Nghiên ứu sự biểu hiện ủa á gen liên quan đến quá trình tổng hợp isoflavone ở giá đỗ đậu tương

à Với mong muốn xác định được giai đoạn phát triển của cây đậu tương cho hàm lượng isoflavone cao nhất, đồng thời xác định được sự biểu hiện của các gen trong quá trình sinh tổng hợp is

trờng đại học bách khoa hà nội

trờng đại học bách khoa hà nội

LỜI MỞ ĐẦU

Isoflavone là hợp chất chỉ được ìm thấy trong thực v t ật Chúng

cũng là m ột loại phytoestrogen hay còn gọi là hormon thực ật, có c v ấu trúc hoá

h tọc ương tự estrogen ở người Bằng ệc ắt vi b chước estrogen ở những ị v í xtr ác

định trong cở thể ng ời, isoflavone mang lại những lợi ư ích ề ức khoẻ v s giúp con

người tránh được ệnh ật Isoflavone được tìm thấy b t trong đậu ương, đậu xanh t

và những loài h ọ đậu khác Tuy nhiên đậu tương đáng được chú ý nhất vì úng ch

có hàm lượng cao nhất, đặc ệt bi là genistein v daidzein [34] à

Với mong muốn xác định được giai đoạn phát triển của cây đậu tương cho

hàm lượng isoflavone cao nhất, đồng thời xác định được sự biểu hiện của các

gen trong quá trình sinh tổng hợp isoflavone với hai hợp chất cụ thể là genistein

và daidzein từ đối tượng là giá đậu tương mới nảy mầm, chúng tôi tiến hành í th

nghiệm:

 Tách chiết và định lượng hỗn hợp isoflavone từ giá đậu

tương mới nảy mầm

 Nghiên cứu sự biểu hiện c c ủa ác gen mục êti u trong con đường

sinh tổng hợp isoflavone ở giá đậu tương

• Phenylalanine ammonia lyase

• Cinnamic acid 4 – hydroxylase

• 4 coumarate: CoA ligase

• Chalcone synthase

• Chalcone reductase

• Chalcone isomerase

1.1.Hợp chất flavonoid trong tự nhiên

1.2.Phân loại flavonoid

1.8 Quá trình tổng hợp isoflavone ở đậu tương

1.9 Các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp isoflavone

1.9.1 Chalcone synthase

1.9.2 Chalcone isomerase

1.9.3 Chalcone reductase

1.9.4 Enzym chủ chốt isoflavone synthase

1.9.4.1 Sự phát hiện ra isoflavone synthase (IFS)

1.9.4.2 Phương thức hoạt động của IFS

1.10 Kỹ thuật trao đổi chất cho sự tích luỹ isoflavone ở cây họ đậu

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.2 Nguyên liệu

2.3 Hoá chất và dụng cụ2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

2.4.2 Phương pháp tạo giá đỗ

2.4.3 Tách chiết hỗn hợp isoflavone

2.4.4 Định tính và định lượng hỗn hợp isoflavone

2.4.5 Xác định các gen biểu hiện chu trình tổng hợp soflavonei

2.4.5.1 Tách chiết RNA tổng số

2.4.5.2 Phương pháp định lượng RNA bằng quang phổ kế

2.4.5.3 Điện di kiểm tra sản phẩm

2.4.5.4 Tinh sạch RNA bằng kit của Promega

2.4.5.5 Xác định sự có mặt của các gen biểu hiện trong chu trình tổng

hợp isoflavone bằng phương pháp RT – PCR

2.4.5.6 Điện di sản phẩm kiểm tra sự ểu hiện c c bi ủa ác gen

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Hàm lượng isoflavone trong giá đậu tương ở các giai đoạn phát triển

khác nhau

3.2 Kết quả định lượng RNA

3.3 Xử lý Dnase

3.4 Nghiên cứu biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình tổng

hợp isoflavone trong thân giá đậu tương:

3.4.1 Sự biểu hiện c ủa gen PEPC

3.4.2 Sự biểu hiện của gen PAL

3.4.3 Sự biểu hiện của gen C4H

3.4.4 Sự biểu hiện c ủa gen 4CL

3.4.5 Sự biểu hiện c ủa gen CHS

3.4.6 Sự biểu hiện c ủa gen CHR

3.4.7 Sự biểu hiện c ủa gen CHI

3.4.8 Sự biểu hiện của gen IFS

DANH MỤC CÁC K Ý HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CHI: chalcone isomerase CHR: chalcone reduct e asCHS: chalcone synthase C4H: cinnamic acid 4 – hydroxylase dNTP: Deoxy Nucleotid TriphosphatDFR: dihydroflavonol reductase EDTA: Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid EtBr: Ethidium Bromide

F3H: flavanone 3 – hydroxylase HDL: height density lipid (lipid tốt)

IFS: isoflavone synthase LDL: low density lipid (lipid xấu) LDOX: leucoanthocyanidin dioxygenase

PAL: phenylalanine ammonia lyase

RT PCR: Reverse Transcript e Polymerase Chain Reaction asTAE: Tris – Acetate EDTA-

TE: Tris – EDTA2- HIS: 2- hydroxyisoflavone synthase 4CL: 4 coumarate: CoA lig e as

DANH MỤC CÁC BẢNG À BIỂU ĐỒ V

• Bảng 1.1 Hàm lượng isoflavone trong những loài họ đậu

• Bảng 3.1 Hàm lượng isoflavone trong thân giá và hạt giá của giá đậu tương VX93 ủ ở 25P

0

P

C

• Bảng 3.5 Hàm lượng isoflavone trong thân giá

của giá đậu tương VX93 ủ ở 25P

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Tên và công thức ho á học của c ác isoflavone đậu tương

Hình 1.2 Con đường phelylpropanoid

Hình 2.1 Hệ thống sắc ký lỏng cao áp

Hình 3.1 Kết quả đ iện di RNA tổng ố s

Hình 3.2 Sự biểu hiện gen của ẫu sau khi xử lý m DNA

Hình 3.3 Sự biểu hiện c ủa gen cấu trúc PEPC

Hình 3.4 Sự biểu hiện c ủa gen PAL

Hình 3.5 Sự biểu hiện c ủa gen C4H

Hình 3.6 Sự biểu hiện c ủa gen 4CL1_2

Hình 3.7 Sự biểu hiện c ủa gen 4CL 3_4

Hình 3.8 Sự biểu hiện c ủa gen CHS

Hình 3.9 Sự biểu hiện c ủa gen CHR NCBI

Hình 3.10.S ự biểu hiện c ủa gen CHR TIGR

Hình 3.11 Sự ểu hiện c bi ủa gen CHI 2

Hình 3.12 Sự ểu hiện c bi ủa gen CHI1A

Hình 3.13 Sự ểu hiện c bi ủa gen CHI1B2

Hình 3.14 Sự ểu hiện c bi ủa gen IFS 1

Hình 3.15 Sự ểu hiện c bi ủa gen IFS 2

Biểu 3.1 Hđồ àm lượng daizein và genisteintrung bình ủa c

c mác ẫu thân giá

Biểu đồ 3.2 Hàm lượng isoflavone tổng số trung bình ủa c

c mác ẫu thân giá

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Hợp chất flavonoid trong tự nhiên

Flavonoid là những hợp chất phenol thực vật có chứa 15 nguyên tử cacbon

trong phân tử Người ta cũng có thể coi flavonoid là dẫn xuất của croman và

cromon thuộc nhóm phenyl propan vì chúng có chứa khung cacbon CR 6 R- CR3

R(trong đó, anthocyanin, leucoanthocyanin, catechin là dẫn xuất của croman, còn

các hợp chất còn lại trong đó có isoflavone đều là sản phẩm ngưng tụ của

cromon với một nhóm phenol ngoại) [12]:

Flavonoid là nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên, tạo màu cho hoa, quả, cành và

lá cây Flavon cho màu vàng, anthocyanin cho màu tím trong môi trường trung

tính, màu đỏ trong môi trường axit, hoặc màu xanh trong môi trường kiềm

Các flavonoid thường tồn tại trong tự nhiên dưới dạng monome, rất ít khi gặp

các polyme của chúng Hơn nữa, các monome này thường liên kết với các gốc

đường qua liên kết glucosit, phần lớn là các loại đường đơn giản như glucoza,

fructoza, đôi khi liên kết với cả các disaccarit và một số oligosaccarit Khi

monome liên kết với đường thì ta gọi là glycosit flavonoid, còn khi monome

đứng độc lập thì gọi là aglycon Như vậy, sự đa dạng của flavonoid là do sự khác

nhau của các nhóm đường và khả năng liên kết của chúng vào các vị trí khác

nhau của phân tử ban đầu Đường có thể khác nhau do độ lớn của vòng oxy, cấu

hình các liên kết glycosit và thứ tự liên kết giữa chúng

Trên thế giới, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 5000 loại flavonoid khác

nhau Tuy nhiên, mới chỉ có khoảng 1000 chất được nghiên cứu một cách đầy

đủ Ở Việt Nam đã phát hiện được trên 200 hợp chất flavonoid có trong gần 100

họ thực vật Ví dụ: catechin và galocatechin có trong lá chè, rutin trong hoa hoè

(Styphnolobium japonicum L.Schott), puerarin trong sắn dây (Pueraria montana

(Lour.) Merr.), gencyanin trong quả mơ (Prunus armeniaca), crizin trong gỗ của

cây tùng hương (Pinus massoniana)…[6]

Flavonoid giữ nhiều vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của thực

vật Không đơn thuần là yếu tố tạo màu hấp dẫn cho hoa, quả, hợp chất này còn

có tác dụng giúp các loài thực vật bậc cao kháng lại sự tấn công của vi sinh vật,

tạo một hàng rào bảo vệ hữu hiệu cho cây cỏ Đối với con người, flavonoid chứa

nhiều hợp chất có lợi cho việc tăng cường và bảo vệ sức khoẻ (tanin, isoflavone,

rutin…) Vì thế, tuy đã có nhiều công trình nghiên cứu về flavonoid, nhóm hợp

chất này vẫn tiếp tục thu hút sự chú ý của các nhà khoa học

1.2 Phân loại is oflavonoid

1.3 H ợp chất isoflavone

Isoflavone là một dưới nhóm của flavonoid, có cấu trúc cơ bản gồm gốc

phenol đính vào vị trí số 3 trên phân tử cromon Riêng nhóm isoflavone đã gồm

hơn 600 hợp chất khác nhau [18] Nhiều hợp chất trong số này đã được nghiên

cứu về tính chất cũng như tác dụng Mỗi loại thực vật đặc trưng bởi một hoặc

một số isoflavon nhất định Ví du: daidzein và puerarin trong sắn dây, rotenoid

trong hạt của loài Lonchocarpus salvadorensis, cristacarpin từ Erythrina

abyssinica,…

Isoflavone là nhóm trao đổi chất thứ cấp diphenolic được chiếc xuất từ một số

lượng hạn chế thực vật bậc cao Mặc dầu có ít nhất 22 họ thực vật sản xuất và

tổng hợp isoflavon nhưng hầu hết là được tìm thấy ở họ e Papilionoideae [23]

Trong hầu hết các loại họ đậu ăn được thì đậu tương chứa hàm lượng

isoflavone cao nhất (bảng 1.1), cao hơn 100 lần so với những loại họ đậu khác

Bảng 1.1 Hàm lượng isoflavone trong những loài họ đậu [23]

Isoflavone (mg/100 g)

Đậu

Franke et al (1995), Mazur et al (1998)

Franke et

al (1995), Mazur et

al (1998)

Đậu Hà

Franke et al (1995), Mazur et al (1998)

Franke et

al (1995), Mazur et

al (1998)

Đậu

Franke et al (1995), Mazur et al (1998)

Mazur et

al (1998)

Đậu tương Hàn Quốc

144.99

al (1995), Mazur et

al (1998)

tương Nhật Bản

(1995), Wang

& Murphy (1994a)

Franke et

al (1995), Mazur et

al (1998)

Đậu tương Đài Loan

al (1998)

Đậu tương

Mỹ (thực phẩm)

128.35

Franke et al (1995), Mazur et al (1998), Wang

& Murphy (1994a,b)

Franke et

al (1995), Mazur et

al (1998)

Đậu tương

Mỹ

153.40

Eldridge &

Kwolek (1983) Franke et al (1995), Wang

& Murphy (1994a)

Franke et

al (1995), Mazur et

al (1998)

Genistein và daidzein là hai isoflavone phổ biến ở nhiều loài thực vật Tuy

nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy rằng đậu tương và các sản phẩm từ đậu

tương là nguồn giàu hai hợp chất này nhất Bên cạnh đó, đậu tương lại là loại

thực phẩm bổ dưỡng cho sức khoẻ con người Do đó, isoflavone đậu tương đã

thu hút sự chú ý của các nhà khoa học trong mấy thập kỷ trở lại đây [33 ].

1.4 Các isoflavone trong đậu tương

Hình 1.1 Tên và công thức hoá học của các isoflavone đậu tương [19]

Hàm lượng của mỗi loại isoflavone trong hạt đậu là rất khác nhau, với tỷ lệ

daidzein : genistein : glycitein là 4: 5: 1(Wang và Murphy, 1994) Hầu hết

isoflavone trong hạt đậu tương kết hợp với đường glucose hoặc đường malonyl ở

vị trí C7 Liên kết đường –acetyl được phát hiện nhưng hầu hết là trong quá trình

xử lý hoặc là lên men những sản phẩm đậu đưa ra giả thuyết chúng là những sản

phẩm phân rã của của những liên kết đường – malonyl (Reinli và Block, 1996)

Giống như nhiều hợp chất flavonoid, những flavones liên kết với nhau được lưu

giữ trong không bào và được cố định bằng enzyme

1.5 Tính chất vật lý của oflavone is

Các isoflavone có độ hoà tan rất khác nhau Do phân tử phân cực, nên các

glycosit flavonoid và sulfat flavonoid không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu

cơ, tan được trong nước Ngược lại, các aglycon lại tan trong dung môi hữu cơ

mà không tan trong nước Trong môi trường axit các g ốc đường c ủa gluc it os

isoflavone sẽ ị b phân cắt, còn trong m i trường kiềm c gô ác ốc acyl d b phâễ ị n cắt

[20]

Cấu trúc của các flavonoid thường được xác định dựa theo phương pháp

quang phổ tử ngoại Phương pháp này dựa vào khả năng hấp thụ tia UV của các

hợp chất flavonoid do sự tồn tại của hệ thống nối đôi liên hợp trong phân tử tạo

ra bởi hai vòng benzen và vòng phụ phenol ngưng tụ Các flavonoid tập trung ở

hai dải hấp thụ có bước sóng là: 320 ÷ 380 nm và 240 ÷ 280 nm [18]

1.6 Tính chất hoá học của isoflavone

Nhóm phenol có tính axit, dễ tạo muối tan trong nước với hydroxyt kiềm Khi

có nhiều nhóm OH trong phân tử và thêm nhóm cacbonyl thì tính axit lại càng

tăng; flavonoid khi đó dễ dàng tan trong các dung dịch bicacbonat natri Nhóm

hydroxyl phản ứng với NaOH, KOH, NHR 4 ROH cho màu vàng đặc trưng Do đó,

nếu đun flavonoid với dung dịch NaOH đậm đặc thì sẽ xuất hiện hiện tượng mở

vòng tạo dẫn xuất axit thơm [6]

Trong cấu trúc phân tử của một số flavonoid thường có các nhóm hydroxyl

nằm kề nhau, rất dễ dàng nhường hai HP

+

P để tạo thành các gốc tự do có ái lực cao với các ion kim loại nặng có hoá trị hai như Fe, Cu, Zn…

Tuỳ theo số lượng và vị trí của các nhóm hydroxyl, các flavonoid tạo phức

với các muối AlClR 3 R, FeClR 3 R cho màu lục hoặc màu xanh nâu Phản ứng này thể

hiện rất rõ khi gia nhiệt rau quả trong các thiết bị bằng sắt

Flavonoid còn có phản ứng Shinoda đặc trưng của nhóm cacbonyl, phản ứng

diazo hoá… cho phép xác định sự có mặt của các hợp chất này trong đối tượng

nghiên cứu

1.7 Những lợi ích sức khoẻ mà isoflavone mang lại

Đậu tương cùng với lúa mì và hai loại hạt kê được xem như là những mùa vụ

không thể thay thế ở Trung Quốc Trong thế kỷ này ở Trung Quốc đậu tương là

nguồn cung cấp protein chính cho những người ăn kiêng, cùng với sự phát triển

nghành trồng trọt ở Trung Quốc thì đậu tương đã trở thành sản phẩm chủ yếu của

các nước Đông Nam Á Ngày nay ở những nước này đậu tương được tiêu thụ

dưới những dạng truyền thống như phomat đậu, phomat đậu khô, sữa đậu, bánh

đậu lên men, patê đậu lên men Mức độ tiêu thụ đậu tương ở Đông Nam Á

khoảng 12 16 gram người/ ngày tuỳ thuộc vào đối tượng nghiên cứu Thậm chí –

mức sống đã được cải thiện nhiều hơn trong năm mươi năm qua và protein động

vật đã được sử dụng nhiều hơn, đậu tương vẫn tiếp tục trở thành nguồn thực

phẩm quan trọng [ ] 23

Ngược lại, tại Mỹ thì đậu tương không được trồng ở quy mô rộng cho đến

chiến tranh thế giới lần thứ hai, và sau đó chỉ là những kết quả nghiên cứu để

thay thế dầu thực vật Đậu tương được con người sử dụng rất là hạn chế Tuy

nhiên trong suốt mười năm qua sự tiêu thụ đậu tương như là một nguồn thức

phẩm đã tăng lên một cách cách đáng kể từ 900 nghìn vào đầu năm 1990 ăng $ t

lên ba triêu một trăm nghìn $ vào năm 2100 Ở Bắc Mỹ và Đông Âu protein đậu

được tiêu thụ dưới dạng sữa đậu để thay thế thịt hoặc protein đậu được tách ra và

bổ sung vào các loại thực phẩm

Trong số những nguyên nhân giải thích việc phát triển thị trường thực phẩm

đậu tương thì sự nhận thức được những lợi ích về sức khoẻ của những sản phẩm

từ đậu hoặc liên quan đến đậu là một trong những nhân tố quan trọng nhất

Những nghiên cứu dịch tễ học đã phát hiện ra sự khác nhau trong nguyên nhân

gây ra ung thư liên quan đến hocmon giữa những người dân ở miền Đông Á và

miền Tây Âu Ví dụ ung thư vú ở Đông Á thấp hơn gần sáu lần so với ở Mỹ và

ung thư tuyến tuyền liệt thấp hơn gấp mười hai lần, Sự khác biệt này phát sinh

do nhiều nhân tố như di truyền và phong cách sống [27] Tuy nhiên nhiều nghiên

cứu đưa ra giả thuyết là do sự khác nhau về chế độ ăn uống, đặc biệt là mức độ

tiêu thụ đậu tương Đặc biệt hơn, một trong những nhân tố duy nhất của đậu

tương mà đóng vai trò quan trọng trong việc mang lại lợi ích sức khoẻ cho con

người là Isoflavone

1.7 .1 Hoạt ính chống ung thư ủa is t c oflavone

Trong quy mô phòng thí nghiệm những dữ liệu về dịch tễ học và động vật

đã thiết lập nên mối quan hệ giữa lượng isoflavone lấy vào và sự xảy ra ung thư

vú, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư ruột kết Sự kìm hãm tyrosine kinase và

DNA topoisomerase bởi isoflavone đóng góp phần nào trong việc ngăn chặn ung

thư (Messina 1994)

Một thử nghiệm được tiến hành với 100 phụ nữ tình nguyện: lượng

isoflavone đưa vào cơ thể trung bình là 60 - 100 mg/ngày trong thời gian liên tục

6 tháng [12] Thử nghiệm cho thấy những phụ nữ này có nguy cơ mắc các bệnh

ung thư, đặc biệt là ung thư dạ con thấp hơn hẳn so với đối chứng Nhiều thử

nghiệm khác cũng đã được tiến hành với cả nam giới và nữ giới, đều khẳng định

vai trò của isoflavone trong việc phòng chống ung thư

Cơ chế phòng chống bệnh ung thư của hốn hợp các chất này đã dần dần

được sáng tỏ Cơ chế này dựa trên khả năng tạo gốc tự do của phân tử

isoflavone Do sự tồn tại của hệ thống nối đôi liên hợp, các phân tử isoflavone dễ

dàng tạo gốc tự do Các gốc tự do này tương đối bền vững, khi nó thay thế các

gốc tự do hoạt động được tạo ra trong quá trình bệnh lý: OHP

Quá trình này bắt đầu bằng phản ứng:

do gây bệnh trong các quá trình chuyển hoá tế bào bình thường thành tế bào ác

tính

1.7 .2 Hoạt ính sinh học ủa is t c oflavone

Thời k mỳ ãn kinh bắt đầu ào khoảng tuổi 45 – 55, về v sinh lý học trong giai

đoạn này cho đến cuối cuộc đời, phụ ữ n phải sống trong tình trạng thiếu h ụt

estrogen với những biểu hiện mà y học ọi là triệu chứng mãn kinh Thật ra g

estrogen vẫn còn trong cơ thể, nh ng mức rất thấp không đủ b v ư ở ảo ệ phụ ữ n

khỏi một ố ệnh s b [7]

Khi thiếu estrogen, lượng cholesterol sẽ ăng trong đó LDL(lipid xấu) t ng t ă

nhiều hơn HDL(lipid t ) và ốt triglycerid ng kèm tă theo tăng VLDL (lipid rất ấu) x

nên th m nhiều nguy cơ ơê x vữa động mạch Đối với hệ tim mạch: trong giai

đoạn hoạt động ủa c buồng trứng òn b c ình thường, estrogen có t dác ụng ảo ệ b v

người phụ ữ đối n với c bác ệnh ạch vành và m m ạch áu n m ão, nhờ đó mà phụ n ữ

ít b thiị ếu máu c ơ tim và đột quỵ ơn nam giới Nguy cơ h thuyên tắc mạch s t ng ẽ ă

lên nếu có kèm theo các ếu t y ố nguy cơ như: nghiện thu láốc , béo ph , cao huyết ì

áp Do trogen có t dụng làm chậm s es ác ự tiêu x ng vươ à tăng tiết calcitonin, nên

thiếu estrogen ở thời mãn kinh, người phụ n s b ãng xữ ẽ ị lo ương, xương dễ ị ãy b g

dù va chạm nhẹ, thường ặp g nh là ất đầu ưới ươ d x ng cổ tay và đầu êtr n x ng ươ

đùi [23]

Isoflavone, cụ thể là daidzein và genistein, từ lâu đã được coi là

phytoestrogen, một hormon thực vật lý tưởng để thay thế hormon của người

trong trường hợp bị thiếu Sở dĩ hai isoflavone kể trên có tính chất này là do cấu

trúc tương tự giữa chúng với hormon estrogen [22]

Estrogen là loại hormon sinh dục nữ có bản chất steroid, được tổng hợp từ

cholesterol, qua nhiều phản ứng phức tạp, tạo thành dạng phổ biến là estradiol

Estrogen có nhiều tác dụng sinh lý quan trọng trong cuộc sống của phụ nữ [11] :

- Kích thích phát triển nang buồng trứng

- Tăng bài tiết dịch nhày ở cổ tử cung

- Kích thích sự tăng trưởng các tuyến của cổ tử cung

- Tăng cường độ co bóp cần thiết

- Phát triển hệ thống ống dẫn sữa

- Tăng cường phát triển xương

Trước, trong và sau thời kỳ mãn kinh, lượng estrogen trong cơ thể biến đổi

bất thường dẫn đến nhiều bệnh nguy hiểm thường gặp trong thời kỳ mãn kinh:

nhức đầu, áp huyết cao, đau thắt ngực, ung thư dạ con, ung thư cổ tử cung, loãng

xương…

Isoflavone đậu tương, do có thể kết hợp với các thụ thể của estrogen, có khả

năng thay thế estrogen khi cần, giảm bớt các nguy cơ gây ra do thiếu hụt

estrogen, đồng thời lại có hoạt tính estrogen yếu, giảm bớt lượng estrogen khi dư

thừa, tạo sự cân bằng hormon trong cơ thể

Liệu pháp thay thế Estrogen bị giảm sút bằng Phytoestrogen là một đường

hướng tích cực, không dùng thuốc có hiệu quả cao Hãy ăn các sản phẩm chế

biến từ đậu nành, mỗi ngày chỉ cần 2-3 cốc sữa đậu nành hoặc vài bìa đậu phụ

thêm vào chế độ ăn hằng ngày là được Nếu có điều kiện ngâm đậu nành nảy

mầm mà ăn thì tốt hơn nhiều

1.7.3 .Một ố hoạt ính s t khác c oflủa is avone

Isoflavone có thể ngăn chặn chứng nghẽn mạch vành tim bằng việc giảm

lipid xấu (LDL) và tăng lipid tốt (HDL)

Năm 1999 cơ quan kiểm soát thực phẩm và thuốc FDA đã phê chuẩn yêu

sách về sức khoẻ như sau: “ Thực đơn hằng ngày phải giảm thấp hàm lượng chất

béo no và cholesterol bằng việc s dử ụng 25 gam protein đậu một ngày để giảm

nguy cơ bệnh tim” Việc sử dụng 25 – 59 mg isoflavone / ngày có khả năng làm

giảm 8 % lượng cholesterol trong máu của người trưởng thành Cung cấp 118

mg isoflavone / ngày, liên tục trong 3 tháng sẽ giảm nguy cơ tắc nghẽn động

mạch ở phụ nữ sau mãn kinh[27]

Isoflavone có thể có tác động tích cực lên những quá trình sinh lý khác

như những hoạt động của hệ thần kinh :

Với những hiểu biết quan trọng của estrogen trong những chức năng của thần

kinh và não, những nghiên cứu bắt đầu từ sự tác động vào cách cư xử ở động vật

và người liên quan đến lượng tiêu thụ isoflavon(Lephart et al , 2002) Isoflavone

trưởng thành và trung niên trong bữa ăn hằng ngày sử dụng khoảng 70 mg hợp

chất này [27]

1.8 Qúa trình tổng hợp isoflavone ở đậu tương

Isoflavonoids được tổng hợp từ một nhánh của con đường phenylpropanoid

Đường hướng phenylpropanoid bao gồm rất nhiều nhánh phổ biến với các loài

thuộc hoặc không thuộc họ đậu, tạo ra hàng loạt các hợp chất khác nhau, như

lignan, lignin, flavone, flavonol, tannin (được biết đến như là proanthocyanidin),

và anthocyanin Bởi vì màu sắc hoa có sức hấp dẫn đối với con người và những

thành phần tạo nên màu sắc đáp ứng được các phép phân tích, nên con đường

phenylpropanoid là con đường trao đổi chất thứ cấp được nghiên cứu nhiều nhất

Ngày nay những nghiên cứu về sinh hoá và kỹ thuật gen đã phát hiện ra nhiều

bước và những enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp flavonoid [23]

Bắt đầu từ aminoaxit phenylalanine, enzyme phenylalanine ammonia lyase

(PAL) tách nhóm amine từ amino acid và sinh ra axit cinnamic Bước đầu một

vài cytochrome P450 monooxygenases nằm trong con đường này, axit cinnamic

4- hyđroxylase (C4H) kết hợp với một nhóm hydroxyl tạo thành p- coumarate

Enzyme 4- coumarate: coenzyme A ligase (4CL) hoạt hoá tốt hơn p- coumarate

bởi có sự kết hợp của nhóm CoA ở vị trí cacbon thứ ba Tiếp theo chacon

synthase (CHS) tiến hành đông tụ p- coumaroyl – CoA với ba phân tử malonyl –

CoA hình thành nên khung flavonoid C15 Trong hầu hết các loài hợp phần này

Naringenin là một trong những phần cơ chất giữa con đường flavonoid và

isoflavonoid Xa hơn nữa sự biến đổi của naringenin đã dẫn đến việc sản xuất ra

hàng loạt các hợp chất flavonoid Những phản ứng phổ biến nhất sử dụng

naringenin như là một cơ chất là việc cộng thêm vào một nhóm hydroxyl ở vị trí

cacbon số 3 tạo thành dihydrokaempferol được xúc tác bởi flavanone 3 –

hydroxylase (F3H)

Hình 1.2 Con đường phenylpropanoid

Sự thay đổi vị trí C3 là rất cần thiết cho việc sản xuất ra anthocyanins và

tannin, mà cần thiết phải có enzyme d yih droflavonol reductase (DFR),

leucoanthocyanidin dioxygenase (LDOX), UDPG–flavonoid glucosyl transferase

(UFGT), và những enzyme khác

Một vài enzyme khác cũng sử dụng naringenin như là một cơ chất Trong ngô

có năm loại enzyme đã biết đến đều sử dụng naringenin Thêm vào đó F3H,

enzyme sinh tổng hợp flavone ở ngô (FNSII), cytochrome P450 monooxygenase

sử dụng naringenin để sản xuất ra flavone DFR cũng sử dụng trực tiếp

naringenin như một cơ chất cho việc tạo ra những mô đăc biệt

Mặc dầu hoạt lực của tất cả các enzyme này là đối tượngđã được nghiên cứu

trước đây, dịch chiết tự nhiên của những enzyme phân chia flavone thì vẫn chưa

được làm sáng tỏ, luồng cơ chất cho mỗi con đường thì vẫn chưa được xác định

Đối với quá trình trao đổi chất sinh tổng hợp isoflavone trong những thực vật

không thuộc họ đậu, naringenin là chất chuyển hoá then chốt vì IFS phải trực

tiếp cạnh tranh với những enzyme nội sinh khác để chuyển hoá cơ chất này Sự

am hiểu kỹ thuật và quy tắc của con đường này sẽ là yếu tố cần thiết cho những

đề tài nghiên cứu về quá trình trao đổi chất

Trong những loài tổng hợp isoflavone, enzyme isoflavone synthase (IFS),

cytochrome P450 monooxygenase hoạt động như những chìa khoá để mở điểm

vào của quá trình trao đổi chất hình thành nên tất cả các loại isoflavonoid

Enzyme này giữ hai vai trò: nó biến đổi naringenin được tạo thành bởi CHI

thành genistein và cùng với enzyme chalcone reductase tạo ra daidzein Trong

trường hợp này, CHR, CHS, và CHI phối hợp với nhau tạo ra isoliquiritigenin và

sau đó là liquiritigenin là tiền thân của daidzein Cả daidzein và genistein có thể

kết hợp liên tiếp với chuỗi glycosyl và malonyl và ẩn trong không bào Con

đường sinh tổng hợp glycitein thì vẫn cần tiếp tục nghiên cứu, mặc dầu đã có

những quan điểm cho rằng flavanone liquiritigenin bị thuỷ phân bởi flavanone 6

– hydroxylase (F6H) đáp ứng như một tiền chất (Latunde - 2001)

1.9 Các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp isoflavone

Isoflavone được tổng hợp bằng phương pháp hoá học, nhưng sẽ tạo ra

những hoá chất thải độc hại, phương pháp phức tạp (nhiệt độ, pH), tốn kém…

nên thu nhận hợp chất này từ thiên nhiên vẫn đem lại nhiều lợi ích nhất (có thể

dễ dàng tiến hành trên quy mô công nghiệp hơn, vì chủ yếu chỉ cần phản ứng

chiết bằng dung môi thích hợp, không cần điều khiển nhiều phản ứng như

phương pháp hoá học) Nhiều nhà khoa học đã cố gắng tổng hợp isoflavone bằng

con đường sinh học [ ] 20 (nhờ sử dụng kỹ thuật gen để kích thích sự tạo thành

isoflavone ở những cây họ đậu, những cây không thuộc họ đậu, hoặc biến nạp

những vector chứa gen mã hoá enzyme đặc hiệu vào vi sinh vật để tổng hợp

isoflavone với lượng rất lớn trong một thời gian ngắn )

Từ sơ đồ trên ta thấy các enzyme sau có vai trò xúc tác quá trình tổng hợp

isoflavone đậu tương:

- Phenylalanine ammonia lyase (PAL)

- Cinnamic acid 4-hydroxylase (C4- H)

- 4 coumarate:CoA ligase (4 CL)

- Chalcone synthase (CHS)

- Chalcone reductase (CHR)

- Chalcone isomerase (CHI)

- Isoflavone synthase (IFS)Ngoài IFS, nhiều enzyme khác cũng đóng vai trò chủ chốt như PAL, C4H,

4CL, CHS và CHI Hai enzyme quan trọng nhất cho kỹ thuật trao đổi chất là

CHI và CHR CHI quan trọng bởi vì nó xúc tác phản ứng cho một điểm nhánh

nơi mà mà đường hướng biến đổi cơ chất tạo ra flavonoid hay isoflavonoid

CHR không tìm thấy trong các loài không thuộc họ đậu, đáp ứng cho qúa trình

tổng hợp 6P

’

P – deoxychalcone là tiền chất cho daidzein và glycitein Xa hơn nữa

phần lớn phytoalexin được xuất phát từ 6P

1.9.1 Cha cone synthasel

Chalcone synthase là một enzyme điều tiết trong con đường phenylpropanoid

Có tám trình ự gen m t ã hóa CHS trong đậu ương, đều t đã được ách t dòng và giải

trình t ự ( Akada et al., 1990a, 1990b, 1991, 1993a, 1993b, 1993c ; Akada and

Dube, 1995) Phần lớn c ác gen CHS có kích thước 2 – 2.8 kb, trừ CHS3 (4.04

kb) T c c gất ả ác en được đặc trưng bởi sự ện diện c hi ủa hai exon phân cách ởi b

một intron nhỏ (122bp) 8 gen CHS được chia ra làm hai óm d v t ng nh ựa ào độ ươ

đồng nucleotid vùng ở đọc Từ CHS1 đến CHS6 tạo th ành m nhột óm có độ

tương đồng nucleotid 93%, CHS7 và CHS8 tạo nên n óm thứ h hai, c độ ươó t ng

đồng nucleotid 97%, giữa hai nhóm này có s tự ương đồng nucleotid là 80% [19]

1.9.2 Chalcone reductase

Hầu hết các loài thực vật bậc cao, trong quá trình phát triển, dưới tác dụng

của CHS, lần lượt gắn 3 phân tử malonyl – CoA vào 1 phân tử p.coumaroyl –

CoA để tạo thành chalcone CHR có khả năng tổng hợp 6’ – deoxychalcone nhờ

việc loại nhóm hydroxyl trên phân tử malonyl – CoA thứ 2 Hợp chất này sau

một loạt biến đổi sẽ tạo thành daidzein và glyceollin Đây là những phytoalexin

hoặc tiền chất phytoalexin, đóng vai trò hữu hiệu trong quá trình tự bảo vệ của

thực vật với sự tấn công của bệnh hại

Nhiều nghiên cứu cho thấy các gen CHR và CHS được phiên mã đồng thời

Có giả thiết cho rằng CHR và CHS kết hợp thành một phức hệ enzyme, phức hệ

này có tác dụng hoạt hoá đồng thời hai phản ứng nói trên Tuy nhiên, từ kết quả

giải trình tự gen đậu tương, người ta thấy có 3 trình tự tương tự nhau của gen mã

hóa CHR và 8 trình tự mã hoá CHS Do đó việc khẳng định giả thiết này còn gặp

rất nhiều khó khăn [18]

Dựa vào gen CHR, chúng ta có thể điều chỉnh thành phần isoflavone đậu

tương theo hướng tạo nhiều (tăng cường sự biểu hiện gen) hoặc ít (ức chế sự

biểu hiện của CHR) daidzein [23]

1.9.3 Chalcone isomerase

CHI xúc tác cho phản ứng đồng phân hoá chalcone [22 ]

Trong tất cả các loài thực vật bậc cao, sự đồng phân hóa naringenin chalcone

thành naringenin bởi CHI xảy ra rất nhanh, tuy nhiên sự biến đổi 2P

hơn liên kết hydro trong phân tử CHI được tách chiết từ những cây không thuộc

họ đậu thì không thể sử dụng isoliquigenin như một cơ chất Vì thế CHI được

phân thành hai loại Loại I CHI được tìm thấy trong tất cả các cây họ đậu và

không phải họ đậu chỉ đồng phân hoá naringenin chalcone thành naringenin

Loại II được tìm thấy trong các cây họ đậu, ngoài hoạt tính tương tự CHI loại I,

còn chuyển hoá isoliquiritigenin thành liquiritigenin

Những gen mà mã hoá cả hai loại CHI được tách dòng từ những loài thực vật

khác nhau (Kimura et al., 2001; Shimada et al., 2003) và suy ra các gen này

giống nhau trên 70% trình tự axit amin Trong khi CHI loại I và CHI loại II chỉ

tương đồng khoảng 50% [16]

1.9.4 Enzym chủ chốt isoflavone synthase

1.9.4.1 Sự phát hiện ra isoflavone synthase (IFS)

IFS là enzyme quan trọng nhất của con đường isoflavone, nó biến cơ chất

flavanone thành isoflavone Giống như những enzyme cytochrome P450

monooxygenase tính ưa béo của protein đã kìm hãm sự phân tách và xác định

IFS Mất gần mười sáu năm để xác định IFS như là một cytochrome P450

monooxygenase và tách dòng trình tự DNA của nó Khi gen được tách dòng lần

cuối nó được báo cáo bởi ba nhóm nghiên cứu khác nhau nhưng đều đưa ra kết

quả giống nhau về cấu trúc bộ gen [23]

Nhóm Dixon ở Noble Foudation – Oklchoma đã thử nghiệm 2 cytochrome

P450 monooxygenase được lựa chọn từ giống đậu EST, sử dụng microsome tinh

sạch từ những tế bào côn trùng mang một véctơ biểu hiện baculovirus Một trong

những sản phẩm gen này có thể chuyển liquiritigen và naringene thành daidzein

và genistein tách biệt Gen này được định tên là 2- hydroxyisoflavone synthase

(2- HIS Dựa vào chuỗi tương đồng và phép định tên cytochrome P450 )

monoxygenase nó được ếp vào phân họ CYP93C của cytochrome P450s x

Nhóm nghiên cứu Ayabe thuộc đại học Nihon - Nhật Bản đưa ra báo cáo về

một chuỗi cũng thuộc phân họ CYP93C mà mã hoá hoạt lực 2-

hydroxyisoflavone synthase từ cây cam thảo Nhóm này đã phân tách được tám

cytochrome P450 monooxygen từ những mô của cây cam thảo Khi được biểu

hiện trong nấm men mang một enzyme cytochrome P450 reductase, một trong

những gen này tạo ra protein mà biến flavone thành isoflavone Bằng phương

pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng khối phổ người ta xác định được rằng có

thể tổng hợp 2- hydroxyisoflavone và cuối cùng là isoflavone

Công ty Dupont cũng đưa ra báo cáo về gen mã hoá IFS bắt đầu từ cơ chất

EST Nhóm này tập trung vào những cytochrome P450 monooxy gây bệnh Sử

dụng hệ thống biểu hiện trong nấm men giống nhau như mô tả trên, họ đã chỉ ra

hai trình tự gen trong đậu tương EST tương đồng cao mã hoá những protein mà

bộc lộ hoạt lực IFS được xác định bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Tiếp

theo họ đã tách dòng được mười một gen IFS từ chín loài khác nhau , trong đó

có hai loài từ Beta vulgaras là thực vật không thuộc họ đậu nhưng có khả năng

tích luỹ isoflavone Thêm vào đó trình tự gen của hai gen mã hoá IFS trong đậu

tương EST được tách dòng bằng phương pháp PCR Hai extron và một intron

được tìm thấy ở cùng vị trí với cả hai gen Các intron này đèu nằm ở vị trí như

nhau và giống nhau 92.5% về trình tự nucleotid Trình tự axit amin của những

enzym này cũng giống nhau tới 96,7% (Jung et al , 2000) Hiện nay có khoảng

30 trình tự IFS trong ngân hàng dữ liệu tất cả chúng đều thuộc phân họ CYP93C ,

của cytochrome P450s

1.9.4.2 Phương thức hoạt động của IFS

IFS là một enzyme đặc biệt bởi vì nó xúc tác ít nhất hai phản ứng không

thông thường với một protein: phản ứng hydroxyl hoá và phản ứng chuyển nhóm

aryl trong phân tử Vì sự kết tinh của màng gắn protein là cực khó, những nổ lực

để phân tích cấu cấu trúc của IFS vẫn chưa thành công Không có được cấu trúc

cuối cùng., kỹ thuật chính xác cho phản ứng enzyme này thì vẫn mang tính chất

suy đoán Có đề suất cho rằng flavone đầu tiên bị biến đổi thành 2-

hydroxyisoflavone và sau đó là isoflavone bởi ba bước sau (Hashim et al., 1990)

Đầu tiên một gốc ở vị trí C3 được sinh ra sau đó sự sắp đạt lại trong nội phân tử

chuyển nhóm aryl từ vị trí C2 sang vị trí C3 và để lại một nhóm hydroxyl vẫn

đính ở C2, một enzyme khác có tên là isoflavone dehydratase sau đó biến đổi 2-

hydroxyisoflavone thành isoflavone [28]

Có rất nhiều dẫn chứng từ thí nghiệm chứng minh cho giả thuyết này Nó

được chứng minh lặp lại nhiều lần rằng để thay thế isoflavone, sản phẩm cuối

cùng của enzyme IFS là 2 – hydroxyisoflavone , một hợp chất không ổn định ở

điều kiện môi trường Liquiritigenin và naringenin là bằng chứng cho việc tạo

thành 2- hydroxyisoflavone sau khi ủ với IFS chứa microsome Để giải thích cho

lý do “2- hydroxyissoflavone sunthase” là tên chính xác cho enzyme này hơn là

isoflavone synthase Enzyme mà xúc tác dehydrat hoá 2 – hydroxyisoflavone

thành isoflavone được làm giàu lên từ Pueraria lobata (Hakamatsuka1998) Sản

phẩm isoflavone từ 2 – hydroxyisoflavone hầu hết là giống nhau bởi sự tương

đồng của enzyme này trong các cây họ đậu [25]

Sự am hiểu sâu sắc về cơ cấu IFS là mục đích hàng đầu trong kỹ thuật

enzyme để làm giàu hoạt lực IFS Trong tương lai sự phát sinh những

cytochrome P450 monooxylase mới cũng có thể tạo ra những hợp chất phenolic

duy nhất có chức năng sinh lý và sinh hoá đặc biệt

1.10 Kỹ thuật trao đổi chất cho sự tích luỹ isoflavone ở cây họ đậu

Đã từ lâu người ta mong muốn tăng giá trị dinh dưỡng của đậu tương bằng sự

gia tăng hàm lượng isoflavone tổng số trong hạt trong khi vẫn duy trì số lượng

và chất lượng của các thành phần khác như protein và dầu Hướng nghiên cứu dễ

dàng nhất là kỹ thuật trao đổi chất, sự biển hiện quá mức của một đơn enzyme

giới hạn tỷ lệ có thể đưa tới sự tích lũy sản phẩm cuối cùng nhiều hơn Ví dụ sự

biểu hiện quá mức của enzym tổng hợp stricotosidin ở các mô tế bào

Catharanthus roseus dẫn tới mức cao hơn của sản phẩm kaloids Không có đủ

những phép đo thay đổi theo con đường isoflavone hay phenylpraponoid để xác

định enzyme nào xúc tác giới hạn tỷ lệ phản ứng PAL, CHS và IFS là những

enzyme chủ chốt trong những nhánh chính của con đường phenyl praponoid

Tuy nhiên sự biển hiện vượt mức của 3 enzyme này độc lập với nhau nên không

có khả năng thay đổi nhiều thành phần của isofalvone PAL, CHS, và IFS được

biến nạp vào trong đậu tương qua phôi vô tính Các nghiên cứu mới đây chỉ ra

rằng ngoài ba gene đó chỉ có lectin promoter driven PAL gene là làm tăng 30%

thành phần isoflavone trong một số hạt chuyển gen Thậm chí còn không có sự

khác nhau đáng kể so với những dòng được đièu khiển bằng điều kiện tự nhiên

Những kết quả này cũng tương tự với thực nghiệm thực hiện ở Dupont Khi

PAL, CHS, IFS được biểu hiện trong hạt dưới sự điều khiển của một protein dự

trữ beta- conglycinin promoter, không có sự thay đổi đáng kể về mức của

isoflavone, thậm chí ngay cả khi gia tăng hàm lượng protein của những gen này

tại sao đường hướng này đã không thực hiện được Một là do ngay cả khi sự thay

đổi cơ chất được gia tăng bởi sự biểu hiện quá mức của PAL và CHS thì những

cơ chất đó cũng không phải là đích mong đợi của quá trình sinh tổng hợp

isoflavone [23]

Thứ hai tập hợp những kinh nghiệm đã chứng minh thêm rằng sự tăng các

dòng cơ chất qua con đường trao đổi chất có thể gây ra một kết quả ngạc nhiên

nhờ sự phức tạp của mạng lưới trao đổi chất Như sự chú ý ở trên gen CRC ở

ngô mã hóa cho một nhân tố phiên mã ảo mà phiên mã hoạt hóa toàn bộ con

đường phenyl proponoid ở ngô Khi gen CRC được biến nạp vào trong đậu

tương dưới một promoter phaseolin đặc hiệu trong hạt, nó hoạt hóa con đường

flavonoid và phenylpropanoid ở con đường phenylpropanoid, mức độ của RNA

hoặc protein của bốn loại enzyme thử nghiệm PAL, C4H, CHS, và CHI được

tăng lên hơn gần mười lần Trong con đường flavonoid sự biểu hiện của ba gen

thử nghiệm F3H, DFR và FLS được tăng mạnh Ngược lại, sự biến nạp với CRC

đã không ảnh hưởng đến sự biểu hiện của những enzyme trong nhánh

isoflavonoid bao gồm IFS, IFR và IOMT

CRC biểu hiện khác nhau thì rõ ràng có sự liên ứng dạng cis- với những

promoter của những gen trong con đường phenylpropanoid và flavonoid ở đậu

tương, sự tương tác với bộ máy phiên mã của đậu tương có thể làm tăng sự biểu

hiện gen Tuy nhiên những gen đặc hiệu với con đường isoflavone trong đậu

tương và có lẽ trong những cây họ đậu khác rõ ràng không tham gia vào các hoạt

động phiên mã Một sự mong đợi đó là gen CHR mà biểu hiện tương tự như

những gen khác ở con đường phenylpropanoid thậm chí CHR là đặc biệt cho cây

họ đậu và không có ở ngô Có khả năng rằng phải có sự đòi hỏi phối hợp biểu

hiện của CHS và CHR để thông qua những quy luật phiên mã tương tự suốt quá

trình phát triển

Sự biểu hiện vượt mức của CRC không những làm xóa trộn sự biểu hiện gen

của các con đường liên quan mà con gây ra một sự bién đổi lớn về kiểu hình của

hạt Đầu tiên thành phần glycitein và daidzein được định lượng bằng HPLC đã

tăng bốn lần trong những hạt chuyển gen Thứ hai thành phần genistein đã giảm

đi đáng kể, trong một vài trường hợp thì hầu hết các mức độ đều không phát hiện

ra Kết quả là thành phần daidzein đã tăng từ 40% đến khoảng 90%, trong khi

genistein thì giảm đi từ xấp xỉ 50% tới dưới 10% hoặc thấp hơn Thứ ba, tất cả

các hạt chuyển gen mang một gen CRC có vỏ màu hơi nâu, trong khi màu nâu

này không phải do tannin đặc vì nó không chuyển màu với vanillin Tannin đặc

được tăng lên trong vỏ hạt khi so sánh với hạt tự nhiên

Sự biểu hiện phối hợp gen có thể giải thích cho một số kiểu hình quan sát

thấy Từ khi CRC tăng sự biến đổi ở con đường phenylpropanoid và flavonoid

nhưng không có lợi cho sức khoẻ mà đã thấy từ sự tiêu thụ thực phẩm đậu Tuy

nhiên để tăng thành phần isoflavone tổng số, nồng độ CRC khi F3H cạnh tranh

trực tiếp với IFS về cơ chất naringenin, sự bất hoạt của gen F3H ở dòng CRC sẽ

ngăn chặn phần lớn con đường flavonoid và gián tiếp với dòng cơ chất của quá

trình sinh tổng hợp isoflavone Quả thực khi tạo CRC và F3H cùng ngăn chặn và

được cùng biến nạp vào trong đậu tương, genistein đã được trữ lại với mức giống

như hạt bình thường và hàm lượng isoflavone tổng số được gia tăng ít nhất sáu

lần Những đặc điểm sinh lý và sự phân tích con đường con đường phân từ trong

những cây chuyển gen này đã không được thông báo Sẽ thật đáng quan tâm nếu

sự gia tăng hàm lượng của isoflavone ở hạt đậu dẫn tới sự khác nhau trong sự tác

động tương hỗ giữa cây – vi sinh vật Tóm lại sự kết hợp củahoạt động gen điều

khiển nhân tố phiên mã và sự ngăn chặn của một con đường cạnh tranh đã cung

cấp một phương pháp thành công để tăng sự tích luỹ isoflavone trong hạt đậu

So với mục đích dự án là tăng hàm lượng isoflavone, chiến lượt phát triển

đậu tương có mức isoflavone giảm thì dễ hơn nhiều Có ít nhất hai hướng nghiên

cứu mà có thể sẽ phù hợp cho việc sản xuất ra đậu tương không có

isoflavone.Thứ nhất sử dụng gen bất hoạt để giảm sự biểu hiện của IFS ở hạt và

thứ hai kết hợp sự biểu hiện quá mức của nhân tố phiên mã CRC và gen bất hoạt

của CHR để đồng thời làm giảm cả hai sản phẩm genistein và daidzein Đây là

một trường hợp mà trong đó sự chăn nuôi truyền thống là đặc biệt có lợi, khi một

chiến lượt khác là phân lập đột biến rộng lớn, sàng lọc để xác định những dòng

isoflavone đã suy giảm Thêm vào đó để tiện lợi cho những ứng dụng tiềm năng

như là sữa bột nhân tạo cho trẻ em hay protein cho người tập thể hình, những

dòng này cũng sẽ là hướng có ích trong nghiên cứu con đường isoflavonoid, sự

tăng vốn chung của cơ chất naringenin có xu thế gần với quá trình sinh tổng hợp

flavonoid, như là tổng hợp tanin đặc Cùng lúc đó sự phiên mã IFS hay protein

thì không tăng lên, bởi vậy sự tích luỹ genistein đã giảm đáng kể Tượng tự khi

CHR và CHS được biểu hiện vượt mức trong khi enzyme IFR và IOMT thì

không, sự gia tăng tích luỹ daidzein và glycitein có thể xảy ra Tuy nhiên vùng

màu nâu không thể giải thích bởi vì vỏ hạt là mô mẹ và màu nâu của nó lại

không tách biệt với những hạt chuyển gen trừ khi tồn tại một hệ thống vận

chuyển một số flavonid từ lá mầm tới vỏ hạt trong suốt quá trình phát triển của

phôi

Một ngạc nhiên khác và tác động trái ngược là sự phát hiện một vùng là

tiền thân của dai zein, isoliquiritigenin và liquiritigenin trong những hạt non d

chứa CRC Những thành phần này chưa bao giờ được báo cáo ở những hạt tự

nhiên Điều này ngụ ý rằng CHI là một enzyme giới hạn phổ biến là một nhân tố

giới hạn tỷ lệ trong sự hình thành daidzein

Như một sự lựa chọn, CRC có thể chỉ gây ra sự biểu hiện của CHI loại

một ở đậu tương (mà tương đồng với ngô), nhưng không có khả năng hoạt hoá

CHI loại II đây là cái cần thiết cho sự sinh tổng hợp daidzein và không có bản

tương đồng ở ngô Dưới những tình huống này, toàn bộ con đường isoflavonoid,

bao gồm ít nhất là CHI loại II, IFS, IOMT và những gen IFR dường như được

điều hoà bằng một tập hợp các nhân tố phiên mã khác so với loại CRC Bộ gen

này có thể gây đáp ứng phòng vệ hoặc tín hiệu chốt mà đặc biệt để nâng cao sự

sinh tổng hợp isoflavonid Sự tương tác và cạnh tranh giữa con đường isoflavoid

và flavonoid là một vùng quan trọng cho sự khảo sát xa hơn nữa

Nhân tố phiên mã CRC có thể được sử dụng để sinh ra daidzein mức cao,

genistein mức thấp ở đậu tương, thích hợp để tạo đậu thực phẩm dùng làm

nghiên cứu vai trò của daidzein, góp phần trong chức năng của isofavone trong

suốt quá trình tương tác cây vi sinh vật và vai trò mà isoflavone thực hiện –

trong việc cung cấp những yếu tố có lợi cho sức khoẻ, thu được từ việc tiêu thụ

thực phẩm từ đậu [ ] 23

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng được chọn nghiêđể n cứu ở đây là đậu ương được trồng phổ biến t

ở Việt Nam Có bốn giống đậu hay được trồng phổ biến ở Việt Nam là DT84,

VX93, AK06, và DT12 Trong đó VX93 là giống

cho hàm lượng isoflavone cao nhất, nên t i chọn giô ống đậu ày n cho những

nghiên cứu tiếp theo

2.2 Nguyên liệu

Chúng tôi nghiên cứu nhóm hoạt chất isoflavone trên giống đậu tương được

VX93 do Trung tâm đậu đỗ Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam-

cung cấp

Đậu tương dạng hạt, chọn loại tốt (hạt đều, chắc mẩy, không mối mọt), loại

bỏ hết hạt lép, hạt nhọn Nghiên cứu, so sánh sự biểu hiện của các gen nằm trong

chu trình tổng hợp các isoflavonoid ở thân giá, và hạt giá của đậu tương VX93

đã nảy mầm thành giá đỗ 2cm, 5cm, 10cm, ở nhiệt độ 25P

0

PC và 35P 0

PC

2.3 Hoá chất và dụng cụ

- Các dung môi tách chiết: accetonitril, nước cất, axit chlohydric

- Dụng cụ thí nghiệm:tủ ấm ánh sang, tủ sấy, tủ hút, bình cầu, bình tam

giác, ống eppendorf, cân phân tích, máy đo hàm ẩm, vortex, máy lắc,

khuấy từ…

- Dung môi tách chiết RNA và chạy PCR: Trizol, isopropanol, đệm

natri acetat, nitơ lỏng, nulceotid bốn loại, Tag polymerase…

2.4 Phương p áp nghiên cứu h

2.4.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Có nhiều phương pháp xác định độ ẩm khác nhau: phương pháp sấy

nhanh, sấy đến trọng lượng không đổi, hoặc phương pháp cất với dung môi

Phương pháp sấy cho kết quả tương đối chính xác, thao tác và thiết bị đơn giản,

không cần sử dụng và hoàn nguyên dung môi, không gây độc cho nguyên liệu

[10]

Để xác định độ ẩm của thân giá và hạt giá sau khi đã nghiền ta tiến hành

như sau

Phương pháp 1: Cân chính xác một lương nhỏ thân giá, hoặc hạt giá,

cho vào đĩa nhôm đã biết trọng lượng Sấy ở nhiệt độ 105P

o

P

C, cho đến khi trọng lượng giữa hai lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không đáng ể k

Độ ẩm của nguyên liệu được tính theo công thức:

−

− c a

b

a: trọng lượng của đĩa nhôm và nguyên liệu trước khi sấy (g)

b: trọng lượng của đĩa nhôm và nguyên liệu sau khi sấy (g)

c: trọng lượng của đĩa nhôm (g)

Phương pháp 2: Để xác định độ ẩm của mẫu sau khi đã nghiền

bằng Nitơ, ta chỉ cần cho trực tiếp một lượng mẫu xác định vào máy đo

hàm ẩm Vì mẫu đã nghiền mịn nên dễ dàng được sấy khô đến trọng luợng

không đổi dưới sức nóng của tia hồng ngoại, cho kết quả chính xác

2.4.2 Phương pháp tạo giá đỗ

Đậu tương VX93 được rửa sạch, loại bỏ những hạt nhỏ và lép Ngâm trong

nước 4 tiếng, hạt đậu tương nở to, vớt ra rổ, rửa sạch lại vá cho vào rổ đã lót lá

tre ở đáy, cứ một lớp đậu mỏng, ta lại lót một lớp lá tre để tạo độ thoáng cho hạt,

trên cùng ta phủ một lớp lá tre dày để giũ ẩm và tránh ánh sáng Nhi ệt độ thích

dân gian chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi trồng giá đậu tương ở nhiệt độ

Tiến hành làm song song ba mẫu: một mẫu ủ trong vòng 36h (thân giá dài

2 cm) Một mẫu ủ trong vòng 60h (thân giá dài 5 cm) và một mẫu ủ trong vòng

84 h (thân giá dài 10cm)

2.4.3. Tách chiết hỗn hợp isoflavone

Quá trình chiết hợp chất isoflavone dựa trên cơ sở của phương pháp chiết

thông thường Căn cứ vào độ phân cực của các hợp chất isoflavone, những dung

môi thường được sử dụng để tách chiết isoflavone ra khỏi đối tượng nghiên cứu

thường là: ethanol, methanol, nước và acetonitrile, trong đó acetonitrile được

đánh giá là dung môi cho hiệu suất tách cao nhất [19] Do đó, em sử dụng

acetonitril để khảo sát hàm lượng isoflavone trong các đối tượng nghiên cứu của

mình

Các bước tiến hành:

1 Chuẩn bị mẫu theo bảng sau: