BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10 15625/vap 2020 00083 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri LÊN CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA ( Pangasianodon hypophthalmus ) Trần Thị Phương Dung * , Nguyễn Hồ Phương Uyên Tóm tắt : Đề tài được thực hiện với mục tiêu đánh giá sự biến động về huyết học và khả năng diệt khuẩn của huyết thanh trên cá Tra giống (45 - 50 g) khi nhiễm vi khuẩn Edwarsiella ictaluri sau 2 - 4 tuần Vi khuẩn Edwarsiella ictaluri là tác nhân gây chết cá Tra giống c hiếm tỉ lệ 51,2% Kết quả phân tích các chỉ tiêu huyết học cho thấy số lượng hồng cầu giảm mạnh ở cá bị bệnh mủ gan (p < 0,05), đồng thời có sự xuất hiện của hồng cầu không nhân và hồng cầu thoái hóa C ác loại bạch cầu lympho, bạch cầu mono hay bạch cầu trung tính đều biến động theo hướng giảm ở thời điểm sau hai tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn nhưng tăng trở lại sau bốn tuần có ý nghĩa thống kê (p < 0,05 ) Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh cá bệnh cao hơn cá khỏe Từ khóa: Edwardsiella ictaluri , Panga sianodon hypophthalmus , huyết học, miễn dịch 1 MỞ ĐẦU Cá Tra ( Pangasianodon hypophthalmus ) là m ộ t trong những loài cá da trơn nước ngọt có giá trị kinh tế cao được nuôi phổ biến ở Đồng bằng Sông Cửu Long ( ĐBSCL ) (Phan v à nnk , 2009 ) Theo thống kê từ Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP) , trong 9 tháng đ ầ u năm 2018 kim ngạch xuất khẩu cá Tra đến 127 quốc gia trên thế giới đạt 1,6 tỉ USD, tăng 24% so với cùng kỳ năm 2017 Tuy nhiên, trong những năm gần đây, việc sản xuất và tiêu thụ cá Tra đang phải đối mặt với nhiều khó khăn và thách thức do giá cả bấp bênh, thị trường xuất khẩu không ổn định và việc thâm canh hóa với mật đ ộ nuôi cao đã làm cho bệnh trên cá xảy ra thường xuyên hơn (Le & Cheong, 2010) B ệnh phổ biến và nguy hiểm trê n cá Tra gi ố ng ở ĐBSCL từ năm 2007 là bệnh mủ gan ( chiếm 51,2%) ( Lý Thị Thanh Loan, 2008) Hiện nay, các nghiên c ứ u về vaccine nhằm tăng cường kh ả năng đ ề kh á ng cao, góp phần thúc đẩy nghề nuôi th ủ y s ả n bền vững và hiệu quả hơn về kinh tế cũng như môi trường N hiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh lí , sinh hóa, khả năng gây bệnh, độc lực của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cũng như sự biến đổi mô học do vi khuẩn này gây ra đã được công bố trên các đối tượng cá Tra với các kích cỡ khác nhau làm nền tảng cho việc tạo vaccine Tuy nhiên , thông tin về sự biến đổi các chỉ số huyết học và khả năng miễn dịch của cá Tra bị nhiễm vi khuẩn E ictaluri giai đoạn cá giống (45 - 50 g) rất ít và rời rạc Nghiên cứu này nhằm đánh giá tổng quát sự biến động các t ế bào máu và kháng thể đặc hiệu bảo vệ cá Tra ( Pangasianodon hypophthalmus) chống lại vi khuẩn E ictaluri khi nhiễm bệnh ngoài tự nhiên V ì vậy , nghiên cứu về ảnh hưởng của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri lên các chỉ tiêu huyết học và khả năng tiêu diệt vi khuẩn huyết thanh của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) giai Trư ờ ng Đ ạ i h ọ c Sư ph ạ m Thành ph ố H ồ Chí Minh * Email: dungttp@hc mue edu vn PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 671 đoạn cá giống từ 45 - 50 g trong thời gian mắc bệnh dài từ 2 - 4 tuần được thực hiện góp phần cung cấp thêm thông tin làm cơ sở cho việc chẩn đo án và phòng bệnh bệnh mủ ga n một cách đầy đủ hơn 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Vật liệu Cá Tra giống ( Pangasianodon hypophthalmus ) có kích cỡ khoảng 45 - 50 g/con C á được nuôi ổn định 3 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm để cho cá quen với điều kiện sống trong bể Cá đư ợ c nuôi trong môi t rường nước pH=7 - 7, 5, nhiệt độ duy trì ở mức nhiệt độ phòng tương ứng nhiệt độ nước 27 - 28 o C Cá được cho ăn thức ăn công nghiệp 3 lần/ngày vào lúc 7 h, 12 h, 17 h Chọn cá bố trí thí nghiệm có kích thước tương đối đồng đều, khỏe mạnh, linh hoạ t và da sáng bóng Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm với 3 nghiệm thức (NT) : (i) NT 1 cá tiêm nước muối sinh lí ; (ii) NT 2 cá tiêm vi khuẩn nồng độ 10 4 CFU/mL ; (iii) NT 3 cá tiêm vi khuẩn nồng độ 10 5 CFU/mL Mỗi NT 15 con (lặp lại 3 lần) Thu mẫu máu 15 cá thể /NT qua 3 thời điểm: (i) Lần 1: t rước cảm nhiễm; (ii) Lần 2: s au khi tiêm cá với vi khuẩn hay nước muối sinh lí 2 tuần; (iii) Lần 3: s au khi tiêm cá với vi khuẩn hay nước muối sinh lí 4 tuần 2 2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nhuộm vi khuẩn g ram âm mẫu phết mô Phương pháp được mô tả bởi Lưu Thị Thanh Trúc (2014) : phết mẫu mô chứa vi khuẩn lên lam, cố định bằng đèn cồn, sau đó cho lần lượt các dung dịch Crustal violet (30 giây), lugon (60 giây), ethanol (15 - 30 giây), s afranin (60 - 80 giây) Tại mỗi bướ c đều rửa bằng nước cất 5 giây Sau đó đưa lam lên kính quan sát ở vật kính (X40) Phương pháp nhuộm HE mẫu mô Phương pháp được mô tả bởi Lưu Thị Thanh Trúc (2014) : cố định mẫu bằng formalin 10% Sau đó cắt tỉa mẫu, khử nước, làm trong mẫu và ngấm paraffin Sau đó tiến hành đúc khối mẫu, cắt mẫu Nhuộm mẫu bằng Mayer’s Hematoxylin và Eosin (HE) Sau đó đưa lam lên kính quan sát ở vật kính (X40) Phương pháp định lượng số lượng hồng cầu Phương pháp được mô tả bởi Natt & Herrick (1952) có hiệu chỉnh : l ấy máu cá từ động mạch ch ủ đuôi bằng kim tiêm 1 mL tiệt trùng Dùng ống hút pha loãng hồng cầu hút máu lên đúng vạch 0,5 Đưa đầu ống pha loãng vào dung dịch pha loãng hồng cầu (Hayems) , hút từ từ đến vạch 101, vừa hút vừa xoay nhẹ ống pha loãng Ngừng hút khi đ ến vạch 101, rút ống pha loãng ra khỏi dung dịch pha loãng, đặt ngón trỏ vào đầu của ống pha loãng, tháo dây hút ra Lắc ống pha loãng trong 3 phút Bỏ 3 - 4 giọt đầu, lau khô đầu ống pha loãng, Cho hỗn hợp dung dịch lan tỏa vào đầy buồng đếm , để yên trong 2 phút Đếm hồng cầu 4 ô lớn (1 ô lớn có 16 ô nhỏ) ở 4 góc của buồng đếm và 1 ô ở trung tâm buồng đếm Công thức tính mật độ hồng cầu: N1 = A x (4000 : 80) x 200 = A x 10000 (số hồng cầu đếm được trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ) là A) 672 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Phương pháp định lượng số lư ợng bạch cầu tổng Phương pháp được mô tả bởi Hrubec et al , ( 2000) như sau: n hỏ một giọt máu cách đầu lam kính 1 cm Một tay giữ lam kính, tay còn lại cầm lam kéo, nghiêng 45 o tiếp xúc cạnh ngắn vào giọt máu để cho máu lan tỏa theo cạnh này, khi giọt máu đã được chia đều, đẩy nhanh và đều lam kéo theo chiều dài của lam nằm ngang Cố định tiêu bản bằng cách tay trái cầm tiêu bản nghiêng 30 o , tay phải cầm pipet nhỏ 3 - 4 giọt cồn tuyệt đối lên phần đầu của tiêu bản, nghiêng tiêu bản cho cồn chảy hết về đuôi của tiêu bản máu Nhỏ giọt dung dịch thuốc nhuộm Giem sa phủ kín diện tích máu, để 15 - 20 phút sau đó rửa tiêu bản Đếm tổng số 1 500 