Ppt tbvktcnsh

Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH SÁNG MÁNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCRGVHD: TS.. Huỳnh Văn BiếtTHIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH SÁNG MÁNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR NHÓM: 6 GVHD: TS Huỳnh Văn Biết 1 THÀNH VIÊN Phạm Thị Thúy Nguyên 21126431 Nguyễn Thị Hà 21126320 Võ Uyên Chi 21126292 2 NỘI DUNG CHÍNH 1 GIỚI THIỆU 2 NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 3 KẾT QUẢ 3 1 GIỚI THIỆU o Bệnh sán máng - bilharzia, do giun sán họ Schistosomatidae gây ra o Trên quy mô toàn cầu, cứ 30 người thì có một người mắc bệnh sán máng o Chẩn đoán bệnh qua việc quan sát trứng bằng kính hiển vi trong phân hoặc nước tiểu o Đã phát triển phương pháp phản PCR để cải thiện khả năng phát hiện trực tiếp Schistosoma 4 1 GIỚI THIỆU o Bệnh lây nhiễm qua da do bơi hoặc lội ở những vùng nước bẩn, nhiễm vào mạch máu của hễ tiêu hóa hoặc hệ tiết niệu o Các triệu chứng cấp tính là viêm da, vài tuần sau đó là sốt, ớn lạnh, buồn nôn, đau bụng tiêu chảy, khó chịu và đau cơ 5 2 NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu • Mẫu DNA/RNA: mẫu phân, nước tiểu, sinh thiết hoặc huyết tương • Mồi • Enzyme tổng hợp (DNA polymerase) • Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) • Dung dịch đệm và nồng độ Mg2+ • Chất phát huỳnh quang 6 2 NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Phương pháp 1 2 3 Tách chiết Kiểm soát Xét nghiệm DNA chiết xuất ức realtime PCR Schistosoma chế 7 Tách chiết DNA Máu và 1ml huyết Tách nước tiểu thanh chiết acid hoặc nucleic 1ml viên Thiết bị MagNA Pure Compact là hệ thống tách nước chiết axit nucleic lâm sàng hoàn toàn tự động tiểu 8 Tách chiết DNA 250mg - 500mg mẫu phân được hòa tan trong 1 mL PBS (- 20°C) 200 μL huyềnL huyền Sử dụng Bộ Thu được DNA phù phân sau chuẩn bị mẫu PCR tinh khiết khi đập hạt cao 9 Kiểm soát chiết xuất, ức chế Thành phần Nồng độ Thiết bị LightCycler 2 được thiết kế cho các ứng dụng chẩn DNA 2,5 µL đoán trong ống nghiệm kết hợp với bộ thuốc thử LightCycler 10X Taq SyBr 3,3 µL Mồi BgO7 0,1 µL Mồi BgO8 0,1 µL MgCl2 4 mM Tổng thể tích 10 µL Quá trình khuếch đại được tiến hành trên thiết bị LightCycler 2 (Roche Diagnostics) trong 40 chu kỳ 15 giây ở 95°C, 10 giây ở 70°C và 20 giây ở 72°C, sau đó là bước đồng nhất 10 Xét nghiệm Realtime PCR Schistosoma Để đạt được độ nhạy phân tích cao, trình tự lặp lại song song 121 bp đóng góp khoảng 12% tổng trình tự bộ gen Schistosoma mansoni đã được chọn làm gen mục tiêu PCR Sơ đồ thể hiện vị trí gắn mồi của mồi và mẫu dò trong trình tự gen 121 bp và gen β-actin cactin của con người 11 Xét nghiệm Realtime PCR Schistosoma Thành phần Nồng độ DNA 3 µL 10X Platinum Taq PCR-Buffer 2 µL MgCl2 (50 µM) 1,5 µL Mỗi dNTP 200 µM Albumin huyết thanh 0,8 µg Mồi SRA1 500 nM Đầu dò SRP 300 nM Taq polymerase 1,25 đơn vị Thiết bị LightCycler 2 Tổng thể tích 20 µL Quá trình khuếch đại được tiến hành trên thiết bị Roche LightCycler 2 bao gồm: 95°C/5 phút , 45 chu kỳ 58°C/30 giây và 95°C/10 giây Huỳnh quang được đo một lần trong mỗi chu kỳ ở cuối đoạn 58° 12 3 KẾT QUẢ • Cải thiện việc phát hiện Schistosoma trong mẫu nước tiểu và phân • Hiệu quả, đáng tin cây hơn • Ở những bệnh nhân có kính hiển vi âm tính, tỷ lệ dương tính với PCR huyết thanh cũng tương đối cao 13 CẢM ƠN THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE 14