à Với mong muốn xác định được giai đoạn phát triển của cây đậu tương cho hàm lượng isoflavone cao nhất, đồng thời xác định được sự biểu hiện của các gen trong quá trình sinh tổng hợp is
bộ giáo dục đào tạo trờng đại học bách khoa hµ néi luËn văn thạc sỹ khoa học Ngành : công nghệ sinh học nghiên cứu biểu gen liên quan đến trình tổng hợp isoflavone giá đỗ đậu tƠng DơnG TH Thanh Tịnh hà nội 2006 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061131502381000000 bé giáo dục đào tạo trờng đại học bách khoa hµ néi luận văn thạc sỹ khoa học nghiên cứu biểu gen liên quan đến trình tổng hợp isoflavone giá đỗ đậu tƠng Ngành : công nghệ sinh học Dơng tH Thanh Tịnh Ngời hớng dẫn khoa học : TS L£ QUANG HOµ hµ néi 2006 -1- Luận văn thạc sỹ LỜI MỞ ĐẦU Isoflavone hợp chất tìm thấy thực vật Chúng loại phytoestrogen hay cịn gọi hormon thực vật, có cấu trúc hoá học tương tự estrogen người Bằng việc bắt chước estrogen vị trí xác định cở thể người, isoflavone mang lại lợi ích sức khoẻ giúp người tránh bệnh tật Isoflavone tìm thấy đậu tương, đậu xanh loài họ đậu khác Tuy nhiên đậu tương đáng ý chúng có hàm lượng cao nhất, đặc biệt genistein daidzein [34] Với mong muốn xác định giai đoạn phát triển đậu tương cho hàm lượng isoflavone cao nhất, đồng thời xác định biểu gen trình sinh tổng hợp isoflavone với hai hợp chất cụ thể genistein daidzein từ đối tượng giá đậu tương nảy mầm, tiến hành thí nghiệm: Tách chiết định lượng hỗn hợp isoflavone từ giá đậu tương nảy mầm Nghiên cứu biểu gen mục tiêu đường sinh tổng hợp isoflavone giá đậu tương • Phenylalanine ammonia lyase • Cinnamic acid – hydroxylase • coumarate: CoA ligase • Chalcone synthase • Chalcone reductase • Chalcone isomerase • Isoflavone synthase Dương Thị Thanh Tịnh -2- Luận văn thạc sỹ MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU MỤC LỤC Danh Mục Các Ký Hiệu Viết Tắt Danh Mục Các Bảng Biểu Đồ Danh Mục Các Hình Vẽ Đồ Thị CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Hợp chất flavonoid tự nhiên 1.2.Phân loại flavonoid 1.3 Hợp chất Isoflavone 10 1.4 Các isoflavone đậu tương: 13 1.5.Tính chất vật lý c isoflavone 15 1.6.Tính chất hố học isoflavone 16 1.7 Những lợi ích sức khoẻ mà isoflavone mang lại 17 1.7.1 Hoạt tính chống ung thư 18 1.7.2 Hoạt tính sinh học 19 1.7.3 Các hoạt tính khác 21 1.8 Quá trình tổng hợp isoflavone đậu tương 22 1.9 Các gen liên quan đến trình sinh tổng hợp isoflavone 25 1.9.1 Chalcone synthase 26 1.9.2 Chalcone isomerase 26 1.9.3 Chalcone reductase 27 1.9.4 Enzym chủ chốt isoflavone synthase 28 1.9.4.1 Sự phát isoflavone synthase (IFS) 28 1.9.4.2 Phương thức hoạt động IFS 29 Dương Thị Thanh Tịnh -3- Luận văn thạc sỹ 1.10 Kỹ thuật trao đổi chất cho tích luỹ isoflavone họ đậu 31 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Đối tượng nghiên cứu 36 2.2 Nguyên liệu 36 2.3 Hoá chất dụng cụ2.4 Phương pháp nghiên cứu 36 2.4.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu 36 2.4.2 Phương pháp tạo giá đỗ 37 2.4.3 Tách chiết hỗn hợp isoflavone 38 2.4.4 Định tính định lượng hỗn hợp isoflavone 39 2.4.5 Xác định gen biểu chu trình tổng hợp isoflavone 40 2.4.5.1 Tách chiết RNA tổng số 40 2.4.5.2 Phương pháp định lượng RNA quang phổ kế 41 2.4.5.3 Điện di kiểm tra sản phẩm 41 2.4.5.4 Tinh RNA kit Promega 42 2.4.5.5 Xác định có mặt gen biểu chu trình tổng 42 hợp isoflavone phương pháp RT – PCR 2.4.5.6 Điện di sản phẩm kiểm tra biểu c gen 44 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Hàm lượng isoflavone giá đậu tương giai đoạn phát triển 46 khác 3.2 Kết định lượng RNA 54 3.3 Xử lý Dnase 57 3.4 Nghiên cứu biểu gen liên quan đến trình tổng 57 hợp isoflavone thân giá đậu tương: 3.4.1 Sự biểu gen PEPC 58 3.4.2 Sự biểu gen PAL 59 Dương Thị Thanh Tịnh -4- Luận văn thạc sỹ 3.4.3 Sự biểu gen C4H 60 3.4.4 Sự biểu gen 4CL 61 3.4.5 Sự biểu gen CHS 62 3.4.6 Sự biểu gen CHR 63 3.4.7 Sự biểu gen CHI 65 3.4.8 Sự biểu gen IFS 67 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 DANH MỤC CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 76 Dương Thị Thanh Tịnh -5- Luận văn thạc sỹ DANH MỤC CÁC K Ý HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CHI: chalcone isomerase CHR: chalcone reductase CHS: chalcone synthase C4H: cinnamic acid – hydroxylase dNTP: Deoxy Nucleotid Triphosphat DFR: dihydroflavonol reductase EDTA: Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid EtBr: Ethidium Bromide F3H: flavanone – hydroxylase HDL: height density lipid (lipid tốt) IFS: isoflavone synthase LDL: low density lipid (lipid xấu) LDOX: leucoanthocyanidin dioxygenase M MLV: Moloney Murine Leukemia Virus Rever Transcripetase PAL: phenylalanine ammonia lyase RT PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction TAE: Tris – Acetate - EDTA TE: Tris – EDTA 2- HIS: 2- hydroxyisoflavone synthase 4CL: coumarate: CoA ligase Dương Thị Thanh Tịnh -6- Luận văn thạc sỹ DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ • Bảng 1.1 Hàm lượng isoflavone lồi họ đậu • Bảng 3.1 Hàm lượng isoflavone thân giá hạt giá giá đậu tương VX93 ủ 250 C Xác định HPLC P P • Bảng 3.2 Hàm lượng isoflavone thân giá hạt giá giá đậu tương VX93 ủ 350 C Xác định HPLC P P • Bảng 3.3 Hàm lượng isoflavone thân giá hạt giá mẫu nghiền giá đậu tương VX93 ủ 25 C P P • Bảng 3.4 Hàm lượng isoflavone thân giá hạt giá mẫu nghiền giá đậu tương VX93 ủ 35 C P P • Bảng 3.5 Hàm lượng isoflavone thân giá giá đậu tương VX93 ủ 25 C 35 C P P P P • Bảng 3.6 Kiểm tra độ tinh RNA Dương Thị Thanh Tịnh -7- Luận văn thạc sỹ DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Tên cơng thức hố học isoflavone đậu tương Hình 1.2 Con đường phelylpropanoid Hình 2.1 Hệ thống sắc ký lỏng cao áp Hình 3.1 Kết điện di RNA tổng số Hình 3.2 Sự biểu gen mẫu sau xử lý DNA Hình 3.3 Sự biểu c gen cấu trúc PEPC Hình 3.4 Sự biểu gen PAL Hình 3.5 Sự biểu gen C4H Hình 3.6 Sự biểu gen 4CL1_2 Hình 3.7 Sự biểu gen 4CL 3_4 Hình 3.8 Sự biểu c gen CHS Hình 3.9 Sự biểu c gen CHR NCBI Hình 3.10.Sự biểu c gen CHR TIGR Hình 3.11 Sự biểu gen CHI Hình 3.12 Sự biểu gen CHI1A Hình 3.13 Sự biểu gen CHI1B2 Hình 3.14 Sự biểu gen IFS Hình 3.15 Sự biểu gen IFS Biểu đồ 3.1 Hàm lượng daizein genistein trung bình mẫu thâ n giá Biểu đồ 3.2 Hàm lượng isoflavone tổng số trung bình mẫu thân giá Dương Thị Thanh Tịnh -8- Luận văn thạc sỹ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Hợp chất flavonoid tự nhiên Flavonoid hợp chất phenol thực vật có chứa 15 nguyên tử cacbon phân tử Người ta coi flavonoid dẫn xuất croman cromon thuộc nhóm phenyl propan chúng có chứa khung cacbon C6 - C R R R (trong đó, anthocyanin, leucoanthocyanin, catechin dẫn xuất croman, R hợp chất cịn lại có isoflavone sản phẩm ngưng tụ cromon với nhóm phenol ngoại) [12]: Flavonoid nhóm hợp chất hữu tự nhiên, tạo màu cho hoa, quả, cành Flavon cho màu vàng, anthocyanin cho màu tím mơi trường trung tính, màu đỏ mơi trường axit, màu xanh môi trường kiềm Các flavonoid thường tồn tự nhiên dạng monome, gặp polyme chúng Hơn nữa, monome thường liên kết với gốc đường qua liên kết glucosit, phần lớn loại đường đơn giản glucoza, fructoza, liên kết với disaccarit số oligosaccarit Khi monome liên kết với đường ta gọi glycosit flavonoid, cịn monome đứng độc lập gọi aglycon Như vậy, đa dạng flavonoid khác nhóm đường khả liên kết chúng vào vị trí khác Dương Thị Thanh Tịnh