Nghiên Ứu Tần Suất Alen 2 Lous Đa Hình Str Ở Quần Thể Người Kinh Việt Nam.pdf

TRƯỜNG ĐẠ Ọ ỘI H C BÁCH KHOA HÀ N I LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên c u t n su ầ ất alen 21 locus đa hình STR ở ầ ể ngườ ệ qu n th i Kinh Vi t Nam ĐỖ Ị TH XAO MAI Ngành Công ngh sinh h c ệ ọ Giảng viên hướng[.]

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ọ Ộ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nghiên c u t n su  ầ ất alen 21 locus đa hình STR

ở qu n th ầ ể ngườ i Kinh Vi t Nam ệ

ĐỖ TH XAO MAI Ị Ngành Công ngh sinh h c : ệ ọ

Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trương Quc Phong

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ọ Ộ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nghiên c u t n su  ầ ất alen 21 locus đa hình STR

ở qu n th ầ ể ngườ i Kinh Vi t Nam ệ

ĐỖ TH XAO MAI Ị Ngành Công ngh sinh h c : ệ ọ

Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trương Quc Phong

Trang 3

C NG HÒA XÃ H I CH Ộ Ộ Ủ NGHĨA VIỆ T NAM

Độ ậ – ự c l p T do H nh phúc – ạ

B N XÁC NH N CH NH S A LU Ả Ậ Ỉ Ử ẬN VĂN THẠC SĨ

H và tên tác gi ọ ả luận văn: Đỗ ị Th Xao Mai

Đề tài lu ận văn: Nghiên c u t n su ầ ất alen 21 locus đa hình STR ở quần thể người Kinh Vi t Nam ệ

Chuyên ngành: Công ngh sinh h c ệ ọ

Mã số SV: CA180119

Tác giả, Người hướng d n khoa h c và Hẫ ọ ội đồng ch m luấ ận văn xác nhận tác gi ả đã sửa ch a, b sung luữ ổ ận văn theo biên bản h p Họ ội đồng ngày 30/10/2020 v i các n i dung sau: ớ ộ

- Chỉnh s a các l i chính t , thi u ch viử ỗ ả ế ữ ết tắt

- Trình bày cho rõ ràng

- Viết lại tài li u tham kh o theo tiêu chu n ệ ả ẩ

- Chỉnh sửa b ục, nộ c i dung luận văn cho hp lý

Ngày tháng năm 2020 Giáo viên hướ ng d n ẫ Tác gi lu ả ận văn

CHỦ Ị T CH H ỘI ĐỒ NG

Trang 4

L ỜI CAM ĐOAN

ng n i dung vi trong lu tìm Tôi xin cam đoan nhữ ộ ết ận văn là do sựtòi, h c h i và nghiên c u c a b n thân v i s ọ ỏ  ủ ả ớ ự hướng d n t n tình cẫ ậ ủa PGS TS Trương Quc Phong và TS Nguyn Văn Li

Mọi kết qu nghiên cả u cũng như ý tưởng của các tác giả khác (nếu có) đều đưc trích d n c thẫ ụ ể Đề tài luận văn này cho đến nay chưa đưc

b o v t i b t k m t hả ệ ạ ấ ỳ ộ ội đồng b o v ả ệ luận văn thạc sĩ nào và cũng chưa đưc công b trên b t k  ấ ỳ phương tiện nào Tôi xin ch u trách nhi m v ị ệ ề

nh ng lữ ời cam đoan trên

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

H C VIÊN Ọ

Đ Th Xao Mai 

Trang 5

L Ờ I CẢM ƠN

V i t m l ng k nh tr ng v s biớ ấ   ọ à ự ết ơn chân thành nh t, em xin cấ ảm ơn PGS TS Trương Quc Phong v TS Nguyà n Văn Li đã ậ ình hướ t n t ng d n em ẫtrong qu trá ình nghiên c u em ho n th nh lu để à à ận văn này

Em xin chân th nh cà ảm ơn Lãnh đạo, Ch huy Vi n Phỉ ệ áp y Quân đội đãtin tưởng giao đề à à t i v quan tâm, tạo điều ki n giệ p đ em trong qu tr nh công á ì

Trang 6

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

ĐẶ T V N Đ 1 Ấ Ề CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀ I LIỆ 4U 1.1 Tổng quan về ầ t n suất alen 4

1.1.1 Tần suất alen là gì 4

1.1.2 Tầm quan trọng c a vi c nghiên cứu tần suất alen 5ủ ệ 1.2 Tổng quan về STR, Alen, locus gen 6

1.2.1 STR ( Short tandem repeat) là gì 6

1.2.2 Alen là gì 8

1.2.3 Locus là gì 8

1.3 Tình h nh nghiên c u trong vì ứ à ngoài nước 9

1.3.1 Tình h nh nghiên cứu trong nước 9ì 1.3.2 Tình h nh nghiên cì ứu trên thế giới .10

CHƯƠNG 2 VẬ T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁ Ệ P NGHIÊN CỨ 12U 2.1 Vật liệu nghiên cứu .12

