Nghiên cứu tạo mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp chứa thông số free triiodothyronine, free thyroxine, thyrotropin dùng trong đánh giá chất lượng xét nghiệm

Do đó, nghiên cứu tạo mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp chứa 3 thông số Free Triiodothyronine, Free Thyroxine, Thyrotropin là hết sức cấp bách và cần thiết, giúp đáp ứng được nhu cầu c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- ∞0∞ -

NGUYỄN THỊ HỒNG PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO MẪU NGOẠI KIỂM MIỄN DỊCH

TUYẾN GIÁP CHỨA THÔNG SỐ FREE

TRIIODOTHYRONINE, FREE THYROXINE,

THYROTROPIN DÙNG TRONG ĐÁNH GIÁ

CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- ∞0∞ -

NGUYỄN THỊ HỒNG PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO MẪU NGOẠI KIỂM MIỄN DỊCH

TUYẾN GIÁP CHỨA THÔNG SỐ FREE

TRIIODOTHYRONINE, FREE THYROXINE,

THYROTROPIN DÙNG TRONG ĐÁNH GIÁ

CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS LÊ THỊ TRÚC LINH

PGS TS TRẦN HỮU TÂM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Ký tên

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Dộc lập - Tự do - Hạnh phúc

Giàng viên hướng dần 1 : TS Lê Thị Trúc Linh

Ý kiến cùa giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ luận văn trước Hội

Thành phố Hồ Chi Minh, ngày tháng năm 202-3

Người nhận xét

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Đôc lập - Tự do - Hạnh phúc

Giàng viên hưcÝng dần 2 : PGS TS Trần Hữu Tâm

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ luận văn trước Hội đồng:

Thành phố Hồ Chi Minh, ngày Sữ.Ặ.tháẠg ỉk năm 202d'.

Người /ihậi/ xét

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “Nghiên cứu tạo mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp chứa thông số Free Triiodothyronine, Free Thyroxine, Thyrotropin dùng trong đánh giá chất lượng xét nghiệm” là bài nghiên cứu của chính tôi

Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tôi cam đoan rằng toàn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được công bố hoặc được sử dụng để những bằng cấp ở những nơi khác

Không có sản phẩm/ nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận văn này

mà không được trích dẫn theo đúng quy định

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các trường đại học hoặc cơ sở đào tạo khác

Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2023

Chữ ký tác giả: ………

Họ và tên tác giả: Nguyễn Thị Hồng Phương

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn và công việc được giao Đồng thời tôi cũng cảm ơn tập thể Khoa Sinh phẩm đã đóng góp công sức và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện thí nghiệm

học Mở TP.HCM nhất là TS Lê Thị Trúc Linh đã luôn quan tâm và truyền đạt cho tôi những kiến thức, kỹ năng và kinh nghiệm trong nghiên cứu khoa học Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn PGS TS Trần Hữu Tâm đã truyền đạt kiến thức và hướng dẫn tận tình trong quá trình thực hiện luận văn Những góp ý quý báu và những chỉnh sửa chi tiết trong luận văn của thầy cô giúp luận văn của tôi được hoàn thiện hơn về mặt nội dung và hình thức Thầy cô cũng luôn quan tâm, động viên, nhắc nhở kịp thời để em có thể hoàn thành luận văn đúng tiến độ

Con cảm ơn ba mẹ người đã hi sinh cả đời để nuôi dạy con khôn lớn và động viên tinh thần để con có niềm tin và nghị lực vượt qua những khó khăn trong cuộc sống và công việc để con có thành quả như ngày hôm nay

Trân trọng

NGUYỄN THỊ HỒNG PHƯƠNG

độ tin cậy và chất lượng xét nghiệm miễn dịch tuyến giáp là kiểm soát chất lượng xét nghiệm Việc kiểm soát chất lượng này được thực hiện thông qua mẫu ngoại kiểm Do

đó, nghiên cứu tạo mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp chứa 3 thông số Free Triiodothyronine, Free Thyroxine, Thyrotropin là hết sức cấp bách và cần thiết, giúp đáp ứng được nhu cầu của các phòng xét nghiệm

Bước đầu tiên của nghiên cứu là sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng tác động đến nồng

độ của thông số TSH, FT3, FT4 trong mẫu Thí nghiệm sàng lọc đa yếu tố được thực hiện bằng ma trận Plackett- Burman Kết quả cho thấy có 3 yếu tố gồm ethylene glycol, meso-erythritol, thời gian sấy có tác động mạnh nhất Sau đó, 3 yếu tố này được tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt RSM-CCD và đã tìm ra giá trị tối ưu hóa của ethylene glycol, thời gian sấy, meso-erythritol lần lượt là 16,02 %; 12,79 giờ; 0,12 g/ml

Mô hình cũng dự đoán nồng độ 3 thông số TSH là 7,56 (µU/ml), FT3 là 4,75 (pmol/l),

FT4 là 12,78 (pmol/l) Hai tiêu chí quan trọng trước khi thực hiện ngoại kiểm là đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định theo tiêu chuẩn ISO Guide 80 và 13528, do đó các mẫu này được đánh giá độ đồng nhất và thực hiện lão hóa cấp tốc để đánh giá độ ổn định theo thời gian, cũng như đánh giá ảnh hưởng chất lượng mẫu trong điều kiện vận chuyển

ngày (10 tháng 16 ngày) Với thời gian này, mẫu đạt tiêu chuẩn của 1 mẫu kiểm chuẩn,

Kết quả độ ổn định trong điều kiện vận chuyển khi gửi 6 mẫu ở gần và 3 mẫu ở xa cho thấy giữa các phòng xét nghiệm không có sự khác biệt với Fthực nghiệm < Flý thuyết Điều này chứng tỏ mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp ổn định trong điều kiện vận chuyển Sử dụng phân tích thống kê theo kiểm định Cochran’s với cỡ mẫu mỗi lô n = 10 cho thấy các mẫu trong môi trường bảo quản tối ưu là đồng nhất Xác nhận giá trị đích ban đầu của mẫu là cơ sở đánh giá độ đúng của kết quả xét nghiệm trên các phương pháp phân tích khác nhau và được chia theo 3 nhóm thiết bị: Roche Cobas e411 (điện hóa phát quang), Mindray CL-1000i (hóa phát quang), Human Reader HS (miễn dịch enzyme) để gửi mẫu phân tích Giá trị đích của nhóm sẽ được xác định bằng cách tính giá trị trung bình và 2 lần độ lệch chuẩn (2SD) Trên dòng máy Roche Cobas e411 giá trị đích của

thông số TSH là 6,27 ± 0,24 µU/ml, FT3 là 4,20 ± 0,20 pmol/l, FT4 là 13,25 ± 0,80

pmol/l; trên dòng máy Mindray CL-1000i giá trị đích của thông số TSH là 5,33 ± 0,32 µU/ml, FT3 là 3,19 ± 0,12 pmol/l, FT4 là 12,44 ± 0,32 pmol/l; trên dòng máy Human Reader HS giá trị đích của thông số TSH là 5,33 ± 0,32 µU/ml, FT3 là 3,19 ± 0,12 pmol/l, FT4 là 12,44 ± 0,32 pmol/l Kết quả đánh giá trị đích trên các dòng thiết bị cho thấy độ biến thiên CV% đều nhỏ hơn độ biến thiên cho phép (I%) theo nguồn biến thiên sinh học

Mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp đáp ứng các tiêu chí của một mẫu ngoại kiểm, đạt độ ổn định trong các điều kiện bảo quản và vận chuyển để triển khai chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm tại Việt Nam Đây là cơ sở ban đầu cho việc nghiên cứu thêm các thông số xét nghiệm miễn dịch liên quan đến các bệnh lý tuyến giáp như kháng thể Thyroid peroxidase (TPOAb), Thyroglobulin (Tg), kháng thể Thyroglobulin (TgAb),…Nghiên cứu cũng cần tối ưu hóa mẫu thêm ở ngưỡng cường giáp để có thể áp dụng vào chương trình ngoại kiểm và xác định tuổi thọ chính xác của mẫu theo thời gian thực

The thyroid immunoassay is one of the earliest available medical facilities These tests are very crucial in helping doctors make important decisions about treatment, early diagnosis, and prevention of diseases, Three parameters, Free Triiodothyronine (FT3), Free Thyroxine (FT4), and Thyrotropin (TSH) are common uesd in thyroid immunoassays It is crucial to have a reliable and quality-assured service for obtaining accurate test results Quality control is an essential tool in ensuring the reliability and qulity of thyroid immunoassays This quality check is performed through an exception sample Therefore, it is crucial to conduct research on creating foreign samples to test thyroid immunity, which includes the three parameters of Free Triiodothyronine, Free Thyroxine, and Thyrotropin This research is urgent and necessary in order to meet the needs of laboratories is extremely urgent and necessary, helping to meet the needs of laboratories

The first step of the research is to identify the factors that influece the concentrations of TSH, FT3, FT4 This is done through a multifactor screening experiment using the Plackett- Burman matrix The results of the experiment showed that three factors including an ethylene glycol, meso-erythritol, and drying time had the strongest impact Next, the three factors were optimized using the RSM-CCD surface response method, resulting in optimized values of 16.02 %, ethylene glycol, 12.79 hours drying time, and 0.12 g/ml for meso-erythritol The model also predicts the concentration

of TSH, FT3, FT4 to be 7.56 (µU/ml), 4.75 (pmol/l), and 12.78 (pmol/l) Two important criteria to consider are uniformity rate and stability evaluation, as outlined in ISO Guide

80 and 13528 It is important to evalute the samples for uniformity rate and aging in order

to combat price instability over time and to assess the quality of samples that may affect operating conditions The sample lifespan determined by the accelerated aging method at

a test sample, with a longer sample shelf life than that of foreign companies such as Randox and Biorad Stable results under exercise conditions when sending 6 near and 3

Theoretical F This proves the pattern except for the free linear stability test under switching conditions Use statistical analysis to test Cochran's with a sample size of n =

10 per batch to find samples in the optimal storage environment that are homogeneous Confirming the initial value of the sample is the basis for evaluating the accuracy of test results on different analytical methods and is divided into 3 groups of equipment: Roche

(chemiluminescence), Human Reader HS (without translation enzyme) to send samples for analysis The target values of the group will be determined by calculating the mean value and 2-fold deviation (2SD) On the Roche Cobas e411 model, the target value of the TSH parameter is 6.27 ± 0.24 µU/ml, FT3 is 4.20 ± 0.20 pmol/l, FT4 is 13.25 ± 0.80 pmol/ l; on the Mindray CL-1000i model, the target value of parameter TSH is 5.33 ± 0.32 µU/ml, FT3 is 3.19 ± 0.12 pmol/l, FT4 is 12.44 ± 0.32 pmol/ I; on the Human Reader HS model, the target value of TSH is 5.33 ± 0.32 µU/ml, FT3 is 3.19 ± 0.12 pmol/l, FT4 is 12.44 ± 0.32 pmol/l The results of evaluating target values on device lines show that the variation in CV%% is all smaller than the allowable variation (I%) according to biological sources of variation

The thyroid immunoassay test meets the criteria of an external test sample, achieving a level of stability under storage and movement conditions for the sample to develop a testing quality control program in Vietnam This is the initial basis for additional research work on immunological test parameters related to thyroid diseases such as Thyroid peroxidase antibodies (TPOAb), Thyroglobulin (Tg), and Thyroglobulin antibodies (TgAb), … Research also needs to optimize additional samples at the armor threshold so that they can be applied to a program that can test and determine the exact life of the sample in real time

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết đề tài 1

1.2 Mục tiêu đề tài 3

1.2.1 Mục tiêu tổng quát: 3

1.2.2 Mục tiêu cụ thể: 3

1.3 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 3

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 3

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 4

1.4 Phương pháp nghiên cứu: 4

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài 4

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 4

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài 5

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 6

2.1 Tổng quan tuyến giáp 6

2.2 Điều hòa hoạt động của các hormone tuyến giáp 6

2.3 Bệnh lý về tuyến giáp 8

2.4 Kỹ thuật xét nghiệm tuyến giáp 10

2.6 Mẫu ngoại kiểm 14

2.7 Quy trình đông khô 17

2.8 Tình hình nghiên cứu mẫu miễn dịch tuyến giáp 18

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị 20

3.1.1 Nguyên vật liệu hóa chất: 20

3.1.2.Trang thiết bị 20

3.2 Thu thập mẫu 20

3.3 Cỡ mẫu 21

3.4 Xử lý và pha chế mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp dạng lỏng từ huyết tương bệnh phẩm sau khi thu thập từ các bệnh viện 22

3.5 Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ của TSH, FT3, FT4 trong mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp khi thực hiện đông khô 23

3.6 Tối ưu thành phần các chất bảo quản mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp dạng đông khô 24

3.7 Thẩm định chất lượng mẫu qua độ đồng nhất và ổn định của mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp dạng đông khô sau khi tối ưu hóa 25

3.7.1 Đánh giá độ ổn định theo thời gian 25

3.7.2 Đánh giá độ ổn định trong điều kiện vận chuyển: 26

3.7.3 Đánh giá độ đồng nhất của mẫu 27

3.8 Xác định giá trị đích ban đầu của mẫu tương ứng với các phương pháp xét nghiệm 27

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 29

4.1 Kết quả xử lý mẫu sau khi thu thập 29

4.2 Kết quả sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ của TSH, FT3, FT4 trong mẫu ngoại

kiểm miễn dịch tuyến giáp khi thực hiện đông khô 30

4.3 Kết quả tối ưu thành phần các chất bảo quản mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp dạng đông khô 34

4.4 Kết quả đánh giá mô hình dự đoán bằng thực nghiệm 41

4.5 Đánh giá độ đồng nhất của mẫu 42

4.6 Kết quả khảo sát tuổi thọ mẫu bằng phương pháp lão hóa cấp tốc 44

4.7 Kết quả đánh giá theo điều kiện vận chuyển 46

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

5.1 Kết luận: 51

5.2 Kiến nghị 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Trục điều hòa vùng dưới đồi, tuyến yên, tuyến giáp 7 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chẩn đoán bệnh tuyến giáp 9 Hình 4 1 Mặt đáp ứng nồng độ TSH theo tỷ lệ Ethylene glycol (A), Thời gian sấy (B) và Meso-erythritol (C) 38 Hình 4 2 Mặt đáp ứng nồng độ FT3 theo tỷ lệ Ethylene glycol (A), Thời gian sấy (B) và Meso-erythritol (C) 39 Hình 4 3 Mặt đáp ứng nồng độ FT4 theo tỷ lệ Ethylene glycol (A), Thời gian sấy (B) và Meso-erythritol (C) 40 Hình 4 4 Mẫu miễn dịch tuyến giáp sau khi đông khô 42 Hình 4 5 Biểu đồ biểu hiện nồng độ của 3 thông số tuyến giáp ở nhiệt độ lão hóa cấp tốc

Hình 4 6 Biểu đồ biểu hiện nồng độ của 3 thông số tuyến giáp ở nhiệt độ lão hóa cấp tốc

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4 1 Kết quả nồng độ TSH, FT3, FT4 của hỗn hợp mẫu ban đầu 29 Bảng 4 2 Kết quả nồng độ TSH, FT3, FT4 của mẫu huyết thanh dùng làm chất nền 29 Bảng 4 3 Ngưỡng bệnh lý suy giáp từ các tài liệu y văn và khoảng đo phân tích của thiết bị 30 Bảng 4 4 Các yếu tố khảo sát cho thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman ở mức bệnh lý suy giáp 32 Bảng 4 5 Kết quả ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman của mẫu ở mức bệnh lý suy giáp 32 Bảng 4 6 Các biến trong ma trận Plackett-Burman và ảnh hưởng của chúng ở mức bệnh

lý suy giáp 33 Bảng 4 7 Nồng độ các yếu tố ảnh hưởng sử dụng trong thiết kế thí nghiệm CCD 35 Bảng 4 8 Nồng độ các yếu tố ảnh hưởng sử dụng trong thiết kế thí nghiệm CCD 35 Bảng 4 9 Kết quả thực nghiệm và kết quả lý thuyết từ mô hình tối ưu hóa RSM-CCD 41 Bảng 4 10 Kết quả nồng độ của 3 thông số tuyến giáp trước và sau khi đông khô 42 Bảng 4 11 Kết quả độ đồng nhất của mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp 43 Bảng 4 12 Kết quả theo dõi độ ổn định trong điều kiện vận chuyển của 9 PXN trên dòng máy xét nghiệm miễn dịch Roche Cobas e411 46 Bảng 4 13 Kết quả giá trị ấn định của 3 thông số miễn dịch tuyến giáp trên dòng Roche Cobas e411 47 Bảng 4 14 Kết quả giá trị ấn định của 3 thông số miễn dịch tuyến giáp trên dòng máy Mindray CL-1000i 48 Bảng 4 15 Kết quả giá trị ấn định của 3 thông số miễn dịch tuyến giáp trên dòng máy Human Reader HS 48 Bảng 4 16 Giá trị CV% của 3 thông số miễn dịch tuyến giáp trên 3 dòng máy 49

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT

TẮT

nhận

assay

Miễn dịch hấp thụ liên kết enzyme

TRH Thyrotropin-releasing hormone Hormone giải phóng thyrotropin

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Tuyến giáp là một bộ phận quan trọng, đóng vai trò giải phóng các hormone giúp điều hòa hoạt động của các tế bào, mô và cơ quan trong cơ thể Trên thế giới, tỉ

lệ người mắc các bệnh lý về tuyến giáp chiếm khoảng 5%, tỉ lệ mắc bệnh tăng lên theo tuổi và thường gặp ở phụ nữ Các bệnh về tuyến giáp thường bị bỏ sót và không được chẩn đoán kịp thời làm ảnh hưởng đến việc điều trị Các chỉ số phổ biến được

sử dụng trong xét nghiệm bệnh lý tuyến giáp bao gồm Free thyroxine (gọi tắt là FT4), Free triiodothyronine (gọi tắt là FT3) và thyrotropin (TSH) TSH thường được sử dụng để theo dõi các bệnh nhân đang điều trị thay thế hoặc ức chế hormone tuyến giáp Dạng tự do FT3, FT4 là dạng có hoạt tính trong máu và nồng độ FT3, FT4 không bị phụ thuộc vào các protein vận chuyển trong các tình trạng như mang thai, dùng thuốc tránh thai, điều trị bằng estrogen…Thông qua các chỉ số này, bác sĩ có thể đánh giá tình trạng bệnh của bệnh nhân là suy giáp, cường giáp hay viêm giáp Hiện nay, các xét nghiệm này được thực hiện dựa trên nguyên lý miễn dịch – sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể Các kết quả xét nghiệm càng chính xác thì việc điều trị bệnh càng hiệu quả Do đó, một vấn đề đang được đặt ra và được các phòng xét nghiệm quan tâm thực hiện đó là đảm bảo chất lượng xét nghiệm Đảm bảo chất lượng xét nghiệm bao gồm toàn bộ các hoạt động có kế hoạch và có hệ thống trong

hệ thống quản lý chất lượng như các chính sách, kế hoạch, đào tạo nhân sự, bảo trì

và hiệu chuẩn thiết bị xét nghiệm, lựa chọn phương pháp, hóa chất, thuốc thử,…nhằm hạn chế đến mức thấp nhất sai sót có thể xảy ra trong quá trình xét nghiệm Để đảm bảo chất lượng xét nghiệm cần phải thực hiện việc kiểm tra chất lượng xét nghiệm định kỳ Hai công cụ được sử dụng phổ biến trong kiểm tra chất lượng là ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm (EQA – External Quality Assessment) và nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm (IQC - Internal Quality Control) Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm phải được đánh giá bởi một tổ chức độc lập, có chức năng thực hiện, trong khi đó nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm lại được thực hiện và đánh giá bởi chính phòng xét nghiệm Các xét nghiệm tuyến giáp cũng là những xét nghiệm cần phải

thực hiện EQA và IQC để đảm bảo chất lượng xét nghiệm Tuy nhiên, để thực hiện EQA và IQC cần có một mẫu kiểm tra chất lượng (mẫu ngoại kiểm và mẫu nội kiểm), tương tự mẫu bệnh phẩm, đáp ứng được các yêu cầu về chất lượng Nghiên cứu này chủ yếu tập trung theo hướng sản xuất mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp do mẫu ngoại kiểm được các phòng xét nghiệm đặc biệt quan tâm và không yêu cầu khắt khe

về mặt chất lượng như mẫu nội kiểm

Hiện nay, trên thế giới các mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp được sản xuất sản xuất ở dạng lỏng hoặc đông khô, thời hạn sử dụng của mẫu từ 4 đến 6 tháng tùy vào hãng sản xuất Một số công ty như Randox và Biorad lại sản xuất mẫu ngoại kiểm sinh hóa với nhiều thông số trong đó bao gồm cả các thông số miễn dịch tuyến giáp như T3, T4, TSH, FT3, FT4 mà không có bộ mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp riêng Mặt khác, quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp được các công ty nước ngoài bảo mật hết sức chặt chẽ và hầu như không có các công trình nghiên cứu đăng trên các tạp chí nước ngoài Tại Việt Nam, hiện chưa có công trình nghiên cứu nào được công bố về sản xuất mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp Hơn nữa, các đơn vị có chức năng nghiên cứu sản xuất mẫu ngoại kiểm rất ít, chỉ có các Trung tâm kiểm chuẩn xét nghiệm thực hiện các nghiên cứu này Đối với việc cung cấp mẫu và triển khai chương trình ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp cũng chỉ có các Trung tâm kiểm chuẩn xét nghiệm được phép thực hiện Mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp được định hướng nghiên cứu ở dạng mẫu đông khô nhằm tăng độ ổn định của mẫu và sẽ thực hiện tối ưu hóa quy trình đông khô để kéo dài thời hạn mẫu 12 tháng

Theo thống kê của Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm Thành phố thì số lượng các đơn vị tham gia ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp khá cao so với vi sinh, đông máu, tim mạch… và tăng lên theo từng năm Năm 2019 là 142 đơn vị, 2020 là 154 đơn vị, năm 2021 là 176 đơn vị và năm 2022 là 178 đơn vị Do đó, nhu cầu về mẫu ngoại kiểm là rất lớn nên việc chủ động sản xuất mẫu trong nước giúp giảm rất nhiều chi phí, thuận lợi cho phòng xét nghiệm trong việc lựa chọn mẫu ngoại kiểm

Dựa trên hình hình triển khai công tác đảm bảo chất lượng cho xét nghiệm miễn dịch tuyến giáp, được sự đồng ý của phía Trung tâm kiểm chuẩn trong công tác hỗ trợ

nghiên cứu sản xuất mẫu, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tạo mẫu ngoại

kiểm miễn dịch tuyến giáp chứa thông số Free Triiodothyronine, Free

Thyroxine, Thyrotropin dùng trong đánh giá chất lượng xét nghiệm” Đề tài sản

xuất mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp sẽ giúp cho công tác đảm bảo chất lượng xét nghiệm, đạt đến sự tin tưởng và thừa nhận kết quả lẫn nhau tại các bệnh viện và phòng xét nghiệm trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng và Việt Nam nói chung, đồng thời có giá thành hợp lý, tiết kiệm nhiều cho ngân sách Nhà nước

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu:

Mẫu nghiên cứu là mẫu huyết tương/huyết thanh của người gồm có các chỉ số

tuyến giáp (TSH, FT3, FT4) ở ngưỡng giá trị bệnh lý suy giáp cận lâm sàng, được thu thập từ các phòng xét nghiệm, bệnh viện (dự kiến: bệnh viện Xuyên Á, Nguyễn

