Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên Huế

Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên Huế

HUẾ, NĂM 2024ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

BÙI LÊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ ĐÁNH GIÁHOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY SÂM CAU

(CURCULIGO ORCHIOIDES GAERTN.) THU TẠI THỪA THIÊN HUẾ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HUẾ, NĂM 2024ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

BÙI LÊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ ĐÁNH GIÁHOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY SÂM CAU

(CURCULIGO ORCHIOIDES GAERTN.) THU TẠI THỪA THIÊN HUẾ

Ngành: Sinh lý học thực vậtMã số: 9420112

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS TRƯƠNG THỊ BÍCH PHƯỢNG2 TS HOÀNG TẤN QUẢNG

LỜI CẢM ƠN

Những bước chân đầu tiên vào con đường nghiên cứu khoa học, cũng chínhlà một chặng đường đầy khó khăn, gian nan và thách thức đối với tôi Nhưng nhữngbước chân chập chững này sẽ chẳng đi đến đâu nếu không có sự hỗ trợ, giúp đỡ vàdìu dắt từ quý Thầy, Cô, anh, chị, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn và dành những lời tri ân sâu sắc nhất đếnCô PGS.TS Trương Thị Bích Phượng Cô đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tìnhcho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án Cô đã hỗ trợ tôi hết sức, hết lòng vàđầy trách nhiệm để giúp tôi vượt qua các khó khăn, tiến hành các nghiên cứu vàhoàn thành luận án

Cũng xin cho tôi được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy TS Hoàng TấnQuảng, Nghiên cứu viên Phòng thí nghiệm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinhhọc, Đại học Huế cùng phối hợp với Cô PGS.TS Trương Thị Bích Phượng hướngdẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Nhân dịp này, tôi cũng xin cảm ơn đến Ban Giám hiệu trường Đại học Khoahọc, phòng Đào tạo Sau đại học trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, quý ThầyCô khoa Sinh học đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tạiTrường.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo cùng quý anh chị em đã vàđang công tác tại Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế; Khoa Giải phẫu bệnh,Bệnh viện trường Đại học Y Dược; Khoa Sinh hoá, Bệnh viện Trung ương Huế;Công ty Hương Cát đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gianthực hiện luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Y-Dược,Ban Chủ nhiệm Khoa Cơ bản, Trường Đại học Y-Dược, Đại học Huế, nơi tôi đangcông tác đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiệnluận án.

Chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, khích lệ và ủng hộ của gia đình, bạn bè,người thân cũng như các đồng nghiệp và anh chị em tại đơn vị tôi đang công tác vàcác đơn vị hỗ trợ trong thời gian thực hiện luận án.

Và cuối cùng, con xin dành những lời tri ân, lời chúc sức khỏe tốt đẹp nhấtvà sâu sắc nhất đến Ba Mẹ Ba Mẹ là những người đã tần tảo chăm lo và nuôi nấngcon lớn khôn cho đến ngày hôm nay Ba Mẹ luôn ở bên cạnh con, động viên và ủnghộ con Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị em trong gia đình mình cũngnhư các cháu đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em để học tập và hoàn thànhtốt luận án Em cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến chồng và hai con, đã luôn ởbên cạnh, ủng hộ và giúp đỡ em rất nhiều khi gặp khó khăn, động viên khi em chánnản trong công việc, buồn phiền trong cuộc sống.

Huế, tháng 05 năm 2024

Tác giả

Bùi Lê Thanh Nhàn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và dánh giá hoạt

tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.)” là công trình

nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của Cô PGS.TS Trương Thị Bích Phượng vàThầy TS Hoàng Tấn Quảng Những kết quả nghiên cứu của người khác và các sốliệu được trích dẫn trong luận án đều được chú thích đầy đủ Tôi xin cam đoan cácsố liệu và kết quả trong luận án là hoàn toàn trung thực Tôi hoàn toàn chịu tráchnhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này.

Huế, tháng 05 năm 2024

Tác giả

Bùi Lê Thanh Nhàn

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ALT Alanine aminotransferaseAST Aspartate aminotransferase

BGL Blood Glucose Level (Nồng độ glucose trong máu) BMD Bone Mineral Density (Mật độ khoáng hoá của xương)BSA Bovin Serum Albumin (Albumin huyết thanh bò)BVF Bone Volume Fraction (Tỷ lệ thể tích xương)

DMSO Dimethyl Sulfoxide

DNA barcode DNA-barcoding (DNA mã vạch)DPPH 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

ECO Ethanol Extract of C orchioides (Dịch chiết ethanol của cây Sâm

cau) es Elongating spermatids (Tinh tử dài)

FSH Follicle Stimulating Hormone (Kích noãn bào tố)GGT Gamma Glutamyl Transpeptidase

GPS Global Positioning System (Hệ thống định vị toàn cầu)GPX Glutathione Peroxidase

GSSG Glutathione disulfide (Glutathione oxy hoá)GTs Glycosyltransferase

H Nhóm chuột xử lý nhiệt 40°C và uống nước

HC100 Nhóm chuột xử lý nhiệt và uống Sâm cau với liều dùng 100 mg/kg thể trọng

HC200 Nhóm chuột xử lý nhiệt và uống Sâm cau với liều dùng 200 mg/kg thể trọng

HC400 Nhóm chuột xử lý nhiệt và uống Sâm cau với liều dùng 400 mg/kg thể trọng

H&E Hematoxylin and Eosin (Hematoxylin và Eosin)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng caoHPTLC High Perfromance Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng hiệu

MECO Methanol Extract of C orchioides (Dịch chiết methanol của Sâm cau)

MF Mount frequency (Tần suất gắn kết)

MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

MIF Macrophage Migration Inhibitory Factor (Yếu tố ức chế di chuyển đạithực bào)

ML Mount Latency (Tần suất gặp gỡ)

MMP Mitochondrial Membrane Potential (Điện tích màng ty thể)Na Observed Number of Alleles (Số allele quan sát được) rnDNA Nuclear ribosomal DNA (DNA ribosome hạch nhân)

Ne Effective Number of Alleles (Số allele hiệu quả)

OD Optical Density (Mật độ quang học, hay độ hấp thụ quang)

SHBG Sex Hormone-Binding Globulin (Hormone giới tính liên kết với globulin)

SOD Superoxide Dismutases

STAT Signal Transducer and Activator of Transcription (Bộ chuyển đổi tín hiệu và hoạt hoá phiên mã)

TBARS Thiobarbituric Acid Reactive Substances (Cơ chất phản ứng với thiobarbituric acid, hay chỉ số ôi hoá)

v/v Tỷ lệ thể tích trên thể tích

WCO Water Extract of C orchioides (Dịch chiết nước của Sâm cau)

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)w/v Tỷ lệ khối lượng trên thể tích

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ SÂM CAU 5

1.1.1.Đặc điểm phân loại 5

1.1.2.Đặc điểm của họ Hypoxidaceae 5

1.1.3.Đặc điểm của chi Curculigo . 6

1.1.4.Đặc điểm thực vật học của Sâm cau 7

1.4.3.Hoạt tính sinh học của Sâm cau 28

1.4.3.1.Tác dụng chống oxy hóa 28

1.4.3.2 Tác dụng bảo vệ, chống độc cho gan 29

1.4.3.3 Tác dụng chữa lành vết thương 30

1.4.3.4 Tác dụng điều hòa miễn dịch 30

1.4.3.5 Hoạt tính tăng cường chức năng sinh lý 31

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 39

2.2 ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 39

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học 40

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền cây Sâm sau 41

2.3.4.Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết Sâm cau 52

2.3.4.1.Phương pháp đánh giá tác dụng của dịch chiết Sâm cau lên khảnăng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày

52

2.3.4.2.Đánh giá tác dụng của dịch chiết Sâm cau lên quá trình sinh tinh

53

2.4 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 56

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 57

3.1.ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂYSÂM CAU TẠI THỪA THIÊN HUẾ 57

3.1.1.Đặc điểm thực vật học của cây Sâm cau 57

3.1.1.1.Đặc điểm phân bố 57

3.1.1.2.Đặc điểm hình thái của Sâm cau 59

3.1.1.3.Đặc điểm vi phẫu của Sâm cau 62

3.1.1.4.Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây Sâm cau 66

3.1.2.Đặc điểm di truyền của cây Sâm cau 68

3.1.2.1.Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị DNA mã vạch quần thểSâmcauởThừa Thiên Huế

