文献综述
异种体细胞核移植
1.1.1 体细胞核移植 (SCNT)
体细胞核移植（Somatic Cell nuclear transfer，SCNT），又称体细胞克隆，是将 供体体细胞的细胞核转移到已去核卵母细胞的细胞质中，使体细胞核在卵母细胞中 发生重编程，并发育为新的胚胎，最终发育为动物个体。早在 1962年，约翰格登就 通过实验把蝌蚪已分化体细胞的细胞核移植进入卵母细胞质中，并成功培育出―克隆
青蛙‖，首次证明了可以通过 SCNT 技术从完全分化的体细胞获得完整的克隆动物
（Gurdon，1962 ）。1997 年全球首只克隆哺乳动物―多莉‖羊的诞生（图 1-1）
（Wilmut et al, 1997），掀起了全世界高等动物的研究热潮。Dolly 的诞生证明一个 完全分化成熟的体细胞，还能恢复到早期原始细胞状态，还能像胚胎细胞一样保存 全部遗传信息，推翻了生物学界有关―用成年动物细胞无法培育成胚‖的理论，是生 物技术及其理论的革命。随后，有关克隆动物的报道接连不断。目前，已有 20多种 哺乳动物被成功克隆。
图1-1使用体细胞核移植过程克隆多莉羊 Fig 1-1 Cloning of Dolly the Sheep using the somatic cell nuclear transfer process
近十年来，体细胞克隆技术的进步与发展，结合分子遗传学和基因组学等生物 技术的进步，使科学家们拥有一件新的非常有效的工具，来深入研究重要的生命科 学问题，包括各种疾病的发病机理、动物生长发育的机制等等，并已在生殖性克隆、 治疗性克隆和基础研究等领域中获得了一些应用（Niemann et al，2012）。同时，克 隆技术在生产基因编辑（转基因）动物的发展也越来越快，目前已在动物育种实际 中发挥着其巨大的应用潜力（Thomson and McWhir，2004 ）。尽管如此，克隆效率 的低下仍然是 SCNT 技术发展应用中面临的极大障碍。目前，各种动物的克隆效率 都很低，小鼠的克隆效率（按产生活体动物数量与移植的胚胎数量的百分比来计算， 下同）在 1% 到 2% 左右，奶牛为 5% 到 20%，在其他物种中则大概为 1% 到 5%。 限制克隆技术广泛应用的另一障碍是胚胎及克隆动物的发育异常（Ogura et al， 2013），例如胎盘异常增大、克隆动物的异常肥大、免疫缺陷、呼吸系统缺陷和早 衰等（Loi et al，2016；Ogura et al，2013），尽管这些表型不会传递给后代（Fulka et al，2004；Tamashiro et al，2002；Wakayama et al，2013），但上述异常发育的机 制目前仍为阐明。在过去十年中，克隆技术研究人员在提高克隆效率方面付出了巨 大努力（Meissner and Jaenisch，2006 ），然而，由于缺乏对 SCNT 技术介导的重编 程的表观遗传障碍的理解以及克服这些障碍的关键方法的建立，克隆效率依然十分 低下。随着现代生物技术的进步，特别是单细胞测序等技术的出现，已经能够分析
SCNT 重编程过程中的转录组和表观遗传变化。这些分析揭示了一些分子机制，并
为如何克服这些缺陷提供了线索（Liu et al, 2016; Matoba et al, 2014; Matoba et al, 2018）。事实上，最近中国科学家在克隆猴上的成功（Liu et al，2018 ）很大程度上 归功于这种理解和建立克服表观遗传重编程关键障碍的方法（Cibelli and Gurdon，
2018 ）。因此，未来还需要做更多的工作来揭示阻滞克隆胚胎发育的表观遗传障碍，
从而有效提高 SCNT 效率。
1.1.2 异种体细胞核移植（iSCNT）
在过去的几十年中，由于环境变化和人类对自然资源开发的加剧，导致全球生物多样性显著下降。野生动物如今面临诸多生存上的威胁，包括人类活动导致栖息地的丧失，狩猎、污染对野生动物生育力和繁殖力的影响，以及外来物种的捕食或猎物丧失导致的不良饮食（Holt et al, 2004）。如今，许多动物物种被列为濒危物种。
这意味着这些物种有灭绝或受到威胁的危险，并且很可能在不久的将来成为濒危物 种。体细胞核移植技术作为一种特殊的辅助生殖技术 (ART) 手段，提供了一种可用 于保护濒危物种或具有优良基因型的动物的方法，且已被研究证实可以使一些濒临 灭绝或灭绝的动物复活（Rojas et al，2005 ）。如果由于动物突然死亡，无法完成生 殖繁衍及解冻后精子寿命降低等情况而无法使用其他传统的 ARTs，则可以选择
SCNT 方法。SCNT的成功需要大量重建胚胎的生产和移植，以保证活体动物的诞生。
因为直接从野生动物个体中获取卵母细胞不太现实且非常困难，iSCNT 已发展成为 野生珍稀及濒危动物 SCNT 的替代方法。iSCNT 涉及将一个物种的细胞核或细胞转 移到另一个物种的去核卵母细胞的细胞质中（Jiang et al, 2011），体外激活培养后， 重构胚可以在体外发育到囊胚。
图1-2使用iSCNT方法建立濒危和灭绝动物模型(Rola et al, 2021)
Fig 1-2 Modeling endangered and extinct animals using the iSCNT method
目前，iSCNT 主要应用于帮助拯救濒临灭绝的物种，甚至恢复灭绝后的物种。 iSCNT 技术涉及通过将来自野生哺乳动物的供体细胞的细胞核与来自不同的种、不
同的属、不同的科、不同的目或不同的纲的动物的去核受体卵母细胞融合来重建胚 胎。然后将所得胚胎移植到合适的代孕动物（通常是卵母细胞的供体）的子宫中， 以发育至足月（Beyhan et al，2007；Moro et al，2015a；Moro et al，2015b）。当供 体细胞和受体卵母细胞来自具有相似生殖生理、妊娠期和胎盘的进化关系密切的物 种时，哺乳动物中的 iSCNT 会更有效。理论上，不存在生殖隔离，能自然杂交的物 种更有可能在 iSCNT 实验中表现良好（Lagutina et al，2013）。当核供体细胞和受 体卵母细胞分别来源于具有较远亲缘关系的动物时，如来自不同的门、不同的目、 不同的科、不同的属，iSCNT 的克隆胚胎仅能发育到早期阶段（桑椹胚和囊胚）， 而无法产出活体动物。iSCNT 效率低的原因在于两个方面：1）mtDNA 基因与编码 线粒体蛋白的核基因不相容（mt/基因组 DNA 不相容），2）供体细胞传递的 mtDNA（mtDNA 异质性）可能导致克隆胚胎发育不良。mtDNA 复制、转录和翻译
所需的因子由核 DNA 编码，因此，协调一致的 mt/基因组 DNA 对于胚胎的正常发 育至关重要（Loi et al，2011）。iSCNT 胚胎内的不相容性显著影响到胚胎基因组激
活 (EGA) 时发生的核质事件 (Sansinena et al, 2011)。在 iSCNT 中，供体核和受体细胞来自不同物种，胚胎相关基因的核重编程和重编程过程则面临着更大的生物学挑战（Zuo et al，2017；Loi et al，2011）。为了使 iSCNT 胚胎成功发育到囊胚期及以后，它需要协调 EGA 的供体和受体成分（Beyhan et al，2007）。iSCNT 胚胎的全局转录组分析显示部分 EGA、几个多能基因的阶段特异性表达失败以及母体转录物的降解受损（Wang et al，2009；Wang et al，2011；Zuo et al，2017）可能是导致胚胎发育阻滞的原因。不充分的的转录激活和表观遗传重编程可能会导致 iSCNT 胚胎基因组激活的失败并导致胚胎发育阻滞（Zuo et al，2017）。
近年来 I SCNT 胚胎发育研究的成就
iSCNT 研究几乎是在多莉羊成功克隆后立即进行的。自然杂交的物种更有可能
在 iSCNT 实验中表现良好。这是可以理解的，因为通过自然交配能产生活的杂交后代表明这两个物种之间存在一定的核质相容性（Mastromonaco et al，2007）。通常，当供体和受体细胞来自密切相关的物种时，哺乳动物中的 iSCNT 效率更高。iSCNT
实现的两个主要前提是早期发育事件和机制在哺乳动物中的进化上是保守的，并且 在哺乳动物卵母细胞中调节这些事件的分子能够与来自另一个物种的细胞核相互作 用。然而，这些前提的有效性值得严格审查。尽管大多数哺乳动物胚胎遵循非常相 似的个体发育模式，但在进化上不同的分类群之间确实存在该过程的许多方面的显 著差异（Gilbert and Bolker，2001）。发育事件的时间调控因物种而异，例如细胞周 期进程、胚胎基因组激活 (EGA)、囊胚形成、植入和胚胎发育都存在物种之间的差 异性。iSCNT 研究已根据动物进化分类系统进行了总结，不同的纲间见表 1-1、不 同的目间见表 1-2、不同的科间见表 1-3、不同的属间见表 1-4、不同的种间见表 1-5。
表 1-1 不同纲克隆报告的综合列表 Table 1-1 Comprehensive list of interclass cloning experiments reported donor species Recipient species Stage of development References
Chicken (G gallus) Cow (B taurus) Blastocyst Liu et al, 2004
目前，有研究报道的关于不同纲的 iSCNT 只有一项。由于两个物种之间的进化 关系太远，对 iSCNT 的成功有很大影响（表 1-1）。在鸡-牛 iSCNT 实验中，iSCNT 胚胎发育至囊胚期，但未进行胚胎移植。
表 1-2不同目克隆报告的综合列表 Table 1-2 Comprehensive list of interorder cloning experiments reported
No donor species Recipient species Stage of development References
1 Chicken (G gallus) Cow (B taurus) Blastocyst Liu et al, 2004
2 Rhesus Monkey (M mulatta) Cow (B taurus) Blastocyst Dominko et al, 1999
3 Rat (R norvegicus) Cow (B taurus) 2-cell Dominkoet al, 1999
4 Panda (A melanoleuca) Rabbit (O cuniculus) Blastocyst Chenet al, 2002
5 Human (H sapiens) Cow (B taurus) Blastocyst Changet al, 2003
6 Mouse (M musculus) Cow (B taurus) 8-Cell Arat et al, 2003
7 Human (H sapiens) Rabbit (O cuniculus) Blastocyst Chen et aL, 2003
8 Rhesus Monkey (M mulatta) Rabbit (O cuniculus) Blastocyst Yang et al, 2003
9 Dog (C familiaris) Cow (B taurus) Blastocyst Murakami et al, 2005
10 Ibex (C ibex) Rabbit (O cuniculus) Blastocyst Jiang et al, 2005
11 Domestic cat (F catus) Rabbit (O cuniculus) Blastocyst Wen et al, 2005
No donor species Recipient species Stage of development References
12 Panda (A melanoleuca) Rabbit (O cuniculus) Blastocyst Wen et al, 2005
13 Pig (S sucrofa) Rabbit (O cuniculus) Blastocyst Chen et al, 2006
14 Rabbit (O cuniculus) Pig (S sucrofa) Blastocyst Chenet al, 2006
15 Marbled cat (P marmorata) Rabbit (O cuniculus) Blastocyst Thongphakdee et al, 2006
16 Domestic cat (F catus) Rabbit (O cuniculus) Blastocyst Thongphakdee et al, 2006
17 Human (H sapiens) Cow (B taurus) Blastocyst Illmensee et al, 2006
18 Tibetan antelope (P hodgsonii) Rabbit (O cuniculus) Blastocyst Zhao et al, 2006
19 Camel (Camelus) Rabbit (O cuniculus) Blastocyst Zhao et al, 2006
20 Tiger (P tigris) Pig (S sucrofa) Blastocyst Hashem et al, 2007
21 Human (H sapiens) Cow (B taurus) 16-cell Chunget al, 2009
22 Poodle ( C lupus) Pig (S sucrofa) Blastocyst Sugimura et al, 2009
23 Rhesus Monkey (M mulatta) Cow (B taurus) 16-cell Song et al, 2009
24 Rat (R norvegicus) Pig (S sucrofa) Blastocyst Sugawara et al, 2009
25 Mouse (M musculus) Pig (S sucrofa) 4-cell Amarnath et al, 2011
26 Dog (C familiaris) Pig (S sucrofa) 16-cell Honget al, 2012
27 Rhesus Monkey (M mulatta) Cow (B taurus) Blastocyst Kwon et al, 2016
28 Mouse (M musculus) Pig (S sucrofa) Blastocyst Jiang et al, 2011
29 Rhesus Monkey (M mulatta) Cow (B taurus) 16-cell Wang et al, 2011
30 Cat (F catus) Cow (B taurus) Blastocyst Wittayarat et al, 2017
31 Cynomolgus (M fascicularis) Rabbit (O cuniculus) Blastocyst Yamochi et al, 2013
32 Dog (C familiaris) Cow (B taurus) Blastocyst Kim et al, 2014
33 Dog (C familiaris) Cow (B taurus) Morula Mousai et al, 2015
34 Rhesus Monkey (M mulatta) Pig (S sucrofa) Blastocyst Zhu et al, 2014
35 Raccoon dog (N procyonoides) Pig (S sucrofa) 4-cell Jeon et al, 2016
36 Rhesus Monkey (M mulatta) Cow (B taurus) Blastocyst Kwonet al, 2016
37 Rhesus Monkey (M mulatta) Pig (S sucrofa) Blastocyst Zhu et al, 2017
另一方面，许多研究也报告了当核供体细胞和受体卵母细胞具有非常远的分类 学关系时，仍有 iSCNT 桑椹胚和囊胚的产生，如不同的目间（表 1-2）和不同的科
间（表 1-3）的情况。然而，在这些 iSCNT 研究中效果似乎不佳，且结果不总是可
重复的。此外，由于动物之间的分类关系较远，所有研究均未进行胚胎移植。
表 1-3 不同科克隆报告的综合列表 Table 1-3 Comprehensive list of interfamily cloning experiments reported
No donor species Recipient species Stage of development References
1 Pig (S sucrofa) Cow (B taurus) Blastocyst Dominko et al, 1999
2 Whale (B acutorostrata) Cow (B taurus) 4-cell Ikumi et al, 2004
3 Sei whale (B borealis) Pig (S sucrofa) 4-cell Lee et al, 2009
4 Cow (B taurus) Pig (S sucrofa) 6-cell Lagutinaet al, 2010
5 Pig (S sucrofa) Cow (B taurus) 16-cell Lagutina et al, 2010
不同的属间和不同种间异种克隆胚胎体内外培养发育通常是成功的，有时会产 生后代，而囊胚是最先的发育阶段（表 1-4和 1-5）。不同属和不同种的异种克隆已 有报道进行了胚胎移植，多为不同属，但胚胎未能在母体内发育到最后阶段。然而， 仍有在不同种间关于后代出生的报道。
表 1-4 不同属克隆报告的综合列表 Table 1-4 Comprehensive list of intergenus cloning experiments reported
No donor species Recipient species
1 Takin (B taxicolor) Cow (B taurus) Blastocyst Dominko et al, 1999
2 Buffalo (B bubalis) Cow (B taurus) Blastocyst Kitiyanant et al, 2001
3 Sheep (O aries) Cow (B taurus) Blastocyst Li et al, 2006
4 Leopard cat (P bengalensis) Domestic cat (F catus) Fetus Yin et al, 2006
5 Marbled cat (P marmorata) Domestic cat (F catus) 8-Cell Thongphakdee et al, 2006
6 Sheep (O aries) Cow (B taurus) Blastocyst Huaet al, 2007
7 Tibetan antelope (P hodgsonii) Goat (C hirus) Blastocyst Zhao et al, 2007
8 Goat (C aegagrus) Cow (B taurus) 16-cell Sansinena et al, 2011
9 Buffalo (B bubalis) Cow (B taurus) 8-cell Srirattana et al, 2011
10 Goat (C aegagrus) Cow (B taurus) Blastocyst Kwonget al, 2012
11 Przewalski’s gazelle (P przewalskii) Cow (B taurus) Blastocyst Zuoet al, 2014
12 Bison (B bison) Cattle (B taurus) 16-cell González-Grajales et al, 2015
13 Cheeth (A jubatus) Cat (F silvestris) Blastocyst Moro et al, 2015
14 Cheeth (A jubatus) Cat (F silvestris) Morula Moulavi et al, 2017
15 Buffalo ( B bubalis) Cow (B taurus) Blastocyst Alsalim et al, 2018; 2019
当供体细胞和受体卵质来源于表现出相似生殖生理、妊娠期和胎盘的密切相关 物种时，哺乳动物中的 iSCNT 更有效（Lagutina et al，2013）。事实上，iSCNT 的 结果是产生了 mtDNA/基因组 DNA 杂交体。所有 mtDNA 都来自供体卵母细胞，而 基因组 DNA 来自供体细胞（Lanza et al，2000；Loi et al，2001）。mtDNA 基因与 编码线粒体蛋白的核基因之间的不相容性被认为是 iSCNT 胚胎发育停滞的主要原因 之一（Ogura et al，2012）。此外，可能会出现某种程度的 mtDNA 异质性，因为会 出现相对少量的供体细胞线粒体插入到重建的胚胎中（Beyhan et al，2007；Takeda， 2013）。
表 1-5 不同种克隆报告的综合列表 Table 1-5Comprehensive list of interspecies cloning experiments reported
No donor species Recipient species Stage of development References
1 Gaur (B gaurus) Cow (B taurus) Fetuses Lanza et al, 2000
2 Zebu (B indicus) Cow (B taurus) Offspring Meirelles et al, 2001
3 Muflon (O gmelini) Sheep (O aries) Offspring Loiet al, 2001
4 Wild cat (F silvestris) Domestic cat (F catus) Offspring Gomez et al, 2003; 2004
5 Gaur/Cow hybrid Cow (B taurus) Fetus Dindot et al, 2004
6 Banteng (B javanicus) Cow (B taurus) Blastocyst Sansinena et al, 2005
7 Yak (B grunniens) Cow (B taurus) Blastocyst Murakami et al, 2005
8 Yak (B grunniens) Cow (B taurus) Fetus Li Yet al, 2006; 2007
9 Gray Wolf (C lupus) Dog (C familiaris) Offspring Kim et al, 2007
10 Gaur (B gaurus) Cow (B taurus) Blastocyst Mastromonaco et al, 2007
11 Sand Cat (F margarita) Domestic cat (F catus) Offspring Gomez et al, 2008
12 River buffalo (B bubalis) Swamp buffalo (B bubalis) Offspring Yang et al, 2010
13 Yak (B grunniens) Cow (B taurus) Blastocyst Xiong et al, 2012
14 Gaur (B gaurus) Bovine (B taurus) Offspring Srirattana et al, 2012
15 Gaur (B gaurus) Bovine (B taurus) Blastocyst Imsoonthornruksa et al, 2012
16 Argali (O ammon) Sheep (O aries) Blastocyst Pan et al, 2014
17 Coyotes (C latrans) Dog (C lupus) Offspring Hwang et al, 2013
18 Yak (B grunniens) Cow (B taurus) Blastocyst Xiong et al, 2014
19 Wild Buffalo (B arnee) Buffalo (B bubalis) Blastocyst Priya et al, 2014
影响 I SCNT 克隆效果的因素
核重编程描述了一种细胞的基因表达向另一种不相关细胞类型的转换 (Gurdon and Melton, 2008) 并从分化的、特化的细胞类型转变为发育更原始和多能的状态
(Yamanaka and Blau, 2010)。在核重编程中，不会发生基因组修饰，但会发生表观基 因组的改变（DNA 甲基化、组蛋白修饰），这会刺激和抑制受体卵母细胞中的核重 编程。个体发生从单个细胞，合子开始。早期胚胎的受精卵和每个卵裂球都是全能 的，具有发育成整个生物体的潜力。随着发育的进行，单个卵裂球的发育潜力逐渐 下降，随后产生多能、专能、单能和终末分化的体细胞。然而，体细胞的发育潜力 可以通过 SCNT 恢复到全能阶段或通过直接重编程恢复到多能状态（Mitalipov and Wolf ，2009）。
图1-3SCNT的开发和重编程模型（Mitalipovand Wolf ，2009）
Fig 1-3Development and reprogramming model of SCNT
目前，克隆效率很低（Lagutina et al，2013），克隆胚胎移植后只能达到 1%-6% 的存活后代出生率。原因是由于卵母细胞的细胞质未能通过核重编程恢复已移植的 供体细胞核的全能状态。克隆胚胎体外体内培养发育的失败表明在移植前后甚至出 生后的表观遗传失调和基因表达异常。这问题发生在 SCNT 胚胎和 iSCNT 胚胎上。 1.3.1.1 受体卵质核移植中的供体核重塑
要使 iSCNT 成功，研究认为必须将供体细胞核重塑为类似于受精卵的细胞核， 而在中期停滞的卵母细胞的细胞质可以促进这种重塑。这种染色质结构的变化，这 里称为核重塑，被认为会导致经历转录的基因模式发生变化，这里称为核重编程。 之所以区分核重塑和重编程，是因为重塑是 DNA 的物理重新包装，而重编程是这 些结构变化的结果。为了响应基因活性的变化以及细胞分裂过程中结构和功能需求 的变化，核结构在间期被重塑。在 iSCNT 中，移植的核的核重塑可能在 iSCNT 胚 胎的后续发育中起重要作用。2007 年，在白肢野牛-牛 iSCNT 中，检测到两个不同 种的物种之间存在一定的核-细胞质不相容性，囊胚发育不良伴有发育迟缓，细胞数 量减少，以及异常的凋亡和相关基因表达下降，所有与线粒体功能相关的细胞过程 中断的迹象在这研究中已观察到（Mastromonaco et al，2007）。当供体和受体细胞 来自密切相关的物种时，哺乳动物的 iSCNT 效率更高。不同的种 iSCNT 产生了郊
狼 (Canis latrans) – 狗 (Canis lupus familiaris) 的健康后代 (Hwang et al, 2013)。 2012 年，一个高卢牛后代诞生了（Srirattana et al，2012）。另一方面，许多研究报告了 当核供体细胞和受体卵母细胞具有非常远的分类学关系时会产生 iSCNT 桑椹胚和囊 胚，例如恒河猴（Macaca mulata）-牛的情况（Kwon et al， 2011)、人-羊 (Hosseini et al, 2012)、人-山羊 (Sha et al, 2009)、鼠-猪 (Jiang Y et al, 2011) 或狗-猪 (Jeon et al,
2016), 恒河猴 – 牛 (Kwon et al, 2016), 恒河猴 – 猪 (Zhu et al, 2017), 老鼠 – 兔 (Huang et al, 2017), 猫牛 (Wittayarat et al, 2013)、犬-猪 (Pan et al, 2014)、犬-猪 (Kim et al,
2018) 组。在黑猩猩-牛 iSCNT 实验中，黑猩猩细胞核仅部分重塑，克隆胚胎未发育
超过 8 至 16 个细胞阶段（Wang et al，2009）。
1.3.1.2 胚胎基因组激活
核移植胚胎，无论供体核来源如何，通常都会发育到由受体卵母细胞决定并受 母体控制的母体-胚胎转变 (MET) 的物种特异性阶段。成功的胚胎基因组激活 (EGA) 的制备完全取决于受体卵母细胞正确阻断供体细胞 DNA 转录和相应 mRNA 翻译的 能力。使用具有高水平成熟促进因子 (MPF) 的中期 II (MII) 卵母细胞会导致染色质 过早凝结 (PCC)，从而保证在核转移到受体卵质后供体细胞基因组转录沉默。胚胎 基因组 (EGA) 的全局激活是早期哺乳动物胚胎发育中最关键的步骤之一，被认为是 iSCNT 胚胎发育发生阻滞的关键时期。在早期胚胎发生过程中，细胞核和细胞质之
间的交流决定了胚胎发育关键步骤如 EGA 的成功与否。在 iSCNT 中，情况更加复 杂，因为供体细胞核和受体细胞质来自不同的物种。因此，在 MET 期间，承载一个 物种遗传信息的胚胎核的激活在很大程度上取决于受体细胞质中蛋白质和转录物的 库存（来自另一个物种）（Schultz, 1993，Minami et al, 2007）。基因转录的启动涉 及许多因素，其中一个因素的缺失或物种不相容会阻碍随后的转录（Heix et al,
1997）。目前，很少有关于 iSCNT 胚胎 EGA 之前和当时的胚胎基因功能的数据。
2011 年，iSCNT 恒河猴-牛，分析了恒河猴-牛 iSCNT 8 至 16 细胞胚胎的 EGA 相关 转录组，剖析了胚胎基因激活、体细胞基因沉默和母体 RNA 降解、核基因组等方面 的重编程过程在 iSCNT 胚胎中未完全激活，母体 RNA 降解似乎在 iSCNT 胚胎中受 损（Wang et al，2011）。2014 年，克隆胚胎的转录微阵列分析表明，牛-牛 SCNT 胚胎中重编程相关基因的上调显着高于在黄羊-牛 iSCNT 胚胎中观察到的水平 (1527:643) (Zuo et al, 2014) 。在猴-牛 iSCNT研究中，研究结果还表明，EGA过程中 核仁成分蛋白的异常表达和解体导致核仁结构异常，从而导致猴-牛 iSCNT 胚胎的 发育率降低（Song et al，2009）。
1.3.1.3 组蛋白甲基化
组蛋白甲基化是将甲基转移到构成核小体的组蛋白氨基酸的过程，DNA 双螺旋围绕这些氨基酸形成染色体。组蛋白的甲基化可以增加或减少基因的转录，这取决于组蛋白中的哪些氨基酸被甲基化，以及连接了多少甲基。削弱组蛋白尾和 DNA 之间化学吸引力的甲基化事件增加了转录，因为它们使 DNA 从核小体中解开，从而转录因子蛋白和 RNA 聚合酶可以接触到 DNA。这个过程对于基因表达的调节至
关重要，它允许不同的细胞表达不同的基因。DNA 甲基化和组蛋白修饰是主要的表 观遗传修饰。翻译后乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化和磷酸化可发生在组蛋白尾部 的氨基酸残基上，从而改变其化学结构。这些组蛋白修饰是―组蛋白密码‖的一部分， 通过影响染色质凝聚状态，调节基因转录（图 1-4）。组蛋白修饰可以激活或抑制： 组蛋白 H3 和 H4 的乙酰化与活跃的转录有关，而去乙酰化会压缩染色质并使其不易 被转录共激活因子接触。组蛋白甲基化可根据靶残基发挥激活或沉默作用。促进染 色质压缩或松弛的特定组蛋白甲基化：H3K4me1、H3K79me3、H3K36me3 和 H4K3 打开染色质并激活基因转录； H4K20me1、H3K9me3 和 H3K27me3 使基因转录沉默。
图 1-4促进染色质压缩或松弛的特定组蛋白修饰（ Audano et al, 2014 ）
Fig 1-4 Specific histone modifications that promote chromatin compaction or relaxation
在 SCNT 中，已确定组蛋白甲基化在 SCNT 胚胎发育中起重要作用。许多作者
通过对 iSCNT 胚胎的实验也确定了组蛋白甲基化在 iSCNT 胚胎发育中的作用。
2009年，在黑猩猩 – 牛 iSCNT克隆胚胎体外培养中，iSCNT 胚胎的发育没有超过 8
到 16 -细胞阶段，监测 H3K27 甲基化并确定 H3K7me3 在同种和异种 SCNT 胚胎中 相似，表明 H3K27me3 的变化可能共享与牛胚胎中的 EGA 事件密切相关（Takeda，
2013）。组蛋白赖氨酸甲基化 - 供体细胞基因组的组蛋白 H3 赖氨酸 9 二/三甲基化 (H3K9me2/3) 作为 SCNT 有效重编程的主要表观遗传屏障。2017 年，经 TSA 处理的 iSCNT 猫 牛 胚 胎 的 H3K9me2 显 着 高 于 未 经 TSA 处 理 的 iSCNT 猫 牛 胚 胎
（Wittayarat et al，2017）。2018 年，组蛋白甲基转移酶抑制剂 - BIX 01294 的治疗，
增加了 Oct4 和 CDX2 的表达水平，显着降低了 5-甲基胞嘧啶和 H3K9me2 的水平， 但不增强 iSCNT 水牛-牛胚胎的发育能力（Alsalim et al，2018）。然而，用 BIX-
01294 （组蛋白甲基转移酶抑制剂）处理并没有增强 iSCNT 胚胎的发育能力，但可
能对表观遗传构成和衍生囊胚的质量有一些有益的影响。因此，异常的表观遗传重 编程被认为是 iSCNT 克隆胚胎体外内发育失败的主要原因，其主要受表观遗传机制 的调节，包括组蛋白甲基化和组蛋白尾部修饰。
1.3.1.4 组蛋白乙酰化
克隆猛犸象
根据对猛犸象化石的形态学研究，猛犸象（mammoth）是已灭绝的象，属于长毛象属（Mammuthus）的一个物种。按照更新世猛犸象的演化, 猛犸象分类如下（从最早到最新）M meridionalis（南方猛犸象）、M trogontherii（草原猛犸象）和 M columbi（哥伦比亚猛犸象）和 M primigenius（长毛猛犸象）。在其中，长毛猛犸象（M primigenius）是大约 80 万年前最后一个冰河时代末期生活在东亚的最著名的猛犸象物种（Chang et al, 2017）。在最后一个冰河时代，猛犸象很好地适应了寒冷的环境。它被毛皮覆盖，外层覆盖着长长的护毛。长毛猛犸象是今天象的绝种近亲。长毛猛犸象的大小与现代非洲象大致相同。大多数猛犸象种群在更新世晚期和全新世（Pleistocene）中期已灭绝了（Murchie et al, 2021）。长毛猛犸象生活在最后一个冰河时代，当天气变暖和食物供应发生变化时，它们可能已经死亡。它们是象科的成员，该科还包含现代象的两个属及其祖先。研究人员从古代 DNA 中独立组装了猛犸象的线粒体基因组图谱，这使他们能够确认猛犸象和亚洲象 (Elephas
21 maximus) 之间的密切进化关系（Gross， 2006；Cooper， 2006）。2015 年的 DNA 评估证实，亚洲象是猛犸象的近亲（图片1-9）。在西伯利亚永久冻土中发现的这种 物种的尸体相对丰富，有时还保存完好，这为猛犸象的结构和习性提供了很多信息。 科学证据表明，在 10,500 至 7,600 年前，北美可能还存在少量猛犸象。对 2015 年发 现的牙齿化石的检查表明，弗兰格尔岛上存在着一小群猛犸象，位于俄罗斯北部海 岸外的北极岛屿，直到 4,300 年前，才因近亲繁殖和遗传多样性丧失而灭绝。从动 物身上发现的最古老的 DNA 正在为猛犸象，可以追溯到 100 万年前。这些发现强 调了深度古基因组学在扩大我们对物种形成和长期适应性进化的理解方面的潜力
（van der Valk et al, 2021）。
图 1-9猛犸象的科学分类(Shoshani et al, 2007) Fig 1-9 Scientific classification of Wolly Mammoth
1.4.2 猛犸象的复活—伟大的梦想
科学家声称，复活已灭绝的动物，如猛犸象，很可能在几年内实现（Shapiro, 2015）。尽管这些巨型野兽已经灭绝了数千年，但在冰封的北极荒野中发现了数十 具保存完好的尸体。保存完好的软组织残骸和长毛猛犸象 DNA 的存在导致了这种 物种可以通过科学手段复活的想法。2009 年的研究表结果明可以从猛犸象组织中分 离出细胞核（Kato et al，2009 ）。借助新的生殖生物学和基因组工程技术，来自日 本、俄罗斯和韩国的一组科学家宣布他们计划从其冷冻细胞中克隆长毛象。与大约
在 6500 万年前消失的恐龙不同，它们的遗骸仅以化石的形式存在，猛犸象的遗骸可 能仍然保留着可用的组织样本。然而，事实证明，找到保存完好且基因未受损的组 织是一项真正的挑战，这就是为什么过去克隆猛犸象的尝试经常失败的原因。
图 1-10日本科学家计划复活猛犸象
Fig 1-10 The plan of Japanese scientists to resurrecting the mammoth
科学家已经提出了几种方法来实现复活已灭绝的猛犸象。克隆将涉及去除雌性 象卵细胞中含有 DNA 的细胞核，并用猛犸象组织中的细胞核进行替换（Yamagata et al，2019 ）(图 1-10)。然后重构胚会被刺激分裂，并重新移植到一头雌性象体内。
由此产生的小象将具有猛犸象的基因，尽管它的胎儿环境会有所不同。然而由于保 存条件，大多数完整的猛犸象几乎没有可用的活的细胞。
第二种方法是用冷冻的猛犸象尸体上的精子细胞对象卵细胞进行人工授精 (Shapiro, 2015)。由此产生的后代将是象-猛犸象的杂交种，并且必须重复该过程，以 便更多的杂交种可以用于繁殖。经过几代杂交将产生几乎纯羊毛猛犸象。在一个案 例中，一头亚洲象和一头非洲象生产了一头名为 Motty 的活小象，但它在不到两周 大时就因缺陷而死亡。现代哺乳动物的精子细胞在深度冷冻后最多可以存活 15 年， 这一事实使得这种方法不可行（Shapiro, 2015）。
图 1-11用亚洲象创造杂交猛犸象 Fig 1-11 Creating a hybrid woolly mammoth by Asian elephant
最近，有研究正在尝试用基因编辑技术使猛犸象基因逐渐取代象细胞中的基因
（Palkopoulou et al，2015）。到 2015 年，使用新的 CRISPR DNA 编辑技术，由 George Church 领导的一个团队将一些猛犸象基因编辑到亚洲象的基因组中。他们最初专注于耐寒性，目标基因是外耳大小、皮下脂肪、血红蛋白和头发属性（Shapiro，2015）。如果有任何方法成功，建议将杂交种引入西伯利亚的一个名为更新世公园的野生动物保护区（Zimov，2005 ）。在合成生物学和人工细胞时代（Hammer and
Kamat，2012），这在技术上可能是可行的，但肯定会使任务复杂化。从核重编程 的角度来看，这可能是改进猛犸象基因组的非凡可能性。人类实际上可以使用卵母 细胞的重编程机制赋予新 DNA 结构兼容性，从而实现完全重编程，从而实现正常 发育。
成功复活猛犸象的克隆方法中，最关键的因素之一是卵母细胞的来源。早已消 失的猛犸象有活生的亲戚是象，尤其是亚洲物种。因此，我们可以使用亚洲象卵母 细胞作为猛犸象细胞核的受体。这确实是最好的选择，虽然不是一条没有问题的成 功之路。迄今为止，还没有关于象采集卵母细胞的报道。在野生动物资源保护中， 已经报道了在其他巨型食草动物（例如犀牛）中进行诱导发情和获取卵母细胞的尝 试（Hermes et al，2009 ），因此有充分的理由相信，在象中的计划，至少是卵母细 胞的获得并非不可克服。象的大小和卵巢的位置使这样的过程在技术上具有挑战性， 但并非不可能。象只有一个成熟卵母细胞，很少有两个卵母细胞在每个发情周期结 束时成熟并排卵。每年只有三到四个周期（在没有怀孕的情况下），每头雌性象可 以为猛犸象克隆项目―捐赠‖的卵母细胞数量非常有限（Hildebrandt et al，2011）。如 果需要数千个卵母细胞，则必须对数百头象进行重复的卵母细胞收集程序。为这些 程序找到如此大量的雌象是一项不可能完成的任务。全世界动物园和马戏团圈养象 的数量（亚洲和非洲的总和）在 1,500–2,000 只，其中包括了公母和所有年龄组的象
（Saragusty，2012 ）。因此，另一种方法是寻找不同的动物卵母细胞来源。
猪卵母细胞的选择
如上所述，从象以外的动物身上寻找卵母细胞的来源将是恢复已灭绝动物（如猛犸象）的一个可行选择。我们课题组多年来一直致力于猪的基因编辑和 SCNT，并取得了许多成功的成果。猪卵母细胞也很容易从当地屠宰场收集，然后转移到实验室进行猪卵母细胞体外培养以供下一步研究（Wei et al, 2013）。每天采集和培养的猪卵母细胞数量可达 5000-6000 个，保证了需要大量卵母细胞的 SCNT和 iSCNT研究。此外，每天可以进行的克隆细胞数量为 2000 到 3000 个胚胎。因此，在该研究中，我们进行探索使用象供体核和猪卵母细胞受体细胞进行了 iSCNT 实验。通过这项研究，我们想评估猪卵母细胞的细胞质在体外和体内条件下支持象核重编程的能力。
研究使用猪卵母细胞作为受体来重建狗（Lagutina et al，2011；Sugimura et al， 2012）、牛（Lagutina et al，2011；Gupta et al，2013）、小鼠（Lagutina et al， 2011；Gupta et al，2013 年）、大鼠（Sugawara et al，2009 年）、鸡（Gupta et al，
2013 年）和鲸鱼 iSCNT 胚胎（Lee et al，2009 年）等等。事实上，据推测，猪卵母 细胞可用作通用受体，因为它具有高去甲基化能力，能够支持多个物种的核仁形成 和随后的早期胚胎发育（Lagutina et al，2011）。猪卵母细胞 (Lagutina et al, 2011) 能够支持许多物种的细胞核中的核仁形成，包括在 4 到 8 个细胞阶段具有非常接近 EGA 的马、兔、犬和猫 (Grondahl and Hyttel，1996；Hoffert et al，1997；Kanka， 2003；Maddox-Hyttel et al，2005），并且，有趣的是，即使在一些具有八细胞阶段 EGA 的羊核中（Crosby et al，1988）也能支持核仁的形成。在马和兔的细胞核中发 现了最密集的核仁素标记的核仁。放线菌素 D 测试证实了马 - 猪 iSCNT 胚胎中 rDNA 的活性 RNA Pol I 转录的存在（Lagutina et al，2011）。这些具有活性 RNA
Pol I 的胚胎中没有一个能够克服 4 到 8 个细胞阶段的发育障碍，这证实了 EGA 的
部分和异常特征。然而，2009 年报道了犬-猪 iSCNT 的发育（Sugimura et al， 2009）。
猪体外获得的卵母细胞/胚胎的发育能力明显低于体内产生的，这反映了猪体外受精胚胎的培养条件欠佳（Hyun et al, 2003）。对猪的研究为培养条件对体外胚胎发育的不利影响提供了很好的例子。因此，将猪体外受精培养条件引入 iSCNT 胚胎立即对该技术提出了挑战。猪 IVP 系统（IVM 或 IVC）存在许多问题，尽管做出了努力，但该物种的 IVC 条件尚未完全优化(Yoshioka et al, 2003; Ozawa et al, 2006; Redel et al, 2016)。出于这个原因，与来自其他物种的 SCNT 胚胎相比，猪 SCNT 胚胎通常早在一个细胞阶段就被转移到输卵管。尽管如此，使用体内或体外成熟卵母细胞的猪 SCNT 胚胎的发育率一直很低（Onishi et al, 2000; Betthauser et al, 2000）。为了提高猪 IVP，已经为该物种开发了几种培养基，包括 NCSU-23 和 NCSU-37 培养基（Im et al，2004；Petters et al，1993）、BECM-3 培养基（Im et al， 2004；Dobrinsky et al，1996），以及 PZM-3、PZM-4 和 PZM-5 培养基（Im et al，2004；Yoshioka et al，2002）。在这项研究中，我们在体外使用 PZM3 培养基培养 iSCNT 胚胎，将 iSCNT 胚胎在体内 1-2 细胞阶段转移到代孕母猪的输卵管中。
胚胎的体外生产
体外胚胎生产 (IVP) 通常可与体外受精的通用术语互换，被称为在实验室或体 外产生胚胎的过程（Hasler and Barfield，2014 ）。IVP 是一种更灵活的程序，它允 许从屠宰场材料和通过卵泡抽吸从活体供体收集的卵母细胞中产生胚胎。因此，这 一过程可以为发育生物学和生理学的基础研究提供极好的低成本胚胎来源。IVP 最 初是作为一种研究工具开发的，并被用于拯救被屠宰的供体的卵泡卵母细胞。然而， 随着科学技术的发展，IVP 被用于核移植、转基因动物生产和干细胞研究等新兴生 物技术的应用。因此，用于体外生长 (IVG) 的腔前卵泡培养不仅具有产生大量同质 卵母细胞用于 IVP 的潜力，而且还具有研究生长和排卵的生理过程的潜力。
胚胎 IVP和相关生物技术的成功开发和应用取决于一系列基本方案，包括卵母 细胞的体外成熟（IVM）、体细胞核移植（SCNT）和克隆胚胎体外培养（IVC）， 这是三个主要的 IVP 的步骤。IVP 的一个重要先决条件是卵母细胞。卵母细胞可以 从立即死亡（屠宰场来源的卵巢）或活体动物（通过阴道滤泡抽吸）中获得。这些 来源中的每一个都有优点和缺点，需要针对相关研究进行评估。
来自屠宰场的卵巢的卵母细胞是一种极好的材料来源，不受动物福利限制，并
为 IVP 提供更多的卵母细胞。此外，卵母细胞的稀缺性使得灭绝物种和濒危物种的 IVP 对 iSCNT 具有挑战性（Fernandez-Gonzalez et al，2015），因此来自死后或恢复 期动物的卵巢是卵母细胞和雌性遗传物质的宝贵来源（Silva et al , 2004)。在猪 IVP
中 ， 屠 宰 场 衍 生 的 卵 巢 被 广 泛 使 用 ， 因 为 它 们 是 可 靠 且 廉 价 的 卵 母 细 胞 来 源
（Kobayashi et al，2012）。然而，使用这种卵母细胞来源也有缺点。例如，供卵细胞的身份和健康状况通常是未知的，并且当来自不同个体的卵巢相互接触时，存在交叉污染的可能性（Hansen，2007）。此外，收集的卵母细胞不成熟，需要体外成熟，不支持高囊胚率。研究人员已经确定，体外成熟卵母细胞发育成囊胚的潜力低于体内成熟卵母细胞（Kikuchi et al，1999；Dang-Nguyen et al，2011）。1989 年首次成功地从体外成熟和体外受精的卵母细胞中成功生产仔猪，但仅在最近十年才证明猪体外生产的囊胚可以发育至足月。尽管已经取得了很大进展，但与其他物种相比，目前的体外受精系统仍然存在体外生产胚胎率低和质量差的问题。这种技术的
低效率可能是由于几个因素，包括雄性原核形成的发生率降低、多精症的高发生率 和胚胎培养的次优条件。
1.6.1 卵母细胞的体外成熟
在 SCNT 技术中，需要将卵母细胞用作受体细胞质。大多数受体卵母细胞在体 外成熟或来源于体内。前两篇报道使用体内成熟的猪卵母细胞进行 SCNT 成功应用 并产生了克隆的仔猪（Onishi et al, 2000; Polejaeva et al, 2000）。同时，使用来自屠 宰场卵巢的体外成熟卵母细胞也有克隆小猪的出生（Betthauser et al，2000）。体外
成熟 (IVM) 对应于从窦卵泡收集的未成熟卵母细胞的培养 (Chang et al, 2014)。IVM 步骤被认为是在实验室生产胚胎的最关键步骤之一（Mermillod, 2011）。IVM 的目 标是引导从当地屠宰场收集的卵巢中获得的卵母细胞进入中期 II (M-II) 阶段并为 IVF 做好准备，因为它们在细胞核和细胞质方面都不成熟。为此，卵母细胞需要在 核和细胞质状态方面成熟。而卵母细胞的核成熟可以通过简单的核染色方法来评估， 例如乙酰紫红素或 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)，细胞质成熟只能由卵母细胞的谷 胱甘肽 (GSH) 含量间接决定，或者IVF 和体外培养 (IVC) 后形成的百分比或细胞数 量和囊胚的比例。
各种基础培养基类型已用于猪卵母细胞的成熟，包括北卡罗来纳州立大学 (NCSU) (Petters and Wells, 1993)、改良组织培养基 (TCM)-199 和改良的含有乳酸和 丙酮酸的 Tyrode 培养基 (TLP) （Yoshioka et al，2008 ）。这些培养基通常含有胎牛
血清 (FCS) 或猪卵泡液 (porcine follicular fluid, pFF)。通常将 pFF 添加到猪卵母细胞 的成熟培养基中，通过更高水平的自由基清除活性来保护卵母细胞免受氧化应激， 从而增强受精后细胞质成熟的发育能力。添加 pFF 的成熟培养基可以增强猪的成熟 发育能力。卵泡内在因素可能在支持卵母细胞成熟过程中发挥重要作用（Schoevers et al，2003；Algriany et al，2004）。然而，pFF 可能被病毒病原体的许多不确定因 素污染（Kim and Dubovi，2003 年）。除了 FCS 和 pFF，IVM 培养基中还添加了其 他补充剂，以帮助卵母细胞在核和细胞质成熟方面为受精做好准备，这将在下面讨 论。然而，添加 FCS 或 pFF 会引入许多未知因素来调节猪卵母细胞的成熟过程。一
份 报 告 显 示 ， 无 血 清 IVM 培 养 基 还 可 以 支 持 猪 卵 母 细 胞 成 熟 并 发 育 成 囊 胚
（Yoshioka et al，2008）。无血清 IVM 培养基将有助于确定最佳培养条件。
将猪 COC 置于 38.5ºC、6% CO2 和 100% 湿度的培养箱中持续培养，它们会 在这里停留 42 到 44 小时（Kikuchi，2004，Wei et al，2013）。卵母细胞成熟需要 卵丘细胞的存在（Ju and Rui，2012 ），因为卵母细胞和卵丘细胞之间的细胞间通讯 对于获得发育能力很重要（Kidder and Vanderhyden，2010）。出于这个原因，为 IVM 优先选择的是由多层致密卵丘细胞包围的卵母细胞。在培养过程中，卵丘细胞 的扩张是卵母细胞成熟的明显标志（Mermillod ，2011），并被用作体外成熟卵母细 胞发育能力的预测因子（Appeltant et al，2015）。卵母细胞成熟涉及将非进展卵母 细胞转化为能够承受受精和胚胎发育事件的卵母细胞的细胞变化（Romar et al， 2019）。
体外卵母细胞成熟仍然是哺乳动物 IVP 的限制因素（Banwell and Thompson，
2008）。在我们实验室，使用 IVM 的卵母细胞后约约有 20-30% 成为囊胚（Wei et al, 2013）。体外成熟卵母细胞到囊胚期的体外发育潜能普遍低于体内成熟卵母细胞
（Alcoba et al, 2015），这可能与蛋在体外和体内成熟白质合成和皮质重排的差异有 关粒（Kere et al，2020）。多年来，对几个物种的研究一直致力于通过研究不同的 培养基系统来提高卵母细胞体外成熟的成功率，以努力提高受精后卵母细胞的发育 能力。
1.6.2 体细胞核移植技术
亚洲象成纤维细胞系的建立及卵母细胞的体外成熟培养
实验材料
2.1.1 实验仪器及耗材
仪器设备名称 品牌、型号 产地
超净工作台 AIRTECH SW-CJ-1F 中国苏州
细菌恒温培养箱 DHP-9052 中国上海
CO 2 培养箱 Thermo Forma 370 美国
微量进样器 Eppendorf 德国
超微量分光光度计 Thermo Nanodrop one 美国
高速离心机 Thermo 21R 美国
化学发光仪 BIO-RAD Universal HoodII 美国
恒温水浴锅 DK–8D 型 中国上海
超低温冰箱 Hair 中国青岛 pH计 Sartorius PB-10 德国
三气培养箱 ASTEC 日本
荧光显微镜 OLYMPUS U-HGLGPS 日本
显微操作系统 OLYMPUS ON2 日本
分析型流式细胞仪 Beckmen couler 德国
高压灭菌锅 PHCbi MLS-3781L 日本
体式显微镜 SZX7 日本
细胞电转染仪 Lonza 4D-Nucleofector 德国
细胞培养瓶 NEST T25 T75 中国无锡
细胞培养皿 Corning 100mm 60mm 35mm 美国
滤器 Milli-Q 0.2àm 0.45àm 美国
离心管，枪头，试管，量筒，烧杯，广口瓶及其他耗材，购自昆明中云美，施恩，巨成实验器公司。
2.1.2 主要实验材料和试剂
（1）DMEM高糖培养基购自Thermo Fisher Scientific公司；
（2）胎牛血清购自上海天蔚钧生物科技有限公司；
（3）氨苄青霉素购自上海生工公司；
（4）Trizol购自Thermo Fisher Scientific公司；
（5）BCA试剂购自上海碧云天公司；
（6）二抗（Rabbit/Mouse）购自Abcam公司；
（7）TCM199培养基购自Thermo Fisher Scientific公司；
（8）C1052 细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒自上海碧云天生物技术有限公司。 2.1.3 常用溶液配制
（1） TrisãCl（1mol/L，pH8.0）： 121.14g TrisãCl 溶于 800mL 双蒸水中，用盐酸
调节 pH 值至 8.0，定容至 1L, 高压灭菌；
（2） EDTA（0.5mol/L，pH8.0）： 186.1g EDTA 溶于 800mL 双蒸水中，用
NaOH 调节 pH值至 8.0，定容至 1L，高压灭菌；
（3） SDS（10% ）： SDS 100g 溶于 900mL 双蒸水中，加热至 68℃ 助溶，定容
（4） NaAc （3mol/L，pH5.2）： NaAcã3H 2 O 408.1g 溶于 800mL 双蒸水中，用冰
乙酸调pH 值至 5.2，定容至 1L，高压灭菌；
（5） TE 缓冲液（pH8.0）：在灭菌水中加入 TrisãCl（pH8.0）、EDTA（pH8.0） 保存液，使其终浓度为 10mmol/L 和 1.0mmol/L，高压灭菌，分装后 -20℃ 保存；
（6）抗生素：氨苄青霉素 100mg/mL（溶于灭菌水），过滤灭菌，-20℃ 贮存；
（7） 4%多聚甲醛：称取 40g 多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入 500～800mL
0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffe，PB），加热至 60℃左右，持续搅拌（或磁力
搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许 1N NaOH 才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000mL，充分混匀。
（8） NaCl（1mol/L）：14.61g NaCl溶于 200mL 双蒸水中，定容至 250mL，高压 灭菌；
（9） LB 培养基：蛋白胨 10g，酵母粉 5g，NaCl 10g，琼脂 15g（固体培养基），
溶于850mL 去离子水后，用 5mol/L NaOH 调 pH 至 7.0，定容至 1L，在 1.034×10 5 Pa 高压下蒸汽灭菌 20min，室温保存；
（10） CaCl 2 （1mol/L）：14.7g CaCl 2 ã2H 2 O 溶于 60mL 水中，定容至100mL，过 滤除菌，每份 10mL 分装后 -20℃ 保存。制备感受态时取出一份稀释至 100mL，过滤 除菌，预冷备用；
（11）甘油（50%）： 50mL 甘油加 50mL 水，水浴助溶；
（12） NaOH（4mol/L）： 80.0g NaOH 溶于 400mL 水中，定容至 500mL；
（13）胎牛血清：解冻后分装储于-20℃ 备用；
（14）蛋 白酶 K： 100mg 蛋 白 酶 K，1.19g 乙 酸 钙 ，250μL 1mol/L TrisãCl
（pH8.0），溶于5mL 灭菌水中，过滤除菌，每份 400μL 分装，-20℃ 保存；
（15） DMEM（高糖, GIBCO）溶液：将 DMEM 粉末溶于 900 mL超纯水中，再 按产品说明要求加3.7g/L的 NaHCO 3 , 再另外添加3.57g/L HEPES，66mg/mL青霉素钠
和100mg/L 的硫酸链霉素，调 pH 至 7.2–7.4，然后定容至 1 L。0.22àm 滤膜过滤除菌， 分装后储于 4℃ 备用。使用前添加 10%–20% 的 FBS，构成细胞完全培养基；
（16）无抗生素DMEM：配制时不加入青霉素及链霉素，其余同（15）；
（17）细胞培养基（10% FBS）：10 mL的FBS加入到90 mL的DMEM中，放在 4℃保存备用；
（18） DPBS 液：取 9.55 g DPBS 粉末溶于 900mL 超纯水中，调PH 至 7.2–7.4， 然后定容至 1 L，0.22àm 滤膜过滤除菌，分装后储于 4℃ 备用；
（19）胰蛋白酶细胞传代消化液（0.1%，w/v）：取 0.1 g 胰蛋白酶，0.02 g EDTA, 用上述 DPBS 定容至 100 mL，然后用 0.22àm 滤膜过滤除菌，分装后储于 -20℃ 备用；
（20） KCl 低渗溶液（0.075mol/L）：取 5.592 g KCl 适量蒸馏水溶解后，定容至
（21）丙酮酸钠：10 mL TCM199中加入 0.1 g丙酮酸钠，溶解后 0.22àm 滤膜过 滤除菌，100μL 每管分装。
（22）嘌呤霉素：取嘌呤霉素粉末0.050 g，加 10 mL 无菌 HEPES溶液溶解。
（23）细胞裂解液：加入母液 TrisãCl （pH8.0）、EDTA（pH8.0）、SDS、NaCl， 使其终浓度分别为 10mmol/L、0.05mol/L、0.5%（w/v）、0.1mol/L，室温保存；
（24）冲卵液（TALP）：添加有 100mg/mL 卡那霉素和 0.11mmol/L 丙酮酸的 HEPES-TALP。