Tri Phương, bệnh viện Ung bướu…) và mẫu huyết tương ngưỡng giá trị bình thường

từ bệnh viện Truyền máu huyết học Việc thu nhận mẫu tuân thủ theo quy định về y đức và theo thông tư 40/2018/TT-BYT ban hành ngày 7 tháng 12 năm 2018 quy định

về quản lý mẫu bệnh phẩm bệnh truyền nhiễm

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu:

- Mẫu được thử nghiệm tại phòng xét nghiệm của Trung tâm kiểm chuẩn xét nghiệm TP.HCM, các phòng xét nghiệm tại TP.HCM và một số phòng xét

nghiệm ở tỉnh

- Đề tài được nghiên cứu được thực hiện từ tháng 04/2023 đến tháng 10/2023

- Hướng nghiên cứu thực hiện sản xuất bộ mẫu ngoại kiểm miễn dịch ở bệnh cảnh suy giáp

- Thu thập mẫu và xử lý mẫu tuân theo các yêu cầu về an toàn sinh học

- Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ của TSH, FT3, FT4 trong mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp khi thực hiện đông khô bằng ma trận Plackett-Burman

- Tối ưu thành phần các chất bảo quản mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp dạng đông khô bằng phuong pháp đáp ứng bề mặt – Cấu trúc có tâm (RSM-CCD)

- Thẩm định chất lượng mẫu bằng cách đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định (theo thời gian và trong điều kiện vận chuyển) theo hướng dẫn ISO Guide 34

và Guide 35 (Organization, 2017) từ đó xác định giá trị đích ban đầu của mẫu với các phương pháp xét nghiệm

- Xử lý thống kê bằng phần mềm Design expert®7.0 và Microsoft Excell

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Quy trình chế tạo mẫu kiểm chuẩn dùng trong kiểm soát chất lượng tại phòng xét nghiệm (PXN) là một bí mật công nghệ hàng đầu của các công ty

tiên có thể tiến hành sản xuất được mẫu sinh phẩm miễn dịch tuyến giáp đáp ứng các nhu cầu về mẫu kiểm tra trong thử nghiệm thành thạo, góp phần quan trọng đánh giá chất lượng xét nghiệm tuyến giáp nhằm nâng cao chất lượng của các phòng xét nghiệm ở Việt Nam, đồng thời là tiền đề khoa học cho việc nghiên cứu các mẫu khác như đông máu, tim mạch, sinh học phân tử…phục vụ cho công tác quản lý chất lượng xét nghiệm

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài

Hiện nay, các mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp đang có tại Việt Nam chủ yếu phụ thuộc vào nhà cung cấp nước ngoài như Biorad, Randox; điều này khiến cho hoạt động ngoại kiểm của ngành bị phụ thuộc, thiếu tính chủ động Đồng thời, giá thành cung cấp mẫu cao, dẫn đến tăng chi phí cho hoạt động ngoại kiểm của đơn vị

Do đó, việc nghiên cứu sản xuất mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp trong nước là một việc hết sức cần thiết để có thể chủ động nguồn mẫu, giảm giá thành, tạo điều kiện thuận lợi cho việc triển khai ngoại kiểm Qua đó, các đơn vị y tế có thể dễ dàng hơn trong việc đạt được yêu cầu về đảm bảo chất lượng xét nghiệm, hướng các phòng xét nghiệm đến một chuẩn chất lượng chung, đạt mục tiêu liên thông kết quả xét nghiệm theo như Quyết định 316/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ về Đề án Tăng cường năng lực hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm y học giai đoạn 2016-2025

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan tuyến giáp

Tuyến giáp thuộc hệ nội tiết, nằm phía trước cổ có hình bướm với hai thùy

ở bên trái và phải thanh quản Đây là một trong những tuyến lớn nhất của cơ thể Mô tuyến giáp có kết cấu xốp màu nâu đỏ, được cung cấp nhiều máu Các

tế bào biểu mô quanh các nang tuyến là vùng tổng hợp các hormone tuyến giáp, chủ yếu là tetraiodothyronine (T4) và ở mức độ ít hơn là triiodothyronine (T3) (Ozgur et al., 2011)

Một số chức năng quan trọng của hormone tuyến giáp:

- Kích thích lượng máu qua tim, tăng nhịp tim, kích thích hô hấp cung cấp oxy cho sự chuyển hóa ở các mô và cơ quan

- Tăng hoạt động chuyển hóa các chất trong tế bào như tăng chuyển hóa lipid, protein và glucose

- Giúp cho sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào trong cơ thể

- Duy trì nồng độ canxi và oxy trong máu

2.2 Điều hòa hoạt động của các hormone tuyến giáp

Hormone tuyến giáp có hiệu lực rất mạnh nên nồng độ trong máu của chúng được kiểm soát chặt chẽ bởi cơ chế điều hòa ngược xuất phát từ vùng dưới đồi Vùng dưới đồi sản xuất hormone giải phóng thyrotropin (TRH) TRH được vận chuyển qua cuống não đến thùy trước của tuyến yên Khi đó, TRH truyền tín hiệu đến tuyến yên để tăng hoạt giảm sản xuất TSH (Thyroid stimulating hormone) (Demers, 2004) TSH là một glycoprotein với khối lượng phân tử khoảng 30.000

Da, gồm 2 chuỗi kết hợp lại (alpha – Thyrotropin và beta - Thyrotropin) Alpha – Thyrotropin rất giống với các hormone glycoprotein khác được tạo ra bởi thùy trước tuyến yên như Hormone lutein hóa (LH), hormone kích thích nang trứng (FSH) và Human gonadotropin chorionic (hCG) Beta - Thyrotropin khác và đặc hiệu cho hormone này (Pirahanchi et al., 2022)

TSH được vận chuyển đến tuyến giáp qua máu, nó liên kết với các thụ thể

hoặc T4 Triiodothyronine (hay T3) là dạng hoạt động của hormone tuyến giáp Mặc

dù nó chỉ chiếm 20% lượng hormone được giải phóng, nhưng phần lớn T3 đến từ quá trình chuyển đổi ngoại vi của T4 thành T3 Tetraiodothyronine, còn được gọi là thyroxine hoặc T4, chiếm hơn 80% lượng hormone được tiết ra Khi lưu thông trong máu, T4 tạo thành T3 bằng cách khử iod (Eghtedari & Correa, 2022)

Hình 2 1 Trục điều hòa vùng dưới đồi, tuyến yên, tuyến giáp (Lê Thị Hoài Vân, 2010)

Sau khi được phóng thích vào máu, hormone T3 và T4 liên kết với protein dưới 2 dạng: dạng 1 gắn với protein vận chuyển chủ yếu là TBG (Globulin gắn kết với Thyroxine), gắn với TBA (Thyroxine gắn kết Albumin) và TBPA (Thyroxine gắn kết tiền Albumin) dạng này chiếm 99%; dạng 2 là dạng tự do gồm FT3 (T3 tự do), FT4 (T4 tự do) chỉ chiếm dưới 1% Các thông số FT3, FT4 là dạng có hoạt tính trong máu Khi nồng độ các protein thay đổi như khi mang thai, dùng thuốc tránh thai, điều trị bằng estrogen…sẽ dẫn đến sự thay đổi của T3, T4 trong khi đó dạng tự

do FT3, FT4 không phụ thuộc vào protein vận chuyển Khi T3 liên kết với thụ thể của nó trong nhân, nó sẽ kích hoạt phiên mã DNA, sau đó là dịch mã mRNA và tổng hợp protein mới Những protein mới này ảnh hưởng đến nhiều hệ cơ quan, thúc đẩy

sự tăng trưởng cũng như sự trưởng thành của xương và hệ thần kinh trung ương T3

và T4 hoạt động trên hầu hết các tế bào trong cơ thể để tăng tỷ lệ trao đổi chất cơ bản Hormone tuyến giáp cũng kích hoạt quá trình trao đổi chất, với sự gia tăng hấp thu glucose, phân giải glycogen, sinh tổng hợp glucose, phân giải mỡ, tổng hợp và thoái hóa protein (Delitala et al., 2019)

Ngoài ra, điều hòa bài tiết hormone tuyến giáp còn phụ thuộc vào nhiệt độ hoặc tình trạng stress Nồng độ iod vô cơ cao sẽ ức chế bài tiết T3 và T4; trong khi nồng độ iod hữu cơ cao sẽ giảm hấp thu iod, giảm quá trình tổng hợp T3 và T4 (C

Hình 2 2 Sơ đồ quy trình chẩn đoán bệnh tuyến giáp (Bộ Y tế, 2015)

Nồng độ TSH

Bình thường

Nồng độ FT4 Không chẩn

đoán thêm Nồng độ FT4

thường

Giảm Tăng

Suy giáp

nguyên

phát

Suy giáp cận lâm sàng

Nồng độ FT3

Suy giáp trung ương

Tăng

Cường giáp cận lâm sàng

Khi nồng độ TSH tăng thì cần thực hiện thêm xét nghiệm FT4 nếu chỉ số này giảm thì kết luận là suy giáp nguyên phát, còn FT4 bình thường là suy giáp cận lâm sàng Khi nồng độ TSH giảm, FT4 giảm là suy giáp trung ương… Nếu FT4, FT3 tăng thì kết luận là cường giáp cận lâm sàng (Bộ Y tế, 2015)

Máu toàn phần gồm các thành phần: các tế bào máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) và huyết tương (các yếu tố đông máu, protein, lipid, glucose, các chất điện giải, các globulin miễn dịch,…) Huyết tương loại bỏ fibrinogen sẽ tạo thành huyết thanh Các hormone TSH do tuyến yên tiết ra, FT3, FT4 do tuyến giáp tiết ra được giải phóng vào trong máu và tồn tại trong huyết tương (hoặc huyết thanh) Thời gian tồn

các chỉ số có trong mẫu (Männistö et al., 2007)

Việc đo nồng độ thyrotropin (TSH) được dùng làm xét nghiệm ban đầu trong đánh giá chức năng tuyến giáp, TSH thường được sử dụng để theo dõi các bệnh nhân đang điều trị thay thế hoặc ức chế hormone tuyến giáp TSH là thông số rất nhạy trong việc xác định rối loạn chức năng tuyến giáp và tiên đoán những biểu hiện thay đổi ác tính của khối u Ở một số quốc gia TSH là xét nghiệm duy nhất để chẩn đoán chức năng tuyến giáp, tuy nhiên điều này không đánh giá được chính xác và khách quan nên cần có thêm chỉ số FT4, FT3 để thấy bệnh nhân có những bệnh lý của hệ thống đồi tuyến yên đối với trục tuyến giáp (Matyjaszek-Matuszek et al., 2013) Việc định lượng FT3, FT4 ngày càng được chỉ định xét nghiệm thay cho T3, T4 toàn phần (Nguyễn Đạt Anh & Nguyễn Thị Hương, 2013; C.C Heuck et al., 2000) FT4 là xét nghiệm cần theo dõi tiếp theo để xác nhận rối loạn chức năng tuyến giáp nguyên phát khi thông số TSH bất thường và là xét nghiệm được theo dõi đầu tiên khi tình trạng tuyến giáp không ổn định (giai đoạn đầu của điều trị suy giáp hoặc cường giáp) hoặc bệnh nhân dùng thuốc ảnh hưởng đến bài tiết TSH như dopamine hoặc

glucocorticoids (Baloch et al., 2003; Kundra & Burman, 2012; Stockigt & Lim, 2009)

Các phương pháp định lượng hormone tự do được chia thành hai loại - phương pháp trực tiếp, sử dụng sự phân tách vật lý hormone tự do khỏi hormone liên kết với protein và ước tính các xét nghiệm, tính toán “chỉ số” hormone tự do từ phép

đo tổng lượng hormone đã hiệu chỉnh đối với các protein liên kết bằng việc đo TBG hoặc ước tính protein liên kết, hoặc các xét nghiệm miễn dịch sử dụng kháng thể để phát hiện hormone tự do (Faix, 2013; Stockigt, 2001; Thienpont et al., 2013) Vì các phương pháp định lượng hormone tự do trực tiếp đòi hỏi kỹ thuật cao, bất tiện và tốn kém nên chúng thường chỉ sẵn có ở các phòng thí nghiệm tham chiếu Hầu hết các xét nghiệm FT4 và FT3 được thực định lượng bằng phương pháp miễn dịch kháng thể (Faix, 2013)

Các chỉ số tuyến giáp FT3, FT4, TSH còn được nghiên cứu đánh giá tình trang suy giáp cận lâm sàng đối với các bệnh nhân hội chứng hư thận nguyên phát khi nồng độ FT3, FT4 giảm và TSH tăng Các hormone này bản chất là protein nên lượng hormone bị mất qua nước tiểu theo protein niệu sẽ ảnh hưởng việc kích thích tuyến yên tiết TSH dẫn đến cơ chế suy chức năng giáp (Phạm Thị Phượng, 2013)

Các phương pháp xét nghiệm để xác định chỉ số TSH như miễn dịch phóng xạ (RIA, IRMA), liên kết protein cạnh tranh (CPB), xét nghiệm thụ thể phóng xạ (RRA), miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA, EIA), miễn dịch hóa phát quang (CLIA), điện hóa phát quang (CLIA)… (Baloch et al., 2003) Tuy nhiên theo thống kê các phương pháp và thiết bị được sử dụng của các phòng xét nghiệm đăng ký tham gia ngoại kiểm của Trung tâm kiểm chuẩn xét nghiệm TP.HCM thì 3 phương pháp được sử dụng chính là miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA, EIA), miễn dịch hóa phát quang (CLIA), điện hóa phát quang (ECLIA) (Spencer, 2017)

Xét nghiệm miễn dịch ELISA: là phương pháp dùng trong các xét nghiệm định tính và định lượng kháng nguyên hoặc kháng thể Nguyên lý của phản ứng này dựa trên tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể Trong đó, kháng nguyên hoặc kháng thể được đánh dấu bằng enzyme và hoạt tính của enzyme được đo bằng phương pháp

soi màu Sau khi bổ sung cơ chất thích hợp thì enzyme liên kết với kháng thể sẽ xúc tác phản ứng tạo thành sản phẩm, sản phẩm này thực hiện qua phép đo quang phổ Tùy thuộc vào sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể gồm 4 loại: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, sandwich ELISA và ELISA cạnh tranh (Cerda-Kipper et al., 2019)

Xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang (CLIA): là một xét nghiệm kết hợp kỹ thuật phát quang hóa học với các phản ứng hóa học miễn dịch Tương tự như các xét nghiệm miễn dịch khác, CLIA sử dụng các đầu dò hóa học có thể tạo ra phát xạ ánh sáng thông qua phản ứng hóa học để gắn nhãn cho kháng thể Phản ứng phát quang hóa học có thể được tạo ra theo 2 cơ chế cơ bản: cơ chế hoá học, sử dụng hóa chất như acridinium ester và các dẫn xuất của nó, khi phản ứng với hydro peroxide kiềm

nó sẽ bị hoạt hóa và phát ra ánh sáng; các enzyme liên kết với kháng thể như horseradish peroxidase (HRP) và phosphatase kiềm (AP) sẽ phản ứng với cơ chất như luminol và dẫn xuất của 1,2-dioxetane (AMPPD) để tạo ra sản phẩm là chất phát huỳnh quang (Azim et al., 2018)

Xét nghiệm miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA): là kỹ thuật được nhiều phòng xét nghiệm sử dụng và thực hiện trên hệ thống máy tự động CLIA sử dụng ruthenium tris-bipyridine (bpy) làm chất đánh dấu, bpy sẽ xúc tác cho phản ứng của

ra bức xạ màu da cam 620 nm (Katsumi Aoyagi, 2013) Phương pháp ECLIA có nhiều ưu điểm là độ nhạy, độ đặc hiệu cao, quy trình thực hiện xét nghiệm đơn giản, thời gian xét nghiệm nhanh ECLIA được xem như là một trong những phương pháp hiện đại nhất xét nghiệm các chất như nội tiết tố, chất chỉ điểm ung thư Tuy nhiên,

Xét nghiệm miễn dịch là một trong những chỉ định cận lâm sàng thường quy nhất tại các cơ sở y tế vì chúng giúp bác sĩ đưa ra quyết định quan trọng về điều trị, chẩn đoán sớm phát hiện sớm và phòng bệnh, Do đó, việc phải có một kết quả xét nghiệm miễn dịch tin cậy, đảm bảo chất lượng là hết sức quan trọng Một trong những

công tác đảm bảo độ tin cậy và chất lượng xét nghiệm miễn dịch, bao gồm xét nghiệm tuyến giáp là kiểm soát chất lượng xét nghiệm

Kiểm soát chất lượng xét nghiệm là một phần quan trọng đảm bảo chất lượng xét nghiệm với việc phân tích các thông số đo trên mẫu kiểm tra hàng ngày biết trước giá trị (nội kiểm) và mẫu kiểm tra định kỳ không biết trước giá trị (ngoại kiểm) Trong

đó, ngoại kiểm là hoạt động quan trọng, khách quan do các cơ quan quản lý chương trình ngoại kiểm thực hiện Để thực hiện kiểm soát chất lượng xét nghiệm, cơ quan quản lý sử dụng mẫu ngoại kiểm là dạng vật liệu đáp ứng các yêu cầu kỹ thuật của phòng xét nghiệm và thực hiện để có các kết quả đồng thuận giữa các phòng xét nghiệm

Các phương pháp triển khai ngoại kiểm tra được áp dụng rộng rãi bao gồm 3 loại như sau (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2021):

- Chương trình thử nghiệm thành thạo: cơ quan triển khai ngoại kiểm sẽ cung cấp mẫu cho các phòng xét nghiệm tham gia, và các kết quả của các phòng xét nghiệm thực hiện gửi về cơ quan triển khai ngoại kiểm để được phân tích thống

kê đánh giá so sánh PXN nhận bản phân tích kết quả đã thực hiện từ cơ quan triển khai ngoại kiểm để xem xét và khắc phục sai số (nếu có)

- Kiểm tra lại/xét nghiệm lại: PXN lựa chọn mẫu nghiệm phẩm ngẫu nhiên gửi đến PXN tham chiếu hoặc đơn vị tham chiếu để phân tích và đánh giá lại các kết quả mà PXN đã thực hiện

- Đánh giá tại chỗ: thành lập các đoàn đánh giá bởi cơ quan hoặc tổ chức được công nhận của quốc gia để đến đánh giá các phòng xét nghiệm định kỳ hoặc đột xuất dựa trên các bảng kiểm và tiêu chí quy định

Tại Trung tâm Kiểm chuẩn xét nghiệm Thành phố, chương trình ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp được triển khai bằng phương pháp truyền thống là thử nghiệm thành thạo Các kết quả của các phòng xét nghiệm gửi về sẽ được phân tích và đánh giá theo phương pháp và dòng thiết bị

2.6 Mẫu ngoại kiểm

Mẫu ngoại kiểm là phương thức để triển khai chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm (EQA) Hiện nay, mẫu ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm được hầu hết các phòng xét nghiệm trên thế giới sử dụng Mẫu này được mua từ các công

ty thương mại nước ngoài Tuy nhiên, việc mua này không ổn định do điều kiện vận chuyển và các giấy tờ thủ tục nhập khẩu khó khăn, gây ảnh hưởng cho các PXN trong việc thực hiện kiểm soát chất lượng xét nghiệm theo định kỳ Mẫu EQA có thể chứa một hoặc nhiều thông số và được đặc trưng bằng giá đích (hay giá trị ấn định) cùng với độ không đảm bảo đo đi kèm nhằm phục vụ cho việc đánh giá kết quả đo lường theo tiêu chuẩn quốc tế Tùy vào bản chất của các loại mẫu ngoại kiểm mà giá trị đích được xác định theo các phương pháp khác nhau Trong ngoại kiểm, giá trị đích được xem là giá trị mà PXN hướng tới dùng để tham chiếu cho các kết quả mà PXN tham gia (Migliarino, 2015) Giá trị đích đặc trưng cho từng phương pháp xét nghiệm do kết quả của mẫu ngoại kiểm khi phân tích bằng các phương pháp khác nhau sẽ khác nhau Do đó, khi phân tích kết quả ngoại kiểm việc đánh giá sai số do phương pháp

và thiết bị của PXN cần phải dựa vào giá trị đích được cung cấp ngay từ đầu

Đối với những đơn vị có chức năng làm mẫu ngoại kiểm, có ba hướng dẫn của ISO hỗ trợ cho việc sản xuất và chứng nhận mẫu, chứng minh mẫu thỏa mãn các yêu cầu của người sử dụng ISO Guide 34 nêu ra các yêu cầu nhà sản xuất có đầy đủ năng lực về hệ thống quản lý, nhà xưởng, con người, nhà thầu phụ, (Organization, 2009) ISO Guide 80 lại mô tả một cách cụ thể các bước pha chế và những yêu cầu cần có của một mẫu tham chiếu tự sản xuất (in-house reference material) (Organization, 2014) Trong khi đó, ISO Guide 35 hướng tới mô hình thử nghiệm tính đồng nhất và

ổn định cùng với mô tả đặc trưng của mẫu dự kiến (Organization, 2017)

Các loại mẫu ngoại kiểm được biết như (WHO, 2011):

- Mẫu ngoại kiểm là vật liệu chuẩn được chứng nhận (CRM - Certified Reference Material) là mẫu các nồng độ biết trước và được tạo ra theo quy trình chuẩn mực Mẫu thường được sản xuất và cung cấp bởi các viện đo lường

trị đích), khả năng truy xuất nguồn gốc đo lường (hệ SI) của giá trị đó và độ không đảm bảo đo của nó (Bunk, 2007) Việc chuẩn bị mẫu này bao gồm các bước: lựa chọn chất nền; xây dựng quy trình lấy mẫu; chuẩn bị mẫu; sử dụng phương pháp đo cho thử nghiệm tính đồng nhất và độ ổn định; xây dựng mô

tả đặc trưng của mẫu; đánh giá độ không đảm bảo đo; thiết kế giấy chứng nhận

và báo cáo chứng nhận (Organization, 2017) Hiện nay, có một số nhà cung cấp và sản xuất các mẫu CRM như NMIJ (National Metrology Institute of Japan, Nhật Bản), NIST (National Institute, of Standards and Technology, Mỹ), ERM (European Reference Material, Châu Âu), WHO (World Health Organization), công ty LGC (Anh Quốc), JRC (Joint Research Centre, Châu Âu), NIBSC (National Institute for Biological Standards and Controls, Anh Quốc), ReCCS (Reference Materia Institute for Clinical Chemistry Standards,

RM - Reference Material) Mẫu được sản xuất theo hướng dẫn của IAEA (International Atomic Energy Agency) Các bước chế tạo mẫu RM cũng tương

tự như các bước chế tạo mẫu CRM, tuy nhiên quy trình sản xuất mẫu RM phải được công bố và phải được áp dụng kiểm tra trước khi đưa vào sử dụng Giá trị đích và độ không đảm bảo chuẩn được xác định bằng cách hiệu chuẩn lại theo công bố của mẫu CRM để đảm bảo mẫu ngoại kiểm có tính chuyển đổi

- Mẫu ngoại kiểm là mẫu tự pha chế, được tạo ra bằng cách thêm lượng chính xác các thành phần tham số đã biết vào nền mẫu Mẫu có thể được thực hiện bởi các phòng xét nghiệm thông thường nhưng phải tuân theo các tiêu chuẩn của ISO Guide 35 và Guide 80 (Organization, 2014) Giá trị đích được ước lượng từ sự đồng thuận của các PXN tham gia và không có sự khác đáng kể

so với giá trị đích của mẫu CRM và RM (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2021) Việc pha chế mẫu này đơn giản nhưng đòi hỏi kỹ thuật cũng như thiết bị (cân, dụng cụ đo,…) phải đảm bảo độ chính xác để đảm bảo độ

đồng nhất và ổn định Việc pha chế mẫu này đơn giản nhưng đòi hỏi kỹ thuật cũng như thiết bị (cân, dụng cụ đo,…) phải đảm bảo độ chính xác để đảm bảo

độ đồng nhất và ổn định Việc đánh giá kết quả ngoại kiểm đối với mẫu ngoại kiểm tự pha chế dạng định lượng chỉ đòi hỏi giá trị đích mà không cần sử dụng

độ không đảm bảo đo do kết quả xét nghiệm được phân tích dựa trên kết quả đồng thuận của các nhóm ngang hàng (cùng sử dụng chung phương pháp và thiết bị), tức là các kết quả xét nghiệm có tính lặp lại mà không yêu cầu khắt khe về độ chính xác (Organization, 2014) Yêu cầu duy nhất đối với mẫu pha chế là đạt đồng nhất và ổn định

Mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM) được dùng để hiệu chuẩn, kiểm soát chất lượng, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và ấn định giá trị cho những vật liệu khác (mẫu RM) để có thể trở thành mẫu CRM Mẫu CRM có thể thay thế mẫu pha chế nhưng mẫu tự pha chế không thể thay thế cho CRM Mẫu CRM phải đáp ứng các tiêu chuẩn của ISO 35 và được thiết lập để truy xuất nguồn gốc phép đo Còn mẫu tự pha chế không cần phải truy xuất nguồn gốc Mẫu pha chế thường được sử dụng cho các mục đích như: so sánh các kết quả khi có sự thay đổi phương pháp và thiết bị phân tích, kiểm tra hiệu suất của thiết bị, xác nhận mức độ tương đương của các kết quả đo từ hai hoặc nhiều phòng thí nghiệm, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường (ví dụ: nhiệt độ, độ ẩm) (ISO, 2014) Ngoài ra, mẫu này có ưu điểm là có thể gia giảm các thành phần trong mẫu và có tính chất tương tự như mẫu bệnh phẩm,

có đủ số lượng để triển khai cho nhiều PXN, mẫu được đánh giá độ ổn định và độ đồng nhất trước khi gửi cho các PXN, các yêu cầu về kiểm tra chất lượng mẫu không quá khắt khe và đòi hỏi phải có giấy chứng nhận như mẫu CRM và RM (Theodorsson, 2022)

Đối với mẫu ngoại kiểm dạng tự pha chế, chất lượng của mẫu được đánh giá thông qua độ đồng nhất (sự tương đồng của các mẫu trong cùng 1 lô sản xuất), độ ổn định trong điều kiện bảo quản (tuổi thọ mẫu), độ ổn định trong điều kiện vận chuyển (theo dõi sự biến động của các thông số trong mẫu dưới các tác động vật lý và điều kiện

2.7 Quy trình đông khô

Đông khô là quá trình chuyển nước từ thể rắn sang thể hơi trong ở nhiệt độ và áp

chất lượng mẫu ban đầu: protein không bị biến tính và thủy phân và các hoạt chất sinh học không bị phá hủy, màu sắc không thay đổi Sản phẩm có cấu trúc bánh và

có thể được hoàn nguyên với nước để trở lại dạng lỏng ban đầu (Franks, 1998) Trong sản xuất mẫu ngoại kiểm tự pha chế cần có chất bảo quản ổn định, chống đông và kháng khuẩn nhưng vẫn giữ được tính toàn vẹn của các thành phần trong mẫu Chất bảo quản thường được sử dụng là ethylene glycol và sodium azide (Kulkarni et al., 2020) Ethylene glycol được biết đến là chất ổn định cho các mẫu

có nguồn gốc sinh học và thường được dùng trong điều chế huyết thanh kiểm tra chất lượng nhờ đặc tính chống đông và kháng khuẩn giúp ổn định các phân tử hữu cơ trong huyết thanh Trong khi đó, sodium azide là chất có khả năng kháng khuẩn (Fadhilah et al., 2022; Yao et al., 2017)

Trước khi đông khô, mẫu thường được trộn với chất độn (bulking agent) để giúp cho quá trình tạo bánh và đảm bảo sự kết tinh của mẫu Việc bổ sung chất độn phải không làm ảnh hưởng đến nồng độ của các thông số có trong mẫu Các chất này thường được sử dụng như D-manitol, sucrose, dextran, glycine, meso-erythritol (Kulkarni et al., 2020) Trong đó, meso-erythritol là chất đang được dùng trong chế tạo các dược phẩm dạng đông khô Meso-erythritol ngoài khả năng hỗ trợ tạo bánh đông khô, nó còn có tác dụng bảo vệ protein khỏi sự biến tính, cũng như ngăn chặn những thay đổi do các tác nhân vật lý và hóa học trong quá trình bảo quản mẫu, khả năng hòa tan cao của nó trong nước cũng góp phần cho quá trình hoàn nguyên mẫu (Fujii et al., 2015)

Trong quá trình đông khô thì nhiệt độ lạnh đông là yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm Khi lạnh đông chậm các tinh thể nước đá tạo thành có kích thước lớn sẽ phá vỡ cấu trúc protein của mẫu, làm ảnh hưởng đến tính chất của protein (Ratti, 2001) Bên cạnh đó, thời gian sấy thăng hoa là yếu tố ảnh hưởng đến chất

lượng sản phẩm Khi thời gian sấy ngắn, độ ẩm sẽ không đạt, ảnh hưởng đến chất

lượng của mẫu (Heldman & Lund, 2006)

Mẫu tuyến giáp đã lưu hành từ rất lâu nhưng chưa có một công trình nghiên cứu nào được công bố, chỉ được công bố duới dạng sáng chế Theo sáng chế của Charles

S Hollander tạo ra mẫu kiểm tra chất lượng xét nghiệm tuyến giáp bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ Hai thông số T3, T4 được tách ra khỏi huyết thanh bằng cách

ANS Đệm Barbital có tác dụng ức chế liên kết của T3, T4 với pre-albumin, và đệm ANS để ức chế liên kết của T3, T4 với TBG Dung dịch này sau đó được sử dụng làm mẫu kiểm tra chất lượng xét nghiệm tuyến giáp bằng phương pháp phóng xạ (Hollander, 1975)

Sáng chế của James và cộng sự (năm 1975) đề cập đến quy trình chế tạo mẫu kiểm tra chất lượng tuyến giáp T3 và T4 Theo sáng chế này thì các thông số T3 và T4 được tách ra từ huyết thanh có nồng độ TBG cao bằng cách trộn huyết thanh này

độ cao và loại bỏ phần dịch nổi Hỗn hợp này tiếp tục lọc chân không qua bộ lọc milipore và khuấy sau khi lọc trong 30 phút Sau đó thu nhận dung dịch chứa T3 và T4 và trộn hỗn hợp với huyết thanh sạch ban đầu và tiến hành phân phối mẫu để đông khô Kết quả thu được mẫu huyết thanh dùng để kiểm soát chất lượng tình trạng suy giáp với kết quả nồng độ T3 giảm 25% và nồng độ T4 giảm 5,3mg/100ml so với ban đầu (Turner et al., 1974)