68 3.1.2.2.Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD 75

3.2.ĐẶC ĐIỂM HOÁ SINH CỦA CÂY SÂM CAU TẠI THỪA THIÊN HUẾ 80

3.2.1.Một số chỉ tiêu hóa sinh cơ bản 80

3.2.2 Phân tích định tính một số dược chất trong cây Sâm cau thu tại ThừaThiên Huế 83

3.2.2.1.Định tính flavonoid 83

3.2.3.5.Phân tích lycorine bằng kỹ thuật HPLC 91

3.3.ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA SÂM CAU 93

3.3.1 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư dạ dày MKN45 của dịch chiếtSâm cau 94

3.3.1.1.Tác động của dịch chiết Sâm cau lên kiểu hình tế bào MKN45 94

3.3.1.2.Tác động của dịch chiết Sâm cau lên sự tăng sinh tế bào MKN45

95

3.3.2.Đánh giá tác dụng của dịch chiết Sâm cau đến quá trình sinh tinh ở chuộtSwiss đực 97

3.3.2.1.Tác động của dịch chiết Sâm cau đến nồng độ testosterone 97

3.3.2.2.Tác dụng bảo vệ quá trình phát sinh tinh của dịch chiết Sâm cautrên mô học tinh hoàn dưới tác động của nhiệt

101 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 109

KẾT LUẬN 109

KIẾN NGHỊ 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO 112 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Quy trình nhiệt của phản ứng khuếch đại PCR 42

Bảng 2.2 Danh sách các xuất xứ Sâm cau được sử dụng trong nghiên cứu 43

Bảng 2.3 Trình tự các mồi dùng trong PCR-RAPD 43

Bảng 2.4 Quy trình nhiệt của phản ứng khuếch đại RAPD-PCR 44

Bảng 2.5 Phân bố các nhóm chuột Swiss đực thí nghiệm 54

Bảng 2.6 Thang điểm Johnsen đánh giá mô học ống sinh tinh 56

Bảng 3.1 Đặc điểm phân bố, thực bì và phẫu diện đất tại các vùng nghiên cứu 58

Bảng 3.2 Đặc điểm thực vật học của cây Sâm cau tại các vùng nghiên cứu 61

Bảng 3.3 Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của Sâm cau 66

Bảng 3.4 Mức độ tương đồng và tỉ lệ bao phủ của các đoạn gene trn L- trn F ở cácmẫu Sâm cau với trình tự tham chiếu tương đồng nhất trên cơ sở dữ liệu NCBI 69

Bảng 3.5 Thành phần bốn loại nucleotide của các Sâm cau nghiên cứu và mẫu đốichứng trên GenBank 72

Bảng 3.6 Phân tích tính trung lập của quần thể Sâm cau tại Thừa Thiên Huế 73

Bảng 3.7 Các haplotype được tạo ra từ 15 mẫu Sâm cau nghiên cứu 73

Bảng 3.8 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu 74

Bảng 3.9 Trình tự mồi, số lượng band khuếch đại và kích thước band PCR-RAPD 76

Bảng 3.10 Kết quả phân tích PCR-RAPD của các quần thể Sâm cau 78

Bảng 3.11 Chỉ số đa dạng di truyền của 7 quần thể Sâm cau nghiên cứu 78

Bảng 3.12 Sự đa dạng di truyền giữa 7 quần thể Sâm cau nghiên cứu 79

Bảng 3.13 Một số chỉ tiêu hóa sinh cơ bản của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu

81Bảng 3.14 Hàm lượng flavonoid của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu 86

Bảng 3.15 Hàm lượng polysaccharide của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu 88

Bảng 3.16 Hàm lượng saponin của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu 89

Bảng 3.17 Hàm lượng alkaloid của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu 90

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ mẫu đến nồng độ lycorine 91

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của thời gian chiết mẫu đến nồng độ lycorine của Sâm cau

92

Bảng 3.20 Nồng độ lycorine của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu 92

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của dịch chiết Sâm cau đến nồng độ testosterone trong máucủa chuột Swiss đực 98

Bảng 3.22 Đặc điểm của mô học tinh hoàn theo hệ thống điểm Johnsen 103

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây (A) và rễ củ (B) của Sâm cau ( Curculigo orchioides Gaertn.) 5

Hình 1.2 Các bước thực hiện kỹ thuật RAPD 14

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số chất glycoside trong Sâm cau 21

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của ba loại curculigoside (F, G, H) 23

Hình 1.5 Cấu trúc của lycorine (1) và N,N,N’,N’-tetramethylsuccinamide (2) 24

Hình 2.1 Cây Sâm cau tại các địa điểm thu mẫu tại Thừa Thiên Huế 40

Hình 2.2 Bản đồ thu mẫu Sâm cau tại Thừa Thiên Huế 40

Hình 2.3 Mẫu cây Sâm cau được thu hái tại núi Ngự Bình 47

Hình 2.4 Dịch chiết Sâm cau ở các nồng độ khác nhau 53

Hình 3.1 Hình ảnh điều tra vùng phân bố cây Sâm cau tại Thừa Thiên Huế 57

Hình 3.2 Hình thái cây Sâm cau tại tỉnh Thừa Thiên Huế 60

Hình 3.3 Cấu trúc vi phẫu của lá cây Sâm cau 62

Hình 3.4 Cấu trúc vi phẫu của rễ củ Sâm cau 64

Hình 3.5 Cấu trúc vi phẫu của bột cây Sâm cau 65

Hình 3.6 Chu kỳ sinh trưởng và tuổi của Sâm cau 67

Hình 3.7 Sản phẩm PCR của vùng gene trn L- trn F điện di trên gel agarose 1% củacác mẫu nghiên cứu 68

Hình 3.8 Vị trí sai khác của mẫu Sâm cau tại Thừa Thiên Huế dựa trên trình tự

DNAvùng trn L- trnF so với trình tự đối chứng trên GenBank 70

Hình 3.9 Sơ đồ cây phát sinh phả hệ của Sâm cau 75

Hình 3.10 Sản phẩm PCR được khuếch đại bằng mồi OPA-01 của 92 mẫu nghiêncứu 77

Hình 3.11 Cây phát sinh chủng loại của 7 quần thể Sâm cau nghiên cứu 80

Hình 3.12 Phân tích định tính các mẫu lá Sâm cau tại khu vực nghiên cứu 84

Hình 3.13 Phân tích định tính rễ củ Sâm cau tại khu vực nghiên cứu 85

Hình 3.14 Ảnh hưởng của dịch chiết Sâm cau lên mật độ và kiểu hình của tế bào

ungthư dạ dày MKN45 (Thang đo 100 µm) 94

Hình 3.15 Tỷ lệ tăng sinh (A) và tỷ lệ ức chế (B) của tế bào MKN45 95

Hình 3.16 Ảnh hưởng của dịch chiết Sâm cau đến nồng độ testosterone trong máucủa chuột Swiss đực nghiên cứu 99

Hình 3.17 Cấu trúc mô tinh hoàn ở chuột tiếp xúc với nhiệt và được điều trị bằngdịch chiết Sâm cau 102

Hình 3.18 Đánh giá tổn thương mô tinh hoàn ở chuột tiếp xúc với nhiệt và được

điềutrị bằng dịch chiết Sâm cau theo hệ thống điểm Johnsen 104

Hình 3.19 Phân bố tần số của điểm số Johnsen của mặt cắt ngang ống dẫn tinh ởchuột tiếp xúc với nhiệt và được điều trị bằng dịch chiết Sâm cau 105

PHẦN MỞ ĐẦU1 Sự cần thiết của đề tài

Việt Nam với 3/4 diện tích tự nhiên là vùng đồi núi, chịu sự ảnh hưởng củakhí hậu nhiệt đới gió mùa, đã tạo nên cho đất nước chúng ta một hệ sinh thái thựcvật vô cùng phong phú và đa dạng với khoảng 4.000 loài cây thuốc [258].

Cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) là một loài thảo dược sống lâu

năm thuộc họ Hạ trâm (Hypoxidaceae), thường phân bố ở các nước nhiệt đới và cậnnhiệt đới như Việt Nam,Trung Quốc, Ấn Độ, [3], [102], [259] Các nghiên cứu về

thành phần hoá học cho thấy, cây Sâm cau (C orchioides) có chứa glycoside [163],

[217], [240]; alkaloid, saponin [174], [221]; triterpenoid [117], [255], flavonoid vàpolysaccharide,…[168], [150], [224], [244] Với thành phần hoạt chất phong phúnày, Sâm cau đã được sử dụng rộng rãi trong y học bản địa các nước nhằm bảo vệsức khoẻ, bảo vệ gan [172], [215], chống oxy hóa, chống ung thư [125], [142] Sâmcau cũng đã được sử dụng để tăng cường trí nhớ, điều trị loãng xương [82], [164];chống đái tháo đường [242], [252] Chiết xuất rễ củ từ Sâm cau cũng được sử dụngnhư một loại thuốc bổ để khắc phục chứng bất lực, liệt dương [62], [186], rối loạntiết niệu [3], [126], [58]; vàng da [111], [123]; an thần, bảo vệ thần kinh, hoạt độngchống hoại tử [156], [244] và hoạt tính kháng khuẩn [145] Với tác dụng và tiềmnăng to lớn của loài cây thảo dược này trong y dược học, cây Sâm cau đã và đang bịkhai thác quá mức dẫn đến tình trạng ngày càng cạn kiệt và nhiều nơi đã biến mấthẳn Vì vậy, Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) và Việt Nam đã đưacây Sâm cau vào danh mục của sách đỏ cần được bảo vệ ở mức nguy cấp (mức EN,phân hạng VU A1c,d) [27], [102].

Cùng với sự phát triển của nền kinh tế-xã hội, các stress cũng như sự ônhiễm môi trường, tỷ lệ mắc bệnh ung thư và bệnh suy giảm chức năng sinh dục làmột trong những vấn đề nhức nhối của xã hội hiện đại Số người mắc bệnh ngàycàng gia tăng và có xu hướng trẻ hoá bệnh nhân [56], [121], [189] Theo số liệutoàn cầu năm 2020, ung thư dạ dày đứng thứ năm trong số các bệnh ung thư thườnggặp với hơn một triệu người mắc mới, đứng thứ tư về tỷ lệ tử vong do bệnh ác tính

Bên cạnh đó, theo ước tính của WHO có khoảng 80 triệu cặp vợ chồng vô sinh,trong đó vô sinh do nam giới chiếm khoảng 40 - 50% Việt Nam là một trong nhữngquốc gia có tỷ lệ vô sinh cao trên thế giới với 50% số ca mắc bệnh nằm ở độ tuổidưới 30 Thống kê của Bộ Y tế nước ta cho thấy, mỗi năm có khoảng 1 triệu cặp vợchồng mắc bệnh vô sinh, hiếm muộn, chiếm 8 - 10% ở các cặp vợ chồng đang ở độtuổi sinh đẻ Những nghiên cứu gần đây cho thấy chất lượng tinh trùng của đàn ônghiện nay đã giảm nhiều so với trước Từ năm 1965 đến năm 2015, mật độ tinh trùngtrung bình ở đàn ông đã giảm 32,5% sau 50 năm [183] Sự suy giảm quá trình sinhtinh không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe, tinh thần và kinh tế của nam giới mà cònảnh hưởng đến sức lao động, cũng như hạnh phúc gia đình, sự phát triển nòi giốngvà gây hậu quả tiêu cực đối với đời sống xã hội [69] Vì vậy, nghiên cứu hoạt tínhsinh học của cây Sâm cau đối với các tế bào ung thư dạ dày và quá trình sinh tinh làrất cần thiết.

Tuy nhiên, việc nghiên cứu một cách tổng thể về cây Sâm cau tại Việt Namnói chung và tỉnh Thừa Thiên Huế nói riêng, vẫn còn rất hạn chế Việc xác địnhđúng cây Sâm cau và phân biệt với các giống sâm khác là rất cần thiết trong quátrình khai thác, sử dụng cũng như định hướng bảo tồn và phát triển nguồn cây dượcliệu.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứuđặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau

(Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên Huế”

2 Mục tiêu và nội dung của đề tài

2.1 Mục tiêu chung

Xác định được một số đặc điểm hình thái, hóa sinh, đa dạng di truyền và

dược tính của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) phân bố trên địa bàn tỉnh

Thừa Thiên Huế.

2.3 Nội dung của đề tài

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và đa dạng di truyền của cây Sâm cau tự nhiên phân bố trên địa bàn tỉnh Thừa thiên Huế;

- Nghiên cứu một số đặc điểm hoá sinh và sự tích luỹ dược chất của cây Sâm cau tự nhiên tại Thừa Thiên Huế;

- Đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau thu tại tỉnh Thừa Thiên Huế, đồng thời xác định dược lý của cây Sâm cau trên mô hình động vật thực nghiệm.

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị vềmột số đặc điểm thực vật học cũng như hoạt tính sinh học của cây Sâm cau tại ThừaThiên Huế Đồng thời, luận án cũng là tài liệu tham khảo cho các hoạt động nghiêncứu và giảng dạy về sinh học và cây dược liệu.

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu cho việc bảo tồn và phát triển loài

dược liệu Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) tại Thừa Thiên Huế nói riêng và

Việt Nam nói chung.

4 Phạm vi nghiên cứu của đề tài

Nghiên cứu các đặc điểm hình thái của cây Sâm cau tự nhiên phân bố trên địabàn tỉnh Thừa Thiên Huế Các thông số của cây được xác định tại địa điểm thu mẫu.Các thí nghiệm phân tích thành phần dược chất và đánh giá đa dạng di truyềncủa cây Sâm cau được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Khoa Sinh học, trườngĐại học Khoa học và Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế.

Thí nghiệm in vivo về đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết Sâm cau

trên mô hình thực nghiệm và giải phẫu hình thái cây Sâm cau được tiến hành tạiphòng thí nghiệm của Khoa Cơ bản, Trường Đại học Y dược, Đại học Huế.

Các thí nghiệm phân tích mô bệnh học được thực hiện tại Khoa Giải phẫubệnh, Bệnh viện trường Đại học Y dược, Đại học Huế.

Thí nghiệm phân tích nồng độ testosterone trong máu được tiến hành tạiKhoa Sinh hoá, Bệnh viện Trung ương Huế.

5 Những đóng góp mới của luận án

-Đề tài cung cấp các đặc điểm sinh học của loài Sâm cau phân bố tại ThừaThiên Huế, bao gồm: chiều cao cây, kích thước lá, kích thước rễ củ, hình dạng vàmàu sắc hoa, quả,…

-Sử dụng kỹ thuật DNA mã vạch đã định danh được loài Sâm cau phân bố

trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế là loài Curculigo orchioides Gaertn., thuộc chiCurculigo, họ Hypoxidaceae 15 trình tự trnL-trnF có mã số tương ứng từ

OR035735- OR035749 đã được ký gửi lên GenBank.

-Đã đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của các mẫu Sâm cau thôngqua 6 mồi khuếch đại nhiều band DNA với độ đa hình cao Sự khác biệt di truyềncủa các quần thể Sâm cau tại một số địa phương trong nước khá cao Tỉ lệ locus đahình của các quần thể Sâm cau đạt trung bình là 80,66% với khoảng cách di truyềngiữa các mẫu từ 0,0611 đến 0,2958.

-Đã xác định được một số thành phần hóa sinh ở mẫu rễ củ và mẫu lá trongcây Sâm cau phân bố tại Thừa Thiên Huế, bao gồm các chỉ tiêu về hàm lượng củanước (77,778 - 79,853%), tro (8,080 - 10,800%), cellulose (19,060 - 24,820%), vitaminC (0,088 - 0,172%), lipid tổng số (5,010 - 10,420%), protein (0,166 - 3,480 mg/g),flavonoid (0,508 - 2,129 mg/g), polysaccharide (24,859 - 102,274 mg/g), saponin(2,469

- 5,340 mg/g), alkaloid (9,553 - 10,039 mg/g), và lycorine (0,241 - 1,777 µg/mL).