tế bào hồng cầu và bạch cầu trên mẫu nhuộm TBC = (Số bạch cầu trong 1 500 tế bào × R) / Số hồng cầu trong 1 500 tế bào ( TBC là số lượng bạch cầu trong 1 mm 3 máu R là số lượng hồng cầu trong 1 mm 3 máu Phương pháp định lượng số lượng từng loại bạch cầu Phương pháp được mô tả bởi Hrubec et al , ( 2000) : đ ếm tổng số bạch cầu bằng 100 tế bào M ật độ từng loại bạch cầu (tb/mm 3 ) = (số lượng mỗi loại BC × mật độ TBC)/100 Phương pháp xác định khả năng diệt khuẩn của huyết thanh Phương pháp được mô tả bởi Từ Thanh Dung và nnk ( 2013 ) như sau: Dùn g kim tiêm 1 mL để lấy máu và cho vào ống eppendorf 1,5 mL , để yên và giữ lạnh ở 4 o C trong vòng 2 - 3 giờ Tiến hành li tâm 6 000 vòng/phút trong 5 phút Sau khi li tâm, lấy phần huyết thanh cho vào ống eppendorf sạch và tiến hành xác định hiệu giá kháng thể hoặc trữ lạnh ( - 20 o C) Vi khuẩn E ictaluri được bất hoạt bằng formol 2% và giữ trong ngăn mát tủ lạnh 24 giờ Sau đó, du ng dịch vi khuẩn được li tâm 3500 vòng/phút trong 15 phút để rửa sạch formol bằng nước muối sinh lí tiệt trùng, thao tác được lặp lại 2 - 3 lần Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh được xác định bằng phản ứng vi ngưng kết kháng nguyên - kháng thể trên các đĩa nhựa (microplate) 96 giếng Cho 25 μL huyết thanh vào giếng số 1 và 2 Từ giếng số 2 trở đi cho vào mỗi giếng 25 μL nước muối sinh lí Trộn đều huyết thanh với nước muối sinh lí ở giếng 1, hút 25 μL chuyển sang giếng số 2 rồi trộn đều, tiếp tục hút 25 μL ở giếng số 2 chuyển sang giếng 3 rồi trộn đều Tiếp tục làm như vậy cho đến giếng cuối cùng (ở giếng 12 lấy ra 25 μL bỏ đi) Cho 25 μL kháng nguyên (vi khuẩn E ictaluri bị bất hoạt) vào mỗi giếng rồi trộn đều Để yên 4 - 5 giờ ở nhiệt độ phòng rồi đọc kết quả Dương tính (+) : đáy giếng tạo thành một lớp ngưng kết trải rộng Âm tính ( - ) : ở đáy giếng chỉ có một chấm tròn nhỏ màu trắng 2 3 Xử lí số liệu S ố liệu được xử lí dựa trên một nhân tố bằng cách sử dụng phần mềm MS Excel nhập và xử lí số liệu Các s ố liệu trung bình được trình bày ở dạng TB ± SD Phân tích thống kê bằng phương sai một yếu tố mẫu đo lường có lặp lại ( ONE WAY ANOVA) Sử dụng kiểm định so sánh đối chiếu Duncan được dùng để so sánh sự khác biệt giữa các mức của yếu tố thí nghiệm Mức xác suất p < 0,05 được chấp nhận như tiêu chuẩn đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Tất cả các phân tích thống kê đư ợc thực hiện bằng phần mềm I BM SPSS Statistics version 22 0 PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 673 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3 1 Ả nh hư ở ng c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri đ ế n hình thái n ộ i quan và mô h ọ c c ủ a cá Tra Các đặc điểm về hình thái nội quan và mô học cá Tra nhiễm vi khuẩn E ictaluri qua nghiên cứu này trên cá Tra giống giai đoạn 45 - 50 g cho thấy vi khuẩn xâm nhập vào các nội quan sau 12 h cảm nhiễm; khi bị xâm bởi nhiễm vi khuẩn E ictaluri thì các cơ quan như gan, thận và tỳ tạng xuất hiện các biểu hiện đặc trưng cho bệnh mủ gan nh ư xung huyết, xuất huyết, xuất hiện đốm trắng mủ từ 1 - 3 mm sau 3 ngày gây nhiễ m và hoại tử các nội quan khi quan sát mô học khi nhuộm HE dưới kính hiển vi (Hình 1) Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Suanyuk et al , (2013) và Soto (2012) với các bệnh tích điển hình do vi khuẩn Edwarsiella ictaluri Hình 1 a N ộ i quan cá v ớ i nhi ề u đ ố m tr ắ ng; b Vi khu ẩ n xâm nh ậ p vào mô cá sau 12 h (nhu ộ m Gram âm v ệ t ph ế t m ẫ u mô); c T ổ n thương xu ấ t huy ế t và ngh ẽ n c ầ u th ậ n trên mô th ậ n sau 72 h (nhu ộ m HE); d T ổ n thương xu ấ t huy ế t trên mô gan sau 72 h (X40) (nhu ộ m HE) 3 2 Ả nh hư ở ng c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri đ ế n s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u c ủ a cá Tra Bên cạnh hồng cầu trưởng thành với hình dạng bình thường với cấu trúc hình cầu , ở những bể cá được cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri trong đợt thu mẫu lần 2 và 3 còn ghi nhận được sự xuất hiện của nhiều dạng hồng cầu bất thường như hồng cầu khôn g nhân và hồng cầu bị thoái hóa (Hình 2) Hình 2 a Vi khu ẩ n bao quanh HC sau 6 h c ả m nhi ễ m; b HC m ấ t nhân sau 2 tu ầ n c ả m nhi ễ m; c HC thoái hóa sau 2 tu ầ n c ả m nhi ễ m (X40) b c d a b a c 674 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Trong những nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy Liễu và nnk (2011 ) cũng ghi nhận được sự xuất hiện của các dạng hồng cầu bất thường ở đối tượng cá Tra bị nhiễm bệnh B ả ng 1 S ự bi ế n đ ộ ng s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u (x10 6 TB/mm 3 ) c ủ a cá Tra qua các l ầ n thu m ẫ u ở các m ậ t đ ộ vi khu ẩ n E ictaluri kh ả o sát Th ờ i gian Đ ố i ch ứ ng NT1 (10 4 CFU/ml) NT2 (10 5 CFU/ml) L ầ n 1 2,071 ± 0,134 xa 2,057 ± 0,113 xa 2,099 ± 0,123 xa L ầ n 2 2,103 ± 0,124 xa 1,279 ± 0,089 yb 1,284 ± 0,090 yb L ầ n 3 2,131 ± 0,129 xa 1,310 ± 0,068 yb 1,301 ± 0,075 yb Các ch ữ cái x, y trong cùng m ộ t c ộ t ch ỉ s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê v ớ i p< 0,05 Các ch ữ cái a, b trong cùng m ộ t hàng ch ỉ s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê v ớ i p< 0,05 T ừ k ế t qu ả đ ị nh lư ợ ng h ồ ng c ầ u ở B ả ng 1 có th ể nh ậ n th ấ y: (1) s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u ở NT đ ố i ch ứ ng qua các l ầ n thu m ẫ u không có s ự khác bi ệ t có ý nghĩ a th ố ng kê (p > 0,05) ch ứ ng t ỏ trong su ố t th ờ i gian ti ế n hành thí nghi ệ m không có s ự ả nh hư ở ng c ủ a các tác nhân ngo ạ i c ả nh làm thay đ ổ i các ch ỉ s ố huy ế t h ọ c; (2) cá sau khi c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri ở c ả hai NT 10 4 và 10 5 CFU/m đ ề u có s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u thu ở l ầ n 2 , l ầ n 3 gi ả m có ý nghĩa th ố ng kê (p < 0,05) so v ớ i l ầ n 1 trư ớ c khi c ả m nhi ễ m và so v ớ i NT đ ố i ch ứ ng Nguyên nhân là do vi khu ẩ n xâm nh ậ p vào xung quanh h ồ ng c ầ u và gây v ỡ h ồ ng c ầ u sau 24 gi ờ sau gây nhi ễ m (Quách Văn Cao Thi, 2017) S ự bi ế n đ ộ n g s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u theo chi ề u hư ớ ng gi ả m ở l ầ n thu m ẫ u th ứ 2 và 3 ở NT 2 và NT3 cũng phù h ợ p v ớ i m ộ t s ố nghiên c ứ u khác, như Nguy ễ n Th ị Thúy Li ễ u và nnk (2011 ) khi phân tích các thông s ố huy ế t h ọ c ở cá Tra nuôi b ị b ệ nh m ủ gan đã xác đ ị nh s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u ở cá b ệ nh ch ỉ còn 0,75x10 6 TB/mm 3 , gi ả m 63,4% so v ớ i cá kh ỏ e 3 3 Ả nh hư ở ng c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri đ ế n t ổ ng s ố lư ợ ng b ạ ch c ầ u c ủ a cá Tra B ả ng 2 S ự bi ế n đ ộ ng s ố lư ợ ng t ổ ng b ạ ch c ầ u (x10 4 TB/mm 3 ) c ủ a cá Tra qua các l ầ n thu m ẫ u ở các m ậ t đ ộ vi khu ẩ n E ictaluri kh ả o sát Th ờ i gian Đ ố i ch ứ ng NT1 (10 4 CFU/ml) NT2 (10 5 CFU/ml) L ầ n 1 13,773 ± 2,815 xa 13,046 ± 2,350 xa 12,633 ± 2,431 xa L ầ n 2 13,146 ± 2,780 xa 4,889 ± 1,091 yb 4,855 ± 1,021 yb L ầ n 3 13,040 ± 2,508 xa 8,138 ± 1,175 zb 7,835 ± 1,218 zb Các ch ữ cái x, y, z trong cùng m ộ t c ộ t ch ỉ s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê v ớ i p< 0,05 Các ch ữ cái a, b trong cùng m ộ t hàng ch ỉ s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê v ớ i p< 0,05 T ừ B ả ng 2 cho th ấ y: (i) k ế t qu ả đ ị nh lư ợ ng t ổ ng BC c ủ a cá kh ỏ e trư ớ c khi thí nghi ệ m c ủ a các NT không có s ự khác bi ệ t (p > 0, 05) và đ ạ t giá tr ị trung bình là (13,773 ± 2,815)x10 4 TB/mm 3 đ ố i v ớ i NT đ ố i ch ứ ng , NT1 và NT2 l ầ n lư ợ t là (13,046 ± 2,350)x10 4 TB/mm 3 và (12,633 ± 2,431)x10 4 TB/mm 3 ; (ii) s ố lư ợ ng t ổ ng BC ở NT đ ố i ch ứ ng qua c ả 3 l ầ n thu m ẫ u đ ề u không có s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê (p > 0,05) ch ứ ng t ỏ trong su ố t th ờ i gian ti ế n hành thí nghi ệ m, s ự bi ế n đ ộ ng c ủ a s ố lư ợ ng t ổ ng b ạ ch c ầ u không ch ị u ả nh hư ở ng c ủ a các tác nhân n go ạ i c ả nh; (iii) ở các NT đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n, lư ợ ng PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 675 t ổ ng b ạ ch c ầ u đ ề u gi ả m ở l ầ n 2 và b ắ t đ ầ u tăng tr ở l ạ i vào l ầ n 3 v ớ i s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê (p < 0,05) và t ổ ng BC ở NT2 và NT3 qua l ầ n l ấ y m ẫ u 2 và 3 đ ề u th ấ p hơn NT1 đ ố i ch ứ ng K ế t qu ả này phù h ợ p nghiên c ứ u Benli & Yildiz (2004) khi c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n trên cá đã k ế t lu ậ n r ằ ng kho ả ng vài ngày đ ầ u sau khi đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n, t ổ ng lư ợ ng b ạ ch c ầ u c ủ a cá s ẽ tăng cao đ ể ch ố ng l ạ i s ự xâm nh ậ p và t ấ n công c ủ a vi khu ẩ n Bên c ạ nh đó, m ộ t s ố ngh iên c ứ u g ầ n đây cũng đã ghi nh ậ n r ằ ng s ố lư ợ ng t ổ ng b ạ ch c ầ u ở cá b ệ nh khi thu m ẫ u ở nh ữ ng giai đo ạ n khác nhau s ẽ có s ự bi ế n đ ộ ng khác nhau Ngoài ra, nghiên c ứ u c ủ a T ừ Thanh Dung (2010) k ế t lu ậ n r ằ ng m ậ t đ ộ t ổ ng b ạ ch c ầ u c ủ a cá Tra có s ự thay đ ổ i rõ r ệ t tùy thu ộ c vào m ứ c đ ộ nhi ễ m b ệ nh c ủ a cá D ự a trên nh ữ ng cơ s ở và nghiên c ứ u trên, có th ể d ự đoán s ố lư ợ ng t ổ ng b ạ ch c ầ u c ủ a cá Tra ngay sau khi đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri có tăng so v ớ i cá kh ỏ e đ ể ch ố ng l ạ i s ự xâm nhi ễ m và t ấ n công c ủ a vi khu ẩ n, nh ằ m b ả o v ệ cơ th ể Tuy nhiên ở th ờ i đi ể m thu m ẫ u l ầ n 2, s ố lư ợ ng t ổ ng b ạ ch c ầ u có s ự suy gi ả m m ạ nh có th ể gi ả i thích do chính s ự tác đ ộ ng c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri lên c ấ u trúc mô c ủ a m ộ t s ố cơ quan, đ ặ c bi ệ t là th ậ n trư ớ c và t ỳ t ạ ng trong m ộ t th ờ i gian dài t ừ đó làm bi ế n đ ổ i c ấ u trúc và suy gi ả m ch ứ c năng t ạ o máu c ủ a nh ữ ng cơ quan này (Brason, 1993) Theo nghiên c ứ u v ề đ ặ c đi ể m mô b ệ nh h ọ c c ủ a cá Tra b ị b ệ nh m ủ gan c ủ a Quách Văn Cao Thi (2017 ), ở ngày th ứ 2 sau khi c ả m nhi ễ m quan sát mô th ậ n c ủ a cá th ấ y đã b ắ t đ ầ u xu ấ t hi ệ n hi ệ n tư ợ ng xung huy ế t, xu ấ t huy ế t d ẫ n đ ế n th ậ n m ấ t đi nh ữ ng ch ứ c năng quan tr ọ ng và làm suy gi ả m ch ứ c năng t ạ o h ồ ng c ầ u, b ạ ch c ầ u, không còn kh ả năng t ạ o kháng th ể và th ự c bào Đây chính là nh ữ ng nguyên nhân làm cho s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u và t ổ ng b ạ ch c ầ u trong hai NT đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri đ ề u gi ả m đáng k ể ở l ầ n thu m ẫ u sau hai tu ầ n c ả m nhi ễ m Tuy nhiên, ở l ầ n thu m ẫ u sau b ố n tu ầ n cá đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n, s ố lư ợ ng h ồ ng c ầ u và b ạ ch c ầ u đ ề u có s ự tăng nh ẹ so v ớ i l ầ n thu m ẫ u trư ớ c có th ể gi ả i thích do vai trò đáp ứ ng mi ễ n d ị ch t ạ o kháng th ể nguyên phát (Đ ặ ng Th ị Hoàng Oanh và Đoàn Nh ậ t Phương , 2007) 3 4 Ả nh hư ở ng c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri đ ế n s ố lư ợ ng các lo ạ i b ạ ch c ầ u c ủ a cá Tra Trong quá trình phân tích đ ị nh lo ạ i và đ ị nh lư ợ ng t ế bào b ạ ch c ầ u, đã ghi nh ậ n đư ợ c s ự xu ấ t hi ệ n c ủ a các lo ạ i b ạ ch c ầ u như: b ạ ch c ầ u lympho, b ạ ch c ầ u đơn nhân, b ạ ch c ầ u trung tính, không quan sát đư ợ c b ạ ch c ầ u ưa bazơ , b ạ ch c ầ u ưa axit r ấ t hi ế m g ặ p nên không th ể đ ị nh lư ợ ng (Hình 3) Hình 3 a BC Lympho; b BC mono; c BC trung tính (mũi tên) (X40) b a c 676 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Nghiên c ứ u v ề s ự bi ế n đ ộ ng c ủ a các y ế u t ố mi ễ n d ị ch không đ ặ c hi ệ u trên cá Tra nuôi nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri c ủ a Nguy ễ n Th ị Thúy Li ễ u và nnk (2011 ) cũng cho k ế t qu ả không quan sát đư ợ c b ạ ch c ầ u ưa axit và b ạ ch c ầ u ưa bazơ 3 5 Ả nh hư ở ng c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri đ ế n t ỉ l ệ các lo ạ i b ạ ch c ầ u c ủ a cá Tra B ả ng 3 S ự bi ế n đ ộ ng t ỉ l ệ các l ọ ai b ạ ch c ầ u (x10 6 TB/mm 3 ) c ủ a cá Tra qua các l ầ n thu m ẫ u ở các m ậ t đ ộ vi khu ẩ n E ictaluri kh ả o sát NT B ạ ch c ầ u Đ Ố I CH Ứ NG NT1 (10 4 CFU/ml) NT2 (10 5 CFU/ml) L ầ n 1 L ầ n 2 L ầ n 3 L ầ n 1 L ầ n 2 L ầ n 3 L ầ n 1 L ầ n 2 L ầ n 3 Lympho 11,164 ± 2,322 xa 10,799 ± 2,633 xa 10,619 ± 2,135 xa 10,539 ± 1,829 xa 3,181 ± 0,775 yb 5,399 ± 0,721 zb 10,394 ± 2,208 xa 3,511 ± 0,684 yb 5,670 ± 0,926 zb Neutro 1,253 ± 0,435 xa 1,079 ± 0,286 xa 1,048 ± 0,338 xa 1,145 ± 0,480 xa 0,748 ± 0,261 yb 1,157 ± 0,491 xa 1,043 ± 0,387 xa 0,586 ± 0,231 yb 0,964 ± 0,246 xa Mono 1,323 ± 0,370 xa 1,269 ± 0,348 xa 1,331 ± 0,291 xa 1,365 ± 0,357 xa 0,958 ± 0,217 yb 1,581 ± 0,290 xb 1,189 ± 0,248 xa 0,755 ± 0,199 yb 1,201 ± 0,188 xa Các ch ữ cái a, b,c, trong cùng m ộ t hàng ch ỉ s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê v ớ i p< 0,05 Các ch ữ cái x,y trong cùng m ộ t c ộ t ch ỉ s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê v ớ i p< 0,05 D ự a vào k ế t qu ả s ố lư ợ ng t ừ ng lo ạ i BC phân tích ở B ả ng 3, nhìn chung các lo ạ i BC lympho, BC mono hay BC trung tính đ ề u bi ế n đ ộ ng theo hư ớ ng gi ả m ở th ờ i đi ể m sau hai tu ầ n cá đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n nhưng tăng tr ở l ạ i sau b ố n tu ầ n T rong 2 NT đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n so v ớ i NT đ ố i ch ứ ng , t ỉ l ệ các lo ạ i BC l ạ i có s ự bi ế n đ ộ ng gi ả m sau 2 tu ầ n và vào th ờ i đi ể m b ố n tu ầ n có s ự b ắ t đ ầ u tăng l ạ i c ủ a các lo ạ i b ạ ch c ầ u S ự thay đ ổ i t ỉ l ệ các lo ạ i BC trư ớ c và sau khi đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri có th ể đư ợ c gi ả i thí ch do BC neutro có vai trò trong ph ả n ứ ng viêm, là lo ạ i BC đ ầ u tiên đ ế n v ị trí vi khu ẩ n xâm nh ậ p v ớ i s ố lư ợ ng l ớ n, ngoài ra còn có kh ả năng th ự c bào Do đó s ự tăng nh ẹ t ỉ l ệ BC trung tính cho th ấ y t ạ i th ờ i đi ể m thu m ẫ u sau hai tu ầ n cá đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n ho ạ t đ ộ ng c ủ a h ệ b ạ ch huy ế t đang đư ợ c gia tăng đ ể tiêu di ệ t các vi sinh v ậ t l ạ xâm nh ậ p vào cơ th ể BC mono là t ế bào tham gia vào h ệ th ố ng mi ễ n d ị ch không đ ặ c hi ệ u v ớ i vai trò th ự c bào tiêu di ệ t vi khu ẩ n và đ ặ c bi ệ t là kh ả năng trình di ệ n kháng nguyên đ ể th ự c hi ệ n bư ớ c kh ở i đ ầ u c ủ a quá trình đáp ứ ng mi ễ n d ị ch đ ặ c hi ệ u Sau hai tu ầ n c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n, t ỉ l ệ BC mono có gia tăng nh ẹ nh ằ m giúp h ệ th ố ng mi ễ n d ị ch nh ậ n b i ế t đư ợ c kháng nguyên, s ả n xu ấ t kháng th ể chuyên bi ệ t M ặ t khác, BC lympho có vai trò quan tr ọ ng trong mi ễ n d ị ch d ị ch th ể và mi ễ n d ị ch t ế bào nên s ự gi ả m nh ẹ t ỉ l ệ BC lympho có th ể do s ự xâm nhi ễ m c ủ a vi khu ẩ n E ictaluri vào cơ th ể cá làm suy gi ả m h ệ mi ễ n d ị ch và tình tr ạ ng này kéo dài trong hai tu ầ n gây ra hi ệ n tư ợ ng đó Sau 4 tu ầ n vi khu ẩ n b ị suy y ế u nên các lo ạ i b ạ ch c ầ u tăng đ ể s ả n xu ấ t kháng th ể tham gia đáp ứ ng mi ễ n d ị ch K ế t qu ả này phù h ợ p v ớ i hàm lượng kháng thể tăng lên mãnh liệt để đạt cực đại khoảng ngày thứ 20 - 30 sau khi tiêm kháng nguyên ( Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương , 2007) PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 677 3 6 Xác đ ị nh hi ệ u giá kháng th ể c ủ a cá Tra sau b ố n tu ầ n c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri Kháng th ể huy ế t thanh thư ờ ng xu ấ t hi ệ n ngay trư ớ c th ờ i đi ể m s ố lư ợ ng tương bào đ ạ t c ự c đ ạ i kho ả ng ngày th ứ 10 - 15 và hàm lư ợ ng kháng th ể tăng lên mãnh li ệ t đ ể đ ạ t c ự c đ ạ i kho ả ng ngày th ứ 20 - 30 sau khi tiêm kháng nguyên (Đ ặ ng Hoàng Oanh và Đoàn Nh ậ t Phương , 2007) D ự a trên cơ s ở đó thí nghi ệ m gây đáp ứ ng mi ễ n d ị ch cho cá Tra đư ợ c th ự c hi ệ n ở th ờ i đi ể m sau b ố n tu ầ n k ể t ừ ngày c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri cho cá đ ể đ ả m b ả o hi ệ u giá kháng th ể thu đư ợ c đ ạ t c ự c đ ạ i Hình 4 Bi ế n đ ộ ng hi ệ u giá kháng th ể c ủ a cá Tra qua các l ầ n thu m ẫ u ở các m ậ t đ ộ vi khu ẩ n E ictaluri (CFU/ml) kh ả o sát K ế t qu ả phân tích hi ệ u giá kháng th ể cho th ấ y có s ự khác bi ệ t có ý nghĩa th ố ng kê (p < 0,05) gi ữ a các NT sau b ố n tu ầ n c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri C ụ th ể , hi ệ u giá kháng th ể trung bình c ủ a cá ở NT đ ố i ch ứ ng có giá tr ị là 0,27 ± 0,57, ch ứ ng t ỏ h ệ th ố ng mi ễ n d ị ch ở nhóm cá đ ố i ch ứ ng chưa đư ợ c kích thích nên lư ợ ng kháng th ể r ấ t th ấ p Ở các NT đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n thì hi ệ u giá kháng th ể trung bình tăn g rõ r ệ t so v ớ i NT đ ố i ch ứ ng, c ụ th ể , ở NT1 cá đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri m ậ t đ ộ 10 4 CFU/mL thì hi ệ u giá kháng th ể trung bình ghi nh ậ n đư ợ c là 1,8 ± 0,83, cao g ấ p 6,7 l ầ n so v ớ i NT đ ố i ch ứ ng Ở NT2 cá đư ợ c c ả m nhi ễ m vi khu ẩ n E ictaluri m ậ t đ ộ 10 5 CFU/mL thì hi ệ u giá kháng th ể trung bình ghi nh ậ n đư ợ c là 2,47 ± 0,72, cao g ấ p 1,4 l ầ n so v ớ i NT1 và g ấ p 9,15 l ầ n so v ớ i NT đ ố i ch ứ ng và s ự sai khác hi ệ u giá kháng th ể ở c ả ba NT đ ề u có ý nghĩa th ố ng kê (p < 0,05 ) K ế t qu ả trên còn cho th ấ y hi ệ u giá khán g th ể trung bình tăng t ỉ l ệ theo m ậ t đ ộ vi khu ẩ n c ả m nhi ễ m cho cá K ế t qu ả này cũng phù h ợ p v ớ i nghiên c ứ u c ủ a Bùi Quang T ề (2004), m ứ c đ ộ s ả n xu ấ t kháng th ể trong đáp ứ ng mi ễ n d ị ch nguyên phát có tương quan thu ậ n v ớ i li ề u lư ợ ng kháng nguyên đưa vào cơ th ể Vì v ậ y, trên cá T ra trong 3 NT kh ả o sát thì NT tiêm vi khu ẩ n m ậ t đ ộ 10 5 CFU/mL thì t ạ o kháng th ể t ố t nh ấ t cho vi ệ c đáp ứ ng mi ễ n d ị ch trong 4 tu ầ n trên cá giai đo ạ n 45 - 50 g 4 K Ế T LU Ậ N Kết quả phân tích các chỉ tiêu huyết học cho thấy số lượng hồng cầu giảm mạnh ở cá bị bệnh mủ gan (p< 0,05), đồng thời có sự xuất hiện của hồng cầu không nhân và hồng cầu 0 27 1 8 2 47 0 0 5 1 1 5 2 2 5 3 Đối chứng NT1 NT2 Hiệu giá kháng thể Mật độ vi khuẩn E ictaluri (CFU/ml) khảo sát Hiệu giá kháng thể 678 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM thoái hóa Các loại BC lympho, BC mono hay BC trung tính đều biến động theo hướng giả m ở thời điểm sau hai tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn nhưng tăng trở lại sau bốn tuần có ý nghĩa thống kê (p < 0,05 ) Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh cá bệnh cao hơn cá khỏe Nghiên cứu này là cơ sở cho các nghiên cứu khác khi tiêm vaccine cho cá ở dải nồng độ rộng hơn và khảo sát trong khoảng thời gian dưới 2 tuần vì qua hai tuần các tế bào bạch cầu bắt đầu giảm làm giảm khả năng miển dịch trên cá Tra giai đoạn 46 - 50 g Tuy nhiên, việc tạo và duy trì kháng thể trong 4 tuần khi cá được tiêm vi khuẩn rất có ý nghĩa trong việc tạ o vaccine giúp cho việc tăng khả năng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cho cá TÀI LIỆU THAM KHẢO Benli A C K , H Y Yildiz, 2004 Blood parameters in Nile tilapia (Oreochromis niloticus L ) spontaneously infected with Ewardsiella tarda Short communication, Aquaculture Research, pp 1388 - 1390 Branson E , 1993 Basic anatomy and physiology Abbott Laboratories, North Chicago, USA, 447pp Từ Thanh Dung, Trần Hoa Cúc, Nguyễn Hoàng Nhật Uyên, Mã Lê Diễm Trang, 2013 Khả năng đáp ứng miễn dịch của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) chống lại Edwardsiella ictaluri Tạ p chí khoa học Đại học Cần Thơ, 26 (2013): 269 - 276 Từ Thanh Dung, Nguyễn Thị Tiên và Ngu yễn Anh Tuấn, 2012 Nghiên cứu tác nhân gây bệnh trắng đuôi trên cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) và giải pháp phòng trị Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, trang 136 - 145 Ferguson H W , J F Turnbull, A Shin, K Thompson, T T Dung, M Crumlish, 2001 Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage), from the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases, 24: 509 - 513 Hrubec T C , J L Cardinale, S A Smith, 2000 Hematology and plasma chemistry reference intervals for cultured Tilap ia (Oreochromis hybrid ) Vet Clin Pathol , 29:7 - 12 Le T C , Cheong F , 2010 Perceptions of risk and risk management in Vietnamese catfish farming: An empirical study Aquaculture Economics and Management, 14: 282 - 314 Nguyễn Thị Thúy Liễu, Bùi Thị Bí ch