Đánh giá dược liệu Ngũ gia bì gai (Eleutherococcus trifoliatus) thu hái tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu

Phương pháp nghiên cứu và chỉ tiêu nghiên cứu 1. Đặc điểm hình thái dược liệu Ngũ gia bì gai

Xác định các nhóm hợp chất thiên nhiên (saponin, tanin, đường khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ, flavonoid, coumarin, chất béo, steroid, caroten, anthranoid, alcaloid, glycosid tim) có trong thân Ngũ gia bì gai bằng các phản ứng hóa học thường quy theo trong sách Dược liệu học [2] (Phụ lục 1.3). - Dung dịch chuẩn CGA: Cân chính xác khoảng 11,7 mg chất chuẩn CGA, chuyển vào bình định mức 50 ml, định mức đến vạch mức bằng methanol 50 %, thu được dung dịch chuẩn cú nồng độ chớnh xỏc khoảng 234 àg/ml. Sau khi lựa chọn được các điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng CGA trong dược liệu thân Ngũ gia bì gai theo hướng dẫn của hướng dẫn của AOAC [12].

Các tiêu chí cần thẩm định gồm có: tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đú ng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, độ đặc hiệu thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp. - Giới hạn phát hiện (LOD – Limit of Detection): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích, khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được.

- Giới hạn định lượng (LOQ – Limit of Quantitation): Là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng được bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn. + δ: xác định từ độ lệch chuẩn của tập hợp các giá trị b của đường chuẩn + a: hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính (y=ax+b) giữa nồng độ - đáp ứng của chất cần phân tích. - Độ lặp lại của phương pháp là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lă ̣p lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn SD (Standard Deviation) hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%).

- Độ đú ng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.

Kết quả xác định đặc điểm cấu tạo giải phẫu và vi học bột 1. Đặc điểm vi phẫu thân

Vi phẫu cắt ngang thân của Ngũ gia bì gai có tiết diện tròn, từ ngoài vào trong có các đặc điểm: Bần (1) gồm 3-5 hàng tế bào ngoài cùng hình chữ nhật, xếp thành dãy xuyên tâm đều đặn, lớp tế bào ngoài cùng thường bị bong rách.

Kết quả định tính sơ bộ thành phần trong cây 1. Định tính bằng phản ứng hóa học

Nhận xét: Kết quả định tính sơ bộ cho thấy thân cây Ngũ gia bì gai có chứa đường khử, polysaccharid, acid amin và polyphenol. Dịch chiết thân Ngũ gia bì gai cho phản ứng dương tính với sắt (Ⅲ) clorid 5 % và chì acetat 10 %, đều là 2 phản ứng đặc trưng định tính nhóm hợp chất polyphenol. - Sau khi khảo sát các hệ dung môi khác nhau, nhóm nghiên cứu thấy rằng hệ dung môi toluen – ethyl acetat – acid formic – methanol với tỉ lệ 4:6:0,5:1 và TT natri hydroxyd 10 % là phù hợp để tách các hợp chất polyphenol có trong thân Ngũ gia bì gai.

Kết quả sắc ký đồ TLC định tính dược liệu thân Ngũ gia bì gai Chú thích: 1 – Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm;. Khi soi dưới bước sóng 366 nm thì 3 bước này có cường độ phát quang mạnh nhất, cho ánh sáng màu xanh dương; quan sát dưới ánh sáng thường thì 3 vết này cũng cho màu vàng tăng lên khi phun TT natri hydroxyd 10 %. Như vậy, trong dược liệu thân Ngũ gia bì gai có chứa các hợp chất polyphenol.

Kết quả xác định tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu thân Ngũ gia bì gai Lần thử Khối lượng mẫu thử. Nhận xét: Từ bảng trên cho thấy tỷ lệ tro toàn phần trung bình của dược liệu thân Ngũ gia bì gai là 4,624%. Kết quả tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu thân Ngũ gia bì gai Lần.

Nhận xét: Từ bảng trên cho thấy tỷ lệ tro không tan trong acid trung bình của dược liệu thân Ngũ gia bì gai là 0,0163%.

Kết quả xây dựng quy trình định lượng hàm lượng CGA có trong dược liệu Ngũ gia bì gai

Nhận xét: trên sắc ký đồ cho thấy thời gian lưu của CGA trên mẫu chuẩn và mẫu thử là tương đương nhau, pic CGA không bị trùng với các pic khác; đồng thời trên mẫu trắng không có pic nào trùng với pic CGA ở mẫu chuẩn và mẫu thử, chứng tỏ phương pháp và hệ thống sắc ký có độ đặc hiệu cao. Tính phù hợp hệ thống được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở mục 3.5.1, Kết quả được đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lă ̣p lại cùng một mẫu chuẩn CGA có nồng độ 140,4 àg/ml. Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic và thời gian lưu đều nhỏ hơn 2 %, từ đó có thể kết luận rằng các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo độ ổn định của phép phân tích định lượng CGA trong dược liệu thân Ngũ gia bì gai.

Kết quả khảo sát sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ CGA được trình bày trong bảng 3.8. Đường biểu diễn sự tuyến tính giữa nồng độ CGA và diện tích pic Nhận xét: Đường chuẩn được đánh giá thông qua hệ số tương quan R và độ chệch của nồng độ tìm lại được từ đường chuẩn so với nồng độ thực. Kết quả đánh giá đường chuẩn được trình bày trong bảng 3.7 cho thấy độ chêch lệch tại các nồng độ đều nằm trong giới hạn cho phép (<15 %).

Nhận xét chung: Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp định lượng được xây dựng đáp ứng các chỉ tiêu về tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) theo tiêu chuẩn của AOAC. Như vậy, phương pháp định lượng hoàn toàn phù hợp để ứng dụng định lượng CGA trong dược liệu thân Ngũ gia bì gai. Sau khi xây dựng phương pháp định lượng và thẩm định phương pháp, tiến hành xác định hàm lượng CGA có trong dược liệu thân Ngũ gia bì gai thu hái tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu.

Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy hàm lượng CGA trung bình trong dược liệu thân Ngũ gia bì gai khoảng 0,0443 %.