-Dịch chiết từ rễ củ của cây Sâm cau với nồng độ lycorine cao có tác dụngức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư dạ dày, cũng như kích thích quá trìnhsinh tinh trên mô hình thực nghiệm, đặc biệt ở liều dùng dịch chiết 200 mg/kg thểtrọng và 400 mg/kg thể trọng.

6 Đạo đức nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm trên mô hình chuột Swiss đực đã được Hội đồngđạo đức trong nghiên cứu Y đức của Đại học Huế thông qua (số HU VN0007).

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ SÂM CAU1.1.1 Đặc điểm phân loại

Cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thuộc chi Cồ Nốc (Curculigo).Trước đây, chi Curculigo xếp vào họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) [11], nhưng hiện

nay được xếp vào họ Tỏi voi lùn (hay còn gọi là họ Hạ trâm, Hypoxidaceae), BộMăng tây (Asparagale) [195], [260].

Hình 1.1 Cây (A) và rễ củ (B) của Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) [46], [195]1.1.2 Đặc điểm của họ Hypoxidaceae

Hypoxidaceae là một họ thực vật hạt kín, gồm có 9 chi và khoảng 220 loài,chủ yếu phân bố tại các khu vực thuộc Nam Bán cầu, vùng nhiệt đới chấu Á và Bắc

Mỹ [224] Tại Việt Nam có 2 chi là chi Cồ nốc (Curculigo) và chi Hạ trâm(Hypoxis) với khoảng 10 loài [260] Các loài thực vật thuộc họ này đều có đặc điểm

chung là cây thảo, rễ củ hoặc rễ củ dạng củ Lá hình lưỡi mác mọc từ gốc giống nhưlá cau non, có gân song song và nổi rõ Hoa mọc thành cụm hoa, và được mọc từgốc Hoa thuộc mẫu 3, bầu dưới Noãn nhiều đính thành 2 hàng trên giá noãn trụgiữa Hạt có mỏ nhỏ ở bên [46], [260].

Hệ thống phân loại học thực vật của Anh cũng mô tả các đặc điểm của thựcvật thuộc họ Hypoxidaceae bản địa là những loại thảo mộc lâu năm có lá giống cỏmọc từ thân ngầm Các lá nguyên vẹn, có gân song song, không có răng và có lôngtrắng Cụm hoa được mọc trên một cuống không có lá Hoa có 6 đài hoa, có hìnhdạng đối xứng tỏa tròn và có màu vàng; các lá đài đính phía trên bầu nhụy (tức là

nhụy ở dưới) và có lông ở mặt ngoài/mặt dưới có 6 nhị Quả có hình dạng như làmột viên nang khô Các loài trong họ này trước đây được coi là thuộc về Liliaceae.Hiện nay ở Anh quốc, họ Hypoxidaceae chỉ có 1 chi và 1 loài trong khu vực [224],[259].

1.1.3 Đặc điểm của chi Curculigo

Chi Curculigo trên thế giới có khoảng hơn 20 loài Theo Phạm Hoàng Hộ(2003), chi Curculigo ở Việt Nam hiện có 7 loài [11] Theo công bố của Lã Đình

Mỡi và cs (2005) [22] và cơ sở dữ liệu cập nhật trên Trung tâm dữ liệu thực vật Việt

Nam [260], hiện nay chi Curculigo ở Việt Nam gồm có 9 loài: C annamiticaGagnep (tên tiếng Việt: Cồ Nốc Trung bộ), C capitulata (Lour.) O.Kuntze (têntiếng Việt: Cồ Nốc hoa đầu, Sâm cau lá dừa; tên khác: Leucoium capitulata Lour.;Curculigo recurvata Dryan.), C disticha (Gagnep.) (tên tiếng Việt: Cồ Nốc songđính), C gracilis (Kurz) Wall ex Hook.f (tên tiếng Việt: Cồ Nốc mảnh, Lòngthuyền; tên khác: Moliniera gracilis Kurz), C latifolia Dryand ex Ait (tên tiếngViệt: Cồ Nốc lá rộng, Sâm cau lá rộng), Curculigo orchioides Gaertn (tên tiếngViệt: Cồ Nốc lan, Sâm cau, Ngải cau, Nam sáng ton, Soọng ca, Thài léng), C.sinensis S.C Chen, C tonkinensis Gagnep (tên tiếng Việt: Cồ Nốc Bắc bộ), C.conoc Gagnep (tên tiếng Việt: Cồ nốc),

C crassifolia (Baker) (tên tiếng Việt: Cỏ lá dừa trắng).

Chi Curculigo có nguồn gốc từ Ấn Độ và có thể tìm thấy nhiều nơi trên thế

giới, phân bố ở độ cao lên tới 2.300 m so với mực nước biển, đặc biệt ở các vùng

núi đá vôi Các loài thực vật thuộc chi Curculigo là loài cây thân thảo, sống lâu

năm, thường có thân rễ dạng củ Lá dẹt có gốc bẹ, thường có phủ lông Cụm hoamọc gần gốc Hoa màu vàng, có bầu nhụy ẩn trong bẹ lá; bao hoa, nhụy và bao phấnnhô cao lên phía trên bầu nhụy trên một ống hẹp thon dài (ống bao hoa) Quả nang

có hạt màu đen, bóng [11] Thực vật thuộc chi Curculigo chứa thành phần các chất

chuyển hoá thứ cấp đa dạng và phong phú với nhiều hoạt tính sinh học Vì vậy,

Curculigo được sử dụng trong y dược học nhằm giúp điều hoà miễn dịch, loại bỏ

các gốc tự do và chống oxy hoá, điều chỉnh vị giác, chống viêm [34], [37]; kíchthích tình dục, điều chỉnh hành vi tình dục và hormone sinh dục [50], [58], [200];bảo vệ thần kinh [250]; chống loãng xương; chống viêm; chống khối u [233]; ổn

định tế bào mast và kháng histamin [214]; cũng như hoạt tính chống đái tháo đường[114].

1.1.4 Đặc điểm thực vật học của Sâm cau

Trong dân gian Sâm cau còn được gọi với nhiều tên khác nhau, như Kali Musalihay Siyah Musli theo hệ thống y học Ayurvedic [102], [125], [181] hoặc Cồ nốc lan,

Ngải cau, Nam sáng ton, Soọng ca, Thài léng, Tiên mao, Ngãi sâm, Cỏ mắt vàng, ….[11], [27], [260] Sâm cau là một loài thảo mộc, sống lâu năm, thân ngầm căn hànhhình trụ, cao 3 - 10 cm, mọc thẳng hoặc hơi cong queo, hai đầu thót lại, mang nhiều rễphụ [3], đường kính 0,6 - 1,2 cm Mặt ngoài rễ củ có vỏ thô màu nâu hoặc nâu đen, cócác lỗ sẹo rễ con và nhiều vết nhăn ngang, bên trong có nạc màu vàng ngà Chất cứngvà giòn, dễ bẻ gãy, mặt gãy không phẳng, màu nâu nhạt tới nâu hoặc nâu đen ở giữa.Mùi thơm nhẹ, vị đắng và cay Lá (10 - 45 × 0,5 - 3,5 cm) mọc thành đám ở thân ngắnvới các bẹ lá ở gốc, xếp nếp tựa như lá Cau, dài 20 - 50 cm, rộng 2,5 - 3,0 cm; phiến lácó hình mũi mác hẹp có gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn gần như cùng màu, gânsong song rất rõ; bẹ lá to và dài, cuống lá có thể dài đến 10 cm [11], [46], [125].

Sâm cau có hoa quanh năm, hoa màu vàng nhạt, lưỡng tính Phát hoa ở mặtđất, cụm hoa nằm trên một trục ngắn và mảnh giữa các bẹ lá, gồm 3 - 5 hoa; baohoa nằm trên một phần kéo dài của bầu hình thoi có lông rậm kéo dài thành mỏ Lábắc hình trái xoan nhọn, lá đài 3 có lọng dài ở lưng; tràng 3 cánh nhẵn; nhị 6 xếpthành hai dãy, chỉ nhị ngắn; đầu nhụy hình trái xoan, chia 3 nhánh mập Noãn nhiềutrên mỗi ô, đường kính 2 mm, đầu nhụy 3, thuỳ dài ra Quả nang, thuôn, dài 1,2 -2,0 cm, rộng 8 mm, chứa 1 - 4 hạt [11], [65], [181], có khi lên đến 8 hạt [46], [192],[195] Hạt màu đen, hình cầu, đường kính 1-2 mm, ở đầu hơi phình còn phía dướicó một phần phụ hình liềm, có mỏ, khoét sâu thành các đường lượn sóng [3], [192].Cây sinh trưởng tốt trong mùa mưa ẩm, mùa hoa quả từ tháng 5 - 7 [3].