Hằng, Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011 Đánh giá các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi trong ao bị bệnh mũ gan Khoa Th ủy sản, Đại học Cần Thơ, 17a: 20 - 29 Lí Thị Thanh Loan, 2008 Báo cáo tổng kết nhiệm vụ thường x uyên “Quan trắc, cảnh báo môi trường và dịch bệnh thủy sản một số vùng nuôi thủy sản các tỉnh đ ồ ng bằng sông Cửu Long và miền Đông Nam Bộ” Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 Natt M P , Herrick C A , 1952 A new blood diluent for counting erythrocytes and leukocytes of the chicken Poult Sci , 31: 735 - 738 Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, 2007 Giáo trình Miễn dịch học động vật thủy sản Nxb Trường Đại học Cần Thơ Phan L T , Tam B M , Thuy N T T , Gooley G J , Ingram B A , H ao N V , Phuong N T , De Silva S S , 2009 Current status of farming practices of striped catifish, Pangasianodon hypophthalmus in the Mekong Delta, Vietnam Aquaculture, 296: 227 - 236 Soto E , 2012 Edwardsiella ictaluri as the Causative Agent of Mort ality in Cultured Nile Tilapia Journal of Aquatic Animal Health, 24(2): 81 - 90 PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 679 Suanyuk N , Rogge M , Thune R , Watthanaphiromsakul M , Champhat N , Wiangkum, W , 2013 Mortality and pathology of hybrid catfish, Clarias macrocephalus (Günther) × Clarias gariepinus (Burchell), associated with Edwardsiella ictaluri infection in sou thern Thailand J Fish Dis , 37(4): 385 - 95 Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học thủy sả n Viện nghiên cứu N uôi trồng thủy sản I Quách Văn Cao Thi, 2017 Nghiên cứu đặc điểm bệnh học v à cơ chế đa khá ng thuốc của hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và A eromonas hydrophila gây bệnh trên cá Tra ( Pangasianodon hypophthalmus ) nuôi t hâm canh ở đồng bằng sông Cửu L ong Luận án tiến sĩ Chuyên ngành vi sinh vật, Đại Học Cần Thơ Lưu Thị T ha nh Trúc, 2014 Thực hành chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản N xb Nông n ghiệp STUD Y ING THE EFFECTIVENESS OF Edwardsiella ictaluri Bacteria ON HEMATO LOGICAL INDICATORS OF STRIPED CATFISH ( Pangasianodon hypophthalmus ) Tran Thi Phuong Dung * , Nguyen Ho Phuong Uyen Abtracts : This study aimed to evaluate the difference s in haematological parameters and ability to kill bacteria using serum from fish (45 - 50 g) infected by Edwardsiella ictaluri bacteria at 2 - 3 weeks Edwarsiella ictaluri bacteria accounts for 51 2% of Tra catfish deaths Results from haematological analysis revealed a significant reduction ( p < 0 05) in the total number of red blood cell s, t he presence of non - nuclear red cells and degraded red blood cells in infected fish Both mono and neutral lymphocytes fluctuated for two weeks after the fish became infected, but generally trended downward However, lymphocyte levels significantly increased again after 4 weeks The ability to kill bacteria in the serum of diseased fish was higher than in healthy fish Keywords: Edwardsiella ictaluri , Pangasianodon hypophthalmus , haematology, immune response Ho Chi Minh City University of Education * Email: dungttp@hcmue edu vn
BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2020.00083 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri LÊN CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Trần Thị Phương Dung*, Nguyễn Hồ Phương Uyên Tóm tắt: Đề tài thực với mục tiêu đánh giá biến động huyết học khả diệt khuẩn huyết cá Tra giống (45-50 g) nhiễm vi khuẩn Edwarsiella ictaluri sau 2-4 tuần Vi khuẩn Edwarsiella ictaluri tác nhân gây chết cá Tra giống chiếm tỉ lệ 51,2% Kết phân tích tiêu huyết học cho thấy số lượng hồng cầu giảm mạnh cá bị bệnh mủ gan (p < 0,05), đồng thời có xuất hồng cầu khơng nhân hồng cầu thối hóa Các loại bạch cầu lympho, bạch cầu mono hay bạch cầu trung tính biến động theo hướng giảm thời điểm sau hai tuần cá cảm nhiễm vi khuẩn tăng trở lại sau bốn tuần có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Khả diệt khuẩn huyết cá bệnh cao cá khỏe Từ khóa: Edwardsiella ictaluri, Pangasianodon hypophthalmus, huyết học, miễn dịch MỞ ĐẦU Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) mợt lồi cá da trơn nước có giá trị kinh tế cao ni phổ biến Đồng Sông Cửu Long (ĐBSCL) (Phan nnk., 2009) Theo thống kê từ Hiệp hội Chế biến Xuất Thủy sản Việt Nam (VASEP), tháng đầu năm 2018 kim ngạch xuất cá Tra đến 127 quốc gia giới đạt 1,6 tỉ USD, tăng 24% so với kỳ năm 2017 Tuy nhiên, năm gần đây, việc sản xuất tiêu thụ cá Tra phải đối mặt với nhiều khó khăn thách thức giá bấp bênh, thị trường xuất không ổn định việc thâm canh hóa với mật đợ ni cao làm cho bệnh cá xảy thường xuyên (Le & Cheong, 2010) Bệnh phổ biến nguy hiểm cá Tra giống ĐBSCL từ năm 2007 bệnh mủ gan (chiếm 51,2%) (Lý Thị Thanh Loan, 2008) Hiện nay, nghiên cứu vaccine nhằm tăng cường khả đề kháng cao, góp phần thúc đẩy nghề ni thủy sản bền vững hiệu kinh tế mơi trường Nhiều cơng trình nghiên cứu đặc điểm sinh lí, sinh hóa, khả gây bệnh, đợc lực vi khuẩn Edwardsiella ictaluri biến đổi mô học vi khuẩn gây công bố đối tượng cá Tra với kích cỡ khác làm tảng cho việc tạo vaccine Tuy nhiên, thông tin biến đổi số huyết học khả miễn dịch cá Tra bị nhiễm vi khuẩn E ictaluri giai đoạn cá giống (45-50 g) rời rạc Nghiên cứu nhằm đánh giá tổng quát biến động tế bào máu kháng thể đặc hiệu bảo vệ cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) chống lại vi khuẩn E ictaluri nhiễm bệnh ngồi tự nhiên Vì vậy, nghiên cứu ảnh hưởng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri lên tiêu huyết học khả tiêu diệt vi khuẩn huyết cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) giai Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh *Email: dungttp@hcmue.edu.vn PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 671 đoạn cá giống từ 45-50 g thời gian mắc bệnh dài từ 2-4 tuần thực góp phần cung cấp thêm thông tin làm sở cho việc chẩn đốn phịng bệnh bệnh mủ gan mợt cách đầy đủ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Cá Tra giống (Pangasianodon hypophthalmus) có kích cỡ khoảng 45-50 g/con Cá ni ổn định tuần trước tiến hành thí nghiệm cá quen với điều kiện sống bể Cá nuôi môi trường nước pH=7-7,5, nhiệt độ trì mức nhiệt đợ phịng tương ứng nhiệt đợ nước 27-28 oC Cá cho ăn thức ăn công nghiệp lần/ngày vào lúc h, 12 h, 17 h Chọn cá bố trí thí nghiệm có kích thước tương đối đồng đều, khỏe mạnh, linh hoạt da sáng bóng Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm với nghiệm thức (NT): (i) NT1 cá tiêm nước muối sinh lí; (ii) NT2 cá tiêm vi khuẩn nồng đợ 104 CFU/mL; (iii) NT3 cá tiêm vi khuẩn nồng độ 105 CFU/mL Mỗi NT 15 (lặp lại lần) Thu mẫu máu 15 cá thể/NT qua thời điểm: (i) Lần 1: trước cảm nhiễm; (ii) Lần 2: sau tiêm cá với vi khuẩn hay nước muối sinh lí tuần; (iii) Lần 3: sau tiêm cá với vi khuẩn hay nước muối sinh lí tuần 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nhuộm vi khuẩn gram âm mẫu phết mô Phương pháp mô tả Lưu Thị Thanh Trúc (2014): phết mẫu mô chứa vi khuẩn lên lam, cố định đèn cồn, sau cho lần lượt dung dịch Crustal violet (30 giây), lugon (60 giây), ethanol (15-30 giây), safranin (60-80 giây) Tại bước rửa nước cất giây Sau đưa lam lên kính quan sát vật kính (X40) Phương pháp nhuộm HE mẫu mô Phương pháp mô tả Lưu Thị Thanh Trúc (2014): cố định mẫu formalin 10% Sau cắt tỉa mẫu, khử nước, làm mẫu ngấm paraffin Sau tiến hành đúc khối mẫu, cắt mẫu Nhuộm mẫu Mayer’s Hematoxylin Eosin (HE) Sau đưa lam lên kính quan sát vật kính (X40) Phương pháp định lượng số lượng hồng cầu Phương pháp mô tả Natt & Herrick (1952) có hiệu chỉnh: lấy máu cá từ động mạch chủ đuôi kim tiêm mL tiệt trùng Dùng ống hút pha loãng hồng cầu hút máu lên vạch 0,5 Đưa đầu ống pha loãng vào dung dịch pha loãng hồng cầu (Hayems), hút từ từ đến vạch 101, vừa hút vừa xoay nhẹ ống pha loãng Ngừng hút đến vạch 101, rút ống pha lỗng khỏi dung dịch pha lỗng, đặt ngón trỏ vào đầu ống pha loãng, tháo dây hút Lắc ống pha loãng phút Bỏ 3-4 giọt đầu, lau khơ đầu ống pha lỗng, Cho hỗn hợp dung dịch lan tỏa vào đầy buồng đếm, để yên phút Đếm hồng cầu ô lớn (1 lớn có 16 nhỏ) góc buồng đếm ô trung tâm buồng đếm Cơng thức tính mật đợ hồng cầu: N1 = A x (4000 : 80) x 200 = A x 10000 (số hồng cầu đếm ô lớn (80 ô nhỏ) A) BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 672 Phương pháp định lượng số lượng bạch cầu tổng Phương pháp mô tả Hrubec et al., (2000) sau: nhỏ mợt giọt máu cách đầu lam kính cm Mợt tay giữ lam kính, tay cịn lại cầm lam kéo, nghiêng 45 o tiếp xúc cạnh ngắn vào giọt máu máu lan tỏa theo cạnh này, giọt máu chia đều, đẩy nhanh lam kéo theo chiều dài lam nằm ngang Cố định tiêu cách tay trái cầm tiêu nghiêng 30o, tay phải cầm pipet nhỏ - giọt cồn tuyệt đối lên phần đầu tiêu bản, nghiêng tiêu cho cồn chảy hết đuôi tiêu máu Nhỏ giọt dung dịch thuốc nḥm Giemsa phủ kín diện tích máu, để 15 - 20 phút sau rửa tiêu Đếm tổng số 1.500 tế bào hồng cầu bạch cầu mẫu nhuộm TBC = (Số bạch cầu 1.500 tế bào × R) / Số hồng cầu 1.500 tế bào (TBC số lượng bạch cầu mm3 máu R số lượng hồng cầu mm3 máu Phương pháp định lượng số lượng loại bạch cầu Phương pháp mô tả Hrubec et al., (2000): đếm tổng số bạch cầu 100 tế bào Mật độ loại bạch cầu (tb/mm3) = (số lượng loại BC × mật đợ TBC)/100 Phương pháp xác định khả diệt khuẩn huyết Phương pháp mô tả Từ Thanh Dung nnk (2013) sau: Dùng kim tiêm mL để lấy máu cho vào ống eppendorf 1,5 mL, để yên giữ lạnh oC vòng - Tiến hành li tâm 6.000 vòng/phút phút Sau li tâm, lấy phần huyết cho vào ống eppendorf tiến hành xác định hiệu giá kháng thể trữ lạnh (-20 oC) Vi khuẩn E ictaluri bất hoạt formol 2% giữ ngăn mát tủ lạnh 24 Sau đó, dung dịch vi khuẩn li tâm 3500 vòng/phút 15 phút để rửa formol nước muối sinh lí tiệt trùng, thao tác lặp lại - lần Hiệu giá kháng thể huyết xác định phản ứng vi ngưng kết kháng nguyên - kháng thể đĩa nhựa (microplate) 96 giếng Cho 25 µL huyết vào giếng số Từ giếng số trở cho vào giếng 25 µL nước muối sinh lí Trợn huyết với nước muối sinh lí giếng 1, hút 25 µL chuyển sang giếng số trộn đều, tiếp tục hút 25 µL giếng số chuyển sang giếng trộn Tiếp tục làm giếng cuối (ở giếng 12 lấy 25 µL bỏ đi) Cho 25 µL kháng nguyên (vi khuẩn E ictaluri bị bất hoạt) vào giếng trộn Để n - nhiệt đợ phịng đọc kết Dương tính (+): đáy giếng tạo thành mợt lớp ngưng kết trải rợng Âm tính (-): đáy giếng có mợt chấm trịn nhỏ màu trắng 2.3 Xử lí số liệu Số liệu xử lí dựa mợt nhân tố cách sử dụng phần mềm MS Excel nhập xử lí số liệu Các số liệu trung bình trình bày dạng TB ± SD Phân tích thống kê phương sai mợt yếu tố mẫu đo lường có lặp lại (ONE WAY ANOVA) Sử dụng kiểm định so sánh đối chiếu Duncan dùng để so sánh khác biệt mức yếu tố thí nghiệm Mức xác suất p < 0,05 chấp nhận tiêu chuẩn đánh giá khác biệt có ý nghĩa thống kê Tất phân tích thống kê thực phần mềm IBM SPSS Statistics version 22.0 PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 673 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng vi khuẩn E ictaluri đến hình thái nội quan mơ học cá Tra Các đặc điểm hình thái nợi quan mơ học cá Tra nhiễm vi khuẩn E ictaluri qua nghiên cứu cá Tra giống giai đoạn 45 - 50 g cho thấy vi khuẩn xâm nhập vào nội quan sau 12 h cảm nhiễm; bị xâm nhiễm vi khuẩn E ictaluri quan gan, thận tỳ tạng xuất biểu đặc trưng cho bệnh mủ gan xung huyết, xuất huyết, xuất đốm trắng mủ từ - mm sau ngày gây nhiễm hoại tử nội quan quan sát mô học nhuộm HE kính hiển vi (Hình 1) Kết phù hợp với nghiên cứu Suanyuk et al., (2013) Soto (2012) với bệnh tích điển hình vi khuẩn Edwarsiella ictaluri b a d c Hình a Nội quan cá với nhiều đốm trắng; b Vi khuẩn xâm nhập vào mô cá sau 12 h (nhuộm Gram âm vệt phết mẫu mô); c Tổn thương xuất huyết nghẽn cầu thận mô thận sau 72 h (nhuộm HE); d Tổn thương xuất huyết mô gan sau 72 h (X40) (nhuộm HE) 3.2 Ảnh hưởng vi khuẩn E ictaluri đến số lượng hồng cầu cá Tra Bên cạnh hồng cầu trưởng thành với hình dạng bình thường với cấu trúc hình cầu, bể cá cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri đợt thu mẫu lần ghi nhận xuất nhiều dạng hồng cầu bất thường hồng cầu không nhân hồng cầu bị thối hóa (Hình 2) a b c Hình a Vi khuẩn bao quanh HC sau h cảm nhiễm; b HC nhân sau tuần cảm nhiễm; c HC thối hóa sau tuần cảm nhiễm (X40) BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 674 Trong nghiên cứu Nguyễn Thị Thúy Liễu nnk (2011) ghi nhận xuất dạng hồng cầu bất thường đối tượng cá Tra bị nhiễm bệnh Bảng Sự biến động số lượng hồng cầu (x106 TB/mm3) cá Tra qua lần thu mẫu mật độ vi khuẩn E ictaluri khảo sát Thời gian Lần Lần Lần Đối chứng 2,071 ± 0,134xa 2,103 ± 0,124xa 2,131 ± 0,129xa NT1 (104 CFU/ml) 2,057 ± 0,113xa 1,279 ± 0,089yb 1,310 ± 0,068yb NT2 (105 CFU/ml) 2,099 ± 0,123xa 1,284 ± 0,090yb 1,301 ± 0,075yb Các chữ x, y cột khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 Các chữ a, b hàng khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 Từ kết định lượng hồng cầu Bảng nhận thấy: (1) số lượng hồng cầu NT đối chứng qua lần thu mẫu khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) chứng tỏ suốt thời gian tiến hành thí nghiệm khơng có ảnh hưởng tác nhân ngoại cảnh làm thay đổi số huyết học; (2) cá sau cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri hai NT 104 105 CFU/m có số lượng hồng cầu thu lần 2, lần giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với lần trước cảm nhiễm so với NT đối chứng Nguyên nhân vi khuẩn xâm nhập vào xung quanh hồng cầu gây vỡ hồng cầu sau 24 sau gây nhiễm (Quách Văn Cao Thi, 2017) Sự biến động số lượng hồng cầu theo chiều hướng giảm lần thu mẫu thứ NT NT3 phù hợp với một số nghiên cứu khác, Nguyễn Thị Thúy Liễu nnk (2011) phân tích thông số huyết học cá Tra nuôi bị bệnh mủ gan xác định số lượng hồng cầu cá bệnh 0,75x106 TB/mm3, giảm 63,4% so với cá khỏe 3.3 Ảnh hưởng vi khuẩn E ictaluri đến tổng số lượng bạch cầu cá Tra Bảng Sự biến động số lượng tổng bạch cầu (x104 TB/mm3) cá Tra qua lần thu mẫu mật độ vi khuẩn E ictaluri khảo sát Thời gian Lần Lần Lần Đối chứng 13,773 ± 2,815xa 13,146 ± 2,780xa 13,040 ± 2,508xa NT1 (104 CFU/ml) 13,046 ± 2,350xa 4,889 ± 1,091yb 8,138 ± 1,175zb NT2 (105 CFU/ml) 12,633 ± 2,431xa 4,855 ± 1,021yb 7,835 ± 1,218zb Các chữ x, y, z cột khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 Các chữ a, b hàng khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 Từ Bảng cho thấy: (i) kết định lượng tổng BC cá khỏe trước thí nghiệm NT khơng có khác biệt (p > 0,05) đạt giá trị trung bình (13,773 ± 2,815)x104 TB/mm3 NT đối chứng, NT1 NT2 lần lượt (13,046 ± 2,350)x104 TB/mm3 (12,633 ± 2,431)x104 TB/mm3; (ii) số lượng tổng BC NT đối chứng qua lần thu mẫu khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) chứng tỏ suốt thời gian tiến hành thí nghiệm, biến đợng số lượng tổng bạch cầu không chịu ảnh hưởng tác nhân ngoại cảnh; (iii) NT cảm nhiễm vi khuẩn, lượng PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 675 tổng bạch cầu giảm lần bắt đầu tăng trở lại vào lần với khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) tổng BC NT2 NT3 qua lần lấy mẫu thấp NT1 đối chứng Kết phù hợp nghiên cứu Benli & Yildiz (2004) cảm nhiễm vi khuẩn cá kết luận khoảng vài ngày đầu sau cảm nhiễm vi khuẩn, tổng lượng bạch cầu cá tăng cao để chống lại xâm nhập cơng vi khuẩn Bên cạnh đó, mợt số nghiên cứu gần ghi nhận số lượng tổng bạch cầu cá bệnh thu mẫu giai đoạn khác có biến đợng khác Ngồi ra, nghiên cứu Từ Thanh Dung (2010) kết luận mật độ tổng bạch cầu cá Tra có thay đổi rõ rệt tùy thuộc vào mức độ nhiễm bệnh cá Dựa sở nghiên cứu trên, dự đoán số lượng tổng bạch cầu cá Tra sau cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri có tăng so với cá khỏe để chống lại xâm nhiễm công vi khuẩn, nhằm bảo vệ thể Tuy nhiên thời điểm thu mẫu lần 2, số lượng tổng bạch cầu có suy giảm mạnh giải thích tác động vi khuẩn E ictaluri lên cấu trúc mô một số quan, đặc biệt thận trước tỳ tạng mợt thời gian dài từ làm biến đổi cấu trúc suy giảm chức tạo máu quan (Brason, 1993) Theo nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học cá Tra bị bệnh mủ gan Quách Văn Cao Thi (2017), ngày thứ sau cảm nhiễm quan sát mô thận cá thấy bắt đầu xuất hiện tượng xung huyết, xuất huyết dẫn đến thận chức quan trọng làm suy giảm chức tạo hồng cầu, bạch cầu, khơng cịn khả tạo kháng thể thực bào Đây nguyên nhân làm cho số lượng hồng cầu tổng bạch cầu hai NT cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri giảm đáng kể lần thu mẫu sau hai tuần cảm nhiễm Tuy nhiên, lần thu mẫu sau bốn tuần cá cảm nhiễm vi khuẩn, số lượng hồng cầu bạch cầu có tăng nhẹ so với lần thu mẫu trước giải thích vai trị đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể nguyên phát (Đặng Thị Hoàng Oanh Đoàn Nhật Phương, 2007) 3.4 Ảnh hưởng vi khuẩn E ictaluri đến số lượng loại bạch cầu cá Tra Trong q trình phân tích định loại định lượng tế bào bạch cầu, ghi nhận xuất loại bạch cầu như: bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, khơng quan sát bạch cầu ưa bazơ, bạch cầu ưa axit gặp nên định lượng (Hình 3) a b c Hình a BC Lympho; b BC mono; c BC trung tính (mũi tên) (X40) BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 676 Nghiên cứu biến động yếu tố miễn dịch không đặc hiệu cá Tra nuôi nhiễm vi khuẩn E ictaluri Nguyễn Thị Thúy Liễu nnk (2011) cho kết không quan sát bạch cầu ưa axit bạch cầu ưa bazơ 3.5 Ảnh hưởng vi khuẩn E ictaluri đến tỉ lệ loại bạch cầu cá Tra Bảng Sự biến động tỉ lệ lọai bạch cầu (x106 TB/mm3) cá Tra qua lần thu mẫu mật độ vi khuẩn E ictaluri khảo sát NT Bạch cầu Lympho Neutro Mono ĐỐI CHỨNG Lần Lần Lần NT1 (104 CFU/ml) Lần Lần Lần NT2 (105 CFU/ml) Lần Lần Lần 11,164 ± 2,322xa 1,253 ± 0,435xa 1,323 ± 0,370xa 10,539 ± 1,829xa 1,145 ± 0,480xa 1,365 ± 0,357xa 10,394 ± 2,208xa 1,043 ± 0,387xa 1,189 ± 0,248xa 10,799 ± 2,633xa 1,079 ± 0,286xa 1,269 ± 0,348xa 10,619 ± 2,135xa 1,048 ± 0,338xa 1,331 ± 0,291xa 3,181 ± 0,775yb 0,748 ± 0,261yb 0,958 ± 0,217yb 5,399 ± 0,721zb 1,157 ± 0,491xa 1,581 ± 0,290xb 3,511 ± 0,684yb 0,586 ± 0,231yb 0,755 ± 0,199yb 5,670 ± 0,926zb 0,964 ± 0,246xa 1,201 ± 0,188xa Các chữ a, b,c, hàng khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 Các chữ x,y cột khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 Dựa vào kết số lượng loại BC phân tích Bảng 3, nhìn chung loại BC lympho, BC mono hay BC trung tính biến đợng theo hướng giảm thời điểm sau hai tuần cá cảm nhiễm vi khuẩn tăng trở lại sau bốn tuần Trong NT cảm nhiễm vi khuẩn so với NT đối chứng, tỉ lệ loại BC lại có biến động giảm sau tuần vào thời điểm bốn tuần có bắt đầu tăng lại loại bạch cầu Sự thay đổi tỉ lệ loại BC trước sau cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri giải thích BC neutro có vai trị phản ứng viêm, loại BC đầu tiên đến vị trí vi khuẩn xâm nhập với số lượng lớn, ngồi cịn có khả thực bào Do tăng nhẹ tỉ lệ BC trung tính cho thấy thời điểm thu mẫu sau hai tuần cá cảm nhiễm vi khuẩn hoạt động hệ bạch huyết gia tăng để tiêu diệt vi sinh vật lạ xâm nhập vào thể BC mono tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch khơng đặc hiệu với vai trị thực bào tiêu diệt vi khuẩn đặc biệt khả trình diện kháng nguyên để thực bước khởi đầu trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Sau hai tuần cảm nhiễm vi khuẩn, tỉ lệ BC mono có gia tăng nhẹ nhằm giúp hệ thống miễn dịch nhận biết kháng nguyên, sản xuất kháng thể chun biệt Mặt khác, BC lympho có vai trị quan trọng miễn dịch dịch thể miễn dịch tế bào nên giảm nhẹ tỉ lệ BC lympho xâm nhiễm vi khuẩn E ictaluri vào thể cá làm suy giảm hệ miễn dịch tình trạng kéo dài hai tuần gây tượng Sau tuần vi khuẩn bị suy yếu nên loại bạch cầu tăng để sản xuất kháng thể tham gia đáp ứng miễn dịch Kết phù hợp với hàm lượng kháng thể tăng lên mãnh liệt để đạt cực đại khoảng ngày thứ 20 - 30 sau tiêm kháng nguyên (Đặng Thị Hoàng Oanh Đoàn Nhật Phương, 2007) PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 677 3.6 Xác định hiệu giá kháng thể cá Tra sau bốn tuần cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri Kháng thể huyết thường xuất trước thời điểm số lượng tương bào đạt cực đại khoảng ngày thứ 10-15 hàm lượng kháng thể tăng lên mãnh liệt để đạt cực đại khoảng ngày thứ 20-30 sau tiêm kháng nguyên (Đặng Hoàng Oanh Đoàn Nhật Phương, 2007) Dựa sở thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch cho cá Tra thực thời điểm sau bốn tuần kể từ ngày cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri cho cá để đảm bảo hiệu giá kháng thể thu đạt cực đại Hiệu giá kháng thể Hiệu giá kháng thể 2.47 2.5 1.8 1.5 0.5 0.27 Đối chứng NT1 Mật độ vi khuẩn E.ictaluri (CFU/ml) khảo sát NT2 Hình Biến động hiệu giá kháng thể cá Tra qua lần thu mẫu mật độ vi khuẩn E ictaluri (CFU/ml) khảo sát Kết phân tích hiệu giá kháng thể cho thấy có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) NT sau bốn tuần cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri Cụ thể, hiệu giá kháng thể trung bình cá NT đối chứng có giá trị 0,27 ± 0,57, chứng tỏ hệ thống miễn dịch nhóm cá đối chứng chưa kích thích nên lượng kháng thể thấp Ở NT cảm nhiễm vi khuẩn hiệu giá kháng thể trung bình tăng rõ rệt so với NT đối chứng, cụ thể, NT1 cá cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri mật đợ 104 CFU/mL hiệu giá kháng thể trung bình ghi nhận 1,8 ± 0,83, cao gấp 6,7 lần so với NT đối chứng Ở NT2 cá cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri mật độ 105 CFU/mL hiệu giá kháng thể trung bình ghi nhận 2,47 ± 0,72, cao gấp 1,4 lần so với NT1 gấp 9,15 lần so với NT đối chứng sai khác hiệu giá kháng thể ba NT có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Kết cho thấy hiệu giá kháng thể trung bình tăng tỉ lệ theo mật độ vi khuẩn cảm nhiễm cho cá Kết phù hợp với nghiên cứu Bùi Quang Tề (2004), mức độ sản xuất kháng thể đáp ứng miễn dịch nguyên phát có tương quan thuận với liều lượng kháng nguyên đưa vào thể Vì vậy, cá Tra NT khảo sát NT tiêm vi khuẩn mật đợ 105 CFU/mL tạo kháng thể tốt cho việc đáp ứng miễn dịch tuần cá giai đoạn 45 - 50 g KẾT LUẬN Kết phân tích tiêu huyết học cho thấy số lượng hồng cầu giảm mạnh cá bị bệnh mủ gan (p< 0,05), đồng thời có xuất hồng cầu không nhân hồng cầu 678 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM thối hóa Các loại BC lympho, BC mono hay BC trung tính biến động theo hướng giảm thời điểm sau hai tuần cá cảm nhiễm vi khuẩn tăng trở lại sau bốn tuần có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Khả diệt khuẩn huyết cá bệnh cao cá khỏe Nghiên cứu sở cho nghiên cứu khác tiêm vaccine cho cá dải nồng độ rộng khảo sát khoảng thời gian tuần qua hai tuần tế bào bạch cầu bắt đầu giảm làm giảm khả miển dịch cá Tra giai đoạn 46 - 50 g Tuy nhiên, việc tạo trì kháng thể tuần cá tiêm vi khuẩn có ý nghĩa việc tạo vaccine giúp cho việc tăng khả đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cho cá TÀI LIỆU THAM KHẢO Benli A C K., H Y Yildiz, 2004 Blood parameters in Nile tilapia (Oreochromis niloticus L.) spontaneously infected with Ewardsiella tarda Short communication, Aquaculture Research, pp 1388-1390 Branson E., 1993 Basic anatomy and physiology Abbott Laboratories, North Chicago, USA, 447pp Từ Thanh Dung, Trần Hoa Cúc, Nguyễn Hoàng Nhật Uyên, Mã Lê Diễm Trang, 2013 Khả đáp ứng miễn dịch cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) chống lại Edwardsiella ictaluri Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, 26 (2013): 269-276 Từ Thanh Dung, Nguyễn Thị Tiên Nguyễn Anh Tuấn, 2012 Nghiên cứu tác nhân gây bệnh trắng đuôi cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) giải pháp phịng trị Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, trang 136-145 Ferguson H.W., J.F Turnbull, A Shin, K Thompson, T.T Dung, M Crumlish, 2001 Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage), from the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases, 24: 509-513 Hrubec T C., J L Cardinale, S A.Smith, 2000 Hematology and plasma chemistry reference intervals for cultured Tilapia (Oreochromis hybrid ) Vet Clin Pathol., 29:7-12 Le T C., Cheong F., 2010 Perceptions of risk and risk management in Vietnamese catfish farming: An empirical study Aquaculture Economics and Management, 14: 282-314 Nguyễn Thị Thúy Liễu, Bùi Thị Bích Hằng, Đặng Thị Hồng Oanh, 2011 Đánh giá yếu tố miễn dịch không đặc hiệu cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ao bị bệnh mũ gan Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ, 17a: 20-29 Lí Thị Thanh Loan, 2008 Báo cáo tổng kết nhiệm vụ thường xuyên “Quan trắc, cảnh báo môi trường dịch bệnh thủy sản một số vùng nuôi thủy sản tỉnh đồng sông Cửu Long miền Đông Nam Bộ” Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản Natt M P., Herrick C A., 1952 A new blood diluent for counting erythrocytes and leukocytes of the chicken Poult Sci., 31: 735-738 Đặng Thị Hoàng Oanh, Đồn Nhật Phương, 2007 Giáo trình Miễn dịch học đợng vật thủy sản Nxb Trường Đại học Cần Thơ Phan L T., Tam B M., Thuy N T T., Gooley G J., Ingram B A , Hao N V , Phuong N T., De Silva S S., 2009 Current status of farming practices of striped catifish, Pangasianodon hypophthalmus in the Mekong Delta, Vietnam Aquaculture, 296: 227-236 Soto E., 2012 Edwardsiella ictaluri as the Causative Agent of Mortality in Cultured Nile Tilapia Journal of Aquatic Animal Health, 24(2): 81-90 PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 679 Suanyuk N., Rogge M., Thune R., Watthanaphiromsakul M., Champhat N., Wiangkum, W., 2013 Mortality and pathology of hybrid catfish, Clarias macrocephalus (Günther) × Clarias gariepinus (Burchell), associated with Edwardsiella ictaluri infection in southern Thailand J Fish Dis., 37(4): 385-95 Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học thủy sản Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I Quách Văn Cao Thi, 2017 Nghiên cứu đặc điểm bệnh học chế đa kháng thuốc hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila gây bệnh cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh đồng sông Cửu Long Luận án tiến sĩ Chuyên ngành vi sinh vật, Đại Học Cần Thơ Lưu Thị Thanh Trúc, 2014 Thực hành chẩn đốn bệnh đợng vật thủy sản Nxb Nông nghiệp STUDYING THE EFFECTIVENESS OF Edwardsiella ictaluri Bacteria ON HEMATOLOGICAL INDICATORS OF STRIPED CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) Tran Thi Phuong Dung*, Nguyen Ho Phuong Uyen Abtracts: This study aimed to evaluate the differences in haematological parameters and ability to kill bacteria using serum from fish (45-50 g) infected by Edwardsiella ictaluri bacteria at 2-3 weeks Edwarsiella ictaluri bacteria accounts for 51.2% of Tra catfish deaths Results from haematological analysis revealed a significant reduction (p < 0.05) in the total number of red blood cells, the presence of non-nuclear red cells and degraded red blood cells in infected fish Both mono and neutral lymphocytes fluctuated for two weeks after the fish became infected, but generally trended downward However, lymphocyte levels significantly increased again after weeks The ability to kill bacteria in the serum of diseased fish was higher than in healthy fish Keywords: Edwardsiella ictaluri, Pangasianodon hypophthalmus, haematology, immune response Ho Chi Minh City University of Education *Email: dungttp@hcmue.edu.vn