Biomaker và ng d ng trong chứụẩn đoán.... Các phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào biomaker .... VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... Phƣơng pháp nghiên cứu .... Đánh giá khả năng gắn kháng
TỔ NG QUAN
Biomaker và ng d ng trong ch ứ ụ ẩn đoán
proteonomics, ngày nay biomarker liên
1.1.2 ng d ng c a biomarker trong ch n Ứ ụ ủ ẩ đoán bệnh
Có hai lý do chính này ,
1.1.2.1 Ứng dụng của biomarker trong chẩn đoán ung thƣ
1.1.2.2 Ứng dụng của biomarker trong chẩn đoán tim mạch
Peptide lợi niệu type B (BNP)
Albumin bị biến đổi do thiếu máu cục bộ (Ischemia modified albumin: IMA) [20]:
-MB, IMA và TnI giúp phát
-MB và troponin Tùy theo
Các phương pháp chẩn đoán dự a vào biomaker
Hin nay, trên th gi i có r t nhi a vào
n Trong gi i h n c a lu trình bày m t s k thu t truy n th c s d ng và nh ng k thu t m i
c phát tri n trên th gi i
1.2.1 K thu t PCR, real-time PCR ỹ ậ
1.2.2 K thu t ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ỹ ậ
t nhiu du d a trên s k h c hi u gi a kháng nguyên và kháng th
c g n v i m t enzyme Khi thê t thích hng là nitrophenol phosphate) vào ph n ng, enzyme s th t thành m t ch t có màu S xu t hi n màu ch ng t y ra phn c hi u gi a kháng th v màu mà bic n kháng nguyên hay kháng th c n phát hi n,
ng tr c ti p peptides, protein, kháng th t trong mu phân tích K thu t này khá nh nh kháng nguyên ho c kháng th n th p (kho ng 0,1ng/ml)
i kháng nguyên và kháng th phi g nhn bi t thông qua ph n ng t o màu nên gây ra h n ch c c g n enzyme hay vic tìm ra hai kháng th c hi u cho m t protein
Protein array là mt trong nh ng công c nghiên các gi a protein-protein, protein v i các phân t phát hi a protein nghiên c u
Công ngh ng th i hàng nghìn tham s trong mt thí nghi m.Protein microarray ch a m ng nh protein tinh khi t trên mt m ng v i m l n Các protein có th c sàng l c v i hi u su t cao cho ho -protein, protein-DNA, protein- RNA và protein-ph i t [34 ].
Trong k thu t protein array, phi n kính thu n hàng ngàn mu sinh h hiu qu g n Protein chip là các công c phân t c a b n c a ho t tính thu c tính [25 K] t qu phân tích d a trên các tín hi nh quang, phát quang hóa h c, quang ph , phóng x n hóa phát ra trên t ng m nh tín hi u t l thun vng protein liên k t v i m
B ng 1.1: Các lo i protein microarray [21 ].
M ng kháng th S d ng m u dò là các kháng th
phát hi n ho c hiu trong m u sinh h c
phát hi n ho ng các protein
M ng ch S d ng chip có g n các protein tinh khi xác
-protein, protein-DNA, protein- các ti u phân t (lypo t )
c c nh trên b m t khuôn Chúng có d ng t i tính cht hóa h c b m ho c hi polyme hoc aptammer oligonucleotide
Các k thu t s d ng protein arra nh y cao và cho phép phân tích nhi u m u cùng lúc, tuy nhiên c n ph u m u b ng phóng x , các ch làm bi i c u trúc c a m u c kh c ph m này, k thu t phân tích m u b ng
ng b m t không cc nghiên c u phát tri n.
1.2.4 K thuỹ ật tương tác cộng hưởng b m t ề ặ
1.2.4.1 Nguyên lý cộng hưởng b m t (Surface Plasmon Resonance -ề ặ
ng b m t (Surface Plasmon Resonance -SPR) là hing khi ánh sáng chi u t i màng kim lo t m t gii hn gi ng v khúc x
Khi ánh sáng chic thì t truy n c a nó s c có ch s khúc x th u ánh sáng di chuy n v i m mt gi i h n thì nó s ph n x l i kính V i m t góc t i h c mà truy n d c theo b m t gi i h c g i là
c t o b i s h p th mt ph n ánh sáng t i lên b m t vàng Và ch do hot m t thi t b n và có th
ng l i các kích thích Khi ánh sáng chi u t i b m t vàng thì các h n tích âm chuy n t trng thái cân b ng sang tr ng thái ho ng cùng t n s v c sóng c a ánh sáng t i Hi u c g i là c ng
ng b m t (SPR) Khi quan sát k thì nh n th y m t v t m ng trên hình
nh ph n x c a ánh sáng t i b m t vàng v i m t góc t i thích h p V t này
c g i là SPR dip và góc c a nh sáng t i gây ra SPR dip (góc SPR) có th
C m bi n sinh h c quang h ng trong th i gian th c v s thay
i c a các ch s khúc x g n b m c sóng evanescent)
c gây ra b i s liên k t và phân ly c a hai protein Protein th nh t s
c g n trên l p vàng c a b m t c m bi n Protein th hai n m trong dung d nhc c nh Khi protein trong dung dch liên k t v i protein c nh, ch s khúc x g n b m t c m bi n s
n s i góc SPR Khi ph c h p hai protein phân ly, protein th hai theo dung d c r a kh i b m t c m bi n, thì ch s ph n x gi m và góc SPR tr l i tr ng thái ban u m bi n sinh hc quang h c ghi l i s i c i d ng hàm s thi gian trong d ng c a m t sensorgram S i c v ng RU (response units) (1RU= 10 -6 s i ch s khúc x ) Sensorgram bi u di n kho ng th i gian liên k t c a ch t phân tích v i ligand trên b m t chip Trong pha k t h p, dung d ch ch a ch qua b m t ligand và ch t phân tích s liên k t v i ligand N u pha k t h dài thì phn ng s t t i cân b c th hi n qua t l k t h p b ng t l phân ly Khi cht, pha phân ly bu và sensorgram gim khi ch t phân tích b y ra kh i b m t ligand [28]
S i c a góc SPR có th ng h c liên k c t a
ng vài picogram protein trên m i milimet vuông b m t c m bi n [28]
A Khi ch t phân tích liên k t v i phân t ligand g n trên b m t sensor
B ng th i gian th c t và 42 interspot references
t s 6] [2 Độ ng h ọc tương tác
Tương tác cộng hưở ng b m t [28] ề ặ
H ệ th ống tương tác Protein ProteOn XPR36 array [26]
H thng ProteOn XPR36 là mt thi t b ho ng d a trên nguyên lý c a
ng có kh ng th a t ng phân tc tích h p m t h thu khi n ch t l ng r t hi u qu và m t h thng quang h nh li m
Array tương tác ghép vớ ệi h thống điều khi n ch t l ng [26] ể ấ ỏ
c t o ra b i h th u khi n ch t l ng chính gi a, là m t module nhi u kênh (Multichannel module-MCM) MCM t o thành 6 kênh trên b m t c m biu ligand khác
c c nh trên m i kênh Nhóm kênh th 2 hình thành tr c giao v i 6 nhóm kênh th nh t t a 2 dòng kênh tr c giao (Hình 1.5) Trên nhóm kênh th hai, sáu m u phân tích có th song vào S phn h mi spot s c ghi l
ng v i 6 m i 6 ligand Dòng cht lng liên km b o s nh và êm d u c a dòng m
A c c nh trên sáu kênh ligand song song
B Sáu m c giao v i sáu kênh ligand
C Chi t tti - cht phân tích cho th y các v trí c i ch ng (màu vàng)
H thc có nhm c a thi t b quang h c có kh o ra ph n h i có ch ng cao qua toàn b array S chi u sáng liên tng b và h ng hình nh phát hi n s th ng SPR khi ánh sánh chi u qua góc t i phù h p H ng quang h c có nh ng c i ti n thêm th vào b phn c n t
ánh sáng ph n x m c a sensor chip và s
T ng k t qu c a sáu sensorgram bi u di n các ph n h i ng v i sáu n i cùng m t m c c
nh.Các sensorgram cho th y 5 m c a cc c nh
i ch y s phù pjcuar sensorgram vng h c 1:1
Thi t k c i ti u khi n ch t l ng d ng tr c giao c a h thng ProteOn XPR36 làm cho thí nghi m trên nhi u m u ti n hành d dàng và nhanh chóng Array 6x6 và h thu khi n ch t l ng c a h th ng ProteOn XPR36 cho phép th c hi n hi u qu nhi u m u thí nghim song song, ngoài ra còn mc c i ti ng t i các interspot làm mi ch ng Các interspot là nh ng vùng n m trên các sensor chip, gia các kênh và li n k hai v c ho t hóa
y, các interspot là nh ng kênh không có
i ch ng Chính vì v y 6x6 vi kênh s ng mu kin nh t và linh ho t trong thi t k thí nghi m [16] H ng còn có th phân tích th
ng h c chu i các n khác nhau c a m t ch t phân tích Sáu m u phân tích v i n khác nha ng qua ligand có cùng n, hoc sáu m u phân tích v i n có n khác nhau cho phép th ng kê m t cách nhanh chóng các k t qu thí nghi m Vì nhi u ki n thí nghi m có th c kim tra song song, nên quá trình t n ng liên k t và c nh có th tin hành nhanh và hiu qu , v ng mn, h th ng có th c ng d ng trong phân tích ch n l c, so sánh nhi u m i v i k thu t ch n l c t bào lai và ki m tra mi d ch n
Hi vai trò c a m t protein là quan tr tin t i phân tích nh ng mô hình bi u hi ng c a protein v i các phân t sinh h x y ra và phân tích t m quan tr ng c a chúng trong ch bào Gi i mã các
m và ph cho bi t các thông s ng h c c a các quá trình trong t bào T các protein b m n các ph c và nhóm protein, h thng ProteOn XPR36 s li u c gi i mã các
n ni ch bào V i thi t k array 6x6 c a h thng s là công c linh ho thu t phân tích protein khác cho các ng d ng khác nhau
1.2.4.3 Khả năng ứng d ng cụ ủa phương pháp tương tác cộng hưởng b ề m t ặ
D ng (SPR), c SPR (biosensor chip) ,
ng nghiên c u khác nhau thì s d ng các c m bi n sinh h c khác nhau.Chip c m bi n ProteOn c u t o g m l p polymer alginate liên k t v i lp vàng mng trên m m bi n.L p alginate có kh n
ng v i m t s nhóm ch c nh các ligand trên b m t chip B n ch c c a l p alginate t o ra m ng n s bin tính c a ligand c nh và khôn h p th g cht phân tích Ngoài ra, trng ng phân t và c u trúc c a l p ph alginate có th c s t o ra chip c m bi n v i kh m t khác nhau [14] Có sáu lo i chip khác nhau c s d ng cho các m
c thi t k g n v i nhóm amine c a ligand Trong khi
c thi t k g n các ligand biotinyl ho c các protein có ch a polyhistidine [14].V i kh n k t v i nhi u lo i ligand khác nhau lên b m t c m bi t sinh h c, thi t b d a trên nguyên lý cng b m t Plasmon (SPR) cho phép
- Nghiên cng h c kháng nguyên kháng th
Ứ ng d ụng phương pháp tương tác cộng hưở ng b m t trong ề ặ nghiên c u nh n di n protein huy t thanh ứậệế
c u nh n di n protein ứ ậ ệ huyết thanh
1.3.1 T m quan tr ng c a các protein trong huy t thanh ầ ọ ủ ế
Huy- plasma là m t d ch trong, màu vàng nh t và v n,
c khi máu chc lo i b toàn b các thành ph n t bào Huyn quan tr ng c a máu, là ng s ng c a các t bào máu và t t c các t , chi m 55-60% th tích máu [31 ]. Huy t thanh - serum là ph n d ch l ng, trong su t còn l i c lo i b các thành ph n t bào và các y u t n còn l i c a huy i b các y u t c, mu i,
ng, các enzyme, kháng th và các protein hòa tan khác y, huy t thanh r t gi ng huy a nó th c hi n các vai trò r p ng mi n d ch, cung c p ch ng và nhiu hong sinh lý quan tr Huy t thanh không ch là mu xét nghi m lâm sàng mà còn th hi n r t nhi c tính h u ích cho các nghiên cn này, nó là m u phân tích ti m
c phát hi n ra các ch th sinh h c [ 12].
Mng thành ch a kho ng 3,5 - 5 lít huy t thanh v i kho ng 200 -
ng có kho ng t n 20.000 protein khác nhau xu t hi n trong huy t thanh t i m t th m nhnh, ph n l n trong s chúng có m t n r t th p, c u r t giàu protein v i t 60 - 80 mg/ml [ ] Các protein có hàm 10
ng cao trong huy t thanh g m 22 lo i, chi ng protein t ng s lipoprotein, [23] Ngoài ra còn có r t nhi u protein khác t n t i v i hàm
ng th p ho c r t th i gi nh ng ch protein làm nhi m v truy n tín hi u gi gii phóng vào máu do k t qu c a s phá h y mô, do nhi m vi sinh v t,
y, các protein xu t hi n trong huy t thanh do nhi u nguyên nhân khác
Protein trong huyc coi là m t trong nh ng h protein ph c t p nh t i M t s ng cao (mg/m
i t 35-50 mg/ml (chi m t 50- 70%), do s t ng hp hàng ngày gan (kho ng 12g) và có th i gian bán h y là 21 ngày nên nó
c coi là ch th c a b ng [10, 11] IgG kho ng 5-7 mg/ml chi m 1 ng th p (ng/ml) ch chi m kho ng protein t ng s carbonhydrate antigen 125 (CA-125), b2-ng thay
i t 0 - c coi là nh ng ch t ch th nh y cao trong ch n
Các nghiên cng minh r ng các protein huy t thanh có th là các ch th sinh h tin c y trong ch t s bng tr ng (CA 15-n ti n li lpha-fetoprotein) và các b nh v tim m ch (C-reactive protein) [3] Tuy nhiên, tr i qua nhi u th p k nghiên c u m i ch có m ng nh các ch th sinh h c phát hin và s d ng cho m
Huy t thanh là m t h protein khá toàn di n, là phiên b n l n nh mt mu nghiên c u h p d n [1, 10] S h p d n c a huy i v i vi c chu c quy nh b mu có th l y d dàng và an toàn, (ii) m u không ch phn ánh toàn di n ki i mà còn cho bi t tr ng thái c m t thc bi
ng mc bc mc ti u, da, tóc ch c coi là m t t p con nh c a huyn ánh ho ng c a t bào [2].Huy t thanh là m t thành ph n quan tr ng trong máu, ch a nhi u protein có ngu n g c và ch ng lên nhi u quá trình sinh h c khác nha Chính vì thành ph n protein ph c t p c a huy t thanh b t ngu n t nhi u ngu n g c mà vic nghiên c u h protein huy t thanh h a h n s mang l i nhi u thông tin b phát tri n các công tác nghiên c u, ch a tr nhi u b nh k c bi t là các b i chng và các bi bng v thành ph n protein huy t thanh chc ch n các quá trình b nh lý (b ng 1 ) Nói cách khác, 2 huy t thanh là d ng m c bi t, ch ng nhi u thông tin c n thi t cho vic nghiên c u và ch nh, vì th vi c s d ng huy t thanh cho m c
u là cách ti p c n h c minh ch ng qua nh ng thành t c trong nhi u th p k qua
B ng 1.2 S i n protein trong huy t thanh b nh nhân ung
Th c t là nhi u lo i protein trong huy c nghiên cc khi chúng ta bin s t n t i c a gen [10 ng s b ng
c ký l ng kh i ph hic 490 lo i protein khác nhau trong huy t thanh [11 ng s b
n, s c ký l u-kh i ph c 1444 protein [17] và gt qu nh và so sánh ca
35 phòng thí nghi m trong d án proteome huy i c a HUPO (Human Proteome Organization), con s ng thông tin phong phú do các nghiên c u v proteome huy c hoàn toàn b tr cho nh ng thông tin di truy n t các nghiên c u genome V i nh ng c i tin nhanh chóng, các k thu cho s phát tri n c a genomics ch phi h p gi a proteomics và genomics s o trong nh ng nghiên c u v sinh-y h c, là n n t ng cho s phát tri n các s n ph m ch a b lai
1.3.2 Những h n ch trong nghiên c u protein huy t thanh ạ ế ứ ế
Huy t thanh là m t h protein ph c t p, ch a nhi u protein có ngu n g c và ch ng lên nhiu quá trình sinh h .Nh i v ph n các protein trong huy ng có mi liên h ch t ch v i các quá trình b nh lý.Vì th vi c s d ng huy t thanh cho m u là m t trong nh ng cách ti p c c quan tâm nh t trong nghiên c u proteomics hin nay.Tuy nhiên, thách th c l n nh t trong nghiên c u protein huy t thanh không ch s ng r t l n protein có m t (kho ng 10000 lo i), mà còn là t l r t khác nhau c a chúng Trong khi m t s protein có n albumin (50%-70%), immunoglobulin (8%- c l i, có r t nhiu protein, peptid có n r t th t ng n c a chúng ch chi ng protein t ng s [19]
1.3.3 Phương pháp tương tác cộ g hưởn ng b m t gi i pháp cho phân tích ề ặ ả nhận di n protein huy t thanh ệ ế
Nhng khác bi t r t l n v n các protein trong huy t thanh cùng v i s h n ch v m t k thu t c a nh n th cho vi c nghiên c u m t s ng th p trong huy t thanh tr c chú ý trong m t th i gian dài Song g phát tri n m nh m c a các
u proteomics hi i v nh chính xác cao
phép các nhà nghiên c u phân tách, nh n dic nhi u protein t n t i v ng t i fg/mL M t s thành ph ng th p trong huyc quan tâm nghiên c u nhi [22]
Các k thu t phân tích m u t mô t bào và m u huy ng
c dùng là microarray kháng th , protein, peptid Nh
c hi nh h u h yêu c u ph i nhu m hu nh quang thông qua các kháng th 2, và th c hi n th nhiu thí nghi m khá t n kém Còn các k thut ELISA kiu Sandwich khó phát tri n vì chúng yêu c u hai kháng th c hi u cho mVì v y, k thu t SPR có th s d khác ph c nh m c a các k thut trên Nhi u công trình nghiên c u cho th y k thu nh y
i k thu t ELISA v ng phát hi n là ng/ml [22]
Hin nay trên th gi i có m t s công trình nghiên cu ng d ng k thu chm Xiangyi Fang và các c ng s (2010) s d ng k thu t SPR trong nghiên c u ch dày MG7-Ag là m t lo c hi c nghiên c làm ch cho vi c phát hi n s m b th dày
c s d phát hi n MG7-Ag trong huy t thanh c a b t m mi
n cho vi c ch m Kháng th c hi u
c s d t th th và ch t phát hi c c nh trên b m t
phát hi n MG7-Ag trong huy i Ti n hành thí nghi m trên 9 b dày và 2 b nh nhân kh e m nh và d ch t
i ch ng K t qu u cho th y c m
ng sinh h c SPR có ti ng d ng trong ch m u dày Tuy nhiên c n ph i ti n hành các thí nghi nh gi i h n và tiêu
m [33] Chiristopher Lausted và các c ng s (2008) d ng k thu ch
Sau khi tìm hi u và t ng h p m t s tài li u nghiên c u, tôi rút ra m t s k t lu n sau:
- Huy t thanh có ch a nhi u thông tin v các biomaker là m u phân tích thích h nghiên c u ch m.
- K thu ng t SPR là k thu t hi nh y cao và a nhi u lo i phân t , t nh ng phân t có kh ng nh n nh ng phân t có kh ng ln (vài tri u Daltons), và nh ng phân t ng th p nên r t thích h phân tích chm
- Hin nay trên th gi t s nghiên c u ng d ng k thu t SPR trong phân tích huy chm m t s i b nh ung lo
Chính vì vc hi n m t s nghiên c u kh u v k thu ng t ng d ng trong ch
VẬ T LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
M u phân tích : IL-2, Huy t thanh i
2.1.2 Hóa ch t và thi t b s dấ ế ị ử ụng
Các dung dm acetate pH 4,5; PBST pH 7,4 (Phosphate buffered saline v i Tween 20, pH 7,4)
EDAC (ho c EDC): 1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) cacbodimide hydrochloride
Các dung d ch r a gi Điề u ki n b o qu n ệ ả ả
IL-2, IL-2 antibody b o qu n -20 o C, mng xuyên s d ng gi
Sensor chip b o qu n trong bao nitrogen kín khí và gi nhi 4 o C
2.2.1 Phương pháp gắn ligand IL2-antibody lên chip GLC Điề u ki n ch y trên chip GLC [24] ệ ạ
+ T dung dm 30àl/phỳt, th i gian ch y là 60s m r a chíp
Bu ki n ch y trên chip GLC
Các giai đoạ n g n ligand lên chip ắ
+ Ho t hóa b m t chip b ng dung d ch 400mM EDC và 100mM sNHS t l 1:1
+ G n ligand lên chip S d m có pH th a ligand
c g n lên chip nh l n N dung d ch ligand
+ Khóa các v n ligand Dung d c s d ng là 1M ethanolamine, b t ho t nhóm sNHS không liên k t.
- c l nhi phòng t n 1 gi c khi cài vào máy
- Các dung d c l n khi nhi b ng nhi ng dung dm c a thi t b
Ly tâm Ly tâm IL-2 và IL-2 antibody trong 15 giây
Pha loãng IL-2 b ng PBST v i các n : 40nM, 20nM, 10nM, 5nM, 2,5nM, 0nM
Pha loãng IL-2 Ab b ng acetate, pH 4,5
Các dung dc gi l nh trong h tránh m t ho t tính
Cài đặ t các thông s thí nghi m trên máy ProteON XPR36 ố ệ
- Chn các v trí ch a ligand, m u phân tích và các dung d ch theo b ng:
B ng 2.2 V t ligand và dung d m ng m u
n F6 trên giá cha mu Ethanolamine V trí t n G6 trên giá ch a m u IL-2 antibody V trí t H1, H2, H3,
Mi ch ng (không có IL-2 Ab chm acetate
EDAC/Sulfo-NHS V trí t n I6 trên giá ch a m u 0,5% SDS V trí t n L6 trên giá ch a m u
50 mM NaOH V trí t n K6 trên giá ch a m u 100mM HCl V trí t n J6 trên giá ch a m u
- t các thông s ch u ki n ch y c a chip GLC
2.2.2 Phương pháp phân tích mẫu
2.2.2.1.Phương pháp phân tích IL-2
- Ly tâm IL-2 trong 15 giây
- Pha loãng IL-2 b ng PBST v i các n : 40nM, 20nM, 10nM, 5nM, 2,5nM, 0nM
- Các dung dc gi l nh trong h tránh m t ho t tính
Cài đặ t các thông s thí nghi m trên máy ProteON XPR36 ố ệ
- Chn các , mu phân tích và các dung d ch theo b ng:
B ng 2.3 V t IL-2 và dung d m ng m u
n F6 trên giá cha mu Glycine pH 2,5 V trí t n C6 trên giá ch a m u EDAC/Sulfo-NHS V trí t n I6 trên giá ch a m u 0,5% SDS V trí t n L6 trên giá ch a m u
50 mM NaOH V trí t n K6 trên giá ch a m u 100mM HCl V trí t n J6 trên giá ch a m u
- t các thông s ch u ki n ch y c a chip GLC
2.2.2.2 Phương pháp phân tích mẫu huy t thanh ế
M u huy c l c v i màng l c 0,2 àm và ti n hành pha loóng
Cài đặ t các thông s thí nghi m trên máy ProteON XPR36 ố ệ
- Chn các rank ch a m u phân tích và các dung d ch theo b ng:
B ng 2.3 V t m u phân tích và dung d ng m u
M u phân tích V trí t n D6 trên giá ch a m u
n F6 trên giá cha mu Glycine pH 2,5 V trí t n C6 trên giá ch a m u EDAC/Sulfo-NHS V trí t n I6 trên giá ch a m u 0,5% SDS V trí t n L6 trên giá ch a m u
50 mM NaOH V trí t n K6 trên giá ch a m u 100mM HCl V trí t n J6 trên giá ch a m u
- t các thông s ch u ki n ch y c a chip GLC
2.2.3 Phương pháp phân tích số ệ li u
L a ch n mô hình tính toán [27] ự ọ
ph n t ng quan, h th ng SPR cho ta bic các thông s
ng h c K D, kd, ka ca ligand và mu phân tích Các s này
a trên mô hình toán h c Mô hình toán h c này có th
c l a ch phù h p v i nghiên c u Các mô hình có th tính toán thông s ng h c:
Trong nghiên c u này chúng tôi l a ch n mô hình Langmuir là mô hình dùng
L a ch ự ọn vùng tương tác cho tính toán độ ng h c [27] ọ a ligand và m
u phân tích có th c chia làm
Xác đinh các thông số [27]
- Vùng thông s : so sánh thông s trên toàn b c theo nhóm, hng spot
- L a ch n các thông s c n tính toán ka, kd, K D , RU
c s d ng làm m i ch ng khác nhau cho phép lo i tr các y u t gây nhi n k t qu , t ng phân tích chính xác Các kênh có th c dùng làm mi ch ng:
- Kênh interspot (kênh gi c gn ligand ch có dung d c s d ng làm m i chng khi phân tích t ng spot
- i ch ng (là kênh có ch u phân tích chm chc s d i tr toàn b các y u t gây lo nhi u.
- Real-c s d ng k t h p vi kênh interspot hoi chlà kênh duy nhm chng thi song song v i m u phân tích
- c s d hi u ch nh các baseline b lch
- Hiu ch nh th tích ch t: s d ng cong chu hi u chi v i nh ng dung d khúc x cao
KẾ T QU VÀ TH O LU N Ả Ả Ậ
3.1 Đánh giá khả năng gắn kháng th kháng IL-2 lên sensor chíp GLC ể
Quá trình g n IL- c th c hi n
- n ho t hóa b m t chíp s d ng EDC và sNHS EDC là m c s d liên k t các nhóm cacboxyl v i nhóm amin u EDC s ph n ng v i nhóm
t o thành h p ch t trung gian Tuy nhiên h p cht này không b n và s b thy phân tr l i Khi có m t c a hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS), EDC s chuy n nhóm cacboxyl thành m t este sulfo-NHS có ái l c v i nhóm amin Vì v y, b m c ho s n sàng g n kháng th kháng IL-
- n 2: là n g n kháng th kháng IL-2 (IL-2 Ab) lên b mt chip IL- m b ng acetate có pH = 4,5 th mt chip IL-c gi n b m tr t chip b ng liên k t c ng hóa tr t liên k t mnh d - c c nh ch t trên b m t
- n khóa các v trí liên k c ho t hóa
c th c hi n nh ethanolamine HCl
K t qu c (hình 3.1) cho thy n ho t hóa, b m t chip
c ho t hóa t t RU = 4682.55, giá tr i k t qu chu n th c c a hãng (RU = 3882,18) Tín hi c t i 36 v trí
ng t kh t hóa là rt tm b o m ng v s ng các v c ho t hóa t t c
36 v ng này s u qu bám kháng th i kháng nguyên n sau Giai
n gn IL-2 Ab cho th y t l g n IL-2 Ab theo RU là 4743,23
i k t qu ch y c n khóa các liên kt qu t t v u này ch ng t u kin chp, thi t b chy nh và hóa ch t s d ng
5 n khóa các liên kn IL-2 antibody
3.2 Đánh giá ảnh hưởng c a m u huy t ủ ẫ ế thanh đến tín hiệu đo
Thc hi n thí nghi m phân tích s có m t c a protein huy t thanh IL-2 có mt trong m u huy t thanh v pha loãng 1/200, IL-2 tinh khi t và IL-2 tái t h p Quá trình phân tích IL- c th c hi n
n 1 nh chip b v nhi thí nghi m 25 o C
tách ph c h p gi a IL-2 và ligand
K t qu c th hi n t qu u blank
u v g th ng s 1 bi u di n tín hi u c a dung d mng s 2 bi u di n tín hiu ca IL-2 v i IL- c g n lên b mng s 3 bi u di n tín hi u c a quá trình tách liên k t
So sánh bi phân tích IL-2 (hình 3.2A) trong huy t thanh v i IL-2 (hình 3.2B) tinh khi t và IL2 tái t h p (hình 3.2C) cho thng bi u di n
a IL-2 trong 3 mu thí nghim v i ligand có mô hình ging bi u di a IL2 tinh khi t v nhiu th p, tín hi ng h p và g n v ng mô hình Vi mu huy t thanh và IL-2 tái t h ng bi u di nhi u cao
ng mô hình rc bi i v i mu IL-2 tái t h p và n liên k t và giai
n cân b ng tín hi u có s t ngi m u IL-2 tinh khing bin và gi m d n r n cân bu này có th gi i thích do m u huy t thanh và m u IL-2 tái t h p có ch a nhi u t p ch c bi t v i mu huy t thanh có nh c phân t lm t 50- 70%), IgG (chi m 10%) gây án ng không gian, làm n quá trình liên k t (ka gi m) gi a IL-2 trong huyt thanh v i ligand trên b m t chip, và gây c n tr n gi i liên k t
C Hình 3.2 Quá trình phân tích protein IL-2
A IL-2 trong m u huy t thanh pha loãng 1/200
(3)Tín hi u c a quá trình tách liên k t
T k t qu c, ti n hành phân tích các h ng s ng h c theo mô hình Langmuir Chng ha chn mô c các h ng s ng h c ka, kd, KD và tín hi u
n nh t Rmax V i m u huy t thanh k t qu c h ng s liên k t ka = 1,00E+03, h ng s phân ly kd= 5,29E- c
t v i s c g n trên b m t chip)= 161,05 < 200 nng cho phép c a thi t b
K t qu tính toán các h ng s ng h c cho th y h ng s ka=1,00E+03 trong mu huy t thanh th ng s ka = 2,63E+05 trong IL-2 tinh khi t, trong
ng s phân ly kd= 5,77E-04 l ng s kd= 1,49E-04 trong phân tích IL-2 tinh khi t Tuy nhiên h ng s c gia IL-2 v i ligand trong hai thí nghi m l i x p x b ng nhau KD =5.77E-07 (m u huy t thanh) và KD= 5.64E-10 (m u IL-2 tinh khi t) K t qu này ch ng t các protein t p trong m u huy t thanh ch gây nhi u ch không ng ln
tin c y c a k t qu ng IL-2 có trong m u huy t thanh so v i m u IL-2 tinh khii vi m u IL-2 tái t h p c n ti n hành thêm các thí nghi ki m tra l i ho t tính do kh i ligand y u th hi n h ng s KD = 2,55E-10 th u so v i IL-2 trong huy t thanh và IL-2 tinh khi t.
A IL-2 trong m u huy t thanh pha loãng 1/200
c ch tính toán h ng s ng h c
3.3 Phân tích protein IL-2 trong m u huy t thanh ẫ ế
3.3.1 Phân tích các nồng độ khác nhau c a protein IL-2 trong huyủ ết
3.3.2 Phân tích tính nh c a tín hi -2 trong huy t
Tin hành phân tích IL-2 trong huy t thanh v pha loãng 1/200, 1/300, 1/500 Th c hi n thí nghi nh kh phân tích nh n di n
ng IL-2 th p nh t có m t trong m u huy t thanh V u ki n thí nghi m
i, k t qu c th hi n trên hình 3.3
Bi cho th y v ng bi u di -2 các n khác nhau có mô hình gi ng nhau ng bi u di n
t bi git ngng cân b ng Tuy nhiên n cân b
ng c a các tín hi u h p và g n sát v ng chuu này có th gii thích do n -2 giIL a IL2 v i ligand b nh
ng l c l n pha loãng 1/500 cho tín hi nhi u l ng tín hi d c l pha
n liên kng tín hiu m u huy t 1/500 không nhìn th c t ngn giá tr Rmax Giai
n k t thúc quá trình liên k ng tín hi u l i gi t ng u này cho thy v i n -2 trong huy t thanh gi m thì IL ng c a các phân t protein t p là l tin c y c a k t qu này thì c n l p l i thí nghi m và ti p t c ti n hành th nghi m v i nhi u m u huy t thanh khác nhau, vì n -2 trong các m u huy t thanh khác nhau IL là khác nhau
A: huy t thanh pha loãng 1/200 B: huy t thanh pha loãng 1/300
T k t qu c tinh các h ng s c ng h c ph n ng
K t qu c các thông s ng h c h ng s và tín hin nh t V i m u huyc k t qu h ng s ka = 1,01 E + 01, h ng s kd = 5,39E-04, KD = 5,35E-05 V i m u huyc k t qu các giá tr
ng h-04, KD=8,30-07 So sánh các k t qu v i m u huy t thanh 1/200
A: huy t thanh pha loãng 1/200 B: huy t thanh pha loãng 1/300 C: huy t thanh pha loãng 1/500
t qu tính toán h ng s liên k t ka 3 m u x p x b ng nhau và n m trong kho u này cho th y n -IL
2 khác nhau không n h ng s liên k t Tuy nhiên, trong giai
n tách liên k t v i m u 1/500 cho k t qu kd=8,30E- n so v i hai mu huy t thanh 1/200 và 1/300 cho kd=5,39E- u này cho th y nh
ng c a các protein t p trong dung d n tín hi c là l n
Nhc phân t l n gây ra tín hi u nhi u này có th gi i thích do các protein t p i là liên kc hiu mà ch t o ra ph c h p không b n và d dàng b b tách ra (kd cao) V i m u huy pha loãng thy ra hing này Tuy nhiên, v pha loãng th p thì n -2 cao nên IL gi a các protein t p v i ligand y u do ái l c gi a IL-2 v là liên kc hiu Và ph c h p t o thành ch y u là ph c h p b n c a IL- 2 v i ligand (kd th pha loãng càng th p thì IL-2 l i càng khó tip c n v i ligand do n các protein tc phân t l n cao (các protein phân t l n chi m 70%) K t qu u này khi so sánh mu huy t thanh 1/200 v i m u huy t thanh1/300 M u huy t thanh
ng s phân ly c a m u huy t thanh 1/200 l u huy u này cho th y tín hi mu 1/300 t u 1/200 Tuy nhiên n u d a vào tín hi RU thì v i m u huy t thanh 1/500 cho th ng
tín hic vng nhi u là nh
K t qu này cho ta th y v i m ng huyt thanh r t nh (kho ng 0,5 àl) chúng ta hoàn toàn có th c s có m t c a protein huyt thanh thông qua kh a chúng vi kháng th c hi u d a trên h th
3.3.2 Phân tích tính ổn định c a tín hiủ ệu đo protein IL-2 trong huyết
Thc hi-2 trong m u huy t thanh pha loãng 1/200 Mc
p li 4 l n K t qu c th hi n trên hình 3.5
Hình 3.5 A là hình tín hi i b các tín hi u blank (là tín hi u c a dung dm PBST) Ta nh n tín hi u gây ra b i dung d m PBST có s i này không lu này có th gi i thích là s
a dung d i n trong quá trình phân tích Vì v y c n phân tích các m u cùng m tránh sai s
T tín hi u thô l a ch n tín hi u blank và lo i tr tín hi u này r hiu c a 4 l n l p so sánh trên m t tr th K t qu phân tích cho th y các
ng tín hiu gia 4 ln lu có mô hình gi ng c a các tín hi u khôn u này cho th y tính nh c a quá trình phân tích Các lu cho giá tr n nht gi a IL-2 v i ligand Rmax = 63,59 Tuy nhiên n cân b ng, tín hi u có s sai khác ln Tín hi u gi m d n sau các l n l u này có th gi i thích do s thay
i thành ph n c a m u phân tích Vì m u phân tích có nhi u thành ph n d bi, hay nh y c m v ng c nhi phòng trong th i gian l p gi a các l n phân tích
KẾT LUẬN VÀ KI N NGH Ế Ị
1 u ki n th c hi n ho t hóa và g n kháng th lên sensor chip
- Cht ho t hóa EDAC: Sulfo-NHS t l 1:1
- N ligand kháng th kháng IL-2 là 35 nM
- u ki n thí nghi m th c hiu ki n chu n th c c a hãng
2 H th ng d phân tích protein trong huy t thanh thông qua tín hi
3 ng pha loãng huym b o cho phân
Kin ngh Áp du kic xác l p trong nghiên c thc hin
T p chí Công Ngh Sinh h c, 1(4), tr 397-414
2 c v h protein, Vi n Khoa h c và Công ngh Vit Nam, tr 112-129
3 Ngc Liên (2004), Mi n d ch h , Nhà xu t b i h c
4 ng Th Hoàng Oanh (2008), Nguyên lý và k thu t ch b nh th y s i h c C
6 (2007), Biomarker: D u n sinh h c và gi i pháp cho ch li c
7 H i Vâ kit ELISA h tr chm b t bào gan, Vi n công ngh sinh h c.
8 Phm Hùng Vân (2009), PCR và Realtime PCR các v n và các áp dng g p , Nhà xu t b n y h c, H Chí Minh, tr34-
9 Adkins J., Susan N., Varnum M., Auberry K.J (2002), Toward a human bloodserum proteome analysis by multimensional seperation coupled with mass spectrometry, Molecular Cellular proteomics, 1, pp 947-955
10.Anderson N L., Anderson N G (2002), The human plasma proteome, history, character and diagnostic prospects, Molecular Cellular Proteomics, 1, pp 845-867
11.Anderson N L., Polanski M., Rembert P., Gatlin T., Tirumalai R S., Conrads T P., Veenstra T D., Adkins J N., Pounds J G., Fagan R., Anna L (2004), The Human Plasma Proteome-A Nonredundant List Developed by Combination of Four Separate Sources, Molecular & Cellular Proteomics, 3, pp 311-326
12.Anderson N L., Anderson N G (1998), Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words, Electrophoresis, 19(11), pp 1853-1861
13 Anwaruddin S, Januzzi JL, Baggish AL, Lewandrowski EL, Lewandrowski KB Ischaemia modified albumin improves usefulness of standard cardiac biomarkers for the diagnosis of cardiac ischaemia in the emergency department setting Am J Clin Pathol 2005;123:140-5
14.Bio-rad, ProteOn Sensor Chips, http://www.bio- rad.com/evportal/en/US/LSR/Solutions/LUSMBUHYP/ProteOntrad e_Sensor_Chips
15 Brennan ML; Penn MS; Van Lente F; Nambi V; Shshehbor MH; Aviles RJ; Goormastic M; Pepoy ML; McErlean ES; Topol EJ; Nissen SE; Hazen SL Prognostic value of myeloperoxidase in patients with chest pain New England Journal of Medicine 2003; 349(17):1595-1604
16.Bronner et al.2006 Rapid and efficient determination of kinectic rate constants using the ProteOn XPR36 protein interaction array system Bio-Rad bulletin 3172
17.Chan K C., Lucas D A., Hise D., Schaefer C F., Xiao Z., Janini G M., Kenneth H B., Haleem J I., Veenstra T D., Conrads T P
(2004), Analysis of the Human serum proteome, Clinical Proteomics I, 1(2), pp 101-225
18.Christopher Lausted, Zhiyuan Hu, and Leroy Hood (2008), Quantitative Serum Proteomics from Surface Plasmon Resonance Imaging, Molecular & Cellular Proteomics, 7, 2464 2474
19.Ducret A., Bruun C F., Bures E J., Marhaug G., Husby G and Aebersold R (1996), Characterization of human serum amyloid A protein isoforms separated by two-dimensional electrophoresis by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry, Electrophoresis, 17, pp 866 876
20.Donald Schreiber, MD, CM, Associate Professor of Surgery (Emergency Medicine), Stanford University School of Medicine Use of Cardiac Markers in the Emergency Department
21 Kambhampati, D 2004 Protein Microarray Technology 1 ed Weinheim: Wiley-Vch Verlag GmbH & Co KGaA
22.Liebler D C (2002), Introduction to Proteomics:Tools for the New Biology, Humana Press Totowa, New Jersey, pp 31-49
23.Li J., Kelly J F., Chernushevich I., Harrison D J., Thibault P
(2000), Separation and Identification of Peptides from Gel-Isolated Membrane Proteins Using a Microfabricated Device for Combined Capillary Electrophoresis/ Nanoelectrospray Mass Spectrometry, Anal Chem, 72, pp 599-609
24.One-shot Kinetics Kit Instruction Manual ProteOn Protocol Development Kits Bio-Rad Laboratoties, Incorporated, 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547.