1.1.5 Phân bố

Curculigo là một chi thực vật có hoa trong họ Hypoxidaceae, được mô tả lần

đầu tiên vào năm 1788 Nó phổ biến trên khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đớicủa châu Á, châu Phi, châu Úc và châu Mỹ trong các khu rừng râm mát [94], [111].

Trong chi Curculigo thì loài Curculigo orchioides Gaertn (2n = 36) là một loại

thuốc quan trọng trong hệ thống y học Ayurvedic và Unani, được sử dụng dưới tên“Kali Musli” và “Siyah Musli” Các cây này được phân bố ở Rajasthan, Ấn Độ,Trung

Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Philippines, Indonesia,Pakistan, Papua New Guinea, …[63], [260] và xuất hiện rộng rãi ở vùng cận nhiệt

đới Himalaya [181] Ở nước ta, Curculigo orchioides Gaertn (hay còn gọi là Sâm

cau đen, Ngải cau, Tiên mao,…), phân bố rải rác ở các khu vực ẩm ướt tại các vùngnúi như Lai Châu, Tuyên Quang, Sơn La, Cao Bằng, Lạng Sơn, Ba Vì, Hòa Bình,Ninh Bình, Hà Nam, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, KonTum, Lâm Đồng, Bà Rịa-Vũng Tàu [7], [11].

Cây Sâm cau thường phân bố trên nền đất ẩm ven rừng, nhất là các vùngrừng đá vôi hoặc trên nương rẫy của Việt Nam, nơi có độ cao lên tới 1.500 m [1] ỞJava, có thể gặp Sâm cau trên các đồng cỏ trảng nắng hoặc dưới bóng che nhẹ, tạinhững khu vực có một mùa khô hạn hoặc dưới tán các rừng Tếch, ở độ cao 400 mso với mực nước biển [22] Ở vùng núi cận nhiệt đới của miền Trung dãy Himalayacó thể thấy Sâm cau phân bố trong các khu rừng thưa, nhưng hiếm gặp trong rừngrậm ở độ cao 2.250 m đến 2.300 m so với mực nước biển [32], [102], [138] Sâmcau được xem là loài cây bản địa của Ấn Độ và xuất hiện rộng rãi nhiều khu vựckhác như vùng Mahabharat (Nepal), Khasia Hills, Assam, Arunachal, Manipur,Bengal; Western Ghats từ Konkan về phía nam-Bang Maharashtra, Kanara,Nilghiris, Madras đến Cape Comorin, Tích Lan, Trung Quốc, Nhật Bản và Nepal,… [51], [192].

1.2 MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA

DẠNG DI TRUYỀN

1.2.1 DNA mã vạch1.2.1.1 Khái niệm

Thuật ngữ DNA mã vạch (DNA-barcoding, DNA barcode) lần đầu tiên đượcArnot và cs sử dụng vào năm 1993 trong một bài báo mà không nhận được sự chú ýnhiều từ cộng đồng khoa học Đến năm 2002, thông qua nghiên cứu của Hebert vàcs phản ánh mối quan hệ gần gũi của 200 loài sinh vật thuộc bộ cánh vảy với độchính xác 100% bằng cách sử dụng gene ty thể cytochrome-c oxidase tiểu đơn vị I

(COI), DNA mã vạch bắt đầu có tầm ảnh hưởng lớn mạnh Để thúc đẩy việc sử

dụng DNA mã vạch cho tất cả sinh vật nhân chuẩn sống trên hành tinh này, CBOL

gồm hơn 120 tổ

chức từ 45 quốc gia, với mục tiêu ban đầu là xây dựng một thư viện trực tuyến trìnhtự mã vạch (barcode) cho tất cả các loài chưa được biết đến, có thể làm tiêu chuẩnphân loại cho bất kỳ mẫu DNA nào [20], [55] Với sự hỗ trợ của CBOL, cũng nhưTrung tâm công nghệ thông tin Quốc gia (National Center for BiotechnologyInformation - NCBI) của GenBank, DNA mã vạch ngày càng phát triển và là mộtcông cụ di truyền hữu ích được hệ thống hóa để thực hiện chính xác việc xác địnhvà định danh cho mọi loài [71], [154], [212].

Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng một hoặc nhiều trình tự genengắn (200 - 900 bp) được lấy từ một phần chuẩn hóa của hệ gene để hỗ trợ các loàitrong nhận dạng và khám phá bằng cách sử dụng phân kỳ trình tự dựa trên sự liênkết nucleotide [73], [84], [92] Đặc điểm quan trọng nhất của DNA mã vạch là phảiphổ biến và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng, dễ dàng khuếch đại bằngPCR [71], [243] Trong những năm gần đây, một số vùng gene lục lạp (cpDNA), và

vùng gene nhân (ITS-rDNA) đang được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu mối

quan hệ phát sinh chủng loại (phylogeny), phân loại (taxonomy) và nhận dạng loài(identity) ở thực vật [55], [84], [238].

Hiện nay, các ứng viên mã vạch tiêu chuẩn chính giúp phân biệt các loài thực

vật với độ chính xác cao gồm có: ITS, matK, rbcL, psbA-trnH và trnL-trnF Trongđó, trnL-trnF là mã vạch chiếm ưu thế nhờ tính đa vị trí DNA mã vạch và độ biến

thiên cao, giúp nhận diện một cách chính xác thực vật ở cấp độ loài và dưới loài Số

lượng ấn phẩm về trnL-trnF gia tăng hàng năm và đạt trên 10.000 vào năm 2021[93], [253] Vùng trnL-trnF là vùng là chất đệm giữa 2 gene tRNA-Leucine và

tRNA- Phenylalanine, nằm trong vùng sao chép đơn lớn của bộ gene lục lạp [118],[177] Vùng gene này có tỷ lệ chuyển đổi nucleotide cao, khả năng tạo biến thể ditruyền tương đối cao và cung cấp các thông tin phân loại có tính hệ thống hơn Sửdụng mã vạch này để phân tích có thể ảnh hưởng đến việc đọc trình tự ở một số loàido việc lặp lại mononucleotide, nhưng nhìn chung rất đơn giản để giải trình tự [93],[253] Ngoài ra, sự phân bố không gian đa dạng của các nucleotide dọc theo vùng

trnL-trnF còn giúp xác định sự tiến hóa khác nhau giữa các loài sinh vật [248].

DNA mã vạch là một công cụ chẩn đoán hiện đại với các ứng dụng ngày càng

tăng trong phân loại học, sinh học hệ thống và nghiên cứu sinh thái DNA mã vạchcó thể dễ dàng khắc phục những giới hạn của việc phân loại loài thông thường gâyra do các mẫu nghi ngờ có thể bị hư hỏng hoặc không đầy đủ chỉ với một phần môkhả thi để nhận dạng; giảm thiểu được tình trạng DNA bị phân mảnh trong môitrường [71], [84] Tính hữu ích của DNA mã vạch không chỉ giới hạn trong nghiêncứu khoa học về đa dạng sinh học mà còn liên quan đến bảo tồn, sức khỏe cộngđồng và an toàn sinh học [71], [196], [228], [232].

1.2.1.2.Ứng dụng kỹ thuật DNA mã vạch trong nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc

Trong nghiên cứu của Yu và cs (2017), vùng ITS2 được đánh giá trên 127 trình

tự đại diện cho 101 mẫu cây thuốc thu thập từ 14 tỉnh thành khác nhau tại Trung Quốc

(Trachelospermum jasminoides, F pumila, F tikoua và E fortui) Kết quả cho thấy, tỷ

lệ khuếch đại thành công của các vùng ITS2 cho tất cả 101 mẫu là 100% và các trình tựhai chiều đều có chất lượng cao Trình tự ITS2 của các loài nghiên cứu tương đối khác

nhau với độ dài được căn chỉnh là 270 bp và tồn tại 126 vị trí biến đổi chiếm tỷ lệ

46,7% Ngoài ra, trong nghiên cứu chỉ có một kiểu đơn bội của loài T jasminoidesđược tìm thấy, không quan sát thấy các vị trí biến đổi và khoảng cách giữa các loài T.

jasminoides là 0,000; trong khi đó khoảng cách với các loài còn lại rất cao và khoảng

cách mã vạch rõ ràng được ghi nhận dao động trong khoảng từ 0,488 - 0,607 Như vậy,

vùng ITS2 có thể thay đổi và phù hợp với sự khác biệt cao giữa các loài trong cây thuốc

Chi Blumea là một trong những chi có nhiều loài được sử dụng làm thuốc

thảo dược hoặc trong ngành công nghiệp hóa chất với giá trị kinh tế cao ở TrungQuốc Tuy nhiên, người ta biết rất ít về mối quan hệ phát sinh loài và tiến hóa phântử của chi này ở Trung Quốc Vì vậy, Zhang và cs (2019) đã tiến hành phân tích 16

mẫu của 12 loài thuộc chi Blumea ở Trung Quốc bằng trình tự DNA ribosome hạchnhân (nrDNA) và DNA lục lạp (cpDNA) trnL-F để tái cấu trúc mối quan hệ phátsinh gene và ước tính thời gian phân kỳ Kết quả chỉ ra rằng, chi Blumea là đơn

ngành và được

chia thành 2 nhánh khác nhau về môi trường sống, hình thái, loại nhiễm sắc thể và

thành phần hóa Trong đó, nhánh I gồm 3 loài thuộc phân chi Macrophyllae (B.aromatica, B densiflora, B balsamifera) và 1 loài thuộc phân chi Paniculatae (B.lanceolaria); 8 loài còn lại đều thuộc nhánh II [248].

Để đánh giá quan hệ họ hàng của các loài trong chi nhân sâm (Panax), Vũ

Đình Duy và cs (2020) đã tiến hành thu thập và phân tích các mẫu sâm thu tại núiPhu Xai Lai Leng và vườn Dược liệu của công ty TH (Kỳ Sơn, Nghệ An) Mã vạch

DNA vùng gene nhân (ITS-rDNA) và vùng gene lục lạp (matK) đã được sử dụng.Kết quả cho thấy 100% vùng gene ITS-rDNA và matK đều được khuyếch đại PCR

và trình tự đọc hai chiều với độ dài trình tự nucleotide tương ứng là 616 bp và 1433bp So sánh với dữ liệu trên ngân hàng gene thế giới (NCBI), tất cả 32 mẫu sâm tự

nhiên đều có mối quan hệ chặt chẽ với loài Tam thất hoang (P stipuleanatus)

= 99%, BPP = 100%), 19 mẫu sâm tại vườn dược liệu đều có mối quan hệ chặt chẽ

với loài Tam thất (P notoginseng) (MLBS = 100%, BPP = 100%) Sự khác biệt ditruyền giữa các loài trong chi Panax thay đổi từ 0,2 - 7,9%, trung bình 4% đối vớivùng ITS-rDNA và trung bình 1,2% (0,1 - 2,9%) đối với vùng matK Nghiên cứunày đã chỉ ra rằng các loài trong chi Panax có cùng nguồn gốc tiến hóa, giúp xácđịnh mối quan hệ di truyền của các loài/thứ trong chi Panax và ghi nhận Tam thất

hoang có phân bố tại núi Phu Xai Lai Leng, xã Na Ngòi, Kỳ Sơn, Nghệ An, trên cởsở đó chính thức mở rộng vùng phân bố của loài này ở Việt Nam [8].

Huỳnh Thị Thu Huệ và cs (2021) đã tiến hành giải trình tự, phân tích chỉ thị

DNA vùng trnL-trnF có kích thước 1.075 bp từ 10 mẫu lá khô của cây Cà gai leo(Solanum procumbens Lour.) Kết quả cho thấy 100% đoạn gene từ 10 mẫu nghiêncứu đều tương đồng với các công bố của loài Solanum procumbens Lour Khoảngcách di truyền dựa trên trnL-trnF của các mẫu so với một số loài trong chi Solanum

dao động với biên độ thấp, từ 0,0082 đến 0,0399 Các số liệu thu được từ nghiêncứu đã cung cấp thêm thông tin cho những nghiên cứu đa dạng di truyền về chi Cà

(Solanum) cũng như cây thuốc của Việt Nam [13] Ở một nghiên cứu khác trên cây

Bách bộ thu được từ vùng núi miền Bắc Việt Nam, hai chỉ thị DNA mã vạch gồm

truyền

và cây phát sinh chủng loại cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa các mẫu Bách bộ

nghiên cứu với trình tự của loài Stemona tuberosa Lour Vùng gene trnL (1100 bp)cho thấy khả năng phân biệt các loài Bách bộ tốt hơn so với vùng gene rbcL (600

bp) Những kết quả này là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo về loài Bách bộvà những loài cây thuốc quý khác, phục vụ cho nghiên cứu khoa học và thực tiễnnhư phân loại đánh giá đa dạng và bảo tồn [12].

Nghiên cứu dựa trên 3 vùng gene DNA mã vạch là rbcL, ITS, ycf1 và vị trí

codon mã hoá đầu tiên (ScoT) đã được Hasim và cs (2021) sử dụng để tìm ra mốiquan hệ phát sinh gene của 9 loài cây thuốc nguy cấp đặc hữu có nguy cơ tuyệtchủng ở vùng Saint Kathrine, bán đảo Sinai 19 trình tự mã vạch mới đã được đưavào cơ sở dữ liệu NCBI DNA mã vạch có hiệu quả cao trong việc xác định mốiquan hệ di truyền giữa 9 loài nghiên cứu, và có thể phân cụm các loài được nghiêncứu thành các nhóm thích hợp ở cấp phân loại chi và loài một cách hiệu quả Trongkhi đó, chỉ thị phân tử SCoT không thể nhóm các loài thực vật thuộc cùng một chilại với nhau, nó chỉ có thể nhóm các loài thực vật thuộc cùng một họ [91].

Năm 2022, Chen và cs đã phân tích trình tự ITS của cây Gừng đenDistichochlamys citrea có nguồn gốc từ Bạch Mã (Thừa Thiên Huế, Việt Nam) Kếtquả điện di trên gel agarose cho thấy các bộ khuếch đại bởi các đoạn mồi ITS cókích thước khoảng 750 bp So sánh dựa trên BLAST giữa 15 trình tự ITS nghiên

cứu với các các trình tự tham chiếu trên GenBank cho thấy các trình tự hình thành

cụm với các trình tự ITS của cùng loài (AF478744, AY424757, AJ388282, và

AB552946), tách biệt với các loài khác trong họ Zingiberaceae [60] Cũng trong

năm này, loài hoa đặc hữu ở Sa Pa, tỉnh Lào Cai, Việt Nam là Lilium poilanei thuộcchi Lilium, họ Liliaceae đã được đánh giá các đặc điểm hình thái và dữ liệu trình tựDNA bao gồm các đoạn DNA ribosome nhân của ITS, ITS2 và plastid matK, psbA-trnH và rbcL, rpoC1 đã được áp dụng Kết quả cho thấy một số chi tiết hình tháicủa hoa loa kèn đã được phân tích cụ thể và cả hai chỉ thị ITS2 và rpoC1 đều chothấy sự vượt trội trong việc phân biệt L polinanei với điểm tương đồng 100% và cósố gia nhập mới là KR632775.1 và KR632777.1 được đăng ký tại NCBI GenBank.

Những dữ liệu chi tiết về loài này có thể đóng góp vào sự phát triển bền vững hơn

lược nhân giống hoa loa kèn và góp phần vào các cuộc điều tra đa dạng sinh học vàbảo tồn sinh học của loài hoa loa kèn quý hiếm [100].

Bên cạnh đó, các loài thực vật thuộc chi Dó bầu (Aquilaria) là loài thực vật

có nhiều tác dụng dược lý, đặc biệt là tác dụng trị đái tháo đường và nhuận tràng.

Ito và cs (2022) đã xác định được 3 loài Dó bầu: A rugosa, A sinensis và A.crassna nhờ sử dụng trình tự matK và trnL-trnF Đồng thời, phân tích mẫu lá bằng

kỹ thuật HPLC và LC/MS, nhóm tác giả đã cho thấy sự khác biệt về hàm lượng vàthành phần hóa học của 3 loài Dó bầu, cũng như phân biệt được sự khác biệt về hoạttính ức chế và cường độ ức chế α-glucosidase trong dịch chiết lá [104].

Bộ công cụ ITS2 cũng đã hỗ trợ hiệu quả trong nghiên cứu của Jamdade và

cs (2022) để xác định 20 loài thực vật quan trọng về mặt y học thuộc chi

Caryophyllales Kết quả chỉ ra rằng ITS2 đã thành công trong việc phân biệt các

loài được kiểm tra, và có thể được sử dụng để phát hiện tạp nhiễm bẩn ở những câythuốc này Hơn nữa, nghiên cứu này cho thấy rằng sự kết hợp của nhiều phươngpháp có thể hỗ trợ giải quyết các phân loại tương tự về mặt hình thái hoặc có liênquan chặt chẽ [105].

1.2.2 Kỹ thuật RAPD1.2.2.1 Khái niệm

Kỹ thuật RAPD (RandomLy Amplified Polymorphic DNA) là kỹ thuật chỉthị phân tử được William và cs công bố lần đầu tiên vào năm 1990 Hiện nay,RAPD được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật[20].

Cơ sở của kỹ thuật RAPD là sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCRvới các mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mấtnucleotide ở vị trí bắt mồi Mồi sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên,với tỷ lệ base nitơ GC đạt tối thiểu 40% (thường là 50 - 80%), không có trình tựbase đầu xuôi và ngược giống nhau và nhiệt độ kéo dài mồi thấp (34 - 40ºC) [28],[229].

RAPD là chỉ thị trội được di truyền theo qui luật Mendel và được xác địnhdựa trên sự xuất hiện/không xuất hiện của band DNA Một band RAPD sẽ được tạora ở cả dạng đồng hợp tử và dị hợp tử, mặc dù độ đậm nhạt của band có thể khác

nhau nhưng xác định sự đa dạng dựa trên độ đậm nhạt của các band là công việckhó khăn Vì vậy, việc phân biệt các cá thể trội đồng hợp tử với dị hợp tử thường làkhông thể.

Hơn nữa, khó có thể xác định là các band được khuếch đại từ các locus khác nhauhay là các allele khác nhau của một locus đơn Vì vậy, có thể xác định sai số lượngcác locus được khuếch đại Điều này đúng trong trường hợp sản phẩm RAPD khácnhau do đột biến thêm/mất đoạn chứ không phải do đột biến ở vị trí gắn mồi [20].

Hình 1.2 Các bước thực hiện kỹ thuật RAPD [33]

Kỹ thuật RAPD không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu vàcó thể ứng dụng cho các loài khác nhau với các mồi chung Hơn nữa, kỹ thuậtRAPD đơn giản và dễ thực hiện gồm các bước cơ bản sau [28]:

- Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR- Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide

- Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng(NTSYSpc, UPGMA Cluster, Gelcompar…) Các số liệu thu được cho thấy sự gầngũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.

Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã thiết lập được phần mềm máy tính để tựđộng hoá việc xây dựng sơ đồ quan hệ hay độ tương đồng di truyền của các đốitượng nghiên cứu sau khi nhập dữ liệu về các phân đoạn được nhân bản của các cáthể, từ đó cho phép đánh giá được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể đượcnghiên cứu.

NTSYSPC là một công trình cho phép giảm bớt thời gian tính toán và có độ chínhxác cao nên nó là một phần mềm hiệu quả trong việc phân tích kĩ thuật RAPD Chỉthị RAPD sinh ra những chỉ thị trội bởi sự có mặt hay vắng mặt những band DNAđặc trưng, vì vậy không phân biệt được thể dị hợp Đó là hạn chế của chỉ thị này sovới chỉ thị đồng trội RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) [229].Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ở nhữngdòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại RAPD là kĩ thuậtphân loại phân tử dễ sử dụng, được ứng dụng trong xác định tính đa dạng sinh họcvà quan hệ họ hàng của các giống thực vật, động vật khác nhau trong các loài Lợithế của loại chỉ thị này là không cần biết thông tin về trình tự Chỉ thị RAPD còn cómột hạn chế nữa là độ nhạy của RAPD bị phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng,đôi khi kết quả không lặp lại được, đặc biệt là ở những đối tượng có bộ gene lớnnhư lúa mì Để khắc phục hạn chế này, người ta đã nhân dòng những band RAPDđặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết kế những đoạn mồi dài khoảng 20 bptừ cả hai đầu và gọi là chỉ thị SCARs (Sequence-Characterized Amplified Region).Do đó, trong phân tích di truyền, để đảm bảo kết quả có độ chính xác cao, người tathường sử dụng kết hợp kĩ thuật RAPD với các kĩ thuật phân tử khác [48], [97].

1.2.2.2 Ứng dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc

Nghệ đen là một trong những loài nghệ có sự phân bố rộng nhất ởBangladesh, để đánh giá mức độ đa dạng di truyền giữa các quần thể nghệ đen tựnhiên, Islam và cs (2005) đã sử dụng kỹ thuật RAPD Sử dụng hệ số Shannon chothấy nghệ đen ở các vùng đồi như Srimangal, Chittagong và Sitakundu có mức độđa dạng di truyền cao hơn ở vùng đồng bằng (Savar) hay cao nguyên (Birganj) Các

tác giả nhận thấy mức độ đa dạng giữa các quần thể (H′pop/H′sp) đạt 0,717, cao hơn

mức độ đa dạng bên trong quần thể (GST) là 0,283 Phân tích phân bố di truyền

(PCoA) cho thấy các cá thể có nguồn gốc từ vùng đồi được xếp vào một nhóm vàphân biệt rõ với các quần thể vùng đồng bằng hay vùng cao nguyên [103].

Sâm Bố Chính (Abelmoschus sadittifolius (Kurz) Merr là loại thuốc được

dùng phổ biến trong dân gian, có tác dụng làm thuốc bổ, điều kinh, chữa nóng sốt,… Phạm Ngọc Oanh và cs (2006) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa

của 7 mẫu sâm Bố chính tại các tỉnh phía Nam Kết quả cho thấy sự tương đồng của7 mẫu nghiên cứu thay đổi từ 25 - 94% và được chia thành 2 nhóm: một nhóm làSâm Báo hoa vàng Thanh Hóa, một nhóm là 6 loại còn lại Sử dụng chỉ thị RAPD,nhóm tác giả đã nhận dạng được chính xác loài Sâm Báo hoa vàng Thanh Hóa, SâmPhú Yên, Sâm thành phố Hồ Chí Minh và Sâm Lộc Ninh [24].

Dhanya và cs (2011) đã nghiên cứu vùng khuếch đại trình tự đặc trưng(SCAR) có độ đặc hiệu, độ nhạy và độ lặp lại cao để phân biệt các loài Nghệ khác

nhau là C longa, C zedoaria và C malabarica Hai chỉ thị giả định RAPD là ‘Cur

01’ và ‘Cur 02’ được tạo bởi các cặp mồi ngẫu nhiên OPA-01 và OPE-18 tương

ứng có nguồn gốc từ C zedoaria và C malabarica Kết quả phân tích, so sánh bột

nghệ thật với các mẫu bột nghệ đang lưu hành trên thị trường đã phát hiện sự có mặt

của C longa, C zedoaria và C malabarica Như vậy, RADP là một phương pháp

hữu ích giúp các cơ quan quản lý chất lượng thực phẩm kiểm định và sàng lọc cácsản phẩm bột nghệ ở qui mô lớn dành cho xuất nhập khẩu [66].

Trong nghiên cứu của Trương Thị Hồng Hải và cs (2020), 100 cây sâm NgọcLinh 4 và 5 tuổi trồng tại trại Tăk Ngo (Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) đã đượcđánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD Kết quả phân tích với 7 mồi ngẫunhiên đã thu được 132 band DNA đa hình, có kích thước nằm trong khoảng từ 150 -3.500 bp; sự đa dạng di truyền của các cá thể trong quần thể sâm nghiên cứu khácao, hệ số đa dạng trong từng mồi ngẫu nhiên dao động từ khoảng 0,350 - 0,484 Hệsố tương đồng di truyền giữa các mẫu sâm Ngọc Linh biến động từ 0,000 - 0,950 vàchia thành hai nhóm chính ở hệ số tương đồng di truyền 0,700 [9].

Cà Ba thùy (Solanum trilobatum) là một cây thuốc của Ấn Độ có thành phần

glyco-alkaloid steroid có thể sử dụng như tiền chất cho sản xuất steroid thương mại.Shilpha và cs (2013) đã sử dụng chỉ thị RAPD và ISSR (Inter-Simple Sequence

Repeats) để đánh giá sự đa dạng di truyền trên 14 mẫu Solanum trilobatum thu được

từ 5 tiểu bang Nam Ấn Độ Bằng cách sử dụng 20 mồi RAPD đã thu được 189 bandriêng biệt trong đó có 160 band đa hình; bảy mồi ISSR đã thu được 72/83 band đahình Các giá trị PIC dao động từ 0,49 - 0,93 đối với chỉ thị RAPD và 0,16 - 0,9 đốivới ISSR Phân tích nhóm UPGMA đã cho thấy tất cả các mẫu thu thập từ TamilNadu (Ấn Độ) phân

bố trong một nhóm và các mẫu còn lại trong một nhóm khác Nghiên cứu này đã thểhiện mối quan hệ phát sinh loài và biến động di truyền cao, từ đó cung cấp dữ liệucơ bản cho việc bảo tồn và chọn lọc giống cây Ba thuỳ trong tương lai [188].

Năm 2014, Ashraf và cs đã thực hiện nghiên cứu để đánh giá 12 mẫu Gừng

(Zingiber officinale Roscoe) được thu thập từ các tiểu lục địa của Ấn Độ bằng chỉ

thị RAPD 13/20 mồi được sàng lọc đã tạo ra 275 band khuếch đại, trong đó 261band đa hình (94,9%) Từ các số liệu phân tích, nhóm nghiên cứu đã xác định đượctỷ lệ đa hình của tất cả 12 mẫu dao động từ 88,23% - 100%, hệ số tương quan vàdựng cây phả hệ Qua đó, các tác giả cho thấy rằng Gừng đã trãi qua biến đổi ditruyền dưới tác động của các điều kiện sinh thái [45].

Bằng chỉ thị RAPD, Nguyễn Thị Ngọc Trâm và Đặng Trọng Lương (2014) đãđánh giá được sự đa dạng di truyền của 4 mẫu cây Đinh lăng Hệ số tương đồng ditruyền giữa các mẫu là rất lớn đạt từ 0,90 - 0,98 Trong đó, cây số 1 khác xa về mặt ditruyền so với 3 giống còn lại với độ tương đồng di truyền đạt 0,9 Dựa vào đặc điểmhình thái, dược chất và phân tích di truyền, nhóm tác giả chọn giống Đinh lăng

(Polyscias fruticosa

L Harms), cây số 1 có nguồn gốc từ Hưng Yên, để đưa vào sản xuất thuốc [31].

Trà hoa vàng thuộc chi Trà (Camellia), họ Chè (Theaceae), có nguồn gốc ở

khu vực miền Đông và miền Nam Châu Á Đây là loài thực vật quý hiếm vừa có giátrị làm cảnh vừa có giá trị chữa bệnh Đặng Quang Bích và cs (2017) đã sử dụng chỉthị RAPD và ISSR để đánh giá đa dạng di truyền nguồn gene 25 mẫu Trà hoa vàngthu thập tại Quảng Ninh Với tổng số 53 mồi phân tích (45 chỉ thị RAPD và 8 chỉthị ISSR) Tổng số 4656 band đã được phát hiện trong đó có 3628 band đa hình Kếtquả phân tích cho thấy hệ số tương đồng di truyền của 25 mẫu Trà hoa vàng biếnđộng từ 0,54 - 0,81 25 mẫu Trà hoa vàng được tách thành 9 nhóm chính với mứctương đồng di truyền 0,71 Như vậy, việc kết hợp giữa phân tích kiểu hình, sự đadạng di truyền đã giúp các nhà khoa học xác định được sự đa dạng về kiểu gene củacác mẫu Trà hoa vàng có kiểu hình khá giống nhau [2].

Đảng sâm (Condonopsis javanica (Blume) Hook f.) là một cây thuốc quý

được lưu truyền từ lâu đời với các tác dụng bổ tỳ, ích khí, sử dụng để bồi bổ sức

trong tương lai ở Việt Nam, Phạm Thanh Huyền và Đinh Đoàn Long (2017) đã tiếnhành nghiên cứu nhằm đánh giá mức độ đa dạng di truyền của một số quần thể Đảngsâm phân bố tự nhiên và trồng trọt ở một số tỉnh miền núi Tây Bắc (Lào Cai, Hà Giang,Sơn La) và Tây Nguyên (Lâm Đồng, Kon Tum) Tổng cộng 15 mẫu quần thể Đảngsâm, trong đó có 3 mẫu từ Lào Cai, 1 mẫu từ Hà Giang, 1 mẫu từ Sơn La, 4 mẫu từLâm Đồng và 6 mẫu từ Kon Tum đã được thu thập để tách chiết DNA và phân tích đadạng di truyền bằng chỉ thị RAPD-PCR sử dụng 12 mồi có trình tự 10 nucleotide ngẫunhiên Kết quả phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 cho thấy trong tổng cộng 106band RAPD-PCR thu được có 88 band đa hình (83%) và 18 band đồng hình (17%).Mười lăm mẫu quần thể chia làm 2 nhóm lớn, tách biệt rõ rệt giữa nhóm mẫu thu ở TâyBắc và nhóm mẫu thu ở Tây Nguyên Các mẫu thu thập ở vị trí địa lý gần nhau có khácbiệt di truyền nhỏ hơn cho thấy nhiều khả năng chúng có nguồn gốc chung Sự khácbiệt di truyền cao giữa các quần thể cách xa về địa lý cho thấy những nguồn gene nàycần được bảo tồn độc lập phục vụ cho công tác chọn lọc và tạo giống trong tương lai[15].

Mía dò (Costus pictus), thuộc họ Costaceae (họ Mía dò) là một loại cây

thuốc quý có tác dụng chống tiểu đường Naik và cs (2017) đã thực hiện một nghiên

cứu để mô tả 15 mẫu C pictus được thu thập từ các vùng địa lí khác nhau của Ấn

Độ thông qua chỉ thị RAPD và ISSR Tổng cộng 25 mồi RAPD và 20 mồi ISSR đãđược sử dụng cho nghiên cứu này Phân tích RAPD đã tạo ra 343 locus trong đó124 là đa hình, trong khi mồi ISSR tạo ra 177 locus trong đó 77 là đa hình Sơ đồcây được tạo ra từ các dữ liệu hệ số tương đồng cho thấy mức độ đa dạng di truyềnthấp giữa các vùng phía Nam và Tây Ấn Độ [146].

Chỉ thị RAPD được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền 36 mẫu câythuốc họ Tiết dê (Menispermaceae) chứa berberin thu thập từ các tỉnh ở Việt Nam.Sử dụng 22 mồi RAPD để khuếch đại DNA đã thu được tổng số 3216 band DNAthuộc 202 loại band khác nhau, trong đó có 167 band đa hình (chiếm 82,7%) và 35band đơn hình (chiếm 17,3%) Hệ số tương đồng di truyền giữa 36 mẫu giống daođộng trong khoảng 0,53 đến 0,92 Ở mức tương đồng 73%, 36 mẫu giống được chiathành 9 nhóm, tách biệt rõ rệt giữa các chi, loài khác nhau trong họ Tiết dê Nhóm 1

bao gồm 8 mẫu giống thuộc loài Vảy đắng (còn gọi là Dây hoàng liên, Arcangelisiaflava (L.)