Sáng chế của Karen và cộng sự (năm 1976) đưa ra quy trình chuẩn bị mẫu huyết thanh chuẩn dùng trong xét nghiệm phóng xạ tuyến giáp (TBG) Mẫu huyết thanh chuẩn này được điều chế bằng cách loại bỏ T4 tự do ra khỏi huyết thanh bằng cách cho tiếp xúc với các hạt alumina (nồng độ 10%) và cho huyết thanh phản ứng tiếp theo với hạt nhựa (resin) ở môi trường axit Sau đó, loại bỏ các hạt resin bằng cách

ly tâm Kết quả thu nhận được mẫu huyết thanh chuẩn không chứa T4 tự do (Karen

Trong một nghiên cứu của Stefania Giovannini và cộng sự (năm 2011) sử dụng mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp thương mại để đánh giá kết quả ngoại kiểm xét nghiệm FT3 và FT4 cho 100 phòng xét nghiệm tham gia Kết quả cho thấy một số xét nghiệm miễn dịch cho cả phép đo FT3 và FT4 cho thấy giá trị sai lệch phần trăm

so với giá trị trung bình đồng thuận >20% (S et al., 2011) Do đó, các mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp hiện nay trên thế giới đều sử dụng các mẫu thương mại và các thông số này thường hiện diện trong các mẫu ngoại kiểm sinh hóa của các hãng như Randox, Biorad, hoặc một số hãng sản xuất mẫu tuyến giáp riêng cho từng dòng máy

Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào đề cập về việc chế tạo một mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp và các PXN vẫn phải sử dụng mẫu nhập khẩu Các mẫu ngoại kiểm miễn dịch (có chứa thông số tuyến giáp) được các công ty nước ngoài (Randox, Biorad,…) cung cấp dưới dạng mẫu đông khô với thời hạn sử dụng là 6 tháng Một

bộ mẫu ngoại kiểm miễn dịch được gửi đến các phòng xét nghiệm bao gồm 6 lọ mẫu với nồng độ các thông số theo các trường hợp bệnh cảnh khác nhau Do đó, việc chế tạo một bộ mẫu ngoại kiểm miễn dịch chuyên biệt được sản xuất trong nước và đáp ứng nhu cầu về mẫu ngoại kiểm của các phòng xét nghiệm là mục tiêu mà nghiên cứu

sẽ hướng tới

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị

3.1.1 Nguyên vật liệu hóa chất:

- Huyết tương tươi đông lạnh thu thập từ bệnh viện Truyền máu Huyết học

- Canxi clorua (hãng Sigma- Mỹ)

- Thrombin 1kU (hãng Sigma- Mỹ)

- Ethylene glycol (hãng Sigma- Mỹ)

- Sodium azide (hãng Sigma- Mỹ)

- Máy đông khô (hãng Alpha 2-4 LD plus - Đức)

- Máy miễn dịch tự động (hãng Roche cobas e411 - Mỹ)

- Micropipette các loại (hãng Thermo Scientific - Mỹ)

- Vật tư tiêu hao (cuvet, đầu típ, bao tay y tế…)

- Ống nghiệm nhựa

3.2 Thu thập mẫu

Tiêu chí chọn mẫu: mẫu huyết tương/huyết thanh được thu thập từ bệnh viện

Nguyễn Tri Phương có 3 thông số TSH, FT3, FT4 ở mức nồng độ bệnh lý suy giáp cận lâm sàng (các mẫu có nồng độ TSH cao, FT3 và FT4 bình thường) và đã được bệnh viện chấp thuận cho phép thu thập mẫu để sử dụng cho mục đích nghiên cứu theo quyết định số 2590/NTP-HĐĐĐ ngày 19/06/2023 Các mẫu này đã được kiểm

tra nồng độ ban đầu của các thông số FT3, FT4, TSH trên máy xét nghiệm miễn dịch

tự động tại PXN của bệnh viện Nguyễn Tri Phương

Tiêu chí loại trừ mẫu: mẫu huyết tương/huyết thanh không bị tán huyết sẽ được chấp nhận đưa vào nghiên cứu Mẫu không được bảo quản quá 7 ngày sau khi thu thập

bảo an toàn trong quá trình thao tác thì phải xử lý mẫu trong tủ an toàn sinh học cấp

II và tuân thủ các yêu cầu về thải bỏ mẫu nghiệm phẩm

Các mẫu huyết tương tươi đông lạnh được thu thập từ bệnh viện Truyền máu Huyết học sử dụng làm chất nền trong nghiên cứu đã được bệnh viện kiểm tra âm tính với các yếu tố truyền nhiễm như HBV, HCV, HIV, giang mai,…

3.3 Cỡ mẫu

Thu thập 100 mẫu huyết tương bệnh phẩm với tổng thể tích là 90 ml từ bệnh viện Nguyễn Tri Phương tương ứng với bệnh lý suy giáp cận lâm sàng (nồng độ TSH cao, FT3 và FT4 bình thường) Sau đó, 90ml huyết tương sẽ được xử lý, phối trộn với dung dịch nền huyết thanh và các chất bảo quản để có 141 mẫu (mỗi mẫu là 3ml) cho các nghiên cứu trong đề tài, bao gồm:

+ Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng bằng ma trận Plackett-Burman: 12 mẫu tương ứng 12 nghiệm thức của ma trận Plackett-Burman mà phần mềm Design Expert 7.0 đưa ra (Plackett & Burman, 1946)

+ Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng bằng RSM-CCD: 20 mẫu tương ứng với 20 nghiệm thức theo phương pháp RSM-CCD mà phần mềm Design Expert 7.0 đưa

ra (Plackett & Burman, 1946; Khuri, A I., & Cornell, J A., 1988)

+ Đánh giá độ đồng nhất mẫu: 20 mẫu (Thompson et al., 2006)

+ Đánh giá độ ổn định mẫu theo thời gian bằng lão hóa cấp tốc: 50 mẫu

(Organization, 2014; Ljunggren et al., 1977; Magalhães et al., 2018)

+ Độ ổn định mẫu trong điều kiện vận chuyển (gửi 6 đơn vị ở thành phố và

3 đơn vị ở tỉnh, mỗi đơn vị 01 mẫu): 09 mẫu (ISO Guide 35; ISO Guide 80) + Xác định giá trị đích ban đầu của mẫu tương ứng 3 phương pháp thực hiện: miễn dịch enzyme, điện hóa phát quang và hóa phát quang: 30 mẫu (Thomas, 2011; Berge Kristensen & Meijer, 2017)

Tổng số mẫu nghiên cứu: 141 mẫu

3.4 Xử lý và pha chế mẫu ngoại kiểm miễn dịch tuyến giáp dạng lỏng từ huyết tương bệnh phẩm sau khi thu thập từ các bệnh viện

Nguồn nguyên liệu ban đầu là mẫu bệnh phẩm (huyết tương hoặc huyết thanh) thu thập từ các bệnh viện không đồng nhất về màu sắc và nồng độ của 3 thông số TSH, FT3, FT4 nên cần phải được kiểm tra nồng độ ban đầu Dựa vào kết quả nồng

độ ban đầu của 3 thông số TSH, FT3, FT4 trong 100 mẫu huyết tương thu thập mà PXN cung cấp Sau đó, trộn các mẫu lại với nhau tạo thành hỗn hợp mẫu ban đầu Chuyển hỗn hợp mẫu ban đầu ở dạng huyết tương thành huyết thanh sau đó đo lại nồng độ của 3 thông số tuyến giáp (C1) (lặp lại 3 lần) Chất nền được sử dụng để pha chế các mẫu dùng trong nghiên cứu ở trên là huyết tương người thu thập từ bệnh viện Truyền máu huyết học đã bệnh viện được kiểm tra âm tính với các virus HBV, HCV, HIV, giang mai,…(phụ lục 1.11) được chuyển thành huyết thanh và kiểm tra nồng

độ ban đầu TSH, FT3, FT4 (C2) (lặp lại 3 lần) như sau:

+ Giai đoạn 1: Điều chế dung dịch Thrombin - CaCl2

Hòa tan 11,1g CaCl2 trong 100 ml nước cất thu được dung dịch CaCl2 1M Sau đó, hòa tan bột đông khô Thrombin 1kU trong 10 ml dung dịch CaCl2 1M thu

+ Giai đoạn 2: Chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh