B GIÁO D O Ộ ỤC VÀ ĐÀO TẠ TRƯỜNG ĐẠ Ọ ỘI H C BÁCH KHOA HÀ N I Nguy n Trung Anh ễ “Nghiên cứ ảnh hưở ủ ạ ạu ng c a các h t nano kim lo i (coban, b c, s n quá trình chuy n gen ạ ắt và đồng) đế ể vào giố[.]
Trang 1B GIÁO D Ộ ỤC VÀ ĐÀO TẠ O TRƯỜNG ĐẠ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ọ Ộ
-
“Nghiên cứ ảnh hưở u ng c a các h t nano kim lo i ủ ạ ạ (coban, b c, s ạ ắt và đồng) đế n quá trình chuy n gen ể
vào giống đậu tương Việt Nam”
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trướ c tiên, tôi xin bày t lòng bi ỏ ết ơn sâu sắ c nh t t i PGS.TS Nguyễn Văn ấ ớ
Đồng, G iám đố c Phòng Thí nghi m Tr ệ ọng điể m qu c gia Công ngh T bào th c v ố ệ ế ự ậ t, Việ n Di truy n Nông nghi p ề ệ – ngườ i th y luôn kiên nh n và h ầ ẫ ết lòng hướ ng d n, giúp ẫ
đỡ tôi trong su t quá trình tôi th c hi n lu ố ự ệ ận văn.
Tôi xin g i t ử ớ i PGS.TS Đỗ Th Hoa Viên, Việị n Công ngh Sinh h c & Công ệ ọ ngh Th c ph m l i c ệ ự ẩ ờ ảm ơn chân thành, người đã luôn hỗ trợ và giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn
Tôi cũng xin bày tỏ lòng bi ết ơn sâu sắc đố ớ ự giúp đỡ i v i s nhi t tình, nh ng ý ệ ữ
ki ến đóng góp quý báu cũng như sự ỉ ẫ ậ ch d n t n tình c a ủ TS Hà Văn Chiến trong suố t quá trình tôi th c hi n và hoàn thành lu ự ệ ận văn cùng tậ p th cán b Phòng Thí ể ộ nghi m Tr ệ ọng điể m Công ngh T bào Th c v ệ ế ự ậ t – Việ n Di truy n Nông Nghi p v s ề ệ ề ự nhi ệt tình giúp đỡ và đã tạ o m ọi điề u ki n t t nh ệ ố ất để tôi có th c hi ể thự ện được đề tài này m t cách suôn s ộ ẻ và thuậ ợi n l
Tôi xin g i l i c ử ờ ảm ơn tớ i Việ n Di truy n Nông nghi p và Vi n Công ngh ề ệ ệ ệ
Cuố i cùng, tôi xin g i t i b m , anh ch ử ớ ố ẹ ị, ngườ i thân cùng b n bè l i c m ạ ờ ả ơn thân thương nhấ t - nh ững người đã luôn sát cánh, quan tâm và dành cho tôi tình cả m chân thành trong su t th i gian tôi h c t p và hoàn thành lu ố ờ ọ ậ ận văn này cũng như đã luôn luôn bên cạ nh và ng h tôi trong cu c sống ủ ộ ộ
Tôi xin chân thành c ảm ơn!
Hà N i,ộ ngày tháng năm 2017
H c viên cao h c ọ ọ
Nguyễn Trung Anh
Trang 4MỤC LỤC
1
9
11
1.1 cây 11
1.1.1 11
1.1.2 14
1.1.3 15
1.2 17
1.2.1 17
1.2.2 17
1.3 Gen arb 20
1.4 21
1.5 23
1.6 nano 25
- 27
2.1 27
2.2 27
27
28
29
29
Trang 5 30
grobacterium tumefaciens 30
32
2.3 32
33
34
35
36
g 36
36
grobecterium tumefaciens 44
3.2 Phân tích h 52
56
56
56
57
64
Trang 6DANH MỤC BẢNG
12
13
29
33
36
39
42
45
47
50
53
Trang 8Hình 3.13: gen T0 53
Trang 9DANH M Ụ C CÁC KÝ HI U VÀ CH ẾT TẮT Ệ Ữ VI
A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
Trang 10
Trang 11Nam t l u qu c a các gi ng u còn r t h n ch i
“Nghiên c u ứ ảnh hưởng c a các h t nano kim lo i (coban, b c, sủ ạ ạ ạ ắt và đồng) đến quá trình chuy n gen vào giể ống đậu tương Việt Nam” .
M c tiêu c ụ ủa đề tài
Trang 12CHƯƠNG 1: TỔ NG QUAN 1.1 Giới thiệ u chung v cây u ề đậ tương
1.1.1 Nguồn gốc và tình hình s n xu ả ấ t đ ậu tương
Nguồn gốc đậu tương
(Glycine max L Merr)
Trang 13c nghiên c u, tr ng th nghi i hóa v i quy mô và di n tích
S n ả lượ ng
n) (triệu tấ
Di n tích ệ gieo trồng (triệu ha)
Sả n lư ợ ng (triệu tấn)
Trang 14 u , m t trong nh ng nguyên nhân là do di u
Bảng 1.2 ả : S n lư ng đợ ậu tương c a Vi t Nam ủ ệ trong những năm gần đây
Diện tích gieo trông (nghìn ha) 117,2 110,2 100 98
Năng suất (tấn/ha) 1,44 1,43 1,46 1,48
Tổng sản lượng
Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn, số liệu dự báo cua USDA
Trang 15trin khai b i nhóm nghiên c u c a TS Tr n Th Cúc Hòa (Vi ng B ng
* G iá trị về dinh dưỡng
Trang 16cha nhi u h p ch
* G iá trị về nông nghi ệp
-
làm th
1.1.3 M ộ t số ố gi ng đ ậu tương ở Việ t Nam
Trang 17NN&PTNT) công nh n là gi ng m i Quy -KHCN ngày 19/01/2006
Vit Nam
Trang 18Nhm chính: Thng 85 90 ngày Chi u cao cây t 50
1.2 H t nano kim lo i và vai trò c a các h t kim lo i lên cây tr ạ ạ ủ ạ ạ ồ ng
1.2.1 Định nghĩa về ậ v t liệu ạ h t nano
1.2.2 Ả nh hư ở ng c a h t kim lo i nano t i cây tr ủ ạ ạ ớ ồ ng
Trang 20Men hot hóa + 2 Ag+ Men th ng + 2H+
Hình 1.1: Ion b c vô hi u hóa enzym chuyạ ệ ển hóa oxy củ a vi khu nẩ
carbonat, magiê, canxi và các ion hydroxit
Trang 21(2006) v ng nano s t t ph tetramethylammonium hydroxide lên s phát
1.3. Gen bar
Trang 23Agrobacterium dòng CP4), GAT (phân l p t Bacillus lichenformis PAT), (phân l p t
Streptomyces viridochromogenes ), BAR (phân l p t Streptomyces hygroscopicus)
cây
Trang 24Kháng côn trùng: Có r t nhi u loài côn trùng t
1.5 Thực trạ ng nghiên c u bi n n ứ ế ạp gen vào đậu tương
Agrobacterium tumefaciens vào mô in vitro nh m t o cây tr ng bi - i
Trang 25t l thành công cao và ít t n kém Ngày nay, hai h ng chuy n gen th
Agrobacterium tumefaciens b ng cách s d ng n t lá m [35 Các ]
Agrobacterium và có s n h ng tái sinh [28 [35 [42] Tuy nhiên, các nghiên c u th ], ],
Trang 26tin hành ng d ng, nghiên c u c i ti m nâng cao hi u qu bi n
1.6 Các nghiên cứu về ứ ng d ng h nano trong nông nghi p t ụ ạ t ệ ạ i Việ t Nam
Trang 27M t s nghiên c u v ng d ng c các h t nano trong nông nghiêp a c
Trang 28lo b c t ng nuôi c y th y canh cho th
dit c vào t bào th c v t
Trang 29Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc vector pZY101
Vật liệu hạt nano
2.2.2 Hóa ch ất và môi trườ ng
Hóa chất
Streptinomycin (sigma), Spectinomycin (sigma)
Trang 30clorua (NaCl, Meck), Ethylene Diamine Tetra Acetic (EDTA, Meck), Tris HCl, 2-mecaptonethanol, chloroform (Sigma), phenylanine, phenol, isoamyl alcohol, ethanol,
Rad)
2.2.4 Trình t m i và enzyme c t gi ự ồ ắ ớ i hạn sử ụ d ng trong nghiên c u ứ
Trang 31Bước 2: Chuẩn bị khuẩn biến nạp
Trang 362.5 Phương pháp thu thậ p và x lý s li u ử ố ệ
Trang 37CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 K t qu nghiên c u ế ả ứ ảnh hưở ng c a h ủ ạt nano đế n quá trình chuy n gen vào ể
gi ố ng đậu tương ĐT22
3.1.1 K t qu nghiên c u ế ả ứ ảnh hưởng c a hủ ạt nano đơn lẻ đế ừng giai đoạ n t n trong quá trình chuyển gen vào đậu tương ĐT22 ằ b ng A tumefaciens
a) Ảnh hưở ng c a h ủ ạt nano đơn lẻ (Ag, Co, Fe, Cu) trên giai đoạ ạo đa chồ n t i trong
quy trình chuyển gen vào đậu tương ĐT22
Bảng 3.1: Ảnh hưở ng c a các hủ ạt nano đơn lẻ đến khả năng phát sinh đa chồi củ a
chữ cái khác nhau (a, b) thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy ≥ 95%
Trang 38chng có s khác bi C th i l phát sinh cao nht công thc
Hình 3.1: Khả năng phát sinh đa chồ i của đậu tương ở các công th c thí nghi m ứ ệ
A: Ch ồ i t ừ công th c đ ứ ố i ch ứ ng; B: ồi từ Ch công th c nano Ag; C: ồi từ ứ Ch công th c ứ
nano Co; D: Chồ ừ i t công th c nano Fe; E: ứ Chồi từ công th c nano Cu ứ
b) Ảnh hưở ng c a các h ủ ạ t nano đơn lẻ (Ag, Co, Fe, Cu) trên giai đoạ n chọ ọc và kéo n l dài ch i trong quy trình chuy n gen vào gi ồ ể ống đậu tương ĐT22.
Trang 39mang gen c n chuy n Vi khu n Agrobecterium tumefaciens s d ng cho bi n n p có
Trang 40T l m u s ng sót sau ch n l c d a trên s m u s ng sót sau khi ch n l c trên s
Bảng 3.2: Ảnh hưở ng c a ủ các loại ạt nano đơn lẻ ở giai đoạ ố h n s ng sót sau chọn
lọc của đậu tương trong quá trình chuy n gen ể
CTTN Số mẫu tạo đa
chồi
Số mẫu sống sót sau chọn lọc
% sống sót sau chọn lọc
Trang 41ng nuôi c y in-vitro c ch i h p th lên cây và có th i l p v
Hình 3.2: Khả năng đa chồ i sống sót trong môi trường ch n lọc của đậu tương ở ọ
các công th c thí nghi m ứ ệ
A: Đố i ch ng; B: công th c nano Ag; C: Công th c nano Co; ứ ứ ứ
D: Công thứ c nano Fe; E: Công th c nano Cu ứ
Trang 42S s ng sót c a các m u ch i trong 3 công th c thí nghi ng chn
Hình 3.3: Các chồ ủa đậu tương đượ i c c kéo dài trên môi tr ng SEM ườ
A: Đối chứng; B: công thức nano Ag ;
Trang 43C : Công thứ c nano Co; D: Công th c nano Cu ứ
Hình 3.4: Cây đậu tuơng chuyển gen trên môi trườ ng ra r RM ễ
A: Công thứ c nano Cu; B: Công th c nano Co; ứ C: Đố i ch ng; D: công th c nano Ag ứ ứ c) Ch n l c cây sau chuy n gen b ng basta ọ ọ ể ằ ở các công th c thí nghi m c a h t nano ứ ệ ủ ạ đơn lẻ và công th c đ i ch ng ( Ag, Co, Fe, Cu) ứ ố ứ
Bảng 3.3: ỉ ệ T l cây con s ng sót sau khi phun basta ố
ra rễ
Số cây sống sót sau phun
T l s ng sót ỷ ệ ố sau phun (%)
Trang 44A: Đố i ch ng không chuy n gen; B: công th c nano Ag; ứ ể ứ
d) Đánh giá ảnh hưở ng c a h t nano kim lo ủ ạ ại đơn lẻ ớ t i quá trình chuy n gen ể
Trang 45Hình 3.6: Ảnh hưở ng c a h t nano kim lo i đơn l (Ag, Co, Fe, Cu) trong quá ủ ạ ạ ẻ
trình chuyển gen
các ht nano lên quy trình
3.1.2 K t qu nghiên cế ả ứu ảnh hưở ng c a h t nano k t hủ ạ ế ợp đôi lên quá trình
Trang 46a) Ảnh hưở ng c a h t nano k t h ủ ạ ế ợp đôi (Ag.Co, Ag.Cu, Cu.Co) lên quá trình tạo đa chồi trong quy trình chuyển gen vào đậu tương ĐT22
Bảng 3 Ảnh hưở 4 ng c a h t nano kủ ạ ết hợp đôi tới việ ạo đ c t a ch i trong chuyổ ển
gen vào đậu tương ĐT22
nhiễm
Số mẫu tạo
đa chồi
Tỷ lệ tạo đa chồi
so với số mẫu ban đầu vào(%)
Trang 47Hình 3 7: Khả năng phát sinh đa chồ ủa đậ i c u tương ở các công th c thí nghi m ứ ệ
A: Công thứ ố c đ i ch ng; B: Công th c Ag.Co;C: Công th c Ag.Cu; D: Công th c ứ ứ ứ ứ
Cu.Co
Trang 48b) Ảnh hưởng của hạt nano kết hợp đôi ( Ag.Co, Ag Cu, Cu.Co ) đến khả năng chọn lọc và kéo dài chồi trong quy trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22.
Agrobacterium c nuôi c y trên môi tr ng i, sau 14 ngày tin
Bảng 3 Ảnh hưở 5: ng c a h t nano kủ ạ ết hợp đôi đế n kh ả năng sống sót sau chọn lọc
CTTN Số mẫu tạo đa
chồi
Số mẫu sống sót sau chọn lọc
% sống sót sau chọn lọc
Trang 49Hình 3 8: Khả năng đa chồ ố i s ng sót trong môi trường ch n lọc của đậu tương ở ọ
các công th c thí nghi m ứ ệ
A: Chồi từ công th ứ c đ ố i chứ ng; B: Chồi từ công th c Ag.Co; ứ
cht 21,2%
Trang 50Hình 3 9: Các chồ ủa đậu tương trong môi trường kéo dài và môi trười c ng ra rễ
c) Chọ ọ n l c cây sau chuy n gen b ng basta trong thí nghi m c a h t nano ể ằ ệ ủ ạ kết hợp đôi ( Ag.Co, Ag.Cu, Cu.Co)
A
B
Trang 51sót và phát tri n t t môi tr ng t n phát tri n lá kép ti p t c giai
Bảng 3 ỉ ệ 6: T l cây con s ng sót sau khi phun basta ố
ra rễ
Số cây sống sót sau phun
T l s ỷ ệ ố ng sót sau phun (%)
A: Cây đậu tương ĐT22 không chuyển gen;
Trang 52nano cho t l s ng sót và t l i công thi ch ng Cao nh t là
Trang 533.2 Phân tích u qu p nh n gen c hiệ ả tiế ậ ủa đậu tương ĐT22 dưới tác độ ng c a h ủ ạ t nano đơn lẻ và nano k t h ế ợp đôi bằng phương pháp PCR
Hình 3 12: K ết quả tách chi t DNA t ng s cế ổ ố ủa các dòng đậ ương chuyểu t n gen To
1,2,3,4,5: Mẫu DNA của các dòng To Control, Ag, Co, Cu của thí nghiệm nano đơn lẻ; 6,7,8,9: Mẫu DNA của các dòng To Control, Ag.Co, Ag.Cu, Cu.Co của thí nghiệm
Trang 54Hình 3 13: K ết quả PCR ki m tra s có m t c a gen bar trong ể ự ặ ủ cây đậu tương
chuy n gen Tể 0
M: thang DNA chu n 1 kb plus; (- ẩ ): đố i ch ng âm H ứ 2 O ; (+): đố i ch ứng dương plasmid mang gen bar ; 1,2,3,: Mẫu DNA của các dòng T 0 ntrol, Ag, Co Co của thí
nano kết hợp đôi; 10: Đối chứng ĐT22 không chuyển gen.
Trang 55* i v i thí nghi m h : K t qu phân tích PCR cho th y, các cây
bar v i chuy n gen c b ng v c