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.2 Hóa chất, thiết bị ử s dụng trong nghiên cứu .12

2.1.3 Đặc điểm của bộ kit GlobalFiler™ PCR Amplification Kit 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp thu mẫu: 20

2.2.2 Phương pháp phân tích mẫu .21

2.2.3 Phân tích xử lí s ố liệu và tính to n tá ần suất alen 29

CHƯƠNG 3 KẾT QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 34Ả Ứ Ả Ậ 3.1 Kết quả phân tích mẫu .34

3.2 Kết quả phân tích thống kê 37

3.2.1 Kết quả nh tần s tí ố alen của 21 locus .37

3.2.2 Xác định và liệt kê các alen có tần số thấ 41p 3.2.3 Kết quả nh to n tần số ị ợp tử quan s t v ần số ị ợp tử lý tí á d h á à t d h thuyết .42

Trang 7

ii

3.2.4 Kết quả nh toá tí n v so s nh các chỉ ốà á s áph p y 43

3.2.5 Giá t htrị ổ ợp của c c chỉ ố ph p y 47á s á 3.3 So sánh tần suất c c alen của quần t ể nghiên cứu với mộ ốá h t s nghiên cứu khác 47

3.3.1 Tần số alen của locus D3S1358 47

3.3.2 Tần số alen của locus vWA 48

3.3.4 Tần số alen của locus CSF1PO 50

3.3.5 Tần số alen của locus TPOX 51

3.3.11 Tần số alen của locus TH01 58

3.3.12 Tần số alen của locus FGA 59

3.3.17 Tần số alen của locus SE33 65

CHƯƠNG 4 KẾT LU N VÀ KI N NGH 72Ậ Ế Ị TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

PHỤ LỤC 77

Trang 8

iii

DANH M C HÌNH VỤ Ẽ

Hình 1.1 Locus TH01 c a 01 củ á thể 7

Hình 1.2 Các locus trên mộ t nhi m s c thể 8 ễ ắ Hình 1.3 Vị í ctr ủa 13 Locus trong CoDis trên NST 9

Hình 3.1 Kiểu gen trên 24 locus của mẫu HT105.19_2 35

Hình 3.2 Biể u đ c t theo giá trị ồ ộ ch s PM của t ng locus ỉ ố ừ .45

Hình 3.3 Biể u đ c t theo giá trị ồ ộ ch s PD của t ng locus ỉ ố ừ 45

Hình 3.4 Biể u đ c t theo giá trị ồ ộ ch s PE của từng locus 46 ỉ ố

Trang 9

iv

DANH MỤC BẢNG BI U Ể

Bảng 2.1 Cá c locus v alen của bộ kit GlobalFiler™ 17à

Bảng 3.1 Kiểu gen c a mủ ẫu HT105.19_2 trên 24 locus 36

Bảng 3.2 Tầ n su t alen 21 Locus STR trong quầ ấ n th người Kinh Việt Nam 38 ể

Bảng 3.3 Cá c alen c ần số thấp trong quầó t n th nghiên cứu 41 ể

Bảng 3.4 Tần s d h p t quan sát (OH) và t n số ị ợ ử ầ ố dị ợ ử h p t lý thuyết(EH) 42 Bảng 3.5 Kế t qu tính toán các chỉ ố ả s Pháp y 43

Bảng 3.6 Tầ n s alen của locus D3S1358 48 ố

Bảng 3.7 Tầ n s alen của locus vWA 49 ố

Bảng 3.9 Tầ n s alen của locus CSF1PO 51 ố

Bảng 3.10 Tầ n s alen của locus TPOX 52 ố

Bảng 3.16 Tầ n s alen của locus TH01 59 ố

Bảng 3.17 Tầ n s alen của locus FGA 60 ố

Bảng 3.22 Tầ n s alen của locus SE33 66 ố

Trang 10

v

DANH MỤC VIẾT TẮT

Chữ viế ắt t t Nội dung

ADN Deoxyribonucleic acid

FTA Giấy thu mẫu máu

NST nhiễm sắc thể

STR Short tandem repeat

PCR Polymerase chain reaction

CPM Combinded Match probability

CPE Combinded Power of Exclusion

CPD Combinded Power of discrimination

PBS Phosphate - Buffered Saline

SDS Sodium dodecyl sulfate

DDT Dithiothreitol

Trang 12

1

ĐