm thực vật học, chỉ khác biệt về kích thước của lá, rễ củ, hoa, quả và hạt Tuy nhiên, cây Sâm cau thu thập được tại vùng núi Ngự Bình với độ tàn che cũng như độ dày tầng thảm mục cao nhất, phân bố trên nền đất dốc trên 30 độ (Bảng 3.1).Kích thước rễ củ, đường kính lá của cây Sâm cau tại vùng núi này lớn hơn so với các mẫu thu thập được tại hai vùng núi Thiên Thai và núi Thiên Thọ; còn chiều dài cuống lá và chiều dài lá Sâm cau cao nhất ở vùng núi Thiên Thai, số nhánh cây Sâm cau cao nhất ở vùng núi Thiên Thọ (Bảng 3.2).

Qua phân tích đối chiếu với các dẫn liệu nghiên cứu được công bố trong và ngoài nước, chúng tôi nhận thấy các mẫu cây Sâm cau phân bố trong tự nhiên tại Thừa Thiên Huế có sự đồng nhất cao về các đặc điểm thực vật học.

3.1.1.3 Đặc điểm vi phẫu của Sâm cau Đặc điểm vi phẫu của lá Sâm cau

Đặc điểm nổi bật của lá Sâm cau là cấu trúc một lá mầm điển hình, với lá xếp thẳng đứng để đón ánh sáng đồng đều Tiết diện ngang của lá dưới kính hiển vi quang học cho thấy sự phân chia rõ ràng thành các phần chính, bao gồm biểu bì, mô giậu, mô khuyết, mô khuyết có bó dẫn và bó mạch Cấu tạo tương đối đồng nhất này phản ánh đặc điểm sinh lý của lá một lá mầm, phù hợp với chức năng quang hợp của nó.

Hình 3.3 Cấu trúc vi phẫu của lá cây Sâm cau

Ghi chú: A Trục giữa của lá; B Phiến lá; C Mép lá; D Cuống lá;

ĐẶC ĐIỂM HOÁ SINH CỦA CÂY SÂM CAU TẠI THỪA THIÊN HUẾ 80

3.2.1 Một số chỉ tiêu hóa sinh cơ bản

Các mẫu lá và mẫu rễ củ của Sâm cau thu được ở các khu vực phân bố tại Thừa Thiên Huế được tiến hành phân tích định lượng các chỉ tiêu về độ ẩm (hàm lượng nước), hàm lượng tro, cellulose, vitamin C, lipid tổng số, và protein tổng Kết quả phân tích được trình bày ở Bảng 3.13.

Qua kết quả phân tích định lượng cho thấy, hàm lượng của các chỉ tiêu có sự sai khác giữa các phân bố Các mẫu lá và rễ củ của Sâm cau phân bố ở vùng núiNgự Bình cho chỉ số cao nhất về hàm lượng tro (ở lá: 10,800 ± 0,196 %, ở rễ củ:9,180 ± 0,263%) và hàm lượng lipid tổng (ở lá: 10,420 ± 0,03%, ở rễ củ: 8,170 ±0,04%), nhưng hàm lượng protein tổng thấp (ở lá: 0,166 ± 0,022 mg/g, ở rễ củ:1,780 ± 0,042 mg/g) Các mẫu Sâm cau phân bố ở vùng núi Thiên Thai có chỉ số về hàm lượng vitamin C (0,147 ± 0,013% ở rễ củ và 0,172 ± 0,006% ở lá) và hàm lượng protein tổng (3,480 ± 0,069 mg/g ở rễ củ và 0,350 ± 0,013 mg/g ở lá); các giá trị này là cao nhất trong các mẫu phân tích của 3 vùng nghiên cứu Các mẫu Sâm cau tại vùng núi Thiên Thọ có hàm lượng cellulose cao nhất (ở rễ củ 21,080 ±0,047%, ở lá: 24,820 ± 0,067%), trong khi các chỉ số về độ ẩm, vitamin C và hàm lượng lipid tổng là thấp nhất Hàm lượng nước (độ ẩm) của mẫu được xác định bởi sự chênh lệch khối lượng của mẫu thực vật tươi trước khi sấy và sau khi sấy khô tuyệt đối Giữa mẫu rễ củ và lá trong cùng một cây Sâm cau thu tại cùng 1 địa điểm thì mẫu rễ củ luôn có độ ẩm cao hơn Đối với mẫu Sâm cau thu ở các địa điểm khác nhau thì có độ ẩm khác nhau, trong đó mẫu thu tại núi Ngự Bình có độ ẩm cao nhất (79,853% ở rễ củ, 78,833% ở lá) và thấp nhất là mẫu thu tại núi Thiên Thọ (78,016% ở rễ củ, 77,778% ở lá).

