Kiểm Định sơ bộ dược liệu ngũ gia bì gai (eleutherococcus trifoliatus (l ) s y hu) thu hái tại huyện sìn hồ tỉnh lai châuKiểm Định sơ bộ dược liệu ngũ gia bì gai (eleutherococcus trifoliatus (l ) s y hu) thu hái tại huyện sìn hồ tỉnh lai châuKiểm Định sơ bộ dược liệu ngũ gia bì gai (eleutherococcus trifoliatus (l ) s y hu) thu hái tại huyện sìn hồ tỉnh lai châuKiểm Định sơ bộ dược liệu ngũ gia bì gai (eleutherococcus trifoliatus (l ) s y hu) thu hái tại huyện sìn hồ tỉnh lai châu
TỔNG QUAN
Tổng quan về Ngũ gia bì gai
1.1.1 Tên khoa học và phân loại
Ngũ gia bì gai hay còn gọi là Tam gia bì, Tam diệp ngũ gia, có tên khoa học là
Eleutherococcus trifoliatus (L.) S.Y.Hu (syn: Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr)
Cây Ngũ gia bì gai có vị trí phân loại (bậc taxon [3]) như sau:
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Chi Ngũ gia bì (Eleutherococcus)
1.1.2 Phân bố và sinh thái
Ngũ gia bì gai tập trung chủ yếu ở dọc theo các tỉnh miền núi phía Bắc như Lạng Sơn (Bắc Sơn, Tràng Định), Cao Bằng (Quảng Hòa, Trùng Khánh), Lai Châu (Phong Thổ, Sìn Hồ),…
Ngũ gia bì gai thuộc loại cây ưa ẩm, ưa sáng; thường mọc ở ven rừng núi đá vôi ẩm, dọc theo các bờ suối hoặc còn sót lại ở các bờ nương rẫy
Cây ra hoa quả nhiều hằng năm, quả chín và rụng xuống đất trong mùa đông Cây trồng sau 2-3 năm có thể cho thu hoạch [11]
1.1.3 Đặc điểm thực vật – Bộ phận dùng
Cây bụi nhỡ, cao 1-7 m, mọc dựa Cành vươn dài có gai
Lá kép chân vịt, mọc so le với 3-5 lá chét hình bầu dục hoặc thuôn, có gốc tròn, đầu nhọn, kích thước trung bình từ 5-8 cm chiều dài và 2-4 cm chiều rộng Lá chét giữa thường lớn hơn các lá chét bên Mép lá khía răng lớn, gân lá có gai Bề mặt lá nhẵn, mặt trên sẫm bóng Cuống lá kép dài từ 4-7 cm và cũng có gai.
Cụm hoa mọc đầu cành, gồm 3-10 tán, cuống dài 3-4 cm Hoa nhỏ, mẫu 5, màu trắng lục, lá đài không rõ, cánh hoa hình tam giác Nhị 5, chỉ nhị mảnh; bầu dưới, 2 ô
Quả mọng, hình cầu dẹt, mang vòi tồn tại, đường kính khoảng 2,5 mm Khi chín màu đen, có 2 hạt
Toàn cây có tinh dầu thơm
Mùa hoa: tháng 9-11 Mùa quả tháng 12-1 năm sau [11]
Bộ phận dùng: Vỏ rễ, vỏ thân, lá đã phơi hay sấy khô của cây Ngũ gia bì gai [11], [19] Trong nghiên cứu này, chúng em sử dụng thân cây Ngũ gia bì gai
Ngũ gia bì gai chứa acid 3α, 11α- dihydroxy-23-oxylup-20-en-28-oic, acid 24-nor-11α-hydroxy-3-oxolup-20-en-28-oic, acid 24-nor-3α, 11α-hydroxylup-20- en-25-oic, acid 3α-11α-dihydroxylup-20-en-28-oic và acid 3α, 11α-23- trihydroxylup-20-en-28-oic, nevadensin, taraxerol; tinh dầu gồm hơn 60 thành phần, trong đó các chất chính là α-pinen, sabinen, terpinen-4-ol, β-pinen và p-cymen [11]
Tác giả Pongtip Sithisarn (2014) đã phân tích được thành phần chính trong các mẫu rễ cây Ngũ gia bì gai là các dẫn xuất của acid caffeoylquinic bao gồm acid chlorogenic, cynarin, acid 3,5-dicaffeoylquinic, acid 1,4-dicaffeoylquinic và acid 4,5-dicaffeoylquinic [32]
Huaqian Wang và cộng sự (2015) đã xác định được thân và lá của Ngũ gia bì gai có chứa acid chlorogenic, acid isochlorogenic A, acid isochlorogenic C, và rutin [34]
Dong-Li Li, Xi Zheng và cộng sự (2015) đã tìm ra hai triterpenoid mới là acid acantrifoic C và acid acantrifoic D [25]
Các thành phần chủ yếu trong chiết xuất ethyl acetat của Ngũ gia bì gai bao gồm rutin, acid chlorogenic, acid isochlorogenic A và acid isochlorogenic C.
Nghiên cứu của Linh - Vân Thái, Phong - Xương Thạch, Hạ Cao [15] đã chỉ ra rằng Ngũ gia bì gai chứa nhiều loại hợp chất quan trọng như anthranquinone, coumarin, flavonoid, saponin, đường khử, polyphenol, polysaccharid và acid amin Trong đó, lá cây có hàm lượng polyphenol, polysaccharid và flavonoid cao hơn đáng kể so với thân và rễ.
- Ngũ gia bì gai có tác dụng giảm đau nhức xương khớp, ngoài ra còn kích thích tâm thần; tăng cường tác dụng gây co giật của strychnin [11] Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng terpenoid từ dịch chiết ether dầu hỏa và ethyl acetat của Ngũ gia bì gai có tác dụng chống ung thư [25]; polyphenol từ dịch chiết ethyl acetat của Ngũ gia bì gai có tác dụng chống viêm trên chuột thực nghiệm [32]
- Theo kinh nghiệm dân gian, Ngũ gia bì gai là một vị thuốc bổ, làm mạnh gân xương, thấp khớp, lưng gối mỏi đau [11]
1.1.6 Tiêu chuẩn đã công bố về dược liệu Ngũ gia bì gai
Theo DĐVN V, tiêu chuẩn dược liệu Ngũ gia bì gai [1] như sau:
Bảng 1.1 Một số chỉ tiêu đã công bố của dược liệu Ngũ gia bì gai
STT Tiêu chí Yêu cầu
1 Mô tả Mảnh vỏ cuộn hình lòng máng, dài 10 cm đển 20 cm, chiều rộng 0,5 cm đến 1 cm, dày khoảng 1 mm đến 3 mm Mặt ngoài có lóp bần mỏng, màu vàng nâu nhạt có một số đoạn rách nứt, đê lộ lớp trong màu nâu thầm Mặt cắt ngang lởm chởm Vị chát nhẹ, giòn, hơi xốp Mùi thơm nhẹ
2 Vi phẫu Nhiều tế bào mô cứng hình chữ nhật hoặc hình nhiều cạnh màu vàng nhạt, thành rất dày, ống trao đổi rõ, đứng riêng lẻ hoặc tụ lại từng đám Sợi thành dày, có ống trao đổi rõ Mảnh bần với tế bào hình nhiều cạnh, thành dày, màu vàng nhạt Tế bào mô mềm hình nhiều cạnh, thành mỏng, chứa nhiều hạt tinh bột nhỏ hình nhiều cạnh, đơn hoặc kép Tinh thể calci oxalat hỡnh cầu gai, cú đường kớnh 12 àm đến 40 àm
3 Bột Lớp bần gồm một sổ hàng tế bào hình chữ nhật, xếp chồng lên nhau thành dãy xuyên tâm đều đặn Tầng phát sinh bần lục bì gồm một lớp tế bào hình chữ nhật Mô mềm gồm những tế bào thành mỏng, hình dạng méo mó Trong mô mềm vò rải rác có ống tiết và tinh thể calci oxalat hình cầu gai Sợi mô cứng
STT Tiêu chí Yêu cầu xếp thành từng đám rải rác theo một vòng không liên tục giữa ranh giới mô mềm và libe Vùng libe dày có các tia tủy xuyên tâm Tầng sinh libe-gỗ
4 Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng
- Dung môi khai triển: n – Butanol – ethanol – dung dịch amoniac (7:2:5) [Dung dịch amoniac: Trộn 1 thể tích amoniac đậm đặc (TT) với 3 thể tích nước]
- Dung dịch thử Ngâm 0,5 g bột dược liệu với 5 ml ethanol
80 % (TT), đun trong cách thủy khoảng 15 phút, lọc lấy phần dịch trong
- Dung dịch đối chiếu: Hòa tan acid oleanolic chuẩn trong cloroform (TT) để được dung dịch chứa 0,5 mg/ml
- Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 20 àl dung dịch thử và 10 àl dung dịch đối chiếu Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng Phun dung dịch vanilin 1 % (TT) trong hỗn hợp đồng thể tích methanol (TT) và acid phosphoric (TT) sấy bản mỏng ở 120 °C khoảng 5 phút Quan sát dưới ánh sáng thường Trên sắc ký đồ của dung dịch thử xuất hiện 3 vết màu tím trong đó có 1 vết cùng giá trị màu và cùng Rf với vết của acid oleannolic trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu
7 Tro không tan trong acid
STT Tiêu chí Yêu cầu
Tổng quan về CGA
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của acid chlorogenic
- Trọng lượng phân tử: 354, 31 g/mol
- Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (1S,3R,4R,5R)-3-[(E)-3-(3,4- dihydroxyphenyl) prop-2-enoyl] oxy-1,4,5-trihydroxycyclohexane-1-carboxylic acid
3-(3,4-Dihydroxycinnamoyl) quinic acid 3-Caffeoylquinic acid
Acid chlorogenic (CGA) là chất rắn bột, màu trắng hoặc hơi ngả vàng, tan được trong nước và dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd, dimethylformamid Đây là chất khá bền vững với điều kiện bảo quản tốt nhất là 4 °C.
- Nhiệt độ nóng chảy: 205 – 209 °C; Độ hòa tan: 40 mg/mL ở 25 °C [40]
- CGA là một trong những hợp chất có nhiều trong tự nhiên, nhất là cà phê và trà xanh Nó mang hoạt tính sinh học quan trọng, đóng vai trò như chất chống oxy hóa, chống viêm kháng khuẩn, chống viêm, bảo vệ một số cơ quan của cơ thể [29]
- Nghiên cứu của Lin Li, Congping Su và cộng sự (2020) đã chỉ ra rằng CGA có thể làm giảm nguy cơ tăng huyết áp, xơ vữa động mạch, béo phì và tiểu đường loại 2 [26]
- Zaixiang Lou, Hongxin Wang và cộng sự (2011) đã đánh giá tác dụng khỏng khuẩn của CGA Kết quả cho thấy CGA ở khoảng nồng độ từ 20 – 80 àg/ml ức chế hiệu quả sự phát triển của tất cả mầm bệnh vi khuẩn được thử nghiệm; do CGA có khả năng làm tăng tính thấm màng tế bào vi khuẩn, can thiệp vào quá trình tổng hợp nucleotid của vi khuẩn [28]
- Hongkang Zhu, Wenhao Jjang (2022) đã nghiên cứu tác động của CGA trên chuột bị tổn thương gan do rượu thông qua hệ vi sinh vật đường ruột Nồng độ alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL), cholesterol toàn phần (TC) và triglycerid (TG) trong huyết thanh tăng ở những con chuột được cho uống ethanol đã được cải thiện khi dùng CGA Đồng thời, CGA cũng thúc đẩy sản xuất n – butyric (một acid béo giúp duy trì tính toàn vẹn của hàng rào ruột) gấp 3 lần so với thông thường và làm gia tăng các vi khuẩn có lợi cho đường ruột [38]
Nghiên cứu của Shuai Huang và Lu-Lu Wang (2019) đã đánh giá tác dụng chống ung thư của CGA, cho thấy CGA làm giảm khả năng tăng sinh, di cư, xâm lấn và sản xuất ATP của ty thể trong các tế bào ung thư CGA không chỉ biệt hóa tế bào ung thư mà còn không ảnh hưởng đến tế bào thường Nó ức chế sự phát triển ung thư gan và phổi ở chuột mang khối u và ngăn chặn sự hình thành khối u mới ở chuột mang khối u.
Với rất nhiều kết quả khả quan về tác dụng dược lý, CGA được coi là một chất tiềm năng để tiếp tục nghiên cứu và phát triển trong tương lai
1.2.4 Một số đề tài nghiên cứu định lượng CGA bằng HPLC
Đã có một số nghiên cứu định lượng CGA trong dược liệu trên thế giới, bao gồm cả phương pháp truyền thống và phương pháp hiện đại Các đề tài nghiên cứu định lượng CGA bằng HPLC bao gồm:
Bảng 1.2 Một số đề tài nghiên cứu định lượng CGA bằng HPLC
STT Mục tiêu nghiên cứu
Phương pháp Điều kiện sắc ký TLTK
1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng
CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa
- Pha tĩnh: Cột Silica gel pha đảo (C18) (250 mm x 4,6 mm, 5 àm)
- Pha động: Nước chứa 0,1 % acid phosphoric (kênh A) và ACN (kênh B) (tỷ lệ 20:80 tt/tt)
- Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 5 àl
- Bước sóng phát hiện: 327 nm
- Kết quả: Thời gian lưu pic CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa khoảng 10,2 phút Hàm lượng CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại Việt Nam nằm trong khoảng từ 0,057 – 0,375 %
CGA trong một số dược liệu
- Pha tĩnh: Inertsil ODS-3 C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm)
- Pha động: Nước chứa 0,2 % acid phosphoric, pH 1,46 (kênh A) và methanol (kênh B)
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
STT Mục tiêu nghiên cứu
Phương pháp Điều kiện sắc ký TLTK
- Bước sóng phát hiện: 325 nm
- Kết quả: Hàm lượng CGA tìm thấy trong nụ hoa Kim ngân (Lonicera japonica), lá Tía tô đất (Melissa officinalisa) và hạt cà phê (Coffea canephora) có nồng độ tương ứng là
CGA trong Ngũ gia bì chân chim
HPLC - Pha tĩnh: Phenomenex C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm)
- Pha động: Acid acetic 0,1 %: ACN (70:30 tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 320 nm
- Kết quả: Thời gian lưu pic CGA trong mẫu Ngũ gia bì chân chim khoảng 6,7 phút
CGA trong mẫu cà phê tươi và cà phê rang đồng thời đánh giá ảnh hưởng của mức độ rang
- Pha tĩnh: Supelcosil LC-18-DB (30 cm x 4 mm x 5 àm)
- Pha động: Acid formic 0,1 %: ACN (85:15 tt/tt) với CGA
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 330 nm với CGA
STT Mục tiêu nghiên cứu
Phương pháp Điều kiện sắc ký TLTK đến hàm lượng caffeine và
- Kết quả: Thời gian lưu pic CGA trong mẫu cà phê rang là 5,09 phút
5 Xác định năng suất tinh dầu và hàm lượng CGA của một số giống cúc hoa
(Chrysanthemu m) trồng thử nghiệm tại Hà
HPLC - Pha tĩnh: Cột C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 àm)
- Pha động: ACN và acid phosphoric 0,1 %
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 348 nm
- Kết quả: Thời gian lưu pic CGA trong mẫu cúc hoa là 18 phút; hàm lượng CGA trong các mẫu cúc hoa khoảng 0,152 – 0,301 %
Các nghiên cứu trên chỉ ra rằng CGA thường được phát hiện ở bước sóng từ
320 – 350 nm; hệ dung môi pha động thường là hỗn hợp ACN và nước chứa acid phosphoric 0,1 % Tùy vào mẫu cây nghiên cứu mà tỷ lệ pha động và thời gian lưu của pic CGA sẽ khác nhau, kết quả hàm lượng CGA trong mẫu cây cũng sẽ khác nhau
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Thân, cành mang hoa, lá của cây Ngũ gia bì gai có tên khoa học Eleutherococcus trifoliatus (L.) S.Y.Hu) được thu hái tại huyện Sìn hồ, tỉnh Lai Châu Mẫu tươi gồm hoa, lá, thân cây tươi dùng xác định tên khoa học, làm tiêu bản vi phẫu thân cây Mẫu khô cung cấp bởi thầy lang người dân tộc Dao được sấy khô ở nhiệt độ 70 - 80 0 C, bảo quản trong túi PE Mẫu khô dùng trong nghiên cứu vi học bột, định tính, định lượng Thời điểm thu hái: từ tháng 8 đến tháng 11 năm 2022
2.1.2 Dung môi, hóa chất, chất chuẩn
Tên nguyên vật liệu Tiêu chuẩn
1 Ethanol 96 % Tinh khiết hóa học
2 Ethyl acetat Tinh khiết hóa học
3 Chloroform Tinh khiết hóa học
4 Methanol Tinh khiết hóa học
5 Acid acetic Tinh khiết hóa học
6 Acid formic Tinh khiết hóa học
8 Acid hydroclorid Tinh khiết hóa học
9 Toluen Tinh khiết hóa học
10 Nước cất 2 lần Dược Điển Việt Nam V
11 TT Mayer Dược Điển Việt Nam V
12 TT Dragendoff Dược Điển Việt Nam V
13 TT Buchardatt Dược Điển Việt Nam V
14 Chất chuẩn CGA hàm lượng 98 % Dược Điển Trung Quốc
- Cân phân tích Sartorius TE214S của Nhật
- Cân kỹ thuật Sartorius TE3102S của Nhật
- Tủ sấy ETROLAB của Đức
- Thiết bị cô quay chân không Etrolab
- Cân đo độ ẩm MA 150 Sartorius
- Kính hiển vi BIO BASE
- Bộ dụng cụ sắc ký lớp mỏng
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi
- Các dụng cụ thủy tinh khác dùng trong phân tích
2.1.4 Địa điểm – Thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Dược Liệu, Bộ môn Hóa Dược, Bộ môn Lý Sinh; Trường Đại học Y Dược - Đại học Thái Nguyên
Phương pháp nghiên cứu và chỉ tiêu nghiên cứu
2.2.1 Đặc điểm hình thái dược liệu Ngũ gia bì gai
- Quan sát dược liệu thân Ngũ gia bì gai bằng cảm quan ở ánh sáng thường
Mô tả phân tích màu sắc, hình dạng, kích thước, thể chất, mùi vị [3]
- Chỉ tiêu nghiên cứu: Mô tả đặc điểm hình thái dược liệu
2.2.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu và vi học bột của Ngũ gia bì gai
2.2.2.1 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu
Tiến hành làm tiêu bản vi phẫu thân Ngũ gia bì gai bằng phương pháp tẩy nhuộm kép theo Tài liệu thực tập Dược liệu 2 [4] (Phụ lục 1.1)
- Chỉ tiêu nghiên cứu: Mô tả và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu thân Ngũ gia bì gai
2.2.2.2 Đặc điểm vi học bột
Tiến hành làm tiêu bản bột thân Ngũ gia bì gai bằng phương pháp giọt ép theo Tài liệu thực tập Dược liệu 2 [4] (Phụ lục 1.2)
- Chỉ tiêu nghiên cứu: Chụp ảnh và mô tả đặc điểm điển hình của các thành phần có trong tiêu bản bột dược liệu thân Ngũ gia bì gai
2.2.3 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của Ngũ gia bì gai
2.2.3.1 Định tính bằng phản ứng hóa học thường quy
Xác định các nhóm hợp chất thiên nhiên (saponin, tanin, đường khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ, flavonoid, coumarin, chất béo, steroid, caroten, anthranoid, alcaloid, glycosid tim) có trong thân Ngũ gia bì gai bằng các phản ứng hóa học thường quy theo trong sách Dược liệu học [2] (Phụ lục 1.3)
- Chỉ tiêu nghiên cứu: Xác định sự có mặt của các hợp chất có trong dược liệu Ngũ gia bì gai
2.2.3.2 Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Tiến hành theo Phụ lục 5.4, DĐVN V [1] như sau:
- Chuẩn bị dịch chiết dược liệu: Ngâm 5 g dược liệu trong 50 ml methanol trong
24 giờ, lọc lấy dịch chiết, đem cô bớt dung môi để thu được dịch chiết đậm đặc
- Bản mỏng silicagel GF254, cho các bản mỏng vào tủ sấy và sấy ở 105 - 110 °C trong 30 phút để hoạt hóa
- Chuẩn bị bình khai triển, khảo sát để tìm hệ dung môi thích hợp Một số hệ dung môi thường dùng để tách tốt các hợp chất polyphenol [22], [31] như:
Toluen - ethyl acetat (7:3) n-butanol – acid acetic – nước (4:1:5)
Ethyl acetat - acid acetic - acid formic – nước (137:11:11:26)
Sau khi triển khai sắc ký , lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi soi vết dưới đèn UV với bước sóng 254 nm và 366 nm Sử dụng TT natri hydroxyd 10 % để phun hiện màu Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr
Chỉ tiêu nghiên cứu: Xác định sơ bộ sự có mặt của nhóm hợp chất polyphenol có trong thân Ngũ gia bì gai
2.2.4 Xác định độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid, tạp chất
- Sử dụng cân đo độ ẩm MA 150 Sartorius: cân chính xác 1 g bột dược liệu thân Ngũ gia bì gai, khởi động máy và đọc kết quả khi máy dừng [1]
- Chỉ tiêu nghiên cứu: Xác định độ ẩm của dược liệu thân Ngũ gia bì gai
Tiến hành theo DĐVN V [1] như sau:
Để xác định hàm lượng tro của mẫu, tiến hành nung chén sứ đã nung nóng ở 600 ± 25 ºC trong 30 phút trong lò nung, để nguội trong bình hút ẩm rồi cân Sau đó, cân lấy 1,000 g mẫu thử, rải đều vào chén nung, sấy 1 giờ ở 100 – 105 ºC Tiếp tục nung trong lò nung ở nhiệt độ 600 ± 25 ºC đến khi khối lượng không đổi (khoảng 6 giờ) Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng phần tro ra, để nguội trong bình hút ẩm rồi cân.
- Tỷ lệ % tro toàn phần (X %) của dược liê ̣u được tính theo công thức:
Trong đó: m: Khối lượng tro toàn phần (g);
M: Khối lượng mẫu thử (g); a: Độ ẩm mẫu thử; độ ẩm mẫu thử là 9,53 %
- Chỉ tiêu nghiên cứu: Xác định hàm lượng tro toàn phần của dược liệu thân Ngũ gia bì gai
2.2.4.3 Tro không tan trong acid
Tiến hành theo DĐVN V [1] như sau:
- Cho 25 ml dung di ̣ch acid hydrocloric 2M vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan vào một giấy lo ̣c không tro, rửa bằ ng nước nóng rồi đem nung ở 600 ± 25ºC đến khối lượng không đổi (nung trong 4 giờ)
- Tỉ lệ % tro không tan trong acid của dược liê ̣u được tính theo công thức sau:
Trong đó: m: Khối lượng tro không tan trong acid (g);
M: Khối lượng mẫu thử (g); a: Độ ẩm mẫu thử; độ ẩm mẫu thử là 9,53 %
- Chỉ tiêu nghiên cứu: Xác định hàm lượng tro không tan trong acid của dược liệu thân Ngũ gia bì gai
2.2.5 Định lượng CGA trong dược liệu Ngũ gia bì gai
Hàm lượng CGA trong dược liệu thân Ngũ gia bì gai được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với chất chuẩn CGA Phương pháp định lượng được tiến hành theo các bước như sau:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn
- Dung dịch thử: Cân chính xác 1 g bột dược liệu thân Ngũ gia bì gai cho vào bình nón, thêm chính xác 20 ml dung dịch acid formic 5 % trong methanol 50 % Chiết xuất bằng phương pháp siêu âm trong 40 phút, rút dịch chiết, lọc qua màng lọc 0,45 àm được dung dịch thử
- Dung dịch chuẩn CGA: Cân chính xác khoảng 11,7 mg chất chuẩn CGA, chuyển vào bình định mức 50 ml, định mức đến vạch mức bằng methanol 50 %, thu được dung dịch chuẩn cú nồng độ chớnh xỏc khoảng 234 àg/ml Từ dung dịch này tiến hành pha loãng bằng methanol 50 % theo các tỷ lệ khác nhau để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn đem phân tích
Bước 2: Khảo sát điều kiện sắc ký
Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã tham khảo nhiều công trình định lượng CGA trong dược liệu bằng phương pháp HPLC [6], [9], [10] Dựa trên các nghiên cứu trước đó, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn các điều kiện tiến hành sắc ký như sau:
- Pha tĩnh: Cột vertical C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 àm)
- Pha động: ACN và nước (chứa 0,1% acid phosphoric) tỷ lệ 20:80 tt/tt
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl
- Detector UV tại bước sóng 327 nm
16 Đánh giá về thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), và hệ số đối xứng (AS) RS
≥ 1,5; AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5; trên cơ sở kết quả khảo sát lựa chọn các điều kiện sắc ký thích hợp
Bước 3: Thẩm định phương pháp định lượng CGA trong dược liệu thân Ngũ gia bì gai
Sau khi lựa chọn được các điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng CGA trong dược liệu thân Ngũ gia bì gai theo hướng dẫn của hướng dẫn của AOAC Các tiêu chí cần thẩm định gồm có: tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
Là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, độ đặc hiệu thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn
- Cách xác định: Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chuẩn CGA, dung dịch thử và mẫu trắng với chương trình đã lựa chọn Ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích pic
Thời gian lưu pic CGA của dung dịch chuẩn, dung dịch thử phải tương đương nhau Pic CGA trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu b Tính thích hợp hệ thống
- Là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị
Xác định độ tương thích hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thông qua đặc tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các đáp ứng phân tích Tiến hành sắc ký nhiều lần một dung dịch chuẩn của hợp chất analyl (CGA) đã chuẩn bị trước đó Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các tín hiệu sắc ký thu được Độ tương thích hệ thống đạt yêu cầu khi RSD của thời gian lưu và diện tích pic đều nhỏ hơn hoặc bằng 2%.
- Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: Là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích
- Đường chuẩn: Là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ các chất phân tích Đánh giá đường chuẩn dựa vào giá trị R 2 và độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn (Δ) Yêu cầu: 0,99 ≤ R 2 ≤ 1
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả mô tả đặc điểm hình thái dược liệu
Hình 3.1 Cành non (A) và cành già (B) của cây Ngũ gia bì gai
Hình 3.2 Dược liệu thân Ngũ gia bì gai
Hình 3.1A và 3.1B là ảnh chụp đoạn cành Ngũ gia bì gai lúc non và già Thân cây tiết diện tròn có nhiều gai, thân già nâu sần sùi, thân non nhỏ hơn màu xanh Lá kép chân vịt, mọc so le, gồm 3-5 lá chét dài khoảng 4-6 cm Lá hình bầu dục hoặc thuôn, gốc tròn, đầu nhọn, dài 5 - 8 cm, rộng 2 - 4 cm, lá chét giữa lớn hơn Mép lá khía răng cưa, gân lá có gai, 2 mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng Cuống lá kép dài 4 - 7 cm, có gai tiếp giáp giữa cuống lá và thân Cụm hoa tán kép, mọc trên
21 các nách lá, mỗi tán kép có 3-10 tán đơn; cuống tán kép dài 2 - 4 cm; cuống hoa dài
1 - 2 cm Bao hoa có 5 bộ phận, nhẵn Bầu nhụy 2 lá noãn Quả mọng
Hình 3.2 thể hiện thân Ngũ gia bì gai đã được xử lý (rửa sạch, thái phiến, sấy khô) Phiến chéo dài 2-5 cm, rộng 2-3 cm, mặt cắt ngang phẳng, nhẹ, giòn Bên ngoài có lớp bần mỏng, màu nâu, sần sùi, có gai, nứt ở một số vị trí Lõi bên trong có màu nâu ngà vàng.
Mẫu tươi đã được Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội xác định tên khoa học là Eleutherococcus trifoliatus (L.) S.Y.Hu), họ Nhân sâm (Araliaceae) (Phụ lục 2) Mẫu đã được ép tiêu bản khô và tiêu bản được lưu trữ tại bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên
Hình 3.3 Mẫu thân được ép tiêu bản khô lưu tại Bộ môn Dược liệu
Kết quả xác định đặc điểm cấu tạo giải phẫu và vi học bột
3.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân
Hình 3.4 Vi phẫu thân Ngũ gia bì gai
1 - Bần; 2 - Mô dày; 3 - Ống tiết tinh dầu; 4 - Tinh thể calci oxalat; 5 - Mô mềm vỏ;
6 - Mô cứng; 7 - Libe cấp 2; 8 - Tia ruột; 9 - Tầng phát sinh libe – gỗ; 10 - Gỗ cấp 2;
11 - Gỗ cấp 1; 12 - Mô mềm ruột
Vi phẫu cắt ngang thân của Ngũ gia bì gai có tiết diện tròn, từ ngoài vào trong có các đặc điểm: Bần (1) gồm 3-5 hàng tế bào ngoài cùng hình chữ nhật, xếp thành dãy xuyên tâm đều đặn, lớp tế bào ngoài cùng thường bị bong rách Mô dày góc (2) gồm 5-6 hàng tế bào ngay dưới lớp bần, các góc tế bào dày lên, xếp xít nhau bắt màu hồng đậm Mô mềm vỏ (5) gồm những tế bào vách mỏng, hình dạng méo mó; trong mô mềm vỏ rải rác có ống tiết (3) và tinh thể calci oxalat (4) hình cầu gai; tế bào mô cứng (6) xếp thành từng đám rải rác theo một vòng không liên tục giữa ranh giới mô mềm và libe Libe cấp 2 (7) xếp thành vòng cung, giữa các bó libe có các tia ruột (8) xuyên tâm xuống tận gỗ cấp 2 (10), giữa các bó libe và gỗ là tầng sinh libe - gỗ (9) Mạch gỗ cấp 2 to, hình tròn hoặc gần tròn Gỗ cấp 1 (11) hình vòng cung, nằm bên trong gỗ cấp 2 Mô mềm ruột (12) ở trong cùng là các tế bào vách mỏng xếp xít nhau
3.2.2 Đặc điểm bột dược liệu
Hình 3.5 Đặc điểm vi học bột thân Ngũ gia bì gai
1 – Mảnh bần; 2 – Mảnh mô mềm; 3,4,5 – Mảnh mạch; 6 – Đám tế bào mô cứng
7 - Sợi; 8 – Tinh thể Calci oxalat
Bột màu trắng xám, mịn, mùi thơm, không vị Soi trên kính hiển vi thấy: mảnh bần với tế bào hình nhiều cạnh, thành dày, xếp thành dãy xuyên tâm, màu vàng nhạt (1); Mảnh mô mềm với tế bào hình đa giác, thành mỏng (2); Mảnh mạch gồm 3 loại mảnh mạch (3, 4, 5); Tế bào mô cứng hình chữ nhật hoặc hình nhiều cạnh màu vàng nhạt, thành rất dày, ống trao đổi rõ, đứng riêng lẻ hoặc tụ lại từng đám (6); Sợi thành dày, có ống trao đổi rõ (7); tinh thể calci oxalat hình cầu gai (8), cú đường kớnh 12 àm đến 40 àm.
Kết quả định tính sơ bộ thành phần trong cây
3.3.1 Định tính bằng phản ứng hóa học
- Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong thân Ngũ gia bì gai bằng phản ứng hóa học được trình bày ở bảng 3.1 dưới đây:
Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong thân Ngũ gia bì gai Định tính Thí nghiệm Kết quả Kết luận
Glycosid tim Phản ứng của khung steroid - Không
Phản ứng Keller - Killiani - Không
Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Không
Flavonoid Phản ứng Cyanidin - Không
Phản ứng với kiềm - Không
Phản ứng với sắt (III) clorid 5 % + Có
Phản ứng diazo hoá - Không
Coumarin Phản ứng đóng mở vòng lacton - Không
Phản ứng diazo hoá - Không
Phản ứng tăng huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại trong môi trường kiềm
Saponin Phản ứng tạo bọt - Không
Phản ứng phân Saponin steroid - Không
25 Định tính Thí nghiệm Kết quả Kết luận biệt saponin Saponin triterpen - Không
Tanin Phản ứng với protein - Không
Phản ứng với sắt (Ⅲ) clorid 5 % + Có
Phản ứng với chì acetat 10 % + Có Đường khử + Có
Alcaloid Phản ứng với TT Mayer - Không
Phản ứng với TT Dragendorff - Không
Phản ứng với TT Bouchardat - Không
Nhận xét: Kết quả định tính sơ bộ cho thấy thân cây Ngũ gia bì gai có chứa đường khử, polysaccharid, acid amin và polyphenol Dịch chiết thân Ngũ gia bì gai cho phản ứng dương tính với sắt (Ⅲ) clorid 5 % và chì acetat 10 %, đều là 2 phản ứng đặc trưng định tính nhóm hợp chất polyphenol
3.3.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
- Sau khi khảo sát các hệ dung môi khác nhau, nhóm nghiên cứu thấy rằng hệ dung môi toluen – ethyl acetat – acid formic – methanol với tỉ lệ 4:6:0,5:1 và TT natri hydroxyd 10 % là phù hợp để tách các hợp chất polyphenol có trong thân Ngũ gia bì gai
- Kết quả thu được sắc ký đồ như sau:
Hình 3.6 Kết quả sắc ký đồ TLC định tính dược liệu thân Ngũ gia bì gai Chú thích: 1 – Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm;
2 – Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm;
3 – Phun TT natri hydroxyd 10 %, quan sát dưới ánh sáng thường Bảng 3.2 Kết quả sắc ký đồ TLC định tính thân Ngũ gia bì gai
Bước sóng 254 nm 366 nm Phun TT natri hydroxyd 10 %
Nhận xét: Sắc ký đồ của dược liệu thân Ngũ gia bì gai khi soi dưới bước sóng 254 nm có 6 vết, dưới bước sóng 366 nm có 9 vết; khi phun TT natri hydroxyd
10 % và quan sát dưới ánh sáng thường thì có 3 vết bắt màu vàng đậm Ở bước sóng
254 nm có vết 2, 4, 5 là đậm nhất, tương ứng với Rf là 0,103; 0,225; 0,362 (Phụ lục 2.1, 2.2, 2.3) Khi soi dưới bước sóng 366 nm thì 3 bước này có cường độ phát quang mạnh nhất, cho ánh sáng màu xanh dương; quan sát dưới ánh sáng thường thì
3 vết này cũng cho màu vàng tăng lên khi phun TT natri hydroxyd 10 % Như vậy, trong dược liệu thân Ngũ gia bì gai có chứa các hợp chất polyphenol.
Kết quả xác định độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid
- Kết quả xác định độ ẩm của dược liệu thân Ngũ gia bì gai bằng máy đo độ ẩm Sartorius được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.3 Kết quả hàm ẩm của dược liệu thân Ngũ gia bì gai
Nhận xét: Độ ẩm trung bình của dược liệu thân Ngũ gia bì gai là 9,62%
Kết quả xác định tro toàn phần được trình bày dưới bảng sau:
Bảng 3.4 Kết quả xác định tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu thân Ngũ gia bì gai
Lần thử Khối lượng mẫu thử
Khối lượng tro toàn phần (g)
Tỷ lệ tro toàn phần
Nhận xét: Từ bảng trên cho thấy tỷ lệ tro toàn phần trung bình của dược liệu thân Ngũ gia bì gai là 4,624%
3.4.3 Tro không tan trong acid
Kết quả xác định tro không tan trong acid được trình bày bảng sau:
Bảng 3.5 Kết quả tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu thân Ngũ gia bì gai
Khối lượng tro không tan trong acid (g)
Tỷ lệ tro không tan trong acid (%)
Nhận xét: Từ bảng trên cho thấy tỷ lệ tro không tan trong acid trung bình của dược liệu thân Ngũ gia bì gai là 0,0163%
Kết quả xây dựng quy trình định lượng hàm lượng CGA có trong dược liệu Ngũ gia bì gai
3.5.1 Khảo sát điều kiện định lượng
- Quy trình xử lý mẫu: Cân chính xác 1 g bột dược liệu thân Ngũ gia bì gai cho vào bình nón, thêm chính xác 20 ml dung dịch acid formic 5% trong MeOH 50%, cân khối lượng Sau đó siêu âm trong 40 phút, để nguội, cân lại, bổ sung khối lượng giảm bằng dung dịch acid formic 5% trong MeOH 50% Lắc đều, lọc dịch thử qua màng lọc cellulose acetat 0,45 àm thu được dung dịch chạy HPLC
- Chuẩn bị mẫu chuẩn CGA: Cân chính xác khoảng 11,7 mg chất chuẩn CGA, chuyển vào bình định mức 50 ml, định mức đến vạch mức bằng methanol 50%, thu được dung dịch chuẩn cú nồng độ khoảng 234 àg/ml Từ dung dịch này tiến hành pha loãng bằng methanol 50% theo các tỷ lệ khác nhau để thu được các dung dịch chuẩn cú nồng độ 18,7; 37,4; 55,1; 74,8; 93,6 àg/ml đem phõn tớch
- Điều kiện định lượng CGA bằng HPLC lựa chọn được:
+ Pha tĩnh: Cột vertical C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 àm)
+ Pha động: ACN và nước (chứa 0,1% acid phosphoric) tỷ lệ 20:80 tt/tt + Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
+ Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl
+ Detector UV tại bước sóng 327 nm
Kết quả khảo sát pha động được trình bày dưới bảng sau:
Bảng 3.6 Các thông số đánh giá đối với CGA
STT Thông số đánh giá Giá trị Đơn vị
1 Thời gian lưu (tR) 5,601 Phút
2 Diện tích pic (ứng với dung dịch chuẩn nồng độ 10 àg/ml)
4 Hệ số kéo đuôi pic (As) 1,28
Nhận xét: Độ phân giải RS = 1,562 > 1,5; hệ số kéo đuôi pic AS = 1,28 (thuộc khoảng 0,8 - 1,5); cả hai đều đạt yêu cầu nên điều kiện phân tích HPLC này là phù hợp để phân tích CGA có trong dược liệu thân Ngũ gia bì gai
3.5.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Tiến hành phân tích 3 mẫu: dung dịch CGA chuẩn, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng (methanol 50%) với điều kiện phân tích HPLC đã trình bày ở mục 3.5.1, thu được kết quả đánh giá bằng các sắc ký đồ tương ứng như hình sau:
Hình 3.7 Sắc ký đồ của mẫu trắng (1), mẫu chuẩn (2), mẫu thử (3)
Xét trên sắc ký đồ, thời gian lưu của CGA trong mẫu chuẩn trùng với thời gian lưu của mẫu thử, đồng thời không có sự trùng lắp giữa các đỉnh của CGA với các đỉnh khác Thêm nữa, trên mẫu trắng không xuất hiện đỉnh nào trùng với đỉnh CGA của mẫu chuẩn và mẫu thử, điều này chứng tỏ phương pháp và hệ thống sắc ký được sử dụng có độ đặc hiệu cao.
3.5.2.2 Tính phù hợp hệ thống
Tính phù hợp hệ thống được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở mục 3.5.1, Kết quả được đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lă ̣p lại cùng một mẫu chuẩn CGA có nồng độ 140,4 àg/ml Kết quả được trỡnh bày trong bảng sau:
Bảng 3.7 Kết quả đánh giá tính phù hợp hệ thống
STT Thời gian lưu (phút) Diện tích peak (mAU.s)
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic và thời gian lưu đều nhỏ hơn 2 %, từ đó có thể kết luận rằng các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo độ ổn định của phép phân tích định lượng CGA trong dược liệu thân Ngũ gia bì gai
3.5.2.3 Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị một dãy gồm dung dịch CGA chuẩn có nồng độ tăng dần: 18,7; 37,4; 55,1; 74,8; 93,6 àg/ml, sau đú tiến hành phõn tớch HPLC với cỏc điều kiện như đã trình bày ở mục 3.5.1 Kết quả khảo sát sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ CGA được trình bày trong bảng 3.8
Bảng 3.8 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic CGA
Nồng độ tính lại từ đường chuẩn (àg/ml) Độ chệch (%)
Hình 3.8 Đường biểu diễn sự tuyến tính giữa nồng độ CGA và diện tích pic
Nhận xét: Đường chuẩn được đánh giá thông qua hệ số tương quan R và độ chệch của nồng độ tìm lại được từ đường chuẩn so với nồng độ thực Kết quả đánh giá đường chuẩn được trình bày trong bảng 3.7 cho thấy độ chêch lệch tại các nồng độ đều nằm trong giới hạn cho phép (
