(Luận Văn Thạc Sĩ Hoá Hữu Cơ) Chế Tạo Và Nghiên Cứu Độ An Toàn Và Khả Năng Hỗ Trợ Lành Thương Của Tấm Màng Đa Lớp Pcl-Ag-Cos Trên Mô Hình Động Vật Định Hướng Ứng Dụng Trong Băng Gạc Vết Thương

Bä GIÁO DĂC

VÀ ĐÀO T¾O VIàN HÀN LÂM KHOA HâC VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM

Phan Thß Thanh Tâm

LÀNH THƯƠNG CþA TÀM MÀNG ĐA LàP PCL-AG-COS TRÊN MÔ HÌNH ĐÞNG VẬT ĐÞNH HƯàNG ĀNG DỤNG

TRONG BĂNG GẠC VẾT THƯƠNG

TP.HCM - 2023

VÀ ĐÀO T¾O VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM

Phan Thß Thanh Tâm

TRÊN MÔ HÌNH ĐÞNG VẬT ĐÞNH HƯàNG ĀNG DỤNG TRONG BĂNG GẠC VẾT THƯƠNG

Mã sß: 8440113

NGƯÞI HƯàNG DÀN KHOA HàC : PGS.TS Nguyßn Thß Hiáp

TP.HCM - 2023

VÀ ĐÀO T¾O VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM

Phan Thß Thanh Tâm

LÀNH THƯƠNG CþA TÀM MÀNG ĐA LàP PCL-AG-COS TRÊN MÔ HÌNH ĐÞNG VẬT ĐÞNH HƯàNG ĀNG DỤNG

TRONG BĂNG GẠC VẾT THƯƠNG

NGƯÞI HƯàNG DÀN KHOA HàC

PGS.TS Nguyßn Thß Hiáp

LÞI CAM KẾT

Tôi xin xác nhÁn rằng công viác đ°āc trình bày trong luÁn án cąa tôi là hoàn toàn do tôi thực hián, toàn bå nåi dung đ°āc hoàn thành sau khi tôi đng ký hãc ch°¢ng trình Th¿c sĩ t¿i Hãc vián Khoa hãc và Công nghá và tr°çc đó nó không phÁi là måt phần cąa luÁn án hoặc bài nghiên cću khác đã hãc vián hoặc bÃt kỳ tá chćc nào khác để lÃy bằng cÃp, bằng tát nghiáp hoặc các bằng cÃp khác NÁu bÃt kỳ kÁt quÁ nào không chính xác, tôi xin cháu hoàn toàn trách nhiám

TP.Hß Chí Minh, 2023

Phan Thá Thanh Tâm

LÞI C¾M ƠN

Tr°çc hÁt, tôi đặc biát cÁm ¢n ng°éi h°çng d¿n cąa tôi, PGS.TS Nguyßn Thá Hiáp đã cung cÃp cho tôi chą đề thú vá này, c¢ håi làm viác đåc lÁp và nhāng cuåc thÁo luÁn có giá trá Cô đã luôn tin t°ëng và đång viên tôi trong suát quá trình thực hián luÁn vn này Cô đã tÁn tình h°çng d¿n tôi trong suát théi gian nghiên cću và viÁt luÁn vn này Tôi cũng xin cÁm ¢n cô vì đã d¿y tôi cách làm viác hiáu quÁ, cách giÁi quyÁt vÃn đề và cách nghiên cću måt cách đåc lÁp

Tôi cũng muán cÁm ¢n Hãc vián Hàn lâm Khoa hãc và Công Nghá đã t¿o điều kián cho tôi hãc tÁp và làm viác

LuÁn án này đã nhÁn đ°āc rÃt nhiều sự h°çng d¿n và hã trā từ các đßng nghiáp cąa tôi: chá Võ Hßng Phúc, anh Vũ Thanh Bình, chá Đặng Ngãc ThÁo Nhi, chá Nguyßn Thá Thanh Ngãc, anh Nguyßn Vn Khiêm, và b¿n Tng TuÃn Ng¿n, em L°¢ng Đ¿i Tín và em Nguyßn Thá Ph°¢ng ThÁo t¿i phòng thí nghiám Kỹ thuÁt mô & Y hãc tái t¿o (TERM) S¿ không thể thực hián đ°āc nÁu không có nhāng cá nhân hã trā và h°çng d¿n tôi cho viác hoàn thành luÁn án này

Cuái cùng nh°ng không kém phần quan trãng, tôi xin bày tß lòng biÁt ¢n sâu sÃc nhÃt tçi gia đình tôi Hã đã hã trā và dành cho tôi mãi điều tát đẹp nhÃt trong suát quá trình làm luÁn vn Sự hã trā về tinh thần và vÁt chÃt cąa hã đã giúp tôi v°āt qua rÃt nhiều khó khn

Đó là niềm vinh dự cąa tôi khi có tÃt cÁ các b¿n ąng hå tôi NÁu không có các b¿n có l¿ tôi không thể thực hián thành công luÁn vn nh° thÁ này Måt lần nāa, cÁm ¢n b¿n rÃt nhiều

Trân trãng, Thanh Tâm

1.1.1 Måt sá khái niám quan trãng 15

1.1.2 Đái t°āng nghiên cću 15

1.2 Tình hình nghiên cću 16

CH¯¡NG 2: ĐàI T¯ĀNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU 19

2.1 HÓA CHÂT 19

2.2 CHÀ T¾O VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHÂT OLIGOMER CHITOSAN 19

2.2.1 ChÁ t¿o Oligomer Chitosan 19

2.2.2 Đå đề acetyl cąa oligomer chitosan 20

2.1.1 Khái l°āng phân tÿ (GPC) 20

2.1.2 KhÁo sát khÁ nng kháng khuẩn cąa Oligomer Chitosan 20

2.2 CHÀ T¾O MÀNG PCL-Ag-COS (PAC) 21

2.2.5 Lçp phą COS/ PVP trên màng PAP 23

2.3 ĐÁNH GIÁ TÍNH CHÂT MÀNG PAC 23

2.3.1 KhÁo sát và đánh giá hình thái bề mặt sÁn phẩm màng bằng thiÁt bá SEM 23

2.3.2 Đánh giá tính chÃt hóa hãc cąa màng PAC 23

2.3.3 KhÁo sát và đánh giá tính kỵ và °a n°çc cąa màng PAC 23

2.3.4 KhÁo sát và đánh giá tính chÃt c¢ lý cąa màng PAC 23

2.3.5 KhÁo sát và đánh giá khÁ nng hÃp thă n°çc và thoát h¢i n°çc (MVTR) cąa màng PAC 24

2.1.1 KhÁo sát và đánh giá tác đå phóng thích nano Ag cąa màng theo théi gian 25

2.1.2 KhÁo sát và đánh giá tác đå phóng thích cąa COS 25

2.1.3 KhÁo sát và đánh giá khÁ nng kháng khuẩn cąa màng PAC 25

2.1.4 KhÁo sát và đánh giá đåc tính tÁ bào cąa màng 26

2.2 KHÀO SÁT Đä AN TOÀN VÀ KHÀ NNG Hâ TRĀ LÀNH TH¯¡NG 26

2.2.1 Theo dõi và đánh giá tác dăng điều trá cąa màng PAC quy mô phòng thí nghiám 26

2.2.2 Đánh giá khÁ nng hã trā lành th°¢ng màng PAC 26

2.3 PHÂN TÍCH THÔNG KÊ 27

CH¯¡NG 3: KÀT QUÀ VÀ THÀO LUÀN 27

3.1 ĐÁNH GIÁ TÍNH CHÂT CĄA OLIGOMER CHITOSAN 27

3.1.1 Đå đề acetyl (DA) cąa oligomer chitosan 27

3.1.2 Khái l°āng phân tÿ 28

3.1.3 KhÁo sát nßng đå kháng khuẩn cąa COS 28

3.2 ĐÁNH GIÁ TÍNH CHÂT MÀNG PAC 29

3.2.1 Hình thái cąa màng 29

3.2.2 Đánh giá tính chÃt hóa hãc cąa màng 33

3.2.3 KhÁo sát và đánh giá tính kỵ và °a n°çc cąa màng 36

3.2.4 KhÁo sát và đánh giá tính chÃt c¢ lý cąa màng 37

3.2.5 KhÁo sát và đánh giá khÁ nng hÃp thă n°çc và tác đå thoát h¢i n°çc cąa màng 38

3.2.6 KhÁo sát và đánh giá tác đå phóng thích nano Ag cąa màng theo théi gian 39

3.2.7 KhÁo sát và đánh giá tác đå phóng thích cąa COS 40

3.2.8 KhÁo sát và đánh giá tính kháng khuẩn cąa màng 41

3.2.9 KhÁo sát và đánh giá đåc tính tÁ bào cąa màng 42

3.1 KHÀO SÁT Đä AN TOÀN VÀ KHÀ NNG Hâ TRĀ LÀNH TH¯¡NG 43

3.1.1 Tác dăng điều trá bằng màng PAC5-3 43

3.1.2 Đánh giá khÁ nng hã trā lành th°¢ng cąa màng PAC5-3 45

CH¯¡NG 4: KÀT LUÀN VÀ KIÀN NGHà 47

TÀI LIàU THAM KHÀO 49

DANH MĂC CÔNG TRÌNH CĄA TÁC GIÀ 48

PHĂ LĂC 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 C¢ chÁ kháng khuẩn cąa COS dựa vào c¢ chÁ kháng khuẩn cąa chitosan 17 Hình 2 Mô tÁ quy trình chÁ t¿o màng ba lçp PAC 21 Hình 3 KÁt quÁ H-NMR cąa COS 27 Hình 4 Đ°éng chuẩn PEO/PEG và kÁt quÁ GPC từ m¿u COS 28 Hình 5 KÁt quÁ khÁo sát nßng đå kháng khuẩn cąa COS bằng ph°¢ng pháp đĩa th¿ch (A) và đ°éng kính trung bình cąa vòng kháng khuẩn (B) vçi 1-PCL, 2-COS 1%, 3-COS 3%, 4-COS 5%, 5-COS 7%, 6-Penicillin Streptomicycin 29 Hình 6 Ành vi mô SEM Bề mặt cąa các nhóm màng (A) PCL; (B) PA; (C) PAP; (D) PAC5-1; (E) PAC5-2 và (F) PAC5-3 30 Hình 7 KÁt quÁ (1) so sánh đ°éng kính sāi trung bình và (2) đå phân bá đ°éng kính sāi giāa các m¿u A-PCL, B-PA, C-PAP, D-PAC5-1, E-PAC5-2, F-PAC5-3; (3) Đå dày lçp phą COS và (4) đå phą bề mặt cąa COS ë 4 khoÁng théi gian 6 tiÁng, 12 tiÁng, 18 tiÁng và 24 tiÁng 31 Hình 8 KÁt quÁ (A) đå dày màng PAC5-3 và (B) đå dày lçp phą COS t¿i ba vá trí ng¿u nhiên BÁng kÁt quÁ cho thÃy đå dày trung bình cąa màng PAC5-3 và lçp phą COS 32 Hình 9 Ành hiển vi đián tÿ truyền qua (TEM) cąa màng PA và biểu đß phân phái kíchth°çc đ°éng kính AgNPs (Thanh tỷ lá: 200 nm, n = 50) 32 Hình 10 KÁt quÁ XRD cąa màng PAP, PAG và PAC5-3 33 Hình 11 KÁt quÁ EDS khÁo sát sự có mặt cąa nguyên tá C, O và Ag trên bề mặt màng PA 33 Hình 12 KÁt quÁ UV-Vis khÁo sát sự có mặt cąa AgNPs ë théi điểm chÁ t¿o 34 Hình 13 Phá FT-IR cąa PCL, POX, PVP, COS đái chiÁu cùng màng PPC5 và PAC5-3 35 Hình 14 Góc tiÁp xúc cąa PCL, PA, PAP và PAC5-3 Các bćc Ánh phía trên mãi cåt minh hãa các giãt n°çc trên bề mặt màng (dā liáu = trung bình ± SD, n=5, *: p<0,05, ns: p>0,05) 36 Hình 15 Đặc tính c¢ hãc cąa PCL, PA, PAP, PAC5-1, PAC5-2, PAC5-3 (data = trung bình cång ± ph°¢ng sai, sá lần lặp là 3) 37 Hình 16 Tác đå truyền h¢i n°çc (A) và đå hÃp thă n°çc (B) cąa 3 nhóm màng PA, PAP và PAC5-3; vçi uncover-bề mặt thoáng không phą màng (data = mean ± SD, n = 5, ns: p> 0,05, *: p< 0,05) 38 Hình 17 L°āng AgNPs giÁi phóng trong áng nghiám từ màng PAC5-3 trong dung dách PBS (pH=5,5) Các phần dách đ°āc lÃy sau 1, 3, 6, 12 và 24 gié và đánh l°āng bằng kỹ thuÁt ICP-MS (dā liáu = trung bình ± SD, sá lần lặp=3) 40 Hình 18 (A) Nßng đå phóng thích cąa COS trong vòng 24 gié và (B) đ°éng chuẩn đå hÃp thă cąa các nßng đå COS 40 Hình 19 Hình Ánh (A) Các vùng ćc chÁ đ°āc hình thành bëi màng (1) penicillin-streptomycin , (2) PA và (3) PCL trên chąng S aureus,(B) Đĩa agar trÁi dung dách chiÁt màng PCL, (C) Đĩa agar trÁi dung dách chiÁt màng PA, (D) m¿u đái chćng trÁi dung dách khuẩn nuôi t rong môi tr°éng penicillin-streptomycin (Thanh tỷ lá: 10 mm, sá lần lặp =4) 41 Hình 20 Các vùng ćc chÁ đ°āc hình thành bëi màng (1) penicillin-streptomycin , (2)

PAC5-3 và (3) PCL trên chąng S aureus (Thanh tỷ lá: 10 mm, sá lần lặp =4) 42 Hình 21 KhÁ nng sáng (%) cąa nguyên bào sāi sau 24 gié ą ë các nßng đå khác nhau cąa dung dách chiÁt PCL, PA, PAC5-3 và màng Betaplast Silver (dā liáu = trung bình ± SD, n = 3, ns: p> 0,05, *: p< 0,05) 43 Hình 22 KÁt quÁ H&E cąa da thß sau khi điều trá 28 ngày đái vçi mô hình bßng nhißm khuẩn SA đ°āc điều trá bằng bng g¿c kháng khuẩn PAC5-3, bng g¿c th°¢ng m¿i (Betaplast Silver) và bng g¿c bình th°éng (cotton) (Th°çc đo: 10 mm) 44 Hình 23 KÁt quÁ nhuåm H&E và MT cąa m¿u vÁt th°¢ng cÃy khuẩn SA đÃp màng PAC5-3, Betaplast silver, cotton (Th°çc đo: 100μm) 46

DANH MỤC B¾NG

BÁng 1 Mô tÁ thành phần và giÁi thích kí hiáu sÿ dăng trong quá trình chÁ t¿o 21 BÁng 2 Thông sá chuẩn bá và liều chiÁu x¿ các dung dách 22 BÁng 3 Phần trm nguyên tÿ, phần trm khái l°āng cąa C, O và Ag 34 BÁng 4 Góc tiÁp xúc cąa các nhóm màng ë théi điểm bÃt đầu khÁo sát và sau 60s 36 BÁng 5 Hiáu suÃt kháng khuẩn cąa dung dách chiÁt màng PA trong 24 gié 41 BÁng 6 Vùng kháng khuẩn cąa 3 nhóm màng penicillin-streptomycin , PAC5-3 và PCL 42 BÁng 7 Thể hián mćc đå thu nhß vÁt th°¢ng ë nhóm gây nhißm khuẩn S.A ë ngày thć 28 ë 3 nhóm đÃp màng cotton, Betaplast Silver và PAC5-3 45

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AgNPs: Silver nanoparticles

PVP: Poly (N-vinyl pyrrolidone)

DMSO: Dimethyl sulfoxide

S aureus: Staphylococcus aureus

DMEM: Dulbecco`s Modified Eagle Media PBS: Phosphate-buffered saline

UV-Vis: Ultraviolet - Visible spectroscopy SEM: Scanning electron microscopy

EDS: Energy-dispersive X-ray spectroscopy

TÓM TẮT

Sÿ dăng ngußn chitosan trong n°çc để táng hāp oligomer chitosan (COS) bằng cách sÿ dăng quá trình oxy hóa hydrogen peroxide (H2O2) theo ph°¢ng pháp chiÁu x¿ vi sóng KÁt quÁ cho thÃy chitosan đáa ph°¢ng cąa Viát Nam và d¿n xuÃt COS cąa nó có hiáu suÃt tinh chÁ cao trong khi phân tÿ COS t¿o ra trãng l°āng thÃp KÁt quÁ khÁo sát khÁ nng kháng khuẩn dòng Staphylococcus aureus (S aureus) cho thÃy khÁ nng sÿ dăng nh° là måt ngußn vÁt liáu kháng khuẩn tự nhiên, giÁm nguy c¢ hình thành chąng kháng kháng sinh Bên c¿nh kÁt hāp silver nanoparticles (AgNPs), giúp tng khÁ nng bÁo vá vÁt th°¢ng khßi tác nhân nhißm khuẩn Đái t°āng nghiên cću chą yÁu là màng 3 lçp kÁt hāp giāa tính kỵ n°çc ë lçp ngoài và khÁ nng hÃp thă n°çc ë mặt trong nhé kÁt hāp cùng các polymer °a n°çc t¿o điều kián lý t°ëng trong thiÁt kÁ màng lành th°¢ng trá bßng KhÁo sát trên mô hình in

vivo cho thÃy, khÁ nng lành th°¢ng t°¢ng đ°¢ng vçi màng th°¢ng m¿i Betaplast

Silver và nhanh h¢n khi so sánh vçi màng Cotton Đßng théi, cho thÃy khÁ nng kinh tÁ trong sÿ dăng vÁt liáu đáa ph°¢ng để giÁm giá thành chÁ t¿o bng g¿c nh°ng v¿n có hiáu quÁ điều trá

Dựa vào quá trình chāa lành vÁt th°¢ng đ°āc mô tÁ phía trên, bng g¿c đ°āc thiÁt kÁ để hã trā quá trình lành th°¢ng, đßng théi, kÁt hāp các tác nhân kháng khuẩn để bÁo vá vÁt th°¢ng khßi quá trình nhißm trùng Từ đó, vÃn đề làm sao để kÁt hāp nhiều yÁu tá thiÁt yÁu cho quá trình bÁo vá tránh nhißm khuẩn và tng tác đå lành th°¢ng cąa bng g¿c đ°āc đặt ra Bng g¿c đa lçp vçi lçp ngoài chća tác nhân kháng khuẩn, đßng théi cháng thÃm n°çc t¿o måt lçp màng bÁo vá cho vÁt th°¢ng bßng, mặt trong ćng dăng nhāng nghiên cću đáng chú ý gần đây cho viác ngn chặn và chāa lành vÁt bßng bëi tác nhân kháng khuẩn nh° oligomer chitosan phą trên bề mặt trong bng g¿c

Staphylococcus aureus (S.aureus) là dòng khuẩn gram âm có mặt trên các bề mặt da Mặc dù vÁt th°¢ng viêm nhißm căc bå hay mãn tính đ°āc gây ra bëi nhiều lý do, thì vÁt th°¢ng nhißm trùng bëi chąng S.aureus đ°āc xem nh° là måt trong nhāng tr°éng hāp phá biÁn nhÃt.Viác nhißm trùng vÁt th°¢ng khiÁn vÁt th°¢ng chÁm lành, màng sinh hãc (biofilm) hình thành trong quá trình viêm nhißm khiÁn vÁt th°¢ng chÁm lành và trë nên ngày måt nặng h¢n[1] Viác điều trá các vÁt th°¢ng nhißm khuẩn S.aureus dần trë

nên phćc t¿p vì đåc lực sinh ra từ vi khuần và dòng kháng kháng sinh Sÿ dăng các ngußn tự nhiên có khÁ nng kháng khuẩn có thể giÁm thiểu nguy c¢ kháng kháng sinh cąa viác l¿m dăng kháng sinh trong điều trá vÁt th°¢ng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1.VÁn đề nghiên cāu

VÁt th°¢ng có thể đ°āc đánh nghĩa là sự gián đo¿n sÃp xÁp sinh lý cąa các tÁ bào da và rái lo¿n chćc nng cąa nó trong viác kÁt nái và bÁo vá các mô và c¢ quan bên d°çi Nó có thể là nguyên nhân chính do vô tình cÃt, rách, trầy x°çc, áp lực, nhiát đå quá cao, hóa chÃt và dòng đián, hoặc thć phát sau can thiáp ph¿u thuÁt hoặc bánh (ví dă: tiểu đ°éng, loét hoặc ung th° biểu mô) Các tán th°¢ng bao gßm các cÃp đå nh° Ánh h°ëng đÁn lçp biểu bì đÁn đå dày måt phần (Ánh h°ëng đÁn cÁ lçp biểu bì và các phần cąa lçp h¿ bì) và đå dày toàn bå (bao gßm cÁ mÿ d°çi da và x°¢ng) [2].