Bảng 3.13 Một số chỉ tiêu hóa sinh cơ bản của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu

Chỉ tiêu Mẫu Địa điểm

Núi Ngự Bình Núi Thiên Thai Núi Thiên Thọ Độ ẩm

Ghi chú: Các chữ cái a, b, c theo sau trong cùng một hàng chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05 (Duncan’s test)

Các thông số hóa lý có ý nghĩa quan trọng trong việc kiểm tra chất lượng thuốc, thành phần vô cơ và các tạp chất khác có trong thuốc, hoặc có thể biết được chất đất Soni và cs (2011) khi phân tích các mẫu rễ củ của Sâm cau có nguồn gốc từ vùng núi thuộc Jabalpur và Chhindwada (Ấn Độ) đã xác định được một số chỉ tiêu hóa lý của cây, trong đó kết quả định lượng về độ ẩm là 10,32% [194] Trong

(2012) xác định là 74,40% [158] Phân tích của Raj và cs (2018) trên các mẫu Sâm cau hoang dại, trồng trang trại hay nuôi cấy in vitro cho các giá trị về độ ẩm lần lượt là 7,67%, 8,13% và 8,32% [169] Như vậy, rễ củ Sâm cau phân bố tại Ấn Độ đều có độ ẩm thấp hơn các giá trị mà chúng tôi thu nhận được Ngoài ra, độ ẩm của cây Sâm cau thu hái tại Na Hang - Tuyên Quang cũng cho giá trị về độ ẩm (đạt 60,1%) thấp hơn so với các mẫu nghiên cứu tại Thừa Thiên Huế [19].

Sử dụng tính chất bền vững trong môi trường acid và kiềm của cellulose, hàm lượng cellulose được xác định thông qua lượng mẫu còn lại sau xử lý Kết quả thu được cho thấy hàm lượng cellulose trong cây Sâm cau thu tại Thừa Thiên Huế tương đương với các mẫu thu tại các địa điểm khác Tuy nhiên, nghiên cứu này ghi nhận lượng cellulose cao hơn trong các mẫu rễ củ so với mẫu thu tại Na Hang - Tuyên Quang, chỉ đạt 15,1%.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng tro, lipid và protein ở các mẫu thí nghiệm là cao hơn kết quả của Arinathan [44] Sau khi hóa tro trong lò nung, kết quả thu được cho thấy khối lượng còn lại của mẫu lá Sâm cau thu tại cùng 1 địa điểm cao hơn so với mẫu rễ củ (Bảng 3.13) Mẫu tại núi Thiên Thai có hàm lượng tro thấp nhất (8,08% ở rễ củ, 8,78% ở lá), còn mẫu tại núi Ngự Bình có hàm lượng tro cao nhất (9,18% ở rễ củ, 10,80% ở lá) và cao hơn các mẫu rễ củ Sâm cau tại Ấn Độ dược nghiên cứu (8,46% - 8,6%) [36], [44], [53].

Soni và cs (2011) khi phân tích các mẫu rễ củ của Sâm cau có nguồn gốc từ vùng núi thuộc Jabalpur và Chhindwada (Ấn Độ) đã xác định được hàm lượng tro tổng số đạt 4,68% [194] Tỉ lệ tro tổng số của rễ củ cây Sâm cau thu thập từ vùng Badlapur, Maharashtra, Ấn Độ được Patil và cs (2012) xác định là 8,0% [158] Hàm lượng tro trong các mẫu rễ củ của cây Sâm cau hoang dại, hoặc được nuôi trồng trong tự nhiên hay nuôi cấy in vitro theo nghiên cứu của Raj và cs (2018) được xác định có giá trị tương ứng là 4,15%, 10,88%, 7,18% [169] Nghiên cứu của Vũ Thị Thu Lê và cs (2022) trên cây Sâm cau thu hái tại Na Hang-Tuyên Quang cho giá trị về hàm lượng tro đạt 6,9% [19] Như vậy, kết quả cho thấy phân tích trên mẫu rễ củSâm cau trong tự nhiên ở các thí nghiệm trên đều cho hàm lượng tro thấp hơn các giá trị mà chúng tôi thu nhận được.

