Đang tải... (xem toàn văn)
Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC Trang 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌ
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH SÁN MÁNG BẰNG REAL-TIME PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm sinh viên thực hiện: NHÓM 6 Niên khóa: 2021 - 2025 TP Thủ Đức, 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH SÁN MÁNG BẰNG REAL-TIME PCR Giáo viên hướng dẫn Nhóm sinh viên báo cáo TS Huỳnh Văn Biết Nguyễn Thị Hà - 21126320 Th.S Trương Quang Toản Võ Uyên Chi - 21126292 Phạm Thị Thúy Nguyên - 21126431 TP Thủ Đức, 10/2023 CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Bệnh sán máng là một bệnh ký sinh trùng do ốc sên gây lo ngại lớn trên toàn thế giới, xảy ra chủ yếu ở Châu Phi, Châu Á và ở mức độ thấp hơn ở Nam Mỹ và Trung Đông Hơn 200 triệu người bị nhiễm bệnh và khoảng 200.000 người có thể chết vì căn bệnh này mỗi năm Trên quy mô toàn cầu, cứ 30 người thì có một người mắc bệnh sán máng Sự di chuyển của người tị nạn, sự di dời của người dân và những sai lầm trong quản lý nước ngọt thúc đẩy sự lây lan của bệnh sán máng Việc chẩn đoán bệnh sán máng tiết niệu và đường ruột hiện nay dựa vào các thủ thuật kính hiển vi (Kato – Kaz) tốn nhiều thời gian, đòi hỏi người thực hiện được đào tạo và độ nhạy kém, đặc biệt khi gánh nặng ký sinh trùng thấp Vì vậy các nhà khoa học suy nghĩ ra các biện pháp thay thế, phương pháp phát hiện các kháng thể đặc hiệu là phương pháp chẩn đoán đang phổ biến hiện nay những cũng có hiệu quả thất vọng trên chủng Schistosoma haematobium Nên việc phát hiện và phát hiện phương pháp chẩn đoán bằng Real-time PCR sẽ là phương pháp đầy hứa hẹn, có tính độ đặc hiệu và độ nhạy cao 1.2 Mục tiêu Đánh giá hiệu quả việc chẩn đoán bệnh sán máng cụ thể là hai chủng Schistosoma haematobium (Sh) và Schistosoma mansoni (Sm) bằng phương pháp Real-time PCR so với phương pháp soi dưới kính hiển vi thông thường và đánh giá mức độ phù hợp lâm sàng của DNA Schistosoma trong huyết thanh để chẩn đoán bệnh đang hoạt động và để theo dõi hiệu quả điều trị 1.3 Nội dung Trình bày tóm tắt về vật liệu, phương pháp về quy trình chẩn đoán bệnh sán máng bằng phương pháp Real-time PCR CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh sán máng Bệnh sán máng là một bệnh kí sinh trùng cấp tính và mãn tính do sán lá thuộc chi Schistosma gây nên Gồm nhiều chủng khác nhau nhưng các chủng gây nên bệnh sán máng ở người là có các chủng theo hai con đường là đường ruột: Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Schistosoma guineensis và S intercalatum và tiết niệu sinh dục: Schistosoma hematobium Nhưng ở bài này quan tâm tới hai chủng là Schistosoma mansoni (Sm) và Schistosoma hematobium (Sh) 2.2 S mansoni và S hematobium 2.2.1 S mansoni S mansoni lây truyền qua đường nước ở người, con trưởng thành sống trong mạch máu (tĩnh mạch mạc treo) gần ruột người Là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh sán máng trên thế giới Hình 1.1 Con S.mansoni cái và đực 2.2.2 S hematobium Phổ biến ở nhiều nước châu Phi, là bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất ở người, chúng lắng đọng trong các mạch máu xung quanh đường tình dục dẫn đến viêm và để lại sẹo – chính là nguyên nhân gây ung thư bàng quang Hình 1.2 S hematobium 2.2.3 Con đường lây nhiễm Lây qua da do bơi hoặc lội ở những vùng nước bẩn, nhiễm vào mạch máu của hệ tiêu hóa hoặc hệ tiết niệu Các triệu chứng cấp tính là viêm da, sau vài tuần sau đó là sôt, ớn lạnh, buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy, khó chịu và đau cơ 2.3 Phương pháp Real-Time PCR 2.3.1 Nguyên liệu Mẫu DNA/RNA: việc lấy mẫu cũng cần đảm bảo lấy đúng vị trí, lấy đủ lượng mẫu cần thiết để đảm bảo kết quả của xét nghiệm qPCR Nguồn mẫu hiện nay rất đa dạng như mẫu máu, mẫu tế bào nuôi cấy, vi khuẩn, huyễn dịch (huyền phù), mẫu quét bề mặt, mẫu dịch phết (y tế), … mỗi loại mẫu sẽ có cách xử lý khác nhau để đảm bảo mẫu đầu vào cho xét nghiệm PCR Mồi Enzyme tổng hợp (DNA polymerase) Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Dung dịch đệm và nồng độ Mg2+ Chất phát huỳnh quang 2.3.2 Nguyên lý hoạt động Real-TiME PCR có ba giai đoạn cơ bản gồm: Giai đoạn biến tính: Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 94-950C, lúc này liên kết hydro giữa các bazơ trong sợi DNA mạch đôi bị phá vỡ, dẫn đến tạo thành 2 sợi đơn DNA Mỗi sợi đơn này trở thành khuôn để tổng hợp mạch mới Thời gian biến tính có thể tăng lên nếu thành phần khuôn có nhiều GC Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-650C trong 20-40 giây để probe và mồi gắn lần lượt vào sợi DNA khuôn và bắt đầu quá trình tổng hợp mạch mới nhờ vào sự hoạt động của DNA polymerase Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 720C, đây là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động tổng hợp mạch mới của DNA polymerase Giai đoạn này không bắt buộc ở một số chu trình qPCR, do kỹ thuật này thường dùng khuếch đại các đoạn có trình tự ngắn hơn PCR, vào khoảng