Tạo dòng Cắt vector và gene bằng Kpn I và EcoRI và ta thấy nếu gắn gene vào vector thì gene nằm cùng chiều phiên mã của chính nó. Biến nạp vào tế bào Ecoli: Hóa biến nạpo Xử lí e.coli
Trang 1Bài tập 1
Trong trình tự bộ gen của Propionibacterium acnes (vi khuẩn gây ra mụn trứng
cá), bạn đã phát hiện ra một gen dự đoán mã hóa lipase Đây là một enzyme phân hủy chất béo trong da, có thể sử dụng phát triển một chất ức chế điều trị cho mụn trứng cá Bạn muốn tìm hiểu thêm về enzyme này Bạn lên kế hoạch
1 tạo dòng gene
2 biểu hiện nó trong E coli
3 tạo protein và nghiên cứu các đặc tính của nó
Trang 21 Tạo dòng
Cắt vector và gene bằng Kpn I và EcoRI và ta thấy nếu gắn gene vào vector
thì gene nằm cùng chiều phiên mã của chính nó
Biến nạp vào tế bào Ecoli: Hóa biến nạp
o Xử lí e.coli trong CaCl2
o Trộn tế bào E coli đã xử lí với vector tái tổ hợp
o Sốc nhiệt ở 42oC trong 45s
Trang 3o Cấy lên đĩa
Sàng lọc: theo hệ thống xanh trắng- nuôi Ecoli biến nạp bằng môi trường
chứa IPTG, Xgal và Ampicilline hoặc Kanamycin => Nếu cấu trúc lacZ bị phá hủy thì khuẩn lạc mọc lên có màu trắng, dẹt
Kiểm tra: bắt khuẩn lạc có màu trắng trong quá trình sàng lọc
o C1: dùng 2 enzyme cắt (KpnI và EcoRI), cắt vector rồi đem đi điện di Nếu kết quả điện di nhận được là hai đoạn DNA kích thước khác nhau thì
có thể kết luận có DNA tái tổ hợp
o C2: PCR colony
2 Biểu hiện trên E coli:
Thành phần môi trường nuôi cấy:
+ IPTG: kích hoạt promoter LacZ
+ Xgal: sàng lọc xanh trắng
+ Ampicillin/Kanamycin: sàng lọc tế bào chứa 2 gene tự đóng vòng
Promoter trong vector là LacZ => dùng IPTG làm chất cảm ứng để kích hoạt promoter tiến hành phiên mã
Vì cấu trúc gene lacZ bị phá nên khuẩn lạc E coli mọc lên không phản ứng tạo màu với Xgal nên có màu trắng
3 Tạo protein và nghiên cứu biểu hiện
Thu nhận khuẩn lạc trắng
Tách chiết dịch bằng SDS
Biến tính và điện di trên gel polyacrylamide (SDS PAGE)
Nhận biết bằng cách nhuộm màu hoặc Western Blotting
Bài tập 2
Nhóm nghiên cứu của bạn được giao nhiệm vụ nhân bản một protein huỳnh
quang mới được phát hiện và biểu hiện nó trong E coli để có thể nghiên cứu
sâu hơn Khi được kích thích bởi tia cực tím, protein này sẽ phát ra ánh sáng tím Gene mã hóa cho protein này được đặt tên là HusK và được tìm thấy trong
bộ gen của loài Chó Vàng hoang dã (Canis insanus) hiếm hoi và nổi tiếng May
mắn thay, bạn có một mẫu tế bào đông lạnh của con chó Bạn tiến hành nhân dòng và biểu hiện gene này trong E.coli với các thông tin sau
Trang 4Hãy trình bày cách chèn đoạn gene vào trong vector, biến nạp và chọn lọc dòng
tế bào mang đoạn gene mong muốn
A tổng hợp cDNA
B thiết kế primer với trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn
C nhận biết bằng hệ thống xanh trắng
D nhận biết chiều chèn vào của gene quan tâm bằng enzyme cắt giới hạn
Bài giải
A Tổng hợp cDNA:
Tiến hành phiên mã mRNA từ gene của chó
Vì đây là hệ gene của sinh vật nhân thực nên mRNA vừa tạo thành có chứa các đoạn intron, ta tiến hành cắt các đoạn intron và nối lại các exon để tạo nên mRNA trưởng thành
Từ mRNA trưởng thành này, ta dùng enzyme reverse transcriptase, được tìm thấy trong các retroviruses để tiến hành phiên mã ngược, tạo nên DNA bản sao từ mRNA trưởng thành vừa mới thu thập được => cDNA
B Thiết kế primer với trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn.
Đoạn cDNA vừa tạo ra không có trình tự của EcoRI giống vector mà chúng
ta sử dụng, vì vậy cần khuếch đại bằng PCR với 2 primer xuôi và ngược chứa
trình tự EcoRI để gắn nó vào hai đầu của cDNA rồi tiến hành gắn vào vector
tái tổ hợp
Trang 5 Sau khi kết thúc PCR, ta tiến hành cắt đoạn cDNA vừa khuếch đại và vector
tái tổ hợp bằng EcoRI và bắt đầu gắn chúng lại với nhau.
C Nhận biết bằng hệ thống xanh trắng
Sau khi ủ cho cDNA và vector, ta tiến hành biến nạp vào E coli, và tiến hành chọn lọc bằng hệ thống xanh trắng
Môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm 3 thành phần như sau:
o IPTG: hoạt hóa promoter của gene Β-galactosidase
o Xgal: chất thử trong sàng lọc xanh trắng xem có sự xuất hiện của β -galactosidase hay không, nếu có thì khuẩn lạc mọc lên màu xanh, nếu không thì khuẩn lạc mọc lên màu trắng do cấu trúc gene β-gal bị thay đổi
vì có sự tự đóng vòng của hai vector hoặc được cDNA chèn vào
o Kanamycin: sàng lọc tế bào không nhận plasmid hoặc nhận DNA vòng tạo ra do sự đóng vòng của 2 cDNA (do không có gene KanR)
Kết quả:
o Khuẩn lạc trắng: 2 vector tự đóng vòng, hoặc cDNA chèn vào vector
o Khuẩn lạc xanh: vector tự đóng vòng
Ta chọn khuẩn lạc màu trắng, dẹp và tiến hành điện di để kiểm tra,
o Nếu điện di chỉ cho 1 băng có kích thước 4000bp => 2 vector tự đóng vòng
o Nếu điện di cho 2 băng: 1 băng có kích thước 4000bp, 1 băng có kích thước nhỏ hơn 2000bp => Vector chứa DNA tái tổ hợp
D Nhận biết chiều chèn vào của gene quan tâm bằng enzyme cắt giới hạn.
Giả sử đoạn DNA từ đầu NotI tới đầu EcoRI trên vector pCM999 là 400bp
Ta tiến hành kiểm tra chiều của gene quan tâm bằng enzyme cắt giới hạn
như sau: Đem Vector chứa DNA tái tổ hợp cắt bằng NotI và BamHI rồi tiến
hành điện di
o Nếu kết quả điện di cho ra một băng có chiều dài nằm trong khoảng 400-500 bp thì kết luận gene đã chèn vào đúng chiều
o Nếu kết quả điện di cho ra một băng có chiều dài khá lớn => gene chèn ngược chiều
Bài tập 3:
Đoạn trình tự mã hóa protein A được tạo dòng và thu nhận có trình tự theo hình dưới đây Codon bắt đầu và kết thúc dịch mã được in đậm Các amino acid nằm phía ngoài đoạn 1500bp ở đầu 3’ không ảnh hưởng đến hoạt tính của của
protein A
Trang 6Vector biểu hiện có cấu trúc promoter, trình tự các enzyme cắt giới hạn và khung đọc được thể hiện theo hình dưới đây
Hãy lựa chọn các phương án để chèn đoạn gene trên vào vector đảm bảo cho đoạn gene được biểu hiện tạo protein có chức năng
Bài giải
Muốn gene trên chèn vào vector có khả năng biểu hiện tạo protein có chức năng thì thỏa 3 điều sau:
Gene được chèn đúng chiều
Gene được chèn nằm sau promoter của vector
Gene được chèn nằm sau vị trí bám của ribosome trên vector
Từ đó:
loại trình tự BglI vì nó đứng trước promoter của vector
loại trình tự XbaI vì đứng trước vị trí bám của ribosome trên vector
Tiến hành xét 3 enzyme cắt còn lại
NdeI: NdeI cắt vector tại đầu ATG, đồng thời cũng cắt đầu ATG của
gene, về mặt lí thuyết thì thuận lợi vì dễ nối, không cần tính toán sự lệch khung nhưng trên thực tế tránh sử dụng => loại NdeI
Trang 7 BamHI: có thể chèn và tạo dòng được , tuy nhiên làm lệch khung dịch mã
của amino acid đi 1 Nu, ribosome không đọc đúng vị trí của ATG trên
gene => loại BamHI
SacI: khi đếm từ AGC trở đi không làm lệch khung dịch mã => thích hợp
để sử dụng
Bài tập 4:
Nhóm nghiên cứu muốn biểu hiện gene A trong tế bào của chuột.
1 Trên đây là bản đồ một vector kháng ampicillin chứa đoạn cDNA của một gene ở chuột cDNA này là bản sao hoàn chỉnh của một mRNA chứa các vùng 5’ untranslated sequence (5’UTR), vùng mã hóa (có ATG codon [AUG ở
mRNA] và stop codon), vùng 3’ UTR
Trang 82 Bản đồ vector kháng ampicillin giúp biểu hiện gene ở chuột Vector này chứa một promoter mạnh ở tế bào chuột, theo sau là một trình tự khởi đầu dịch mã và
mã hóa cho một amino acid ngắn có chức năng của một epitope dùng đánh dấu (Flag tag) Bên cạnh thẻ epitope là trình tự tạo nên 3’ UTR và hình thành đuôi polyAcủa đoạn mRNA (trình tự tín hiệu polyA) Trong tế bào chuột, promotor
sẽ điều khiển sự phiên mã bắt đầu trước trình tự thẻ epitope và mRNA sẽ dịch
mã từ ATG (codon đầu tiên trong hình vẽ)
3 Để tạo ra protein dung hợp trong tế bào chuột chứa epitope đánh dấu ở đầu N-terminus, đoạn cDNA chứa toàn bộ trình tự mã hóa phải được chèn giữa epitope tag và polyA signal với khung đọc mở (ORF) đọc đúng trình tự Trình
tự 5’UTR và 3’ UTR của đoạn cDNA không cần thiết chèn vào trong vector biểu hiện bởi vì đã có các thành phần khác thay thế Khi cDNA được chèn vào phía sau Flag tag, sự dịch mã vẫn diễn ra ở AUG của epitope tag (không phải AUG của cDNA) Nếu có vài codon ngẫu nhiên giữa epitope và cDNA cũng không ảnh hưởng đến chức năng của epitope và protein tạo ra (nếu đọc đúng khung đọc)
(i) Để chèn đoạn cDNA vào vector bạn có thể sử dụng cặp enzyme nào và giải thích tại sao?
(ii) Hãy vẽ sơ đồ vector tái tồ hợp, ghi chú trình tự, kích thước các đoạn, trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn đã sử dụng?
(iii) Trước khi nối, bằng cách nào bạn chọn được đoạn cDNA có kích thước đúng để nối vào vector?
(iv) Trước khi nối, bằng cách nào bạn chọn được đoạn vector có kích thước
đúng để nối với đoạn cDNA, biết rằng đoạn trình tự cắt bởi BamHI-XbaI rất nhỏ
và không nối với các đoạn khác
(v) Trước khi nối có cần phải xử lý vector với alkaline phosphatase? Giải thích (vi) Sau khi nối có cần phải tinh sạch sản phẩm nối trên gel? Giải thích?
(vii) Sau khi nối, phải làm gì để hoàn thành việc tạo dòng này ?
Bài giải (i)
Nhìn vào vector biểu hiện, ta xác định vị trí đoạn gene chèn như sau:
Sau promoter
Sau thể nhận biết Tag
Trước đuôi Poly A
Trang 9 Trên Vector biểu hiện: cặp enzyme có thể dùng để cắt đoạn giữa Tag và Poly
A: BamHI- EcoRI và BamHI- XbaI
Trên cDNA plasmid: cặp enzyme có thể dùng cắt đoạn cDNA là BamHI- XbaI
Chọn cặp enzyme BamHI- XbaI
(ii) Sơ đồ vector tái tổ hợp:
(iii) Trước khi nối, chúng ta chọn được đoạn cDNA có kích thước đúng
bằng phương pháp điện di, sau đó cắt phần gel agarose chứa cDNA
đó, tiến hành nung chảy agarose, lọc qua cột chứa các viên bi có cấu
tử đính cDNA vào đó, phần dung dịch thừa chứa muối và agarose sẽ trôi ra ngoài, rửa giải cột và thu lấy cDNA
(iv) Tương tự ý (iii), điện di > nung chảy agarose > lọc qua cột chứa cấu tử
> rửa giải
(v) Giải thích như nào cũng được:
Trước khi nối không cần phải xử lý vector với alkaline phosphatase vì cắt bằng 2 enzyme khác nhau
Trước khi nối không cần phải xử lý vector với alkaline phosphatase vì có thể xảy ra hiện tượng 2 vector tự đóng vòng với nhau
(vi) Trả lời:
Sau khi nối còn trải qua một bước sàng lọc nên bước tinh sạch không có cũng không sao
Sau khi nối cần phải tinh sạch sản phẩm nối trên gel để loại bỏ hiện tượng 2 vector hoặc 2 gene tự đóng vòng với nhau, giúp dễ dàng sàng lọc hơn
(vii) Sau khi nối, phải làm biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli và tiến hành
sàng lọc để hoàn thành quá trình tạo dòng này