Chāa lành vÁt th°¢ng là måt quá trình sinh lý trong c¢ thể, trong đó c¢ thể sáng sÿa chāa các tán th°¢ng mô, khôi phăc tính toàn vẹn về mặt giÁi ph¿u và lÃy l¿i chćc nng cąa các bå phÁn bá th°¢ng Måt vÁt th°¢ng có thể đ°āc đóng l¿i hoặc để tự chāa lành theo c¢ chÁ tự nhiên trong c¢ thể, quá trình chāa lành xÁy ra thông qua måt lo¿t các sự kián chßng chéo và bá Ánh h°ëng bëi måt sá yÁu tá bên trong và bên ngoài [3]

Chitin là polysaccharid phá biÁn thć hai trong tự nhiên sau cellulose Quá trình deacetyl hóa måt phần chitin thúc đẩy quá trình thu đ°āc chitosan và sự khác biát giāa chúng là ë nhóm acetyl Chitin bao gßm chą yÁu đ¢n vá cąa N-acetyl-D-gluamine (GlcNAc), trong khi chitosan bao gßm chą yÁu D-gluamine (GlcN) Các đ¢n vá c¢ bÁn hình thành cÃu trúc chitin và chitosan liên kÁt vçi nhau bëi liên kêt ³-(1➔4) glycosidic[4] Chitosan là måt oligomer vçi liên kÁt ³-(1➔4)-linked D-glucosamine có thể đ°āc điều chÁ từ quá trình deacetyl hóa và thąy phân chitin, th°éng đ°āc tìm thÃy chą yÁu trong bå x°¢ng ngoài cąa đång vÁt giáp xác và côn trùng, ngoài vi khuẩn, giçi nÃm và nÃm

Nghiên cću gần đây chß ra rằng chitosan nh° là polymer sinh hãc có tính t°¢ng hāp sinh hãc cao, có khÁ nng phân hąy sinh hãc và không gây đåc tÁ bào Đánh giá tính chÃt cąa oligomer chitosan chą yÁu dựa vào khái l°āng phân tÿ và đå deacetyl hóa, liên qua đÁn tỷ lá giāa GlcNAc và GlcN Hầu hÁt các sÁn phẩm chitosan trên thá tr°éng có khái l°āng phân tÿ từ 50-2000 kDa, vçi đå deacetyl từ 80-90% Dựa vào khái l°āng phân tÿ, chitosan có thể đ°āc nhóm thành 3 nhóm chính: khái l°āng phân tÿ thÃp (<100 kDa), khái l°āng phân tÿ trung bình (100–1000 kDa), và khái l°āng phân tÿ cao (>1000 kDa) [4] Tuy nhiên, chitosan không tan trong n°çc giçi h¿n khÁ nng ćng dăng cąa nó Từ đó, nhiều nghiên cću tng khÁ nng hòa tan trong n°çc cąa chitosan bằng cách thay đái cÃu trúc hoặc t¿o ra các d¿n xuÃt cąa chitosan Chitosan oligomer (COM) còn đ°āc gãi là chitooligomer hoặc chitosan oligosaccharide, đ°āc đánh nghĩa là chitosan có mćc đå trùng hāp d°çi 20 và trãng l°āng phân tÿ trung bình d°çi 3900 Da (th°éng là 0,2–3,0 kDa).

C¢ chÁ kháng khuẩn cąa oligomer chitosan v¿n còn ch°a rõ Tuy nhiên, nhiều giÁ thuyÁt rằng bÁn chÃt kháng khuẩn t°¢ng tự chitosan, trong đó polycation d°çi pH 6,5 là måt yÁu tá quyÁt đánh Đián tích d°¢ng trong chuãi t°¢ng tác vçi các thành phần tích đián âm trong màng tÁ bào vi sinh vÁt, làm thay đái tính chÃt rào cÁn cąa chúng và do đó ngn cÁn sự xâm nhÁp cąa các chÃt dinh d°ÿng hoặc gây rò rß các chÃt bên trong tÁ bào Do các đián tích d°¢ng cąa nó, chitosan cũng có thể t°¢ng tác vçi phần âm cąa màng tÁ bào, điều này có thể d¿n đÁn sự tái tá chćc và më các protein liên kÁt chặt ch¿, giÁi thích đặc tính tng c°éng thẩm thÃu cąa nó [5] Hai c¢ chÁ chính đã đ°āc báo cáo trong tài liáu để giÁi thích các ho¿t đång kháng khuẩn và kháng nÃm cąa chitosan Trong

c¢ chÁ đầu tiên đ°āc đề xuÃt, chitosan tích đián d°¢ng có thể t°¢ng tác vçi các nhóm tích đián âm trên bề mặt tÁ bào và do đó làm thay đái tính thÃm cąa nó Điều này s¿ ngn cÁn các vÁt liáu thiÁt yÁu xâm nhÁp vào tÁ bào và d¿n đÁn rò rß các chÃt hòa tan c¢ bÁn ra khßi tÁ bào C¢ chÁ thć hai liên quan đÁn sự liên kÁt cąa chitosan vçi DNA cąa tÁ bào (v¿n thông qua các nhóm amin đ°āc proton hóa), điều này s¿ d¿n đÁn sự ćc chÁ quá trình táng hāp RNA cąa vi sinh vÁt Trên thực tÁ, đặc tính kháng khuẩn cąa chitosan có thể là kÁt quÁ cąa sự kÁt hāp cąa cÁ hai c¢ chÁ Thách thćc chính cąa nghiên cću này là đánh giá đ°āc đå an toàn và khÁ nng hã trā lành th°¢ng cąa COS Do thành phần chính chą yÁu đ°āc làm từ PCL, måt lo¿i polyester thiÁu các nhóm chćc nng ho¿t đång, màng PCL-Ag có bề mặt kỵ n°çc, không thể t°¢ng tác vçi các thành phần phą °a n°çc về mặt vÁt lý hoặc hóa hãc Để khÃc phăc vÃn đề này, poloxamer 407 (POX) đ°āc chãn làm 8chÃt keo9 để kÁt hāp màng PCL tích hāp AgNPs vçi lçp phą COS-PVP Là polyme triblock có khái kỵ n°çc trung tâm cąa polypropylen glycol và hai khái °a n°çc khái polyethylene glycol, POX có thể kÁt nái vçi cÁ PCL và COS-PVP cùng lúc và giā chúng nh° måt khái tháng nhÃt Sau đó, dung dách COS-PVP đ°āc phą lên lçp trung gian để thu đ°āc sÁn phẩm màng đa lçp Vçi lçp kỵ n°çc có thành phần AgNPs giúp bÁo vá vÁt th°¢ng khßi bá nhißm khuẩn và các các nhân nhißm khuẩn từ bên ngoài, đßng théi lçp trong cùng cho phép thÃm hút tát và sÿ dăng COS nh° måt hāp chÃt tự nhiên lành tính có khÁ nng hã trā lành th°¢ng nh°ng đßng théi cũng là tác nhân kháng khuẩn giúp bÁo vá vÁt th°¢ng khßi sự nhißm trùng trong quá trình lành th°¢ng Từ đó, giÁ thiÁt giúp vÁt th°¢ng lành nhanh và giÁm nguy c¢ viêm nhißm đ°āc đặt ra trong luÁn vn này

1.2.Tình hình nghiên cāu

Nhiều nghiên cću gần đây cho thÃy tính khÁ thi sÿ dăng màng chitosan để chāa lành các vÁt th°¢ng bßng Các vÁt th°¢ng có khÁ nng lành tự nhiên, nh°ng có nhāng ng°éi bá rái lo¿n d¿n đÁn giÁm khÁ nng tự chāa lành vÁt th°¢ng, chẳng h¿n nh° bánh nhân tiểu đ°éng có thể phát triển thành mãn tính, vÁt th°¢ng không lành khiÁn bánh nhân đau đçn và cháu đựng trong théi gian dài [5] Trong nhāng tr°éng hāp nh° vÁy, cần có théi gian điều trá dài, điều này cũng s¿ làm tng chi phí liên quan đÁn chm sóc y tÁ tiên tiÁn Do đó, trãng tâm là các chÃt trá liáu tự nhiên có thể đẩy nhanh quá trình chāa lành vÁt th°¢ng và đßng théi có thể dß dàng tiÁp cÁn vçi ng°éi dân giúp giÁm chi phí điều trá, và chitosan d°éng nh° đáp ćng tÃt cÁ các điều kián này Chitosan đẩy nhanh quá trình chāa lành vÁt th°¢ng bằng cách kích thích các tÁ bào viêm, đ¿i thực bào và nguyên bào sāi, do đó thúc đẩy giai đo¿n viêm Bằng cách này, giai đo¿n viêm dißn ra nhanh h¢n và giÁm nhanh, giai đo¿n tng sinh bÃt đầu sçm h¢n trong quá trình chāa lành vÁt th°¢ng5 Màng chitosan vçi oleic acid và glycerol 1% đã đ°āc chuẩn bá tr°çc đó Các màng chitosan này có hình thái

phù hāp và đ°āc sÿ dăng nghiên cću in vivo vçi chuåt Wistar® cho thÃy màng chitosan

đ°āc cÃy ghép t°¢ng thích sinh hãc và có khÁ nng hÃp thă sinh hãc giúp mô khße m¿nh Từ kÁt quÁ khÁo sát này, màng chitosan có thể cho phép sÿ dăng chúng để chāa lành vÁt th°¢ng [6]

Trong måt nghiên cću khác cho thÃy, kÁt hāp giāa màng polysulfone(PSF) và chitosan cho thÃy tng khÁ nng kháng khuẩn, trong đó màng PSF- chćng minh khÁ nng kháng khuẩn khoÁng 105 cells/ml trong vòng 18 gié, các c¢ chÁ có thể bao gßm phá vÿ thành tÁ bào vi khuẩn và màng tÁ bào, thÁi ra måt l°āng nhß cation kim lo¿i sÃt, t°¢ng tác vçi các măc tiêu nåi bào và lÃng đãng trên vi khuẩn[7]

C¢ chÁ có thể giÁi thích cho khÁ nng kháng khuẩn bao gßm viác phá vÿ thành tÁ bào vi khuẩn và màng sinh chÃt, các t°¢ng tác vçi các măc tiêu gÃn ngoài bề mặt màng và phá hąy tÁ bào vi khuẩn

Vi khuẩn th°éng đ°āc chia làm 2 nhóm chính: vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram d°¢ng dựa theo kÁt quÁ nhuåm gram Thành tÁ bào cąa vi khuẩn gram âm gßm lçp ngoài là màng tÁ bào và thành peptidoglycan Lçp ngo¿i bào gßm 2 đ¢n lçp không cân xćng Lçp bên trong chß bao gßm phospholipid, trong khi lçp ngoài bao gßm phospholipid và lipopolysaccharide Bề mặt cąa vi khuẩn gram âm đ°āc tích đián âm do các nhóm phosphate và pyrophosphates cąa lipopolysaccharides ë lçp ngoài Thành tÁ bào cąa vi khuẩn gram d°¢ng bao gßm peptidoglycan và teichoic acids (Hình 1) Bề mặt cąa vi khuẩn gram d°¢ng đ°āc tích đián âm do các nhóm carboxyl và phosphate cąa teichoic acids

Hknh 1 Cơ chế kháng khuẩn của COS dựa vào cơ chế kháng khuẩn của chitosan

Khi COS đ°āc hòa tan trong dung dách n°çc có tính acid, các nhóm NH2- đ°āc proton hóa thành cation -NH3C[8] GiÁ thiÁt phù hāp nhÃt cho khÁ nng kháng khuẩn là các nhóm polycationic (-NH3C) tự nhiên vì có sự có mặt cąa gác amine từ nhóm glutamine Tính chÃt quan trãng này giÁ thích cho khÁ nng bám vào nhāng thành phần mang đián tích âm trên bề mặt cąa vi khuẩn Viác bám dính này cho phép kích ho¿t nh°ng thay đái trên bề mặt tÁ bào d¿n đÁn sự rò rß tÁ bào chÃt d¿n đÁn sự chÁt tÁ bào[9], teichoic acid và lipopolysaccharide trong vi khuẩn gram âm cho phép chitosan bám vào và phá hąy bề mặt tÁ bào vi khuẩn, t¿o ra c¢ chÁ diát khuẩn

Perinelli và đßng nghiáp đặt giÁ thiÁt rằng chitosan bám vào DNA cąa vi khuẩn d¿n đÁn ćc chÁ quá trình phiên mã cąa mRNA cũng nh° là t°¢ng tác vçi bề mặt tÁ bào Je và Kim (2006) đề xuÃt måt giÁ thiÁt rằng c¢ chÁ kháng khuẩn cąa chitosan là bám lên màng tÁ bào và phá hąy từ đó thay đái chćc nng màng tÁ bào d¿n đÁn sự vÿ màng tÁ bào[10] Trong måt nghiên cću khÁo sát Ánh h°ëng cąa khái l°āng trung bình cąa chitosan (90-300 kDa) đái vçi khÁ nng diát khuẩn cąa nhóm khuẩn gram âm trên cá n°çc ngãt cho thÃy: ë nßng đå 0.8% (w/v) cąa chitosan là điều kián cần và đą cąa cho ćc chÁ sự phát triển cąa areomonas hydrophila, khÁo sát t°¢ng t°, cho thÃy 0.4% chitosan là điều kián cần để ćc chÁ sự phát triển cąa flavobacterium columnare và edwardsiella ictaluri GiÁ thuyÁt đặt ra rằng sự có mặt cąa các nhóm mang đián tích âm và bề mặt kỵ n°çc cąa vi khuẩn là nguyên nhân d¿n đÁn sự t°¢ng tác ćc chÁ vi khuẩn cąa chitosan [11] Måt nghiên cću khác cąa Chung và cång sự (2014) chß ra rằng nhóm khuẩn thể hián các nhóm mang

đián tích âm trên bề mặt s¿ liên kÁt tát h¢n vçi các polycationic cąa chitosan [12] Trong sá các mô hình màng lành th°¢ng khác nhau, màng chitosan đã đ°āc phát triển thành bng g¿c cho chÃn th°¢ng và/hoặc vÁt th°¢ng mãn tính do đặc tính cầm máu, ho¿t đång kháng khuẩn và phÁn ćng cháng viêm [13],[14].Khi vÁt th°¢ng xÁy ra, tiểu cầu s¿ đ°āc kích ho¿t và tÁp hāp l¿i t¿i vá trí vÁt th°¢ng để cầm máu nh° là c¢ chÁ để chāa lành vÁt th°¢ng, đ°āc gãi là giai đo¿n cầm máu ê điều kián vÁt th°¢ng điển hình (pH < 7), màng dựa trên chitosan có khÁ nng hÃp thă måt l°āng lçn dách tiÁt vÁt th°¢ng và từ màng sền sát và/hoặc hydrogel có đặc tính bám dính m¿nh vào mô bá tán th°¢ng để cầm máu[15] Trong måt nghiên cću lâm sàng, g¿c chitosan đã đ°āc sÿ dăng làm chÃt cầm máu trên 75 bánh nhân bá chÃn th°¢ng[16] KÁt quÁ cho thÃy théi gian lành vÁt th°¢ng trung bình t°¢ng đ°¢ng vçi théi gian bng vÁt th°¢ng th°¢ng m¿i, hã trā dā liáu mô hãc in vivo về khÁ nng cąa chitosan trong viác t¿o ra huyÁt khái ë bề mặt vÁt th°¢ng và thúc đẩy quá trình đông máu thông qua kích ho¿t tiểu cầu

Måt nh°āc điểm lçn làm h¿n chÁ viác ćng dăng rång rãi chitosan là nó không hòa tan trong dung dách n°çc Điều này là do các liên kÁt hydro ngoài phân tÿ t¿o thành cÃu trúc tinh thể Tuy nhiên, nó hòa tan trong dung dách axit ë đå pH không lçn h¢n 6 Axit acetic là axit đ°āc sÿ dăng phá biÁn nhÃt cho măc đích này Các biÁn đái hóa hãc cąa chitosan là lựa chãn thay thÁ để cÁi thián các đặc tính đ°āc ćng dăng trong lĩnh vực rång h¢n Các nhóm chćc nng quan trãng nhÃt có khÁ nng biÁn đái chitosan là nhóm amine (–NH2) chitosan oligosaccharide đ°āc xem nh° là måt giÁi pháp để giā nhóm amine nh°ng đßng théi có khÁ nng hòa tan trong n°çc

Bên c¿nh chitosan, các h¿t nano b¿c (AgNPs) đã cho thÃy hiáu quÁ trong ho¿t đång kháng khuẩn và viác cung cÃp các h¿t nano này ë d¿ng bào chÁ rÃn sÿ dăng sāi PEO/chitosan hòa tan trong n°çc giúp cÁi thián h¢n nāa khÁ nng kháng khuẩn Viác kÁt hāp các h¿t nano b¿c vào sāi quay đián th°éng là måt quá trình gßm hai b°çc vçi viác sÿ dăng các hóa chÃt đåc h¿i làm chÃt khÿ và để cÁi thián sự phân tán trong dung dách polymer Các nghiên cću đã chćng minh quy trình måt b°çc để sÁn xuÃt sāi Ag-PEO/chitosan từ chiÁu x¿ tia cực tím cąa dung dách quay đián b¿c nitrat (AgNO3)[17] Các h¿t nano Ag có kích th°çc trung bình 3.5 ± 0.6 nm đ°āc phân tích bằng kính hiển vi đián tÿ truyền qua đ°āc phân tán đßng nhÃt trong sāi PEO/chitosan (đ°éng kính ~ 250 nm đÁn 350 nm) cũng nh° trên bề mặt sāi Đå bền kéo trung bình cąa sāi Ag-PEO/chitosan dao đång từ 5.50 ± 0,19 MPa đÁn 7.54 ± 0.74 MPa, tùy thuåc vào nßng đå AgNO3 trong dung dách[18] Ngoài ra, sự giÁi phóng ion Ag trong áng nghiám cho thÃy tác đå giÁi phóng nhanh về nßng đå ion Ag lúc 10 gié, sau đó giÁi phóng chÁm và cuái cùng đ¿t đÁn tr¿ng thái án đánh ë 72 gié Ho¿t tính kháng khuẩn đ°āc thực hián

trên S.aureus gram d°¢ng và E coli gram âm bằng ph°¢ng pháp trÁi đĩa th¿ch KÁt quÁ

cho thÃy vùng ćc chÁ tng gÃp 1.9 lần và 3.4 lần từ sāi Ag-PEO/chitosan trên S aures

và E coli so vçi sāi PEO/chitosan Nhāng sāi này đ°āc đánh giá bằng các thÿ nghiám

về đåc tính tÁ bào bằng cách sÿ dăng tÁ bào nåi mô chÁu cąa lān và kÁt quÁ cho thÃy khÁ nng sáng sót cąa tÁ bào là trên 90% sau 24 gié nuôi cÃy Nghiên cću này không chß cung cÃp quy trình måt b°çc trong viác kÁt hāp các h¿t nano Ag vào sāi chitosan mà còn đề xuÃt nhiều lo¿i tác nhân hóa hãc và sinh hãc t°¢ng thích vçi sāi PEO/chitosan Từ các nghiên cću đã khÁo sát, cho thÃy viác kÁt hāp giāa 2 tác nhân kháng khuẩn COS và AgNPs cho phép đặt giÁ thuyÁt về viác sự kÁt hāp này làm tng khÁ nng kháng khuẩn, đặt biát các kÁt quÁ từ liáu tham khÁo cho thÃy tiềm nng trong viác hã trā lành th°¢ng

Do khÁ nng chÁ t¿o màng cąa chitosan kém, do không tan trong n°çc nên dung

dách polymer pha trån cąa chitosan và các copolymer khác th°éng đ°āc điều chÁ để sÁn xuÃt sāi chitosan gây mÃt théi gian và quá trình phćc t¿p Viác lựa chãn lo¿i chitosan đóng vai trò chính trong viác xác đánh các đặc tính cąa sāi do tỷ lá pha trån thể tích cąa polymer và do đó, có thể làm giÁm khÁ nng t°¢ng thích sinh hãc (đåc h¿i) và đå án đánh (phân hąy sinh hãc) cąa sāi Để khÃc phăc vÃn đề này, måt d¿n xuÃt °a n°çc cąa chitosan, oligomer chitosan (COS) đã đ°āc sÿ dăng để cÁi thián khÁ nng trån l¿n vçi copolyme (tćc là PVP), là måt polymer hòa tan trong n°çc có đặc tính t¿o màng Trong luÁn vn này, nghiên cću giÁi phóng in vitro từ sāi phą COS-PVP Các thÿ nghiám về khÁ nng sáng sót in vitro sÿ dăng tÁ bào L929 và đánh giá trên mô hình chuåt in vivo về tỷ lá đóng vÁt th°¢ng cho thÃy dián tích vÁt th°¢ng Công trình này đề xuÃt sự kÁt hāp cąa nano b¿c (AgNPs) và đái t°āng khÁo sát dựa trên dòng vi khuẩn S.aureus

Sÿ dăng ph°¢ng pháp phun kéo sāi đián tr°éng là måt ph°¢ng pháp đ¢n giÁn, linh ho¿t để sÁn xuÃt sāi có đ°éng kính từ vài micromet đÁn nanomet [19] Nguyên lý cąa ph°¢ng pháp phun kéo sāi đián tr°éng là sÿ dăng đián tr°éng m¿nh (ví dă: 1 ~ 4 kV/cm) để hút các sāi rÃn từ dung dách polymer Tr°çc khi chÁ t¿o, dung dách polymer đ°āc chuẩn bá vçi các đặc tính dung dách thích hāp (ví dă: đå nhçt, đå d¿n đián, sćc cng bề mặt và đå bay h¢i cąa dung môi) Trong quá trình chÁ t¿o, đián tr°éng ćng dăng cần phÁi v°āt qua sćc cng bề mặt cąa dung dách polymer (hình nón Taylor), n¢i t¿o ra các chuãi sāi mán và theo sau là sự bay h¢i dung môi tr°çc khi h¿ xuáng bå thu sāi SÁn phẩm thu đ°āc là måt tÃm thÁm sāi mán và dày đặc, ë d¿ng cÃu trúc sāi không dát hoặc đ°āc cn chßnh t°¢ng ćng bằng cách sÿ dăng bå thu sāi cá đánh Nhiều ng°éi đã xem xét Ánh h°ëng cąa các thông sá quay đián lên cÃu trúc sāi thu đ°āc vçi măc đích tái °u hóa các điều kián quay đián [20]-[21]

CHƯƠNG 2: ĐÞI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CĀU

Poly (¸-caprolactone) (PCL, Mn 80,000), poloxamer 407, và dimethyl sulfoxide (DMSO), poly (N-vinyl pyrrolidone) (PVP) đ°āc mua từ Sigma-Aldrich Co Ltd., Dorset Gillingham, UK Silver nitrate (AgNO3, ≥ 99%), acetone (AC, CH3COCH3, 99.5%), hydrogen peroxide (H2O2) 30% (v/v), và ethanol (C2H5OH) đ°āc mua bëi Xilong Chemical Co., Ltd (China) Low vicosity chitosan vçi khái l°āng phân tÿ khoÁng 270 kDa đ°āc mua từ Vietnam Food JSC, Vietnam Mueller Hinton Broth (M391-500G) đ°āc mua từ Hi-Media (India) The pathogen, such as Staphylococcus

aureus (S aureus, ATCC 25913) đ°āc cung cÃp bëi the Marine Laboratory, International University-HCM Vietnam National University (Vietnam) Mouse fibroblast L929 cell line đ°āc rã đông và nuôi cÃy trong dulbecco`s modified eagle media (DMEM, Gibco, USA) bá sung 10% fetal bovine serum (Gibco, USA) và 1% penicillin-streptomycin (Gibco, USA) TÃt cÁ các hóa chÃt đều đ¿t tiêu chuẩn phân tích và đ°āc sÿ dăng trực tiÁp mà không cần tinh chÁ thêm

Ph°¢ng pháp chuẩn bá đ°āc mô phßng và thay đái dựa theo ph°¢ng cąa Vinh và cång sự [22], [23] Båt chitosan đ°āc pha ë ba nßng đå (1%, 3%, 5% và 7%) vçi 6% H2O2 ë 30oC trong 10 phút Hãn hāp (HH) sau đó đ°āc đặt vào lò vi sóng ë mćc 400W trong vòng 3 phút, sau đó để h¿ nhiát ë nhiát đå phòng Ethanol 99% sau đó đ°āc thêm vào HH vçi tỷ lá 3:1 (ethanol: HH) Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R-300 lo¿i bß dung môi thừa thu đ°āc cặn tąa Phần cặn tąa thu đ°āc, đ°āc lo¿i bß n°çc bằng

máy đông khô (LABCONCO) thu đ°āc oligomer chitosan d¿ng båt

2.2.2.Độ đề acetyl của oligomer chitosan

Phá 1H-NMR cąa đ°āc đo bằng cách sÿ dăng 1H-NMR ë tr¿ng thái lßng (400 MHz, · tính bằng ppm, Bruker Avance-400 MHz FT-NMR (Bruker Corp, Billerica, MA, USA) Các m¿u chitosan đã đ°āc hòa tan trong DMSO/DCl2 và đ°āc lãc tr°çc khi đo NMR Sau đó, đå deacetyl hóa cąa đ°āc tính toán dựa trên ph°¢ng trình sau:

�㔷�㔷(%) = (1 213 �㔴2

16 �㔴1

) �㕋100

trong đó A1 là giá trá tích phân proton cąa các vá trí C2–C6 trên vòng đ°éng, là dián tích trung bình đo đ°āc trong khoÁng · 3–6 ppm, và A2 là giá trá tích phân proton cąa ba proton N-acetyl cąa N-acetyl glutamide ë khoÁng · 2 ppm

Khái l°āng phân tÿ cąa oligomer chitosan và chitosan đ°āc đo bằng Gel Permeation Chromatography (GPC) (Shimadzu/LC-10ADvp, Kyoto, Japan) vçi refractive index detector RID-10A Há tháng sÿ dăng n°çc làm pha đång TÃt cÁ các m¿u đều hòa tan ë 1,5 mg/mL trong 0,3 M acetic acid và 0,2 M sodium acetate, m¿u sau đó đ°āc lãc tr°çc khi đo GPC vçi tác đå dòng 0,8 mL/ phút ë 40oC vçi thể tích m¿u là 20 µL Chuẩn EasiVial PEO/PEG vçi khái l°āng phân tÿ từ 1,42 đÁn 1220 kDa đã đ°āc sÿ dăng để hiáu chuẩn OHpak SB-804 HQ columns (dimension 8 mm × 300 mm)

2.1.2 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của Oligomer Chitosan

Trong thí nghiám khÁo sát tính kháng khuẩn, ph°¢ng pháp khuÁch tán th¿ch đ°āc áp dăng để xác đánh khÁ nng kháng khuẩn lên dòng vi khuẩn có khÁ nng gây nhißm

B°çc 1: Chuẩn bá:

- Chuẩn bá m¿u: M¿u đái chćng (kháng sinh penicillin-streptomycin ) và m¿u cần kiểm tra (1%, 3% và 5%, 7%)

- Chuẩn bá vi khuẩn :

Dòng vi khuẩn trā đông gßm S aureus đ°āc đ°a vào tą ą 37 °C khoÁng 2 phút, sau đó

lÁp tćc cho vào 20 ml dung dách Mueller Hinton và ą ë 37 °C trong vòng 24 gié Sau đó, dung dách này đ°āc cÃy lên đĩa th¿ch Mueller Hinton và ą 37 °C trong vòng 24 gié để cho vi khuẩn mãc thành từng căm khuẩn l¿c và đ°āc trā trong tą mát 4 °C tái đa 1 tháng TiÁp theo, lÃy 1 căm khuẩn l¿c trên đĩa th¿ch cho vào áng nghiám có chća 20 ml môi tr°éng Miller Hinton ą 37 °C Sau 24 gié, dung dách có vi khuẩn phát triển s¿ đ°āc pha loãng xuáng nßng đå t°¢ng đ°¢ng 108 CFU/ml (Theo tiêu chuẩn Mc Farland, đå đăc cąa dung dách vi khuẩn ë b°çc sóng 625 nm trong khoÁng 0,08-0,1 ćng vçi nßng đå 108 CFU/ml)

B°çc 2: Thực nghiám:

- TrÁi dung dách vi khuẩn lên bề mặt đĩa th¿ch: 150 µl dung dách vi khuẩn (108

CFU/ml) trÁi lên đĩa th¿ch Mueller Hinton Để khô các mặt cąa đĩa th¿ch tr°çc khi đặt m¿u giÃy lãc thÃm ë các nßng đå (1%, 3%, 5%, và 7%)

- Đặt các m¿u đ°āc chuẩn bá sẵn lên đĩa th¿ch (3 m¿u đ°āc đặt lên 1 đĩa th¿ch) và ą 37 °C trong vòng 24 gié

B°çc 3: Thu và phân tích dā liáu:

- Sau 24 gié, các đĩa th¿ch đ°āc lÃy ra khßi tą ą và tiÁn hành đo kích th°çc vòng kháng khuẩn (dùng th°çc đo từ mặt sau cąa đĩa và không đ°āc më nÃp) cąa các chąng

vi khuẩn

- Chăp l¿i các hình bằng máy Canon EOS75

- Ành vòng kháng khuẩn s¿ đ°āc xÿ lý bằng phần mềm ImageJ để phân tích và tính toán kích th°çc vòng kháng khuẩn

B°çc 4: Lặp l¿i thí nghiám và tháng kê dā liáu, các thí nghiám đ°āc lặp l¿i 3 lần

2.2.1 Quy trình chế tạo màng

Hknh 2 Mô tÁ quy trknh chế t¿o màng ba lớp PAC

BÁng 1 Mô tÁ thành phần và giÁi thích kí hiệu sử dụng trong quá trknh chế t¿o

Màng PCL chća PCL-Ag-´ 0,02%

Lçp màng chß có

Màng 2 lçp vçi lçp trên là PA, lçp d°çi là PCL-POX

Màng 3 lçp vçi 2 lçp màng PA-PAP, sau đó đ°āc phą lçp PVP-COS bề mặt

Màng 3 lçp PAC phą COS khÁo

Màng 3 lçp PAC phą COS khÁo

Màng 3 lçp PAC phą COS khÁo

Màng PA và PP đ°āc chÁ t¿o bằng ph°¢ng pháp phun kéo sāi đián tr°éng, các b°çc chuẩn bá nh° sau đ°āc mô tÁ ë Hình 3: 45 mL dung dách AgNPs-PCL đ°āc phun đßng théi bằng ba áng tiêm nằm ngang ë đián áp 15 kV và tác đå dòng 2,5 mL/h vào xi lanh quay ë khoÁng cách 10 cm Các thông sá quay đián tái °u đã đ°āc xác đánh tr°çc để đáp ćng tiêu chí sāi đßng nhÃt, không h¿t và hiáu suÃt thu gom cao nhÃt Sau đó, 45 mL dung dách PCL-POX tiÁp tăc đ°āc sÿ dăng cho lçp màng thć 2 ë cùng điều kián chÁ t¿o

2.2.2 Chuẩn bị màng PCL-Ag (PA)

Chuẩn bá dung dách Ag 10% (w/v): đ°āc pha từ muái b¿c nitrate trong dung môi dimethyl sulfoxide (DMSO) theo các b°çc nh° sau:

+ B°çc 1: Hòa tan 1g muái AgNO3 hoàn toàn trong 10 ml dung dách DMSO

+ B°çc 2: KhuÃy từ hãn hāp ë nhiát đå 40 °C trong 2 tiÁng để thu đ°āc dung dách đßng nhÃt trong suát

+ B°çc 3: Dung dách đ°āc đÁy chặt và bãc kín bằng giÃy thiÁc để tránh sự bay h¢i cąa dung môi cũng nh° tác đång cąa ánh sáng

Chuẩn bá dung dách PCL-Ag-gamma (γ) 0,02% (w/v):

B°çc 1: 2 L dung dách 12% PCL đ°āc chuẩn bá bằng cách hòa tan hoàn toàn 240 g PCL trong 2 L dung môi acetone (AC) và khuÃy từ ë nhiát đå 50 °C đÁn khi tan hoàn toàn Dung dách 12% PCL-AC s¿ đ°āc chia ra 2 phần bằng nhau về thể tích (1000 ml) B°çc 2: Các thể tích dung dách Ag 10% (w/w) s¿ đ°āc thêm vào từng phần dung dách 12%PCL-AC để thu đ°āc nßng đå t°¢ng ćng (BÁng 2)

BÁng 2 Thông số chuẩn bị và liều chiếu x¿ các dung dịch

Thể tích dung dách Ag 10%

(ml)

Thể tích dung dách 12%PCL-AC

(ml)

Liều chiÁu x¿ (kGy) PCL-Ag-γ 0,02%

+ B°çc 3: Dung dách PCL-Ag-γ 0,02% (w/w) (PA) đ°āc bÁo quÁn trong các lã thąy tinh đÁy chặt và bãc trong màng nhôm để tránh sự bay h¢i cąa dung môi cũng nh° tránh bá ánh sáng khÿ các ion b¿c

Dung dách PCL-POX (PP) thu đ°āc bằng cách hòa tan båt polixamer 407 (POX)

trong dung dách PCL 12% (w/v) (ë tỷ lá POX: PCL là 1:12 (w/w)) TiÁp theo, 15 mL PCL-POX đ°āc quay đián t¿o lçp 2 trên màng PCL-Ag 0,02% (w/w) vçi các thông sá t°¢ng tự

2.2.4 Pha chế dung dịch COS-PVP

Dung dách đ°āc chuẩn bá theo ph°¢ng pháp đã đ°āc mô tÁ Đầu tiên, båt COS 5% đ°āc ngâm hoàn toàn n°çc cÃt Dung dách chća 6% (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP) thu đ°āc bằng cách hòa tan 36 g PVP trong 600 ml trong dung dách COS ë nhiát đå phòng trong 30 phút PVP đ°āc thêm vào dung dách đ°āc để tng tính thÃm cąa trên bề mặt màng

Đầu tiên, màng PAP đ°āc chuẩn bá ë d¿ng miÁng vuông có kích th°çc 10 x 10 cm2 Sau đó, dung dách COS-PVP đ°āc trÁi đều trên khay đựng dung dách kích th°çc 1,2 x 1,2 m2 Cùng lúc 12 màng PAP đ°āc nhúng vào và khÁo sát ë các khoÁng théi gian khác nhau (6 tiÁng, 12 tiÁng, 18 tiÁng và 24 tiÁng) Sau đó, màng đ°āc đặt vào tą sÃy ë 50 °C cho đÁn khi màng khô hoàn toàn tr°çc khi thêm måt lçp dung dách phą khác Quá trình nhúng màng vào đ°āc lặp l¿i liên tăc cho đÁn khi dung dách phą đều bề mặt Sá l°āng nhúng s¿ đ°āc khÁo sát bằng ph°¢ng pháp chăp kính hiển vi đián tÿ quét (SEM) Cuái cùng, màng đ°āc khÿ trùng bằng ethylene oxide (EO) và đ°āc bÁo quÁn trong túi kín tái màu ë nhiát đå phòng cho các thí nghiám sau này

2.3.1 Khảo sát và đánh giá hình thái bề mặt sản phẩm màng bằng thiết bị SEM

Các màng PA, PAP và PAG (1 x 1 cm2) đ°āc phą vàng (JEOL Smart Coater, NhÁt BÁn) trong 60 giây tr°çc khi quan sát hình thái bề mặt Sau đó, máy SEM (JSM-IT100, JEOL, Japan) vçi đián áp gia tác 10 kV đ°āc sÿ dăng để đánh giá bề mặt cąa màng Đ°éng kính sāi và kích th°çc lã cąa màng đ°āc phân tích bằng phần mềm ImageJ (NIH, Hoa Kỳ) TEM đ°āc áp dăng để chăp Ánh AgNPs đ°āc tích hāp vçi sāi PCL và đ°éng kính cąa AgNPs đ°āc tính bằng ImageJ

2.3.2 Đánh giá tính chất hóa học của màng PAC

CÃu trúc hóa hãc cąa màng đ°āc thể hián qua phá hßng ngo¿i biÁn đái Fourier IR, Spectrum GX, PerkinElmer Inc., Hoa Kỳ) sá sóng 4000 – 400 cm-1

(FT-Các màng đ°āc kiểm tra sự hián dián cąa pha tinh thể Ag trên màng bằng ph°¢ng pháp nhißu x¿ tia X (XRD, D8 Advance, Brucker) ë bćc x¿ Cu K³, b°çc nhÁy 0,02 đå, théi gian 0,5 giây t¿i Trung tâm Nghiên cću VÁt liáu CÃu trúc Nano và Phân tÿ

Biểu đß phân bá kích th°çc đ°āc v¿ từ dā liáu lÃy đ°āc để đánh giá tính đßng nhÃt cąa AgNPs táng hāp EDS đ°āc sÿ dăng để đo tỷ lá nguyên tá Ag trên bề mặt màng Ph°¢ng pháp đo phá hÃp thă phân tÿ UV-Vis đ°āc áp dăng để đánh giá s¢ bå sự t¿o thành cąa nano Ag cũng nh° sự đßng đều về ph°¢ng dián kích th°çc cąa chúng

2.3.3 Khảo sát và đánh giá tính kỵ và ưa nước của màng PAC

KhoÁng 10 µL n°çc cÃt đ°āc nhß lên bề mặt màng PA, PAP và PAC5-3 bằng micropipette Sự thay đái hình d¿ng giãt n°çc trong théi gian thÿ nghiám đ°āc ghi l¿i bëi bå góc tiÁp xúc bao gßm máy Ánh DSLR (Canon) và há tháng bá đÿ Góc tiÁp xúc cąa hình Ánh đ°āc ghi l¿i đ°āc phân tích bằng phần mềm ImageJ (NIH, Hoa Kỳ)

2.3.4 Khảo sát và đánh giá tính chất cơ lý của màng PAC

M¿u màng PA và PAP và PAC5-3 đ°āc cÃt thành các hình chā nhÁt vçi kích th°çc 3 cm x 1 cm Sÿ dăng SEM đo đå dày cąa các màng Các m¿u sau đó đ°āc mang đi đo đå bền kéo đćt, đå biÁn d¿ng đćt và lÁp giÁn đß ćng suÃt kéo giãn (TA.XTplus, Stable Micro System, UK) Thí nghiám đ°āc lặp l¿i 5 lần cho mãi m¿u

2.3.5 Khảo sát và đánh giá khả năng hấp thụ nước và thoát hơi nước (MVTR) của màng PAC

Thÿ nghiám đ°āc thực hián thą công dựa trên tiêu chuẩn thÿ nghiám BS EN 13726– 1:2002[24]

KhÁ nng hÃp thă n°çc cąa màng đ°āc tiÁn hành theo chuẩn BS EN 13726-1:2002 + B°çc 1: Chuẩn bá dung dách thÿ: Dung dách thÿ chća 142 mmol ion Na và 2,5 mmol ion Ca d°çi d¿ng muái clorua Dung dách này có thành phần ion giáng vçi dách c¢ thể ng°éi hoặc dách từ vÁt th°¢ng Că thể, hòa tan 8,298 g muái NaCl và 0,368 g muái CaCl2.2H2O vào 1 lít n°çc

+ B°çc 2: Đặt các màng PA, PAP và PAC5-3 kích th°çc 5 cm x 5 cm trong đĩa Petri + B°çc 3: Cho måt l°āng n°çc Ãm 37o C t°¢ng ćng 40 lần khái l°āng m¿u vào đĩa Petri + B°çc 4: Đặt đĩa petri vào tą ą Ãm ë 37 oC và giā trong 30 phút

+ B°çc 5: Dùng nhíp kẹp chặt 1 góc màng và lÃc m¿nh ngÁp trong dung dách trong 30 giây rßi cân khái l°āng cąa màng

+ B°çc 6: KÁt quÁ tính toán dựa vào khái l°āng n°çc hÃp thă trên 100 cm2 hoặc khái l°āng cąa màng Lặp l¿i thí nghiám vçi sá l°āng màng táng cång là 10 lần cho 1 m¿u KhÁ nng hÃp thă n°çc cąa các m¿u đ°āc tính theo ph°¢ng trình sau:

+ B°çc 2: Cân khái l°āng há đo gßm bình chća, màng và n°çc (W1, g) + B°çc 3: Đặt há đo vào tą Ãm 37 oC

+ B°çc 4: Sau 18 đÁn 24 gié (T), cân l¿i khái l°āng cąa há đo (W2, g) + B°çc 5: Tác đå thoát h¢i n°çc qua màng đ°āc tính theo công thćc sau:

MVTR= (W1 - W2) x 1000 x 24/T (g/m2/24 gié)

+ B°çc 6: Lặp l¿i thí nghiám vçi sá l°āng màng táng cång là 5 lần cho 1 m¿u.

2.1.1 Khảo sát và đánh giá tốc độ phóng thích nano Ag của màng theo thời gian

Các m¿u hình vuông 1x1 cm2 cąa màng PA, PAP và PAC5-3 đ°āc chuẩn bá và đặt lên bề mặt dung dách PBS (20 mL, pH = 5,5), vçi lçp nền PA h°çng lên trên Sau đó, các lã chća m¿u đ°āc ą ë 37 °C Các phần dách chiÁt đ°āc lÃy sau 1, 3, 6, 12 và 24 gié trong khi måt l°āng dung dách đám mçi t°¢ng đ°¢ng đ°āc thêm vào há tháng để duy trì thể tích không đái Nßng đå b¿c trong các m¿u chÃt lßng đ°āc phân tích bằng ICP-MS, NexION 2000, Perkin Elmer, USA

2.1.2 Khảo sát và đánh giá tốc độ phóng thích của COS

Thí nghiám nßng đå phóng thích đ°āc tiÁn hành bằng cách ngâm màng PAC5-3 (6 × 6 cm2) trong 20 mL dung dách muái đám photphat (PBS) 0,1 M pH = 5,5 ą ë 37 °C T¿i các théi điểm nhÃt đánh, môi tr°éng đ°āc rút ra và đo đå hÃp thă huỳnh quang ë b°çc sóng kích thích 420 nm và b°çc sóng phát x¿ 460 nm bằng cách sÿ dăng đầu đãc vi bÁn (Varioskan™, ThermoScientific, USA) vçi PBS làm m¿u đái chiÁu Nßng đå phóng thích cąa COS đã đ°āc tính toán và thể hián bằng đß thá

2.1.3 Khảo sát và đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng PAC

Ph°¢ng pháp AATCC 100 (Antimicrobial Fabric Test) [25]: là ph°¢ng pháp xét nghiám kháng khuẩn đánh l°āng đ°āc sÿ dăng để phát hián ho¿t tính ćc chÁ vi khuẩn trên vÁt liáu màng

Các b°çc thực nghiám nh° sau: - B°çc 1: Chuẩn bá

Chuẩn bá m¿u: M¿u đái chćng (màng PCL) và m¿u cần kiểm tra (màng PA) đ°āc cÃt thành các hình tròn có đ°éng kính 4,8 cm

Chuẩn bá vi khuẩn:

Dòng vi khuẩn trā đông gßm S aureus đ°āc đ°a vào tą ą 37 °C khoÁng 2 phút, sau

đó cho vào 20 mL dung dách Mueller Hinton, ą ë 37 °C trong vòng 24 gié, sau đó 150 µL huyền phù vi khuẩn cÃy lên đĩa th¿ch và ą 37 °C trong vòng 24 gié để cho vi khuẩn mãc thành từng căm khuẩn l¿c, que cÃy lÃy 1 khuẩn l¿c trên đĩa th¿ch cho vào 20 mL môi tr°éng lßng, ą 37 °C Sau 24 gié, dung dách có vi khuẩn phát triển s¿ đ°āc pha loãng xuáng nßng đå t°¢ng đ°¢ng 108 CFU/ml

- B°çc 2: Thực nghiám

Vi khuẩn đ°āc pha loãng xuáng mÁt đå 105 CFU/ml và đem ą trong tą 37 °C trong 2 gié tr°çc khi thí nghiám, 1 mL dung dách vi khuẩn đ°āc thêm vào 2 bình tam giác có chća m¿u PA và 1 bình tam giác có chća m¿u đái chćng PCL Sau đó đ°āc chuyển sang môi tr°éng nuôi cÃy vi khuẩn vô trùng, ą trong máy lÃc ë nhiát đå phòng trong 24 gié Sau khi ą, lÃy 100 µL dung dách m¿u trÁi trên agar, ą 37 oC trong vòng 24 gié, đÁm sá l°āng khuẩn l¿c trong đĩa nuôi cÃy từ dách chiÁt chća m¿u đái chćng PCL (A) và m¿u PA (B)

- B°çc 3: Thu và phân tích dā liáu

R% =A − B A ý 100 Trong đó:

R%: Hiáu suÃt kháng khuẩn cąa màng

A: Sá khuẩn l¿c trong đĩa nuôi cÃy từ dách chiÁt từ m¿u control (PCL) B: Sá khuẩn l¿c trong đĩa nuôi cÃy từ dách chiÁt từ m¿u PA

Các thí nghiám lÁp l¿i 3 lần, dā liáu đ°āc đ°āc trình bày d¿ng hình Ánh và hiáu suÃt kháng khuẩn

KhÁ nng kháng khuẩn cąa PAC5 đ°āc chÁ t¿o đã đ°āc đánh giá bằng cách sÿ dăng thÿ nghiám ćc chÁ vùng vÁi kháng khuẩn (AATCC 147) kiểm tra trên chąng S aureus

[26]

Tr°çc các thí nghiám, căm khuẩn cąa từng chąng đ°āc lÃy từ đĩa th¿ch gác, đặt vào áng 5 mL MHB và nuôi cÃy ë 37 °C trong 24 gié Sau đó, huyền phù vi khuẩn cąa từng chąng đ°āc chuẩn bá bằng kỹ thuÁt pha loãng đ¿t mÁt đå quang ë b°çc sóng 620 nm OD620 = 0,08-0,1 (bằng 0,5 chuẩn McFarland, xÃp xß 1-2x108 CFU/mL)

Đå nh¿y cąa vi sinh vÁt cąa từng m¿u đái vçi chąng vi khuẩn că thể đã đ°āc nghiên cću tách biát trên đĩa petri Mueller-Hinton agar (MHA) Tóm l¿i, 150 µL huyền phù vi khuẩn đã pha loãng đ°āc đ°a vào và trÁi đều trên bề mặt MHA Sau đó, các màng hình vuông 1x1 cm2 cąa mãi m¿u đ°āc đặt trên đĩa MHA và ą trong 24 gié Vùng ćc chÁ vi khuẩn xung quanh các m¿u đ°āc đo

2.1.4 Khảo sát và đánh giá độc tính tế bào của màng

Đåc tính gây đåc tÁ bào cąa dách chiÁt từ màng PA, PAP và PAC đ°āc đánh giá trên các tÁ bào L929 bằng xét nghiám Resazurin tuân thą các h°çng d¿n cąa ISO 10993[27] Đầu tiên, các tÁ bào đ°āc nuôi vçi mÁt đå 1x105 tÁ bào/mL và nuôi cÃy trong 24 gié TiÁp theo, các dách chiÁt đ°āc chuẩn bá bằng cách ngâm các m¿u có kích th°çc 6 cm2

trên 1 mL môi tr°éng và ą trong 24 gié ë 37 °C ChiÁt xuÃt 100% và đå pha loãng 50% cąa nó đ°āc thêm vào các giÁng nhân tÁ bào và nuôi cÃy trong 24 gié Sau đó, các dung dách chiÁt đ°āc lo¿i bß và môi tr°éng nuôi cÃy có Resazurin (0,02 mg/mL) đ°āc thêm vào từng giÁng và ą thêm 4 gié Sự phát huỳnh quang cąa các dung dách đ°āc kích thích ë b°çc sóng 530 nm và tín hiáu phát ra đ°āc đo ë b°çc sóng 590 nm bằng đầu đãc vi bÁn (VarioskanTM, Thermo Scientific, USA) Tín hiáu cąa các tÁ bào ch°a đ°āc xÿ lý đ°āc nuôi cÃy trong môi tr°éng nuôi cÃy 100% đ°āc coi là khÁ nng sáng 100%

2.2.1 Theo dõi và đánh giá tác dụng điều trị của màng PAC quy mô phòng thí nghiệm

Mô hình bßng trên thß đ°āc thực hián dựa theo các tài liáu tham khÁo sau [28] - Dung dách vi khuẩn đ°āc chuẩn bá bằng cách cÃy vi khuẩn vào dung dách Mueller Hinton và nuôi trong tą ą ë 37 oC MÁt đå vi khuẩn trong dung dách đ°āc xác đánh bằng ph°¢ng pháp đo mÁt đå quang hãc (OD) ë b°çc sóng 620 nm Sau đó dung dách s¿ đ°āc pha loãng nhiều lần, mÁt đå vi khuẩn trong dung dách đ¿t khoÁng 108 CFU/mL Dòng vi khuẩn đ°āc sÿ dăng để đánh giá là Staphylococcus aureus (khuẩn tă cầu vàng)

- Quy trình t¿o bßng đ°āc tiÁn hành nh° đã mô tÁ Sau khi hoàn thành công viác t¿o bßng, 100 μL dung dách vi khuẩn s¿ đ°āc cho vào vÁt th°¢ng Sau đó các vÁt th°¢ng s¿ đ°āc bng l¿i bằng g¿c th°éng Thß s¿ đ°āc quan sát các dÃu hiáu bên ngoài:

Dißn biÁn toàn thân: Tình tr¿ng n uáng, phân và n°çc tiểu, trãng l°āng và tình tr¿ng nhißm đåc, nhißm khuẩn, sát

Dißn biÁn t¿i chã: Hình Ánh, kích th°çc và nhāng thay đái cąa vÁt th°¢ng đ°āc chăp bằng máy Ánh mãi 0, 7, 15, 21, 30 ngày cho đÁn khi lÃy m¿u

Tình tr¿ng dách xuÃt tiÁt, dách mą vÁt th°¢ng - Theo dõi thß trong 28 ngày

2.2.2 Đánh giá khả năng h̀ trợ lành thương màng PAC

- Sau 28 ngày, m¿u da t¿i vùng vÁt th°¢ng đ°āc thu ho¿ch để tiÁn hành đánh giá khÁ nng bÁo vá cháng nhißm khuẩn và chāa lành vÁt th°¢ng

- Mô sau khi thu ho¿ch đ°āc bÁo quÁn trong dung dách formaldehyde 10% Sau đó mô đ°āc đúc khái parafin và đ°āc cÃt thành từng lát mßng để nhuåm bằng H&E (Hematoxylin và Eosin), và MT (Masson Trichrome) Ph°¢ng pháp nhuåm giúp đánh giá mćc đå tái t¿o mô mçi, quá trình hình thành collagen, sự nhißm trùng (nÁu có)

Dā liáu đ°āc biểu thá d°çi d¿ng trung bình ± đå lách chuẩn (SD) Phân tích tháng kê dā liáu thu đ°āc đ°āc thực hián bằng phân tích ANOVA Khi p <0,05, kÁt quÁ đ°āc coi là có ý nghĩa tháng kê TÃt cÁ các thÿ nghiám đ°āc lặp l¿i ba lần

CHƯƠNG 3: KẾT QU¾ VÀ TH¾O LUẬN

3.1.1.Độ đề acetyl (DA) của oligomer chitosan

Để đánh giá chính xác tính chÃt cąa oligomer chitosan, đå đề acetyl là måt trong nhāng tính chÃt đầu tiên cần đánh giá Mćc đå đề acetyl Ánh h°ëng đÁn các tính chÃt vÁt lý, sinh hãc và hóa hãc cąa COS táng hāp đ°āc Mćc đå đề acetyl xác đánh các nhóm amino tự do tiÁp xúc do lo¿i bß các nhóm acetyl khßi chuãi phân tÿ chitin [29]

Phá 1H-NMR cąa các m¿u đ°āc thể hián trong Hình 3 và các giá trá DA tính toán đ°āc liát kê trong công thćc bên d°çi Tín hiáu cąa proton H-1³ cąa các đ¢n vá GlcNAc không rõ ràng do các đān vá này có DA thÃp, Sự xuÃt hián tín hiáu cąa proton H-1³ cąa các đ¢n vá GlcNAc (Ac) ë khoÁng 5,13 ppm Tuy nhiên, måt sá khác biát đã đ°āc quan sát thÃy Tín hiáu cąa proton H-1³ cąa đ¢n vá GlcN(D), proton H-1 cąa các gác bên trong và proton H-2 cąa đ¢n vá GlcN (D) đã đ°āc chuyển sang tr°éng cao

Do đó, kÁt luÁn rằng sự dách chuyển tr°éng cao cąa các tín hiáu này trong phá có liên quan đÁn sự gia tng DA có thể do sự tách H khßi các nhóm amino cąa đ¢n vá GlcN, d¿n đÁn sự khÿ amine

Hknh 3 Kết quÁ H-NMR của COS

Công thćc tính đå deacetyl hóa cąa COS:

�㔷�㔷(%) = (1 213 �㔴2

16 �㔴1

) �㕋100 = 89%

trong đó A1 là giá trá tích phân proton cąa các vá trí C2–C6 trên vòng đ°éng, là dián tích trung bình đo đ°āc trong khoÁng · 3–6 ppm, và A2 là giá trá tích phân proton cąa ba proton N-acetyl cąa N-acetyl gluamine ë khoÁng · 2 ppm

Mćc đå đề acetyl 70–85% là mćc đå đề acetyl trung bình cąa chitosan, có thể hòa tan måt phần trong n°çc Cuái cùng, 85–95% là mćc đå đề acetyl cao cąa chitosan, có khÁ nng hòa tan tát trong n°çc, và 95–100% đ°āc gãi là mćc đå đề acetyl cực cao cąa chitosan, rÃt khó đ¿t đ°āc [30] Dựa trên kÁt quÁ thu đ°āc, nghiên cću chÁ t¿o thành công COS vçi đå đề acetyl (DA) đ¿t 89%, COS có khÁ nng hòa tan tát trong n°çc

Khái l°āng phân tÿ COS đ°āc xác đánh dựa vào đ°éng chuẩn PEO/PEG (Hình 4); đ°éng chuẩn PEO/PEG đ°āc dựng dựa trên 3 m¿u chuẩn (xanh, vàng, đß), đ°éng chuẩn đ°āc dựng dựa trên 12 điểm xây dựng dựa trên 3 m¿u chuẩn có d¿ng:

þ = 2887,48 + 6,77 × 0,19�㕥

Trong đó: y là khái l°āng phân tÿ (Da) đ°āc tính toán dựa và théi gian l°u x (phút) Từ công thćc ta tính đ°āc khái l°āng phân tÿ cąa COS Fernandes và đßng nghiáp báo cáo rằng vçi khái l°āng phân tÿ <5 kDa cho thÃy kÁt quÁ kháng khuẩn tát h¢n so vçi có khái l°āng phân tÿ lçn [18] KÁt quÁ cąa Fernandes cho kÁt quÁ t°¢ng đßng vçi Kulikov và đßng nghiáp, kÁt quÁ này cho thÃy vçi khái l°āng phân tÿ 2,89 kDa, nằm trong khoÁng khái l°āng phân tÿ cho kÁt quÁ kháng khuẩn tát

Hknh 5 Kết quÁ khÁo sát nồng độ kháng khuẩn của COS bằng phương pháp đĩa th¿ch (A) và đường kính trung bknh của vòng kháng khuẩn (B) với 1-PCL, 2-COS 1%, 3-COS 3%, 4-COS 5%, 5-COS 7%, 6-Penicillin Streptomicycin

Từ kÁt quÁ khÁo sát ë Hình 5, ph°¢ng pháp khuyÁch tán đĩa th¿ch, có thể thÃy nßng đå COS ë nßng đå 1% và 3% không đą khÁ nng t¿o vòng kháng Đßng théi, ë nßng đå 7%, khÁ nng kháng cąa COS không cho thÃy sự khác biát giāa khi so sánh đ°éng kính kháng khuẩn vçi m¿u COS ë nßng đå 5% Từ kÁt quÁ khÁo sát này, nßng đå COS 5% đ°āc chãn làm dung dách nhúng cho quá trình phą màng tiÁp theo

3.2.1 Hình thái của màng

Màng PCL đ°āc sÿ dăng nh° màng đái chćng để khÁo sát bề mặt và đ°éng kính sāi so vçi màng PCL-Ag 0,02% (PA), màng PCL-Ag-POX (POX) và 3 màng đ°āc phą COS ë 3 mác théi gian 12 gié, 18 gié và 24 gié ćng vçi PCL-Ag-COS 5-1 (PAC5-1), PCL-Ag-COS 5-2 (PAC5-2) và PCL-Ag-COS 5-3 (PAC5-3);

Hình SEM (Hình 6) cho thÃy hình thái bề mặt cąa PCL(A), PA (B), PAP (C), 1 (D), PAC5-2 (E), PAC5-3 (F) TÃt cÁ các m¿u đều cho thÃy các sāi không có h¿t, mán và không thẳng hàng vçi đå đßng nhÃt t°¢ng đái cao về đ°éng kính sāi Hình B cho thÃy bëi vì nano b¿c đã đ°āc tích hāp vào sāi PCL, nên đ°éng kính sāi nhß h¢n do đå d¿n đián từ các h¿t nano b¿c nh°ng không có thay đái rõ ràng nào về cÃu trúc bề mặt màng so sánh vçi màng PCL

PAC5-Đ°éng kính sāi cąa PCL (Hình 6-A) có kích th°çc từ 3-10 µm, vçi đ°éng kính trung bình là 5,38 ± 1,87 µm; Nhìn chung, kích th°çc đ°éng kính sāi trung bình giÁm dần khi nano b¿c (AgNPs) đ°āc tích hāp; viác tích hāp nano b¿c trong sāi PCL giúp tng mÁt đå đián tích cąa dung dách Thêm vào đó, sự có mặt cąa AgNPs trong dung dách PCL làm xáo trån sự sÃp xÁp cąa chuãi polymer và do đó làm giÁm đå nhçt cąa dung dách Từ đó, dung dách PCL/AgNPs có đå nhçt thÃp h¢n và đå d¿n đián tát h¢n khi so sánh vçi dung dách PCL[31] kÁt quÁ là đ°éng kính sāi nhß h¢n do sự giãn në cąa tia polyme đián tng lên trong quá trình quay đián Hián t°āng này đ°āc xem nh° là hián t°āng phá biÁn cąa dung dách polymer , khi mà dung dách có đå nhçt thÃp và đå d¿n đián cao s¿ d¿n đÁn đ°éng kính sāi nhß h¢n [32] ê lçp thć 2, bề mặt màng PCL-POX (PP) t¿o thành màng 2 lçp PCL-Ag-POX (PAP) cho thÃy trung bình đ°éng kính sāi lçn h¢n so vçi màng PA, tuy nhiên viác kÁt hāp POX tng đå nhçt cąa dung dách [33]

Hknh 6 Ành vi mô SEM Bề mặt của các nhóm màng (A) PCL; (B) PA; (C) PAP; (D) PAC5-1; (E) PAC5-2 và (F) PAC5-3

Sāi PCL/poloxamer cho thÃy bề mặt sāi mán và cÃu trúc thÁm sāi đßng nhÃt không có khuyÁt tÁt, t°¢ng tự nh° các sāi từ nhóm kiểm soát PCL, viác kÁt hāp poloxamer vào sāi PCL đã d¿n đÁn viác giÁm đ°éng kính sāi trung bình, quá trình kéo giãn và làm mßng sāi tát h¢n [34]

T¿i théi điểm khÁo sát 24 gié, cho thÃy đå phą trên bề mặt trên 90% ë vá trí khÁo sát KhÁo sát mái t°¢ng quan giāa đå phą bề mặt và đå dày cąa lçp phą cho thÃy théi gian tái °u cho quá trình phą là 24 gié Đßng théi, viác phą COS làm tng kích th°çc đ°éng kính sāi trung bình Sau quá trình khÁo sát, PAC5-3 đ°āc lựa chãn cho các nghiên cću tiÁp theo

Hknh 7 Kết quÁ (1) so sánh đường kính sợi trung bknh và (2) độ phân bố đường kính

lớp phủ COS và (4) độ phủ bề mặt của COS ở 4 khoÁng thời gian 6 tiếng, 12 tiếng, 18 tiếng và 24 tiếng

Hknh 8 Kết quÁ (A) độ dày màng PAC5-3 và (B) độ dày lớp phủ COS t¿i ba vị trí ngẫu nhiên BÁng kết quÁ cho thấy độ dày trung bknh của màng PAC5-3 và lớp phủ COS

KÁt quÁ khÁo sát và đo đå dày màng màng phần mềm Image J cho thÃy Hình 8, sau 12 gié ngâm màng thì bề mặt phą trên dián tích 50 µm x 50 µm t¿i 10 vá trí khÁo sát thÃy rằng đå phą đ¿t trên 50 % Nhé sự kÁt hāp các polymer °a n°çc là POX và PVP, giúp cho COS không chß phą trên bề mặt màng mà còn thÃm vào lçp thć 2 PP, do đó l°āng COS đą lçn để khi giÁi phóng ra khßi màng đą thực hián khÁ nng kháng khuẩn Hình cho thÃy l°āng COS thÃm vào màng đ¿t gần 40% bề dày

POX đ°āc sÿ dăng ë lçp thć 2 cąa màng Khái polypropylene glycol thu hút bề mặt kỵ n°çc cąa màng PA (w/w) trong khi hai khái °a n°çc cąa polyetylen glycol liên kÁt vçi nhóm -OH hoặc -NH KÁt quÁ là hai lçp PA và COS đ°āc giā vçi nhau bằng lçp PP trung gian Ta thÃy rằng các sāi PP bao phą bề mặt PA Sau quá trình phą, có 2 lçp tách biát trong 1 tÃm màng Khi quan sát hình cÃt ngang, không có dÃu hiáu tách lçp giāa từng lçp Đßng théi cũng cho thÃy måt phần cąa dung dách COS đã đ°āc hÃp thă sâu vào lçp PP

Hknh 9 Ành hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của màng PA và biểu đồ phân phối kích

thước đường kính AgNPs (Thanh tỷ lệ: 200 nm, n = 50).

Ành vi mô (Kính hiển vi đián tÿ truyền qua) TEM cho thÃy xu h°çng về kích th°çc h¿t Ag Kích th°çc trung bình cąa các AgNPs là 26.8 ± 8.7 nm, từ biểu đß phân phái kích th°çc đ°éng kính AgNPs t ừ 5 nm đÁn 55 nm Từ tài liáu tham khÁo, Yaohua Dong và cång sự đã chćng minh AgNPs đ°éng kính 10 ± 5 nm có thể ćc chÁ hoàn toàn vi khuẩn ë nßng đå ćc chÁ tái thiểu thÃp h¢n (1.0 μg/ml), trong khi kích th°çc h¿t khoÁng 90 ± 5 nm có thể ćc chÁ vi khuẩn ë nßng đå cao h¢n (11.5 μg/ml) [35]

3.2.2 Đánh giá tính chất hóa học của màng

Phân tích XRD đã đ°āc thực hián để xác minh cÃu trúc tinh thể nano cąa các h¿t nano b¿c Hình 10 cho thÃy giÁn đß XRD cąa các m¿u PA cho thÃy ba đßnh ë các góc 2θ là 38,13 °, 44,26 °, 64,5 ° Các giá trá này cho thÃy cho các mặt phẳng t°¢ng ćng (111), (200), (220) t°¢ng ćng vçi các pha kÁt tinh cąa nano b¿c [36]

KÁt quÁ này måt lần nāa khẳng đánh sự có mặt các h¿t nano b¿c trong màng PCL bằng kỹ thuÁt chiÁu x¿ gamma Các nhißu nền trong các m¿u XRD phÁn ánh hành vi vô đánh hình cąa ma trÁn PCL

Hknh 11 Kết quÁ EDS khÁo sát sự có mặt của nguyên tố C, O và Ag trên bề mặt màng PA