Kết quả phân tích hàm lượng tro tổng số trong mẫu rễ củ của cây Sâm cau ở vùng núi Thiên Thai và vùng núi Thiên Thọ đều cho giá trị không vượt quá 9%, tương đồng với báo cáo của Bhangi và cs (2020) [51].

Tùy thuộc vào đặc tính dễ tan trong nước và tính khử đối với các chất màu, chúng tôi đã định lượng được hàm lượng vitamin C trong các nguyên liệu mẫu Phân tích kết quả thu được cho thấy hàm lượng vitamin C trong các mẫu lá thu được cao hơn so với mẫu rễ củ nhưng sự chênh lệch này không lớn Trong các mẫu, mẫu ở núi Thiên Thai có giá trị vitamin C cao nhất (0,147% ở rễ củ và 0,172% ở lá), trong khi đó Sâm cau ở núi Thiên Thọ lại có hàm lượng vitamin C thấp nhất (0,088% ở rễ củ và 0,103% ở lá) Nhìn chung, hàm lượng vitamin C có sự chênh lệch lớn giữa các địa phương và thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của Arinathan và cộng sự (2009) cũng như của Vũ Thị Thu Lê và cộng sự (2022).

3.2.2 Phân tích định tính một số dược chất trong Sâm cau ở Thừa Thiên Huế

- Phản ứng với dung dịch 10% NaOH: sau khi bổ sung dung dịch 10% NaOH vào dịch chiết Sâm cau, kết quả dung dịch chuyển dần sang màu vàng đậm, cho thấy mẫu có phản ứng dương tính với dung dịch 10% NaOH (Hình 3.12b, Hình 3.13b).

- Phản ứng với FeCl3: sau khi bổ sung dung dịch 5% FeCl3 vào dịch chiết Sâm cau, kết quả là dung dịch chuyển từ màu vàng trong sang màu xanh đen, cho thấy mẫu có phản ứng dương tính với FeCl3 (Hình 3.12c, Hình 3.13c).

Kết luận: Các mẫu Sâm cau nghiên cứu có chứa flavonoid.

- Phản ứng Benedict: khi cho thuốc thử Benedict vào ống nghiệm chứa dịch chiết ethanol của Sâm cau thì sau 5 phút thấy xuất hiện kết tủa màu vàng đến vàng cam, chứng tỏ mẫu có phản ứng dương tính với thuốc thử Benedict (Hình 3.12d, Hình 3.13d).

- Phản ứng Felling: đun sôi cách thủy dịch Sâm cau với thuốc thử Felling thì thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch, chứng tỏ mẫu có phản ứng dương tính với thuốc

Kết luận: Trong cây Sâm cau Thừa Thiên Huế có thành phần polysaccharide.

- Dựa trên tính chất tạo bọt: Lắc mạnh hỗn dung dịch chứa bột Sâm cau trong

5 phút, có hiện tượng tạo bọt nhưng không bền.

- Dựa vào phản ứng Liebermann-Burchard, kết quả cho thấy ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng phân cách màu hồng đến tím đỏ Kết quả này chứng tỏ mẫu có phản ứng dương tính với saponin triterpenoid (Hình 3.12f, Hình 3.13f).

Kết luận: Trong cây Sâm cau Thừa Thiên Huế có chứa hoạt chất saponin.

Hình 3.12 Phân tích định tính các mẫu lá Sâm cau tại khu vực nghiên cứu

Ghi chú: a Dịch chiết lá Sâm cau; b Dịch chiết sau khi thêm 10% NaOH; c Dịch chiết sau khi thêm FeCl 3 ; d Dịch chiết sau khi thêm thuốc thử Benedict và đun sôi; e Dịch chiết sau khi thêm dung dịch Felling và đun sôi; f Dịch chiết với thuốc thử Liebermann-Burchard; g Dịch chiết sau khi thêm Mayer; h Dịch chiết sau khi thêm Dragendorff; i Dịch chiết sau khi thêm Bouchardat.