Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân giống in vitro cây đàn hương trắng (santalum album l ) có xuất xứ từ ấn độ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

LÊ THÀNH TRUNG

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG

IN VITRO CÂY ĐÀN HƯƠNG TRẮNG (SANTALUM ALBUM L.)

CÓ XUẤT XỨ TỪ ẤN ĐỘ

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ HỒNG GẤM

PGS TS BÙI VĂN THẮNG

Hà Nội, 2023

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tư do - Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn với các số liệu và kết quả đạt được là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào đã công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của Hội đồng khoa học

Hà Nội, ngày tháng 9 năm 2023

NGƯỜI CAM ĐOAN

Lê Thành Trung

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô giáo của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã trang bị kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Sở Giáo dục và Đào tạo Gia Lai, Trường THCS&THPT Phạm Hồng Thái, Chư Păh đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy cô hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hồng Gấm và PGS.TS Bùi Văn Thắng (Viện Công nghệ sinh học Lâm

nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp) đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Đề tài luận văn nhận được sự hỗ trợ về nguyên vật liệu, hóa chất, mẫu vật từ đề tài nghiên cứu cấp cơ sở “Nghiên cứu xây dựng quy trình vi nhân

giống cây Đàn hương trắng (Santalum album L.) hiệu suất cao” do TS

Nguyễn Thị Hồng Gấm chủ trì thực hiện

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn thạc sĩ

Hà Nội, ngày tháng 9 năm 2023

TÁC GIẢ

Lê Thành Trung

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tổng quan về cây Đàn hương trắng 3

1.2 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

1.2.1 Khái niệm nuôi cấy in vitro 11

1.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

1.2.3 Các giai đoạn chính trong quy trình nhân giống in vitro 12

1.2.4 Một số vấn đề thường gặp trong quá trình nhân giống in vitro và giải pháp khắc phục 14

1.3 Một số nghiên cứu về nhân giống Đàn hương trắng 15

1.3.1 Trên thế giới 15

1.3.2 Trong nước 17

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Địa điểm thực hiện 19

2.3 Nội dung nghiên cứu 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Vật liệu nuôi cấy 19

2.4.2 Điều kiện bố trí thí nghiệm 19

2.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 20

2.5 Thu thập và xử lý số liệu 24

2.5.1 Thu thập số liệu 24

2.5.2 Xử lý số liệu 25

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch thích hợp 26

3.2 Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa đến khả năng nhân nhanh chồi Đàn hương trắng 29

3.3 Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ của chồi in vitro Đàn hương trắng 33

3.4 Kết quả ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây con in vitro Đàn hương trắng 36

3.5 Kết quả ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro Đàn hương trắng 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40PHỤ LỤC

BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT

2 BAP 6 - benzyl aminopurin

3 CTTN Công thức thí nghiệm

4 ĐHST Điều hòa sinh trưởng

5 GA3 Gibberellic acid 6 IAA Indol- acetic acid

7 IBA Indol butyric acid

8 MS Murashige & Skoog, 1962 (môi trường MS)

9 NAA α- Naphthalen acetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân bố của các loài Đàn hương trên thế giới 5 Bảng 1.2 So sánh giá trị sử dụng giữa Đàn hương trắng và Đàn hương đỏ 8 Bảng 2.1 Công thức thí nghiệm khử trùng mẫu Đàn hương trắng 21 Bảng 2.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Đàn hương trắng 22 Bảng 2.3 Ảnh hưởng của IBA, NAA đến khả năng ra rễ Đàn hương trắng 23 Bảng 2.4 Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ở vườn ươm 24 Bảng 3.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng tới khả năng tạo mẫu sạch và tái sinh chồi của Đàn hương trắng 27 Bảng 3.2 Kết quả ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng của cây con in vitro 37

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái hoa và quả Đàn hương trắng 4

Hình 2.1 Sơ đồ các giai đoạn trong quá trình nhân giống cho Đàn hương trắng 20

Hình 3.1 Mẫu Đàn hương trắng sau khử trùng cấy vào môi trường 26

Hình 3.2 Mẫu Đàn hương trắng sau vào mẫu 2 tuần (A) và 4 tuần (B) 28

Hình 3.3 Mẫu Đàn hương trắng nhân trên môi trường NCĐH3 31

Hình 3.4 Mẫu Đàn hương trắng nuôi cấy trên môi trường NCĐH9 32

Hình 3.5 Chồi Đàn hương cấy trên môi trường ra rễ 34

Hình 3.6 Chồi Đàn hương ra rễ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường ra rễ 35

Hình 3.7 Bình cây Đàn hương huấn luyện 9 ngày 37

Hình 3.8 Cây Đàn hương con trồng trên giá thể RB1 38

MỞ ĐẦU 1 Lý do chọn đề tài

Đàn hương trắng (Santalum album L.), còn gọi là Bạch đàn hương hay

Bạch đường Đàn hương trắng là cây gỗ quý trong sách đỏ Ấn Độ, một loại cây nhiệt đới nhỏ, có giá trị sử dụng và giá trị kinh tế cao hơn so với các giống đàn hương khác Đàn hương trắng mang lại giá trị sử dụng cao, gần như tất cả các bộ phận của cây như: thân, gốc, cành, lá, giác gỗ đều có thể sử dụng

Đàn hương trắng có xuất xứ từ Kamataka - Ấn Độ, được tìm thấy trong các khu rừng rụng lá khô nhiệt đới ở Ấn Độ, quần đảo Lesser Sunda của Indonesia và Arnhem Land ở miền bắc Australia và là loài duy nhất của chi này được tìm thấy trên lục địa châu Á Phân bố từ Ấn Độ qua Malesia đến quần đảo Thái Bình Dương, đến tận Hawaii và quần đảo Juan Fernández ngoài khơi bờ biển Nam Mỹ Giống được Viện Nghiên cứu cây Đàn hương và Thực vật quý hiếm nhập nội vào Việt Nam và sản xuất thử nghiệm, đã đưa vào trồng tại một số địa phương: huyện Buôn Đôn, Đắk Lắk; huyện Lục Ngạn, Bắc Giang; huyện Thạch Thất, thị xã Sơn Tây, Hà Nội và một số vùng sinh thái tương tự khác

Do là loài cây du nhập từ nước ngoài (đặc biệt là Ấn Độ) về Việt Nam nên nguồn hạt giống phải nhập khẩu với giá rất cao và tỷ lệ nảy mầm thấp nên giá thành cây giống trên thị trường hiện nay rất cao Mặt khác, nếu dùng chất điều hòa sinh trưởng GA3 kích thích nảy mầm cho hạt sẽ gây ảnh hưởng đến việc phát triển lõi gỗ và hàm lượng tinh dầu Tuy nhiên, do cây có giá trị và tinh dầu có hàm lượng santalol alpha cao nên đã bị khai thác quá mức, dẫn đến tình trạng cạn kiệt ở chính các nước có cây phân bố tự nhiên Vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống cây Đàn hương trắng nhằm giảm giá thành cây giống và giữ được hiệu quả cao của cây về các tính trạng cần thiết Trong các

phương pháp nhân giống, nhân giống in vitro là một phương pháp nhân giống

tiên tiến với nhiều ưu điểm như: hệ số nhân giống cao, đáp ứng đủ và kịp thời

cho việc sử dụng một số lượng lớn cây giống trên quy mô lớn, không phụ thuộc vào thời tiết, mùa vụ và giữ được các tính trạng quý của cây đầu dòng (cây mẹ) mà ta mong muốn

Việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân giống in vitro cây Đàn hương trắng (Santalum album L.) có xuất xứ từ Ấn Độ”

nhằm góp phần bảo tồn tài nguyên và làm cơ sở cho việc nhân nhanh, cung cấp nguồn cây giống chất lượng cao để phát triển mở rộng sản xuất giống Đàn hương tại Việt Nam là rất cần thiết

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro cho cây Đàn hương

trắng phục vụ cho việc sản xuất cây giống, phát triển cây Đàn hương trắng ở Việt Nam

3 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn cho việc mở rộng sản xuất và phát triển giống cây Đàn hương trắng, loài cây lâm nghiệp quý có giá trị kinh tế cao tại Việt Nam

Chương 1

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan về cây Đàn hương trắng

1.1.1 Phân loại

Đàn hương trắng có tên khoa học là Santalum album L., thuộc chi Santalum, họ Đàn hương (Santalaceae), bộ Santalales và là loài thực vật có

hoa được mô tả đầu tiên vào năm 1753 Đàn hương trắng là loài cây thân gỗ nhưng đôi khi nó cũng phát triển dưới dạng cây bụi thẳng đứng hoặc hiếm khi thành cây leo [33]

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Đàn hương trắng là loài cây thân gỗ thường xanh cao tới 20 m, chu vi thân có thể đạt tới 2,4 m với các cành nhánh nhỏ rủ xuống [16] Theo nghiên cứu của Riswan (2001), Đàn hương trắng là cây thân gỗ có thể cao từ 12 - 15 m, đường kính thân từ 20 - 35 cm và thân cây phân nhánh [9] Vỏ cây có màu nâu sẫm, hơi đỏ, xám đen hoặc gần đen và ở cây non thì có vỏ nhẵn, màu trắng xám khi cây trưởng thành, vỏ bị nứt trên thân và cành Gỗ ở cây trưởng thành có màu trắng và không mùi, tâm gỗ có màu nâu vàng, cứng và nặng có mùi thơm ngát được dùng ở dạng gỗ hoặc gỗ bào [25]

Về hình thái lá, Đàn hương trắng có lá mỏng thường mọc đối, hình trứng hoặc hình bầu dục với kích thước phiến lá 3-8 x 3-5 cm và có màu xanh lục bóng [16] Miêu tả này cũng đồng nhất với nghiên cứu của Solle và cộng sự (2016), lá thường có đầu lá tròn hoặc nhọn, cuống có rãnh và dài 5-15cm, gân lá dễ thấy [36] Nghiên cứu của Nurochman và cộng sự (2018) cho thấy lá cây Đàn hương trắng là đơn mọc đối, phiến lá có hình elip, mép lá phẳng đầu nhọn nhưng đôi khi cùn, kích thước lá 5,6 x 2,6 cm, lá có màu vàng hoặc xanh lục [24]

Đối với rễ cây Đàn hương trắng, có rễ cái ký sinh trên cây chủ, rễ con bám chặt vào rễ cái cây chủ bằng các giác mút để hút dinh dưỡng từ cây ký

chủ, giúp cây sinh trưởng và phát triển, do đó được gọi là cây gỗ bán ký sinh Ngoài ra, cây có thể ký sinh vào thân hay rễ của cây khác để hấp thụ muối hay muối khoáng [14, 28] Bộ rễ chủ yếu được phân bố ở tầng sâu khoảng 20 - 30 cm và rễ cái có thể ăn sâu trên 1 m nên khi trồng yêu cầu trồng tại nơi có tầng đất sâu trên 1 m [3] Rễ cây Đàn hương trắng khi trưởng thành ở 30 - 40 tuổi rễ có hình bậc thang và có mùi thơm [16]

Hình thái hoa cây Đàn hương trắng là hoa mẫu 4, cụm hoa mọc thành chùm với lúc đầu thì có màu vàng và sau đó có màu đỏ thẫm Hoa thường ra hoa vào tháng 5 - 6 và đậu quả vào tháng 7 - 9 Quả hạch hình cầu, thịt quả có nhiều nhựa và khi chín có màu đen [15] Hoa Đàn hương trắng lưỡng tính, dài từ 5 - 6 cm, hoa có màu tím đỏ ở nách lá, thùy dài từ 2,5 - 1,5 mm hình trứng, mỏng nhiều thịt không có vân sần và lông tơ, các thùy xen kẽ với các lớp đệm nhị 5 xếp xen kẽ hình đĩa, hoa ra từ tháng 12 đến 4 năm sau Quả hình trám với kích thước từ 8 - 12 mm, hạt khi non có màu xanh khi chín có màu tím đen [30]

Hình 1.1 Hình thái hoa và quả Đàn hương trắng

(Nguồn: https://vi.wikipedia.org; wikiduoclieu.org)

1.1.3 Phân bố và đặc điểm hình thái

Đàn hương trắng có phân bố tự nhiên chủ yếu ở Ấn Độ, Indonesia, Úc và New Zealand Hiện nay, trên thế giới có khoảng 17 loài Đàn hương trắng (Bảng 1.1) nhưng chỉ có hai loài Đàn hương trắng được thương mại hóa là Đàn

hương Ấn Độ (Santalum album) và Đàn hương Úc (Santalum spicatum) [22]

Trong đó, tại Nusa Tenggara Timur - Indonesia Đàn hương trắng là loài mọc tự nhiên trong rừng và phân bố phần lớn tìm thấy ở các đảo Timor, Alor, Sumba, Solor, Lembata and Flores Islands Nhưng đến năm 1987, phân bố tự nhiên của loài giảm xuống đáng kể, các quần thể Đàn hương chỉ còn tìm thấy tại tại Timo và quần đảo Sumba Đến năm 1997 quần thể Đàn hương tiếp tục giảm chỉ còn lại bốn huyện ở đảo Timo đó là Timor, Alor, Sumba, Solor, Lembata và Flores Islands [11]

Bảng 1.1 Phân bố của các loài Đàn hương trên thế giới

1 Santalum album L

Phân bố rộng rãi ở Ấn Độ và tập trung nhiều ở khu vực phía nam: Karnataka, Tamil Nadu

6 Santalum pyrularia Phân phổ ở đảo Hawaii và Papua New Guinea 7 Santalum involutum Phân phổ ở vùng Bắc, Nam và Tây of Kauai

đảo Hawaii Courtsey (Keneth R Wood) 8 Santalum boninese Phân phổ ở vùng Tuyama (BoninIslands),

Nhật Bản

9 Santalum yasi Phân bố ở Fiji, quần đảo Niue và Tonga ở Nam Thái Bình Dương

10 Santalum macgregori Phân bố ở Papua New Guinea

11 Santalum accuminatump Phân bố ở vùng Tây Nam và Đông Nam, Úc 12 Santalum murrayanum Phân bố ở vùng Tây Úc

13 Santalum obtusifolium Phân bố ở Victoria, New South Wales và Queensland, Úc

14 Santalum lanceolatum Phân bố ở Western New South Wales, Úc 15 Santalum

fernandezianum

Loài đặc hữu của quần đảo Juan Fernández ngoài khơi Chile

16 Santalum salicifolium Phân bố ở Hawaii nhưng đã bị tuyệt chủng

17 Santalum spicatum Phân bố ở Úc

(Nguồn: The plant list, 2010)

Tại Việt Nam, cây Đàn hương trắng được các nhà khoa học nghiên cứu từ năm 2005, nhưng phải đến năm 2014 mới thu được những thành công bước đầu Sau hơn 4 năm trồng khảo nghiệm trên hơn 43 tỉnh thành trên cả nước như: Nghệ An, Hà Tĩnh, Thanh Hóa, Bình Định,… và khu vực Tây Nguyên, với tốc độ sinh trưởng và phát triển của cây Đàn hương trắng cho thấy sự thích nghi tốt với khí hậu, thổ nhưỡng tại Việt Nam [5]

Đàn hương trắng có thể phát triển trên nhiều loại đất khác nhau Cây có thể mọc ở những nơi gần núi lửa, đất sét hoặc đất cát, nơi đất màu mỡ hoặc đất nghèo dinh dưỡng Cây cũng phù hợp với những nơi đất thoát nước tốt, độ pH thích hợp cho cây phát triển là từ 5,5 đến 6,5 [10]

Ở Timor, Đàn hương trắng thường mọc trên sườn núi khô hạn và gần biển, độ cao lên đến 1.200m, những khu vực này lượng mưa hàng năm đạt đến 1.500mm và hạn hán thường kéo dài đến 6 tháng trong năm [17]

Đàn hương trắng có phân bố ở những vùng có lượng mưa hàng năm từ 600 - 2.000 mm, tuy nhiên lượng mưa hàng năm từ 850 - 1.350 mm được coi là tối ưu và lượng mưa từ 2.500 mm trở lên chỉ phù hợp ở các vị trí dễ thoát nước Môi trường sống tự nhiên có mùa khô rõ rệt và mùa mưa ngắn từ 2 - 3 tháng, cây không thích ứng được với điều kiện ngập úng, đặc biệt là khi còn nhỏ nhưng ít bị ảnh hưởng hơn khi trưởng thành Bên cạnh đó, loài cây này cũng không thích hợp để phát triển ở vùng ẩm ướt thường xuyên [34]

Đàn hương trắng mọc tự nhiên ở độ cao 1.500 m, trong đó gỗ lõi phát triển tốt nhất ở độ cao 600 - 900 m Cây đòi hỏi khí hậu nhiều nắng, phổ biến nhất là trong rừng thưa và ở bìa rừng rụng lá Tuy nhiên, trong thời gian dài quá nóng hoặc nắng gắt sẽ làm giảm sự phát triển nghiêm trọng và thường làm cây con chết, trong khi ở những cây già, vỏ cây có thể bị tách ra và tạo thành các vết nứt sâu Trong điều kiện khắc nghiệt, vỏ cây có thể bị bong ra, lộ phần gỗ Gỗ tốt nhất là từ những cây mọc trong rừng thưa trên đất nghèo và nhiều đá Nó cũng phát triển tốt trên đá ong Trên đất mùn màu mỡ cây sinh trưởng

nhanh, nhưng hàm lượng dầu của gỗ lõi thấp và chất lượng dầu kém Đàn hương trắng không chịu được đất mặn và nhiều vôi nhưng chịu được đất chua

Đàn hương trắng có phân bố tự nhiên trong khu vực có nhiệt độ trung bình hàng năm từ 22,5 - 25oC, với nhiệt độ < 13oC cây tạm ngừng sinh trưởng, chồi ngọn chuyển sang ngủ đông Cây có thể tạm thời chịu được nhiệt 0oC vào mùa đông, nhưng khi nhiệt độ xuống dưới 0oC lá bị rét hại và khi xuống -3°C đến -5°C thì cây có thể chưa chết Nhiệt độ dưới -10°C và thời gian rét liên tục là hai yếu tố chủ yếu làm hạn chế khả năng sinh trưởng của cây Vì vậy, vùng thích nghi phát triển Đàn hương trắng là vùng có nhiệt độ tối thấp, bình quân nhiều năm không thấp hơn 0°C, tích ôn nhiệt độ bình quân ngày > 10°C, đảm bảo thỏa mãn điều kiện nhiệt độ trồng Đàn hương trắng [37]

Nhìn chung, cần trồng Đàn hương trắng ở những nơi nhận được ánh sáng mặt trời tốt, nơi thoát nước tốt (tức là không giữ nước trong thời gian dài), sạch dịch bệnh và không mắc các loại nấm, không có lượng mưa quá lớn và có một mùa khô hàng năm [5]

1.1.4 Giá trị sử dụng và kinh tế

Kết quả nghiên cứu về giá trị sử dụng và thị trường tiêu thụ Đàn hương trắng ở Việt Nam và trên thế giới cho thấy, gỗ Đàn hương trắng có tinh dầu thơm gồm các thành phần α, β - santalol (ancol sesquiterpen), α, β - Santalen, santen, santenon, α - santenol, santalon, santalic axit, teresantalic axit, isovalerandehit, teresantalol, tricycloekasantal, santalin, deoxysantalin, sinapylliandehit, coniferylandehit, syringic andehit, vanilin, urs - 12 - en - 3β - yl - p Thị trường tiêu thụ gỗ Đàn hương trắng ngày càng lớn, cung không đủ cầu, giá bán trên thế giới từ chỗ chỉ có vài chục USD/kg, nay đã nâng lên trên 1.000 USD/kg Hiện nay, Indonesia giá bán khoảng 500 USD/kg, ở Ấn Độ khoảng 1.000 USD/kg [7]

Năm 2016, Viện nghiên cứu cây Đàn hương và thực vật quý hiếm chỉ ra Đàn hương trắng là cây có giá trị kinh tế rất cao được ví là cây hoàng kim, với hai loại mang lại nhiều giá trị kinh tế nhất gồm Đàn hương trắng và Đàn hương đỏ [1] (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 So sánh giá trị sử dụng giữa Đàn hương trắng và Đàn hương đỏ

Tên khoa học Đàn hương trắng Đàn hương đỏ

Santalum album Pterocarpus santalius

Thời gian thu

Hình thành lõi cây Hình thành lõi sau 5 năm, tỷ lệ cấp, đồ dùng trong xe hơi, máy bay, chiết tinh dầu

Hạt Chiết tinh dầu, sản xuất rượu,

Hạt 150 USD/kg (hạt giống) 25 USD/kg

Rủi ro khi trồng

Ít rủi ro hơn, có thể thu được lợi từ cây trồng xen canh trong thời gian đợi thu hoạch Đàn

Cây Đàn hương trắng mang lại giá trị sử dụng cũng như giá trị kinh tế cao hơn, sử dụng cả gốc, cành, lá, giác gỗ để sử dụng và chế biến Lõi gỗ được dùng để sản xuất ra các mặt hàng có giá trị cao, như hàng đồ gỗ mỹ nghệ, đồ gia dụng cao cấp, trang trí nội thất, dùng chiết suất tinh dầu, chất dẫn suất nước hoa… Rễ cây chứa 60 - 70% lượng tinh dầu trên cây đàn hương chính vì vậy rễ đàn hương người ta dùng để sử dụng chủ yếu làm chế xuất tinh dầu, hoặc nghiền lấy bột sử dụng trong ngành mỹ phẩm để làm đẹp, chăm sóc da Giác gỗ được nghiền lấy bột để sử dụng trong ngành mỹ phẩm, làm đẹp, chăm sóc da Ngoài những tác dụng làm đẹp, chăm sóc da, chế xuất nước hoa người ta còn biết đến lá cây đàn hương dùng để sản xuất trà sạch chất lượng cao Hạt có tác dụng để nhân giống, chiết xuất tinh dầu, sản xuất rượu,… [8]

Gỗ Đàn hương trắng được dùng ở dạng bột, tinh dầu, kem, và trở thành một sự lựa chọn hoàn hảo để chăm sóc da mặt Bột gỗ Đàn hương trắng được trộn làm mặt nạ đắp để tẩy mụn đầu đen và mụn đầu trắng Ngoài ra còn được dùng để chữa các chứng đau bụng vùng dạ dày, bụng dưới, đái buốt do viêm đường tiết niệu, thổ huyết, nấc, ho có đờm lâu khỏi, chữa phong thấp đau nhức xương, thuốc điều khí chữa đau tim Theo tây y, gỗ Đàn hương trắng có tác dụng sinh lý chủ yếu là sát trùng đường niệu - sinh dục Y học cổ truyền Ấn Độ dùng lõi gỗ Đàn hương trắng chống viêm, sát trùng, hạ nhiệt, làm săn da, chữa viêm bàng quang, ỉa chảy, lậu mãn tính, xuất huyết, khí hư, loét và rối loạn đường tiết niệu

Tinh dầu Đàn hương trắng được ví như là “nước vàng”, có tác dụng kích thích và cân bằng cảm xúc, xua tan mọi căng thẳng, giúp trấn tĩnh, tỉnh táo, dễ chịu và sảng khoái hơn cho tinh thần và sức khỏe Ngoài ra, tinh dầu Đàn hương trắng còn giúp thanh lọc không khí, khử mùi hôi ẩm mốc, khử mùi thuốc lá, giúp không khí trong lành và tinh khiết

Ngoài ra, Đàn hương trắng được coi là một loại cây linh thiêng và gắn liền với các hoạt động tôn giáo, nghi lễ và nghi lễ khác nhau Các đặc tính

dược liệu và mỹ phẩm của cây đã được mô tả kỹ trong các tài liệu cổ Ở Ấn Độ, người ta có mối liên hệ tâm linh mạnh mẽ với gỗ Đàn hương trắng Tâm gỗ của cây được đốt trong đám tang và đám cưới Hương từ gỗ Đàn hương Ấn Độ là loại hương được ghi nhận là lâu đời nhất do đã được sử dụng trong hơn 4.000 năm qua [12] Trong tôn giáo Phật giáo, gỗ Đàn hương trắng được đốt cháy trong những lễ cầu nguyện và cũng được sử dụng trong các hoạt động cho mục đích tôn giáo của Ấn Độ giáo và văn hóa Jain Người ta tin rằng tinh chất gỗ Đàn hương trắng giúp chuyển hóa ham muốn và duy trì sự tỉnh táo của một người trong quá trình thiền định

1.1.5 Thực trạng

 Trên thế giới

Ở Nam Ấn Độ, loài Đàn hương trắng đang bị đe dọa và ở Western Ghats, một vài dãy núi như Shevaroy Hills và Kalrayan đang phát triển Tại Ấn Độ, Pakistan và Nepal, Đàn hương trắng thuộc quyền sở hữu và kiểm soát việc thu hoạch; tuy nhiên vẫn diễn ra chặt hạ trái phép Hiện nay, Đàn hương trắng Ấn Độ được trồng rộng rãi với quy mô lớn tại Kununurra, Tây Úc Đây là loài cây được sử dụng chính trong việc sản xuất tinh dầu thương mại và mang lại nguồn kinh tế lớn [22, 33]

 Trong nước

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã công nhận giống cây trồng cây Lâm nghiệp mới đối với giống cây Đàn hương trắng có xuất xứ Karnataka - Ấn Độ theo Quyết định số 1305/QĐ-BNN-TCLN ngày 22/4/2019 [6]

Viện Nghiên cứu cây Đàn hương và Thực vật quý hiếm đã nhập nội và sản xuất giống Đàn hương trắng có xuất xứ Karnataka - Ấn Độ thử nghiệm tại một số địa phương như: huyện Buôn Đôn, Đắk Lắk; huyện Lục Ngạn, Bắc Giang; huyện Thạch Thất, Thị xã Sơn Tây, Hà Nội và một số vùng sinh thái tương tự [4]

1.2 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Khái niệm nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro, hoặc vi nhân giống (Micropropagation) là khái niệm để chỉ chung cho tất cả các loại nuôi cấy

nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch được tách khỏi cây trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng và được kiểm soát

Hiện nay, vi nhân giống được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy để tạo cây hoàn chỉnh

1.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào dựa vào các cơ sở đó là tính toàn năng của tế bào, sự trẻ hoá của tế bào và quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào

Tính toàn năng của tế bào

Tính toàn năng của tế bào (totipotency) được hiểu là: Mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh

Cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX, Gottlibeb Haberlant - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời” năm 1902 Theo ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”

Như vậy mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh Ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ

Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Quá trình phát sinh hình thái ở thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào Tất cả những tế bào mới được sinh ra từ mô phân sinh thì cơ bản giống nhau, chúng sẽ trở thành các loại mô khác nhau Quá trình tế bào thay đổi từ những hình dạng chưa trưởng thành đến trưởng thành gọi là sự phân hóa (sự chuyên hoá - differentiation).Còn hiện tượng tế bào trưởng thành trở lại trạng thái phân sinh và tạo ra mô sẹo chưa phân hóa được gọi là phản phân hóa

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình điều hòa hoạt hóa gen Tại một thời điểm nào đó trong hai quá trình phát triển của cá thể có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước đây bị hạn chế) để tạo ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của mô, tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của mô, tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô, tế bào nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau Khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, khi tỷ lệ này cao mô nuôi cấy sẽ phát sinh hình thái theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo

1.2.3 Các giai đoạn chính trong quy trình nhân giống in vitro

Giai đoạn 1: Chuẩn bị

Đây là bước thuần hóa vật liệu để nuôi cấy bằng cách đưa vật liệu nuôi cấy ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi trường mới,

đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và tạo điều kiện chủ động cho công tác nuôi cấy

Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu và cấy khởi động

Là bước đầu tiên của quy trình nhân giống Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là phải tạo ra nguồn vật liệu vô trùng để đưa vào môi trường nuôi cấy Giai đoạn này gồm các khâu như: chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu, chọn cơ quan để lấy mẫu, khử trùng mẫu trong điều kiện vô trùng

Một số hóa chất thường được sử dụng để khử trùng như HgCl2, Ca(OCl)2, H2O2,… tùy thuộc vào từng loại vật liệu mà chọn hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng cho phù hợp Ngoài ra, mẫu mô được chọn cần chú ý tuổi sinh lý của mô và phải có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ

Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt, kéo dài trong thời gian 4 - 6 tuần

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống với hệ số nhân chồi biến động từ 5 - 50 lần tùy thuộc vào loài cây, môi trường và phương pháp nhân chồi

Để thu được hệ số nhân chồi cao cần lựa chọn môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp, do đó trong giai đoạn này thì vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng là cực kỳ quan trọng để tạo ra lượng lớn chồi mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây

Giai đoạn này yêu cầu là tạo ra lượng lớn cây chon tối đa trong thời gian ngắn nhưng vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Tạo cây hoàn chỉnh được tiến hành khi chồi đã đạt được chiều cao, số lượng lá theo tiêu chuẩn Thường sau 2 - 3 tuần nuôi cấy trong môi trường kích thích ra rễ, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây

hoàn chỉnh Ở giai đoạn này phải tạo cây phát triển cân đối về thân, lá, rễ để đạt tiêu chuẩn của một cây giống

Giai đoạn 5: Huấn luyện và đưa cây ra ngoài vườn ươm

Đây là giai đoạn cuối của quá trình nuôi cấy mô, nó đánh giá tính hiện

thực của quá trình nhân giống in vitro Giai đoạn này sẽ tiến hành chuyển dần

cây con đạt tiêu chuẩn về hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây) ra nhà kính hay nhà lưới, sau đó chuyển ra vườn ươm

Cây từ ống nghiệm đưa ra ngoài vườn ươm thường có hiện tượng “sốc” do thay đổi về điều kiện môi trường nên cần có giai đoạn thích nghi Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu sự chăm sóc đặc biệt, do đó ở giai đoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp và trong điều kiện cách ly bệnh để các cây con đạt tỷ lệ sống cao

1.2.4 Một số vấn đề thường gặp trong quá trình nhân giống in vitro và giải pháp khắc phục

Sự tạp nhiễm

Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật, gây hậu quả nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy Nguyên nhân gây tạp nhiễm có thể từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, môi trường, dụng cụ và các máy móc thiết bị trong phòng cấy

Mẫu cấy được sống trong điều kiện môi trường tự nhiên nên có rất nhiều mầm bệnh dù mẫu cấy được khử trùng nhưng thường chỉ diệt được các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn trên bề mặt mẫu cấy Có thể dùng một số chất kháng sinh để diệt vi khuẩn và nấm, song cũng chính các chất này nếu không được dung ở liều lượng và thời gian thích hợp sẽ có thể gây hại cho mẫu cấy

Sản sinh độc tố từ mẫu nuôi cấy

Mẫu mới cấy hay bị hóa nâu, hóa đen rồi chết là hiện tượng thường gặp, có thể là do có chứa nhiều tanin hay hydroxyphenol trong mẫu cấy đã

già Để khắc phục hiện tượng này người ta thường áp dụng mấy phương pháp sau: (i) bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy (0,1 - 0,3%) hoặc Polyvinyl Pyrolidone (PVP); (ii) ngâm mẫu vào dung dịch chứa các chất có tác dụng ngăn chặn oxy hóa Phenol như axit ascobic, axit chanh vài giờ trước khi cấy; hoặc (iii) nuôi cấy trong môi trường lỏng, nồng độ oxy thấp và không có ánh sáng trong 1 - 2 tuần trước khi cấy

Hiện tượng thủy tinh hóa

Mẫu nuôi cấy mô có khi trở nên mọng nước, lá và thân trong suốt do đó rất khó sống, đặc biệt khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hoặc môi trường ít agar, trao đổi khí thấp Có thể hạn chế hiện tượng này bằng cách: (i) giảm nồng độ chất chứa N trong môi trường nuôi cấy; (ii) giảm sự hình thành ethylen trong

bình mới; (iii) xử lý acid abscisic hoặc các chất ức chế sinh trưởng; hoặc (iv)

tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ trong phòng nuôi mẫu

Tính bất định về di truyền

Một số trường hợp trong nhân giống in vitro có xảy ra đột biến tế bào

soma một cách ngẫu nhiên nhưng khi nuôi cấy mô sẹo gặp nhiều đột biến hơn nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng Nguyên nhân có thể là do kiểu di truyền của mô nuôi cấy; số lần cấy truyền càng nhiều thì tỷ lệ đột biến càng cao và do loại mô làm vật liệu nuôi cấy

1.3 Một số nghiên cứu về nhân giống Đàn hương trắng

1.3.1 Trên thế giới

Việc nhân giống Đàn hương trắng đã được tập trung nghiên cứu và đã đạt được những kết quả tốt, trong đó tập trung nhân giống bằng phương pháp

nuôi cấy in vitro

Vào năm 1998, nhân giống in vitro Đàn hương trắng thông qua phôi

soma được nghiên cứu cho kết quả sau 8 tuần nuôi cấy tạo phôi soma hình cầu, có màu trắng trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l TDZ Tiếp theo, cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 1,15 mg/l IAA + 0,2 mg/l Kinetin để tăng trưởng, nhân lên và duy trì phôi Các phôi trưởng thành phát triển tốt

được tách ra và cấy lên môi trường kích thích nảy mầm có chứa 1,5 mg/l GA3 Sau khi nảy mầm, phôi soma được nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l GA3 và việc bổ sung nước dừa là cần thiết cho sự phát triển của cây con từ phôi soma [35]

Tương tự, nghiên cứu của Mo Xiao-lu và cộng sự (2008) cho kết quả: tỷ lệ hình thành phôi soma tốt nhất đạt 91,2% trên môi trường nuôi cấy MS bổ sung 1 mg/l TDZ và chồi đàn hương trắng tăng trưởng nhanh, khả năng nảy mầm cao khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l GA3 + 4% Sucrose [23]

Janarthanam và Sumathi (2011) đã nghiên cứu tái sinh chồi Đàn hương trắng từ hạt, kết quả cho thấy nhiều chồi Đàn hương trắng đã được tái sinh trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l IBA+ 10% nước cốt dừa, chồi tăng trưởng tốt với chiều cao trung bình 2,9 cm sau 45 ngày nuôi cấy Môi trường tạo rễ thích hợp: 1/2 MS bổ sung 0,5 mg/l IBA + 0,25 mg/l NAA với chiều dài rễ trung bình đạt 4,8 cm sau 6 tuần nuôi cấy Cây con được trồng ra ngoài vườn ươm với thành phần ruột bầu đất, phân trùn quế và phân chuồng theo tỷ lệ 1: 1: 1, tỷ lệ cây sống đạt 70% [19]

Năm 2013, Singh và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh cây Đàn hương trắng từ lá cây trưởng thành, cho kết quả là môi trường tạo phôi soma tốt nhất khi sử dụng WPM bổ sung 0,8 mg/l TDZ với 100% mẫu tạo phôi soma Tái sinh cụm chồi tốt nhất ở môi trường WPM bổ sung 2,5 mg/l BAP +0,4 mg/l NAA, với hệ số tạo chồi từ mô sẹo là 24,6 chồi và chồi tăng trưởng tốt nhất trên môi trường WPM bổ sung 5 mg/l BAP + 3 mg/l Kinetin Các chồi sinh trưởng tốt, đạt tiêu chuẩn được chuyển sang môi trường rễ WPM+ 1,5 mg/ IBA với tỷ lệ ra rễ đạt 91,67% [31]

Nghiên cứu tạo mô sẹo và tái sinh chối từ lá mầm Đàn hương trắng được Parveen và Shahzad (2014) công bố, cho thấy sử dụng MS bổ sung 2,2 mg/1, 2,4D + 0,22 mg/l BAP với tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là 35,3% sau 6 tuần nuôi cấy [26]

Năm 2014, Toni Herawan và cộng sự đã nghiên cứu tạo mô sẹo cây Đàn hương trắng Ấn Độ Kết quả cho thấy, mô sẹo được tạo ra từ lá trong môi trường MS bổ sung 3 mg/l 2,4 D + 0,15 mg/l Kinetin đạt 80% mẫu tạo mô sẹo [18] Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Sweekruti Barpanda và cộng sự (2015) kết quả thu được cho thấy mẫu lá tạo mô sẹo tốt trên môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l IAA [14]

Nghiên cứu của Supatmi và cộng sự (2016) cho kết quả tạo phôi soma từ lá trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l IAA và phát triển tốt nhất trên môi trường và MS bổ sung 1 mg/l IAA + 0,2 mg/1 Kinetine cho tỷ lệ mẫu sống cao (98%) Cây mô sinh trưởng tốt khi được cấy vào giá thể gồm đất, cát, compost theo tỷ lệ 1:1:1 [32]

Năm 2015, Peeris và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh cây Đàn hương trắng qua phôi soma để tạo ra một số lượng lớn cây phục vụ cho mục đích thương mại Mẫu tạo mô sẹo tốt nhất khi sử dụng MS bổ sung 2,5 mg/l 2,4D + 3 mg/1 Kinetin sau 8 tuần nuôi cấy Phôi soma nảy mầm tốt nhất trong môi trường MS bổ sung 2mg/l GA3, tỷ lệ mô sẹo tái sinh thành cây con cao nhất khi được chuyển vào môi trường MS có bổ sung 0,4 mg/1 BAP và 0,2 mg/l IAA [27]

Năm 2016, Hartini Realista và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống in vitro Đàn hương trắng kết quả cho thấy hạt được nuôi cấy trên môi trường ½

MS + 2 mg/l BAP cho tỷ lệ hạt nảy mầm là 11,67%, trong môi trường WPM bổ sung mg/l NAA cho tỷ lệ nảy mầm của hạt giống là 8,13% [36]

Ở nghiên cứu của Khande và Bhagyashni Prabhakar (2016) cho thấy, mẫu chồi được khử trùng bằng Tween 20 (2%) với thời gian 20 phút và HgCl2 2% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch cao nhất (đạt 81,66%) Môi trường tạo mô sẹo tốt nhất là MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP với tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là 66,67% [20]

1.3.2 Trong nước

Viện Nghiên cứu cây Đàn hương và thực vật quý hiếm (ISAF) đã thử nghiệm một số phương pháp nhân giống Đàn hương trắng từ hạt và tương đối

thành công Tuy nhiên, cho tới nay chưa có một quy trình hướng dẫn nhân giống Đàn hương trắng từ hạt đầy đủ, trong đó còn thiếu các thông tin về phòng trừ sâu bệnh hại giai đoạn vườn ươm và biện pháp kỹ thuật thâm canh cho chất lượng sản phẩm phù hợp với yêu cầu được sử dụng nhiều trong mỹ phẩm, dược phẩm và thực phẩm chức năng Vũ Thoại (2014) đã nghiên cứu phương pháp kích thích hạt cây Đàn hương trắng nảy mầm tự nhiên, tạo ra giống cây đạt tiêu chuẩn theo phương pháp hữu cơ tại Việt Nam [3] Sau gần ba năm triển khai nghiên cứu và hợp tác thử nghiệm với các đối tác công nghệ trong nước và quốc tế, ISAF đã hoàn toàn làm chủ quy trình công nghệ chọn tạo cây giống Đàn hương trắng chất lượng cao và cung cấp cây giống từ hạt cho các tổ chức, lâm hộ tại nhiều tỉnh, thành phố trên cả nước

Nghiên cứu nhân giống in vitro Đàn hương trắng (Santalum album L.)

công bố bởi Khuất Thị Hải Ninh và cộng sự (2022) Kết quả cho thấy với công thức khử trùng hiệu quả nhất để tạo mẫu sạch Đàn hương trắng sử dụng HgCl2 0,1%, trong vòng 4 phút cho 66,67% mẫu sạch nảy chồi hữu hiệu Môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi MS bổ sung 0,2 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin+ 0,15 mg/l NAA + 30 g/l Glucose (với hệ số nhân chồi 17,01 lần và chiều cao chồi 2,72 cm) Môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA là phù hợp để tạo rễ cây Đàn hương trắng cho tỷ lệ chồi tạo rễ cao nhất (71,12%), chiều dài rễ đạt 1,93 cm, chất lượng rễ tốt [2]

Từ các kết quả nghiên cứu tổng quan cho thấy, nghiên cứu nhân

giống in vitro Đàn hương trắng đã được nhiều tác giả ngoài nước thực hiện Tuy nhiên, các nghiên cứu về nhân giống in vitro ở trong nước còn rất hạn

chế, mới tập trung vào nhân giống từ hạt Để chủ động nguồn cây giống trong nước và hạ giá thành cây con thì các nghiên cứu trong nước là rất cần thiết để đáp ứng nhu cầu cây giống lớn Do đó, các nghiên cứu trên đây là

cơ sở để đề tài tiến hành các nội dung nghiên cứu nhân giống in vitro loài

Đàn hương trắng

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đàn hương trắng (Santalum album L.) do Viện nghiên cứu Đàn hương

và thực vật quý hiếm (ISAF) cung cấp để tiến hành đề tài luận văn

2.2 Địa điểm thực hiện

Đề tài tiến hành nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch in vitro cho cây

Đàn hương trắng;

- Nghiên cứu môi trường nhân nhanh in vitro chồi Đàn hương trắng; - Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro cho chồi

Đàn hương trắng;

- Nghiên cứu xác định thời gian huấn luyện và thành phần ruột bầu ra ngôi cây Đàn hương trắng nuôi cấy mô

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Vật liệu nuôi cấy

Các chồi bánh tẻ được lấy từ cây trội 2 năm tuổi đã được trẻ hóa trước thời điểm lấy mẫu khoảng 3 tháng, chồi sinh trưởng tốt, không sâu bệnh tại Viện nghiên cứu Đàn hương và thực vật quý hiếm (ISAF)

2.4.2 Điều kiện bố trí thí nghiệm

- Số giờ chiếu sáng: 12h/ngày

- Cường độ chiếu sáng khoảng: 2000 - 3000 lux - Nhiệt độ phòng nuôi mẫu: 25 ± 2oC

- Các dụng cụ sử dụng và môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở điều kiện nhiệt độ 118oC trong thời gian 20 phút, áp suất 1,2 atm

- Độ pH của môi trường nuôi cấy: 5,8

2.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Đề tài thực hiện các bước nhân giống cho loài Đàn hương trắng có xuất xứ từ Ấn Độ theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ các giai đoạn trong quá trình nhân giống cho Đàn hương trắng

2.4.3.1 Phương pháp khử trùng

Vật liệu ban đầu là các chồi bánh tẻ được lấy từ cây trội 2 - 3 năm tuổi đã được trẻ hóa trước thời điểm lấy mẫu khoảng 3 tháng

Mẫu cấy được cắt bỏ toàn bộ phiến lá, để lại cuống lá, rồi rửa mẫu dưới vòi nước chảy nhẹ Sau đó, lắc mẫu trong nước xà phòng loãng 3 - 4 phút và rửa lại bằng nước sạch Tiếp tục, cho mẫu vào khay (trong khay có nước xà phòng loãng), dùng chổi lông để chải cọ mẫu, sau đó rửa lại mẫu cho sạch dưới vòi nước chảy và tráng lại mẫu bằng nước cất trước khi mang mẫu vào box cấy

Khử trùng mẫu trong box cấy: Đầu tiên mẫu được lắc tráng bằng nước cất vô trùng 2 - 3 lần, mỗi lần lắc tráng khoảng 2 - 3 phút Mẫu cấy được khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút rồi tráng rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 3

lần Sau đó, mẫu tiếp tục được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% 2 lần với thời gian khác nhau Sau khi khử trùng bằng HgCl2 0,1%, mẫu được tráng rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần, sau đó được ngâm trong dung dịch Cefotaxime 400 mg/l trong 15 phút Tráng rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần

Cắt phân chia mẫu thành những đoạn có ít nhất 1 - 2 đốt chứa mắt ngủ, gắp cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy khởi đầu là MS bổ sung 20 g/l đường sucrose + 7 g/l agar

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu phương pháp khử trùng thích hợp cho loài

Đàn hương trắng

Các thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp, 30 mẫu/lặp và các mẫu được quan sát hàng ngày trong tuần Công thức thí nghiệm được bố trí cụ thể ở Bảng 2.1

Thu thập số liệu sau 4 tuần nuôi cấy, với các chỉ tiêu gồm: tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sạch tái sinh chồi

2.4.3.2 Nhân nhanh chồi in vitro

Chồi mới tái sinh từ mẫu sạch ở thí nghiệm trên đủ tiêu chuẩn sẽ được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh chồi có phối hợp giữa các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin và Auxin để xác định môi trường nhân nhanh thích hợp cho đối tượng được nghiên cứu

Thí nghiệm 2: Xác định môi trường nhân nhanh chồi thích hợp cho

loài Đàn hương trắng

Đề tài sử dụng môi trường MS + 10 g/l sucrose + 20 g/l glucose + 7 g/l agar bổ sung phối hợp 3 chất điều hòa sinh trường gồm BAP, Kinetin và NAA ở các nồng độ khác nhau (Bảng 2.2), bố trí 3 lần lặp, 30 mẫu/lặp

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân

nhanh chồi Đàn hương trắng

CTTN Chất điều hòa sinh trưởng(mg/l)

Sau thời gian nuôi cấy 4 - 6 tuần theo dõi, thu thập số liệu theo các chỉ tiêu gồm: số mẫu tạo cụm chồi, số chồi/cụm, số chồi hữu hiệu và chất lượng chồi thu được

2.4.3.3 Ra rễ, huấn luyện và ra ngôi

Là giai đoạn chuyển mẫu nuôi cấy từ môi trường nhân nhanh chồi sang môi trường tạo rễ để có được cây hoàn chỉnh Các chồi đạt tiêu chuẩn sẽ được nuôi cấy trong môi trường ra rễ và được huấn luyện để thích nghi với các điều kiện bên ngoài

Thí nghiệm 3: Xác định môi trường ra rễ thích hợp cho Đàn hương trắng

Các chồi Đàn hương trắng khỏe mạnh, chiều cao từ 2,5 - 3,0 cm thu được từ giai đoạn nhân nhanh được cắt và cấy chuyển sang môi trường tạo rễ Trong giai đoạn này, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ của chồi

Môi trường MS + 7 g/l agar + 20 g/l sucrose, bổ sung IBA kết hợp với NAA ở các nồng độ khác nhau (Bảng 2.3), bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của IBA, NAA đến khả năng ra rễ Đàn hương trắng

Cây sau khi ra rễ trong phòng thí nghiệm được đưa ra ngoài huấn luyện cho thích nghi dần với điều kiện môi trường tự nhiên Thời gian huấn luyện trong khoảng thời gian khác nhau, trong 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày

Cây con sau thời gian huấn luyện được rửa loại bỏ thạch và trồng vào bầu với thành phần ruột gồm 2 đất: 1 cát vàng: 1 mùn hữu cơ Cây sau khi trồng ra bầu được chăm sóc và tưới nước đầy đủ, theo dõi 4 - 6 tuần và tiến hành đánh giá tỷ lệ sống của từng khoảng thời gian huấn luyện

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến tỷ lệ sống và

sinh trưởng của cây con ở vườn ươm

Sau khi cây con được huấn luyện, rửa sạch thạch bằng nước và tiến hành trồng vào bầu có thành phần đất + cát vàng + mùn hữu cơ với các tỷ lệ khác nhau (Bảng 2.4) Sau 4 - 6 tuần, đánh giá tỷ lệ sống của các cây con từ

mỗi công thức thành phần ruột bầu Sau 6 - 10 tuần, đánh giá khả năng sinh trưởng của các cây con từ mỗi công thức thành phần ruột bầu

Bảng 2.4 Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến tỷ lệ sống và sinh

trưởng của cây in vitro ở vườn ươm

Các chỉ tiêu đo đếm trong phòng thí nghiệm:

- Số lượng mẫu sống, số lượng mẫu bật chồi

- Tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi (%) = - Hệ số nhân nhanh chồi (lần) =

- Tỷ lệ chồi ra rễ (%) =

- Số rễ trung bình =

- Tỷ lệ cây sống (%) = x 100

2.5.2 Xử lý số liệu

Trong nghiên cứu này, để kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố thí nghiệm chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích phương sai một nhân tố thông qua phần mềm excel và phần mềm SPSS 20