（25） NCSU–23 培养基：先取 300mL 超纯水，再按顺序加入 3.178g NaCl， 1.053g NaHCO 3 ， 0.178g KC1 ， 0.081g KH 2 PO 4 ， 0.147g MgSO 4 ã7H 2 O ， 0.125g CaC1 2 ã2H 2 O，0.5g D–葡萄糖，0.073g 谷氨酰胺，0.438g 牛磺酸，0.273g 亚牛磺酸， 0.033g 青霉素，0.025g 链霉素。调 pH 为 7.2– 7.4 后用超纯水定容至 500 mL，使渗透
压为 295–310 mOsm，用于卵母细胞体外成熟基础培养基或者胚胎培养基。0.22àm 滤 器过滤分装，放于 4℃ 保存，2–3 周内用完；
（26）成熟培养基： TCM199+10% pFF+10IU/mL hCG+1 IU/mLPMSG + 0.0001 mg/mL L–半胱氨酸+ 0.0001 mg/mL丙酮酸钠+10ng/mLEGF；
（27）透明质酸酶：取 50mL TALP，称取 100 mg/mL 透明质酸酶，缓慢搅拌，使 之溶解并用 TALP 定容至 100mL，0.20àm 针头滤器在超净台内过滤，分装到 1.5 mL 离心管（Eppendorf 管）内，- 20℃ 保存备用。用前 39℃ 预温；
（28） PMSG （100×）：生理盐水配制，工作浓度为 1IU/mL；
（29） hCG （100×）：生理盐水配制，工作浓度为 1IU/mL；
（30） EGF （1000×）：生理盐水配制，工作浓度为 10ng/mL；
（31） 激 活 液 ：0.25mol/L D-山 梨 醇 ， 添 加 0.01mmol/L Ca（C 2 H 3 O 2 ） 2 、 0.05mmol/L Mg（C 2 H 3 O 2 ） 2 、0.1mg/mLBSA，0.22àm 滤膜过滤除菌，分装后储于 4℃ 备用，用前 39℃ 预温；
（32）细胞松弛素 B（Cytochalasin B， CB）：加 2.5 mL DMSO 溶解 5mg 的 CB，分装到 1.5 mL 离心管，每管 0.1 mL；
实验方法
2.2.1 象耳和脐带组织的采集
先后从西双版纳傣族自治州景洪市曼听公园采集到 1头 6岁亚洲母象的耳缘组织 昆明市圆通山动物园采集 1头新生亚洲公象的脐带组织和 1头死后 16小时 4岁亚洲母 象的耳尖组织。
2.2.2 象耳和脐带组织的成纤维细胞原代培养
将采集新鲜的亚洲象耳组织（3 cm 2 ）/脐带组织（3 cm）置于含 5%青-链霉素溶 液（PS）的 DMEM培养基中，并置于碎冰上立即带回实验室。在实验室预先刮去耳组 织表面的皮肤及污垢，再在超净工作台中用无菌手术刀片充分刮去耳组织及脐带组织 表面的污垢，用含 5%PS的无菌 PBS溶液反复清洗 10次以上，转移至无菌的 PBS溶 液中清洗 6次，去除组织表面残留的双抗，在组织上滴加 500àL左右的 0.1% IV型胶 原蛋白酶（Sigma，Cat No: C5138），用眼科弯剪充分将组织剪碎，将组织匀浆转移
至12.5cm 2 的培养瓶中，加入 2 mL 0.1% IV型胶原蛋白酶充分混匀，置于5%CO 2、38℃ 二氧化碳培养箱中消化约4h，并适时摇晃培养瓶使之充分消化。用 10mL含2%FBS的 DMEM 培养基将消化后的组织-细胞混合液充分重悬，转移至 15mL 离心管中，
1200rpm室温离心 3min，去除上清液，在沉淀中加入 10mL含 2%FBS的 DMEM培养
基重悬反复离心3次，收集组织-细胞沉淀。加入 3mL含10%FBS、1%PS的DMEM细 胞完全培养基重悬组织-细胞沉淀，转移至加有 10mL 细胞完全培养基的 10cm 培养皿 中，置于 5%CO 2、38℃二氧化碳培养箱中进行原代培养，适时观察并拍照记录细胞的 生长状态。
2.2.3 象耳和脐带组织的成纤维细胞传代培养
成纤维细胞增值至接近汇合时，去除培养液，用 PBS冲洗 3遍，向培养皿内加入1mL 0.25% 胰蛋白酶。38℃消化1 min后，立即加入9 mL DMEM（含 2% FBS）终止消化。轻轻吹打使细胞脱落转移至 15mL 的离心管，1200rpm 室温离心 3min，去除上清液。按 5.0×10 4 个/mL的密度传代培养，观察成纤维细胞贴壁和生长情况。
2.2.4 象耳和脐带组织的成纤维细胞冻存
按 上 述 方 法 消 化 细 胞 后 将 细 胞 悬 液 离 心 ， 去 除 上 清 液 。 然 后 用 冻 存 液
（DMEM:FBS:DMSO=7:2:1）重悬细胞，并控制细胞密度约为 1×10 6 个/mL，将悬液
以 0.5 mL/管分装于冻存管中。将冻存管放入细胞程序冷冻盒，依次放置于 4℃冰箱
20min，-79℃超低温冰箱 12-24 h。最后将冻存的细胞置于液氮中长期保存。
2.2.5 象耳和脐带组织的成纤维细胞复苏
将细胞冻存管从液氮中取出后置于 38℃恒温水浴锅中，不停的搅动使其在 1min 内解冻，加入 1mL 的培养液悬浮细胞，转移至 1.5mL 离心管中，1200rpm 室温离心
3min，去除上清液。加入 0.5mL含 10%FBS的 DMEM细胞完全培养基重悬细胞沉淀，
转移至加有 3mL 细胞完全培养基的 6cm培养皿中，置于 5%CO 2、38℃二氧化碳培养箱 中进行培养，适时观察并拍照记录细胞的生长状态。
2.2.6 象耳成纤维细胞生长曲线的绘制
向24 孔培养板每孔内接种 1mL 密度约为 1.0x 104 个/mL的细胞，从接种之日算起，
每隔24h 计数 3个孔内的细胞密度，算出平均值，连续测定8d，绘制细胞生长曲线。
2.2.7 成纤维细胞周期检测
按 2.2.3 的消化方法消化贴壁细胞，用 9mL含 2%FBS的 DMEM培养基将消化后
的细胞重悬，转移至 15mL 离心管中，1500rpm 室温离心 3min，小心去除上清液，可 以残留约 50àL 左右的培养液以避免吸走细胞。加入约 1mL 冰浴预冷的 PBS，重悬细 胞，并转移到 1.5mL离心管内，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约 50àL
左右的 PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
加入1mL冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定 30 min或更长时间。1500rpm
离心 5min，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约 50àL 左右的 70%乙醇，以避免吸
走细胞。加入约 1mL 冰浴预冷的 PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50àL左右的 PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。每管细胞样品中加入 0.5mL 碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光孵育 30min。用流式细胞分析仪在激发波长 488nm 波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞 DNA含量分析和光散射分析。
2.2.8 亚洲象孤雌胚胎体外培养发育
2.2.8.1 亚洲象卵巢收集
一头二岁母亚洲象在中国云南省西双版纳曼亭御花园死亡。死亡 16 小时后使用 干净的刀以卫生的方式收获象子宫和卵巢。然后将它们放入装有 Dulbecco 磷酸盐缓冲
盐 水 （Dulbeccos 的 PBS） 的保 温 瓶中 ，并补 充 有 lml/L 庆 大 霉 素 （Dulbecco 的
PBS+）。Dulbecco 的 PBS 通过将其放在无菌瓶中在 39°C 的培养箱中过夜进行预热。
象子宫和卵巢被带回中国西南生物多样性中心。
2.2.8.2 亚洲象卵母细胞体外培养
象卵巢带回实验室后，利用刀切法，我们从象的 2个卵巢中收集卵丘-卵母细胞复 合体（Cumulus-oocyte complex，COCs）。COCs 采用微滴培养法体外成熟培养，成熟 培养液提前4h左右配制，放入 5%CO 2，38.5℃的 CO 2培养箱中平衡。将 COCs先用成 熟培养液洗 3次，每 200μL微滴中放入 50个 COCs后置入 5% CO 2，38.5℃的 CO 2培 养箱中进行体外成熟培养。培养48h后将卵母细胞用含有0.1mg/mL透明质酸酶的溶液 去除包裹在卵母细胞外围的卵丘细胞，挑取卵周隙明显、卵细胞膜完整、胞质均匀且 排出第一极体的成熟卵母细胞用于下一步实验。
2.2.8.3 亚洲象成熟卵母细胞孤雌激活与培养
象 COCs 体外成熟培养 48h 后剥离卵丘细胞后的象卵母细胞，挑出成熟卵母细胞，成熟卵母细胞移入覆盖石蜡油并平衡 2h 以上的预处理液中处理 0.5-1h。将象卵母细胞在激活液中清洗 3 遍，然后在 150V/mm 脉冲电压，脉冲时程为 100às，脉冲次数为 1次的电激活参数下进行电激活。分别用洗卵液 TALP和含 5μg/mL CB的 PZM3清洗，清洗完后移入含2.2μL/mL CB的PZM3中，再放入5%CO 2 、5%O 2 、90%N2、38.5℃的三气培养箱中平衡 2h，再将象孤雌移入预平衡 2h的 PZM3中清洗，每 30枚一组放入50μL覆盖石蜡油的PZM3微滴中培养。
结果分析
2.3.1 亚洲象成纤维细胞的建立
我们从三种不同组织来源（AE00：活耳组织；AE01：脐带组织；AE02：死耳组
织）进行建立成纤维细胞系。利用胰蛋白酶消化方法，进行原代培养。结果显示在图
2-1 和图 2-2。在培养过程中，我们进行观察成纤维细胞的发展，显示成纤维细胞来自
耳组织生长时间较短对于成纤维细胞来自脐带组织。在六天培养后耳组织成纤维细胞
已达到80%汇合，但脐带组织成纤维细胞培养到 10天后生长达到80%汇合。
图2-1 亚洲象（AE01，♂）脐带成纤维细胞系的建立
Fig 2-1 Establishment of Asian elephant (AE01, ♂) umbilical cord fibroblast cell line
图 2-2 亚洲象（AE02，♀）耳组织成纤维细胞系的建立 Fig 2-2 Establishment of Asian Elephant (AE02, ♀) Ear Tissue Fibroblast Cell Line
2.3.2 象供体细胞培养形态
我们成功地从亚洲象的耳组织中建立了成纤维细胞系。象耳组织经胶原蛋白酶分 离培养 2 h 后，在显微镜下观察可见到只有少数细胞贴壁，大多数细胞单个悬浮在培 养液中，此时贴壁的细胞仍呈圆形，尚未伸展。每天在倒置显微镜下以低倍率监测培 养物，以观察外植体脱落和外植体周围原代细胞的整体径向迁移。一天培养后观察， 细胞开始在培养皿下贴壁并，细胞形状逐渐伸长。两天培养后观察，细胞形态变得梭 形或扁平星形，即典型的成纤维细胞形态。当细胞生长至近 80%汇合时，细胞呈放射 状走势。象成纤维细胞培养 7 天后，在显微镜下我们进行观察细胞培养的形态。结果
显示在图 2-3 A和 B 原代培养后，培养板中出现细胞呈明显的纺锤形，相差显微镜下
拍照（图 2-3A）。成纤维细胞附着在培养板上生长。通过我们观察象成纤维细胞培养
的过程中显示细胞生长速度较快，生长达到80%汇合度的时间较短。
图2-3亚洲象成纤维细胞培养的形态 Fig 2-3 Morphology of Asian Elephant Fibroblast Cultures 2.3.3 象成纤维细胞周期的检测
细胞周期可作为检测细胞增殖状态的重要指标。在本研究中，通过流式细胞仪分 别检测猪胎儿成纤维细胞（PFF）、活体亚洲象耳组织建系成纤维细胞（AE00）、初 生亚洲象脐带建系成纤维细胞（AE01）及死亡亚洲象耳组织建系成纤维细胞（AE02） 的细胞周期分布情况，结果显示，与猪成纤维细胞类似，三种不同建系类型的亚洲象 成纤维细胞均存在 G0/G1、S、G2/M 期三个细胞分裂周期（图 2-4 A），处于 G0/G1
期 、 S 期 细 胞 占 比 由 高 到 低 依 次 为 AE02(97.7% 、 0.19%)>AE01(76.9% 、 5.07%)>AE00(48.7%、7.49%),处 于 G2/M 期 细 胞 占 比 由 高 到 低 依 次 为 AE00
（40.0%）>AE01(17.8%)>AE02(2.12%)（图2-4A和B）,表明通过活体亚洲象耳组织建 系的成纤维细胞增殖速度较快。
图 2-4通过 PI 染色进行细胞周期检测。 A 象成纤维细胞的流式细胞术；B.细胞周期阶 段的定量测量。PI：碘化丙啶； PFF：猪胎儿成纤维细胞； AE00：活耳组织； AE01：
脐带组织； AE02：死耳组织。
Fig 2-4 Cell cycle analysis by PI staining A Flow cytometry of elephant fibroblasts; B Quantitative measurement of cell cycle stages.PI: propidium iodide; PFF：Porcine fetus fibroblast cell; AE00: Living ear tissue; AE01: Umbilical cord tissue; AE02: Dead ear tissue. 2.3.4 生长曲线
我们进行评估象皮肤成纤维细胞在冷冻和恢复前的活力。结果显示在成长曲线
（图 2-5）。象成纤维细胞的生长曲线均呈典型的“S”型。从象成纤维细胞的活力来看 看，1~8 天象成纤维细胞活力较强，8 天之后，成纤维细胞活力不断减弱。从生长曲线 看，1~6 天，带向成纤维细胞的密度不断增加，生长情况基本相似。6 天后，细胞处于 衰亡期，象成纤维细胞的密度降低。
图2- 5象成纤维细胞的生长 Fig 2-5 Growth of elephant fibroblast cells 2.3.5 象成纤维细胞直径
成纤维细胞的直径可能会影响 iSCNT 技术的效果。因此，我们进行对比象成纤维 细胞和猪成纤维细胞的直径。象成纤维细胞消化后（图 2-6A）和猪成纤维细胞消化后
（图 2-6B）使用系列显微图象处理软件（NIS-Elements）进行测量细胞的直径。结果
讨论
亚洲象也是濒危物种，因此亚洲象成纤维细胞的成功建立和培养对于珍稀遗传资 源的保存也具有一定的意义。除了提供方便的组织取样外，耳朵还是分离成纤维细胞 的理想组织，具有出色的细胞数量和质量（Mestre-Citrinovitz et al，2016）。在我们的 研究中，象皮肤成纤维细胞的体外培养显示出非常快速的生长，在显微镜下观察表明 成纤维细胞的形态是正常的，没有异常的问题。在社会经济的快速发展中，人类对生 态环境的影响越来越大，当代生物多样性保护问题是由全世界各种动物种群和物种的 减少和灭绝决定的，成为科学家们的一项重大挑战（Cooke, 2008）。本土动物是宝贵的 遗传资源库，因为它们具有潜在的抵抗力和对不利生物条件的适应能力。因此，保护 和可持续利用生物多样性的战略愿景是经济和社会的可持续发展。动物指定的原生区 域、种群规模和畜群数量的减少是在不久的将来本土动物灭绝的强制性危险的主要指
标（Bahmani et al, 2011）。应尽可能保护濒危品种的原生基因，以增加体细胞克隆在灭
绝后繁殖这些品种的机会。因此，濒危动物的保护已成为一个紧迫的问题。目前，随 着科学技术的发展，许多濒临灭绝的动物物种受到关注，并成功地建立了濒临灭绝的 动物成纤维细胞系，作为保护生物多样性的一种方式，例如伊朗马霍兹山羊（capra hircus）（Elyasi Gorji et al, 2021），美洲虎（Mestre-Citrinovitz et al，2016），中国麂
（Muntiacus reevesi）（Wang et al, 2020）等。此外，还出现了体外保存策略，根据基因
组/基因库对动物遗传资源进行冷冻保存，以期在未来管理遗传多样性的交换或再生特
定种群（Elyasi Gorji et al, 2021）。动物遗传资源的主要体外保存方法集中在配子、胚
胎和体细胞以及睾丸和卵巢组织的冷冻保存。我们采用的胰蛋白酶消化培养法分离原代细胞，相比其他的方法可以获得更多均一的原代细胞，并且缩短了原代细胞培养的时间。
我们从不同组织成功建立了活体亚洲象耳组织成纤维细胞系、死亡亚洲象耳组织 成纤维细胞系及初生亚洲象脐带组织成纤维细胞系。成纤维细胞系培养技术已成为生 物学、医学研究和应用中广泛使用的方法（Sharma et al，2018）。建立成纤维细胞的原 代培养使研究人员能够获得具有大部分原始特征和功能的代表性细胞，这是进一步进 行细胞生物学和细胞工程的重要基础。为了获得适合克隆的核质体，它们的类型和年 龄以及所使用的操作技术对于它们未来的重编程很重要（Kim et al，2007）。可以从新 鲜或冷冻保存的体细胞组织 (Folch et al, 2009, Pan et al, 2014)、成人 (Moulavi et al,
2017) 或胎儿 (Liu et al, 2018) 中获得核体，以及体内或验尸（Pereira et al，2014 ）。虽 然这些细胞的恢复不是一项艰巨的任务，但它们的处理和保存直到用于 iSCNT 需要注 意（Pereira et al，2014 ）。一般来说，皮肤细胞是核体最常用的细胞类型（Song et al，
2007）。正如在野生水牛 (Bubalus arnee) 中所观察到的，皮肤上有大量的细胞，这些细
胞在克隆方面可能具有不同的效率，检测到该物种的成纤维细胞比上皮细胞更容易重 新编程（Saini et al， 2015）。
冷冻保存后，亚洲象皮肤成纤维细胞恢复，评估细胞系的生长情况。象成纤维细 胞的生长曲线均为典型的―S‖形。我们建立了亚洲成纤维细胞系，旨在将来通过体细胞 核移植技术在异种克隆实验中使用这些细胞。2020 年，世界自然保护联盟红色名录中
（The IUCN Red List），所有评估的哺乳动物物种中有四分之一处于危险之中。除了传 统的保护工作外，细胞培养技术的应用已 成为保护这些物种的新工具（Ryder and Onuma，2018 ）。通过这种方法，可以将濒危动物的耳组织分离出来，在培养物中培养 成成纤维细胞，用于细胞系的建立和细胞的冷冻。细胞系的建立已被广泛用于保护物
种 和 生 态 系 统 的 多 样 性 ； 保 存 许 多 稀 有 和 濒 危 动 物 的 遗 传 物 质 ， 例 如 灰 短 角 鹿
（Mazama gouazoubira）（Magalhães et al, 2017），阿拉伯骆驼 (Camelus dromedarius)
（Saadeldin et al，2019），苏门答腊犀（Dicerorhinus sumatrensis）（Jenuit et al, 2021） 等。这些体细胞将成为未来生物学研究的来源（León-Quinto et al, 2009; Saadeldin et al,
2019）。与上皮细胞相比，成纤维细胞同时生长；尽管如此，成纤维细胞可以更容易地 通过胰蛋白酶消化粘附和分离（Saadeldin et al，2019）。此外，有必要验证这些细胞在
培养 (Guan et al, 2010) 和冷冻保存 (Magalhães et al, 2017) 期间可能发生的变化。象成纤维细胞的生长曲线都是典型的―S‖形。复苏后，从 1~6 天，带向成纤维细胞的密度不断增加，6 天后细胞处于衰亡期，象成纤维细胞的密度降低。其他研究人员也发现了类似
的生长曲线（Li et al，2009; Bai et al, 2012; Mehrabani et al, 2014）。总而言之，克隆技 术使体细胞成为保存动物遗传材料的有吸引力的资源，随着动物克隆技术的进一步发 展，建立体细胞库对于濒危物种的恢复极为重要（Makina et al, 2014）。
此外，象孤雌胚胎体外培养发育的结果不理想，主要原因是由于卵母细胞的质量。
象-猪异种克隆胚胎的鉴定及体外内发育研究
实验材料
3.1.1 主要实验仪器
仪器设备名称 品牌、型号 产地
超净工作台 AIRTECH SW-CJ-1F 中国苏州
PCR仪 ABI proflex 美国
荧光定量PCR仪 BIO-RAD CFX96 美国
恒温水浴锅 DK–8D 型 中国上海
超低温冰箱 Hair 中国青岛
三气培养箱 ASTEC 日本
荧光显微镜 OLYMPUS U-HGLGPS 日本
显微操作系统 OLYMPUS ON2 日本
拉针仪 SUTTER:P-97 美国
断针仪 MF-900 日本
高压灭菌锅 PHCbi MLS-3781L 日本
融合仪 LF201 日本
体式热台 WL-01 中国
体式显微镜 SZX7 日本
细胞电转染仪 Lonza 4D-Nucleofector 德国
细胞培养瓶 NEST T25 T75 中国无锡
细胞培养皿 Corning 100mm 60mm 35mm 美国
3.1.2 主要实验材料和试剂
（1）猪卵巢：取自昆明呈贡屠宰场；
（2）受体母猪：云南农业大学实验动物中心后备、经产母猪；
（3） DMEM高糖培养基：购自Thermo Fisher公司；
（4）滇南小耳猪胎儿成纤维细胞系：33dDN161229-03（本实验室保存）；
（5）胎牛血清：购自上海天蔚钧生物科技有限公司；
（6）高保真PCR Taq酶：购自南京诺维赞公司；
（7） 2×Flash PCR MasterMix：购自康为公司；
（8） RNAse溶液：购自天根生物技术有限公司；
（9）凝胶回收试剂盒：购自天根生物技术有限公司；
（10）无内毒素质粒 DNA 大量提取试剂盒：购自 QIAGEN；
（11）无钙镁PBS 缓冲液：购自Thermo Fisher 公司；
（12） Western 一抗、二抗稀释液：购自上海碧云天公司；
（13） Trizol：购自Thermo Fisher公司；
（14） TCM199 培养基：购自Thermo Fisher公司
3.1.3 常用溶液配制
（1）Taq酶：TaKaRa，大连，中国；RNAse溶液：天根生物技术有限公司，北京， 中国；RNA 酶：Merck 公司，德国；PCR 产物纯化试剂盒：AP-PCR-50，Axygen，纽
约 ， 美 国 ；NEBuffer2 ：NEB, Massachusetts， 美 国 ；T7ENI ：M0302 L，NEB, Massachusetts,美国; pMD19 T 载体：Takara, 大连，中国；
（2）Tris-HCl（1M，pH8.0）：称取 121.14g Tris-HCl 溶于 800mL 去离子水中，
调节pH值至8.0，定容后高压灭菌。
（3）EDTA（0.5M，pH8.0）：先称 186.1g EDTA加入 800mL纯水中均匀混匀，
然后用NaOH调节pH值至8.0，最后定容至 1L，高压灭菌后 4℃保存使用。
（4）NaAc（3M，pH5.2）：先称 NaAcã3H 2 O 408.1g加入 800mL纯水中均匀混匀， 用冰乙酸调pH值至5.2，定容至 1L，高压灭菌 4℃保存使用。
（5） 高 糖 培 养 基 （DMEM） 溶 液 ： 购 自 GIBCO ， 使 用 前 用 0.22μm 滤 膜
（Millipore）过滤除菌，分装后储于4℃备用，使用前添加 10%的 FBS。
（6）胰蛋白酶细胞消化液（0.25%，w/v）：取0.25g Trypsin、0.04g EDTA，加入
PBS（10×，GiBCO）10mL，定容至 100mL，然后用 0.22μm滤膜过滤除菌，分装后储
（7）胶原酶Ⅳ：取0.1g collagenase、1mL双抗、20mL FBS，加入79 mL DMEM 中，然后用0.22μm滤膜（Millipore）过滤除菌，现用现配。
（8）成熟培养液：成熟培养液用 TCM-199-PVA，使用时添加 0.1mg/mL Pyruvic Acid、0.1mg/mL L-半胱氨酸盐酸、10%（v/v）pFF、10ng/mL EGF；
实验所用寡聚核苷酸引物（表 3-1）均由昆明硕擎生物科技有限公司合成，使用浓
表3-1实验所涉及引物信息 Table 3-1 Primers information
Nucleotide position of the genome PCR product
采用Primer5设计引物、Spss等软件对所得数据进行统计分析。
象-猪异种克隆胚胎构建、胚胎移植及胎儿获得
3.2.1 猪卵母细胞体外培养
将屠宰场获取的废弃的猪卵巢保存在含 35℃生理盐水的保温瓶中，尽快送回实验
室，用含 100IU/mL青链霉素的 37℃生理盐水洗 3遍，去掉血污。用 20G针头的注射
器从卵巢表面抽取直径 2-8mm的卵泡，抽取液放入 15mL尖底离心管中，置于 37℃水浴锅保温，待卵细胞沉淀后，用洗卵液洗涤 2 次，显微镜下挑取卵丘包裹 3 层以上、
致密、 胞质 均匀 的 A、B 级 的卵 丘-卵母 细胞复 合体 （Cumulus-oocyte complex，
COCs）。COCs 采用微滴培养法体外成熟培养，成熟培养液提前 4h 左右配制，放入
5%CO2，38.5℃的 CO2培养箱中平衡。将 A、B级 COCs先用成熟培养液洗 3次，每
200μL微滴中放入50个 COCs后置入 5% CO2，38.5℃的 CO2培养箱中进行体外成熟
培养。培养 42-44h 后将卵母细胞用含有 0.1mg/mL 透明质酸酶的溶液去除包裹在卵母 细胞外围的卵丘细胞，挑取卵周隙明显、卵细胞膜完整、胞质均匀且排出第一极体的 成熟卵母细胞用于下一步体细胞核移植实验。
图3-1 猪卵母细胞体外成熟培养
Fig 3-1 In vitro maturation culture of porcine oocytes 3.2.2 成熟卵母细胞的去核及体细胞核移植
挑出具有第一极体的成熟卵母细胞后，分批挑选 80-100枚成熟卵母细胞移入覆盖 石蜡油并平衡2h以上的预处理液中处理0.5-1h，转入 7.5 àg/mL CB的PZM3去核操作 液中。用内径 15-20 àm注射针拨动卵母细胞，使卵母细胞的第一极体位于时钟的 4点 钟方向，用固定针吸持卵母细胞，注射针沿 3 点和 4 点钟之间方向刺入卵母细胞，将 极体周围十分之一左右的胞质连同极体一同吸除。将去核卵母细胞移入TALP中清洗4 遍移入 PZM3培养基中。所有卵母细胞去核完成后再分批挑选 80-100枚已去核的卵母 细胞在卵母细胞操作液中平衡 30-60s 移入卵母细胞操作液中。用极细的灭菌玻璃吸管
将提前 10min 消化好的体细胞移入体细胞操作液中，用注射针吸取直径 15-20àm 表面
光滑的体细胞，用固定针吸持、固定好卵母细胞，轻轻转动油压泵将注射针里面的供 体细胞慢慢推到针口，然后将注射针从原刺入口刺入卵母细胞，在远离刺入口的卵周 隙内推出供体细胞，移出注射针，并轻轻按压供体细胞上方的透明带，使供体细胞与 卵母细胞膜紧贴，然后依照同样的方法逐一导入体细胞，获得重构胚胎。
3.2.3 重构胚融合与激活
构建好的重构胚胎转移到 PZM3 + 4 mg/mL BSA 中，在 38.5℃，5%CO2，100% 湿度培养箱中恢复 0.5-1 h。将每批约 50 枚重构胚胎移入融合液（不含 Ca2+的
Zimmerman融合液）中清洗 3 遍，25V/mm 脉冲电压，脉冲时程为 20às，脉冲次数为
1 次的电融合参数下进行重构胚的电融合处理。融合后移入 PZM3 培养基中培养 2h， 2h后将重构胚胎在激活液中清洗 3遍，然后在 150V/mm脉冲电压，脉冲时程为 100às， 脉冲次数为1次的电激活参数下进行电激活。分别用洗卵液TALP和含5μg/mL CB的 PZM3 清洗，清洗完后移入含 2.2μL/mL CB 的 PZM3 中，再放入 5%CO2、5%O2、
90%N2、38.5℃的三气培养箱中平衡 2h，再将重构胚胎移入预平衡 2h的 PZM3中清洗，
每30枚一组放入50μL覆盖石蜡油的PZM3微滴中培养。
亚洲象-猪异种克隆胚胎体外培养 48h后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，自然发情第 1或第 2d的后备母猪用作受体（以出现压背静立反射为发情的当天），移植方法为手术法输卵管深部移植，每头受体移植约 900 枚胚胎以上。手术前一天晚上停喂饲料，手术时，静脉注射丙泊酚（0.2mL/kg）麻醉，受体母猪表现为肌肉松弛、意识消失时将其固定在手术架上，先用温水冲洗手术部位再用碘酒消毒，盖上创布并露出手术部位。手术人员用手术刀在猪腹中线或侧腹部表皮切开一个 5-10cm 的切口，再切开皮下肌肉，之后用刀柄划开肌肉下的脂肪和腹膜，用手探入腹腔找到子宫，轻轻将卵巢拉出腹腔，观察卵巢上的卵泡状态和排卵状况，若没有排卵迹象，停止移植。若即将排卵或已排，随即将重构胚胎吸入胚胎移植管内，从输卵管伞部进入 5cm 左右注入胚胎，另一侧采用同样的方法移植，移植时每侧输卵管移植的重构胚胎数量相近。整个过程用消毒纱布吸去血液，并用 37℃生理盐水保温保湿，移植后缝合切口。手术后将受体母猪单独饲养，注意观察和护理。
象-猪异种克隆体外培养胚胎鉴定
3.3.1 异种克隆胚胎样品采集级处理
构建亚洲象-猪异种克隆胚胎，在体外进行培养，观察胚胎发育时期、卵裂率、囊 胚形成率、囊胚细胞数；并在 2细胞、4 细胞、8细胞、桑椹胚、囊胚阶段采集每个体 外发育的阶段50个胚胎。2细胞构建异种克隆胚胎在48 h培养中提取，在72 h到96 h 体外培养中提取4细胞和 8细胞的胚胎，在 7d体外培养，进行观察，统计，提取象-猪 异种克隆体外培养的囊胚。异种克隆体外培养胚胎从培养液中取出来，在 PBS 中清洗
3遍，每个胚胎单独放入1.5mL的裂解液进行提取DNA。
图3-2 异种克隆胚胎的收集
Fig 3-2 Collection of iSCNT embryo 3.3.2 异种克隆胚胎的分子鉴定
异种克隆胚胎样品收集后，加入 5 àL 无菌水和 5 àL 50 mM NaOH，样品先在室温 下孵育 15 min。然后将样品在 95°C 下孵育 10 min。最后，通过添加 2.5 àL 1M Tris-HCl
(pH 8.0) 中和样品，并将其用作 PCR 模板。使用PCR对5~500pg DNA进行基因分型。
在 10 àL 反应体积中扩增每个 PCR 片段，其中包含 2 àL 裂解处理的基因组 DNA、1ì
KOD FX 缓冲液、4 mM dNTP、0.3 μL 的 10 μM 正向和反向引物（表3-1）和 0.2 单位
的 KOD FX DNA 聚合酶。每个 PCR 反应都涉及在 94°C 下 2 min的初始变性； 98°
C 10 s、65°C (-0.5°C /cycle) 30 s和68°C 30 s 10个循环； 98°C 10 秒，60°C 30
秒和 68°C 30 秒40 个循环。将PCR 产物进行3% 琼脂糖凝胶电泳，然后通过成像系
统显示目的条带。
象-猪异种克隆胎儿鉴定
3.4.1 胎儿采集胎儿形态学观察，测量及处理
亚洲象-猪异种克隆胚胎移植后 17 天进行提取胎儿，以防止核酸及蛋白质降解。 倒置显微镜下观察象-猪胎儿和猪-猪胎儿（滇南小型猪）的形态，用 NISelements D 软 件测量胎冠臀长（CRL）和宽度。胎儿取出后立即置于冰上剪成约 0.5cm 2 大小进行分 装，用于提取 DNA 的样品各取 3 管，-80℃冻存。病变或疑似病变组织浸泡在福尔马 林溶液中。各样品做好详细记录。
3.4.2 胎儿 DNA 提取及分子鉴定
3.4.2.1 酚仿法提取胎儿基因组 DNA
将 组 织 块 剪 碎 放 入 1.5mL 离 心 管 中 ， 加 700 μL DNA 抽 提 缓 冲 液 ，
20 μL蛋白酶K（20mg/mL），混匀。然后在 56℃水浴消化 18h以上，直至组织块或细
胞沉淀完全消失，间歇摇动以获得更好的效果。加入 700 μLTris-饱和酚，温和摇动
12min，12000rpm离心 12min。将上层液相转移至另一新的离心管中，重复上一步骤。
将上层液相转移至另一新的离心管中，加入 700μL 酚：仿（1:1），温和摇动 12min， 12000rpm离心12min。
将上层液相转移至另一新的离心管中，加入 700 μL 氯仿，温和摇动 12min，
12000rpm 离心 12min。将上层液相转移至另一新的离心管中，加 2 倍体积无水乙醇，
颠倒混匀后，12000rpm 离心 10min。弃上清，用 70%乙醇洗沉淀和管壁，倾弃乙醇， 沥尽残液，室温下敞口放置20-30min，使乙醇完全挥发。加适量（约 100 μL）TE缓冲 液，室温过夜溶解或于 42℃水浴助溶 1-2h。0.7%琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 浓 度。260/280nm波长下检测基因组DNA的浓度和纯度，将其调整至适当浓度，-20℃保 存。
3.4.2.2 胎儿分子鉴定
以3.4.2.1中提取的 DNA为模板进行PCR扩增，鉴定方法与 3.3.2 的分子鉴定方
结果分析
3.5.1 iSCNT 胚胎的体外发育
以亚洲象耳部皮肤成纤维细胞为 SCNT 的核供体，36 次重复（对照猪 SCNT，3 次重复）获得 7780 个重建胚胎。与对照组相比，象-猪重建胚胎的卵裂率（73.01% vs 76.15%）、4-细胞阶段（30.48% vs 51.54%）、8细胞阶段（5.64% vs 31.54%）和囊胚 阶段（ 4.73% 对 16.92%) 体外培养发育（表3-2）。这表明iSCNT象-猪重建胚胎的体 外发育低于SCNT猪重建胚胎。然而，根据我们的观察，16.04% iSCNT 象猪重建胚胎 的体外发育在一次实验中达到了囊胚阶段，大致相当于 SCNT 猪囊胚的比例。
表3-2亚洲象猪 iSCNT 胚胎的体外发育 Table 3-2 In vitro development of Asian elephant-pig iSCNT embryos
The percentages are expressed as the Mean ± SE Subscripts indicate significant difference within column
此外，评估 iSCNT 囊胚的发育及其形态，我们对象-猪重建胚胎中的细胞数进行了 计数，并测量了孵化胚细胞的直径，并与对照进行了比较。结果表明，象-猪囊胚细胞 总数与对照组相当（38.67 vs 46.81），孵化的囊胚细胞的直径小于对照（252.75 对
345.77 μm）（表 3-3），表明象-猪重建胚胎的体外发育明显低于猪重建胚胎（对照）。
表3-3 iSCNT 囊胚的形态特征
Table 3-3 Morphological characteristics of iSCNT blastocysts
Total number of blastocyte cell
The percentages are expressed as the Mean ± SE Subscripts indicate significant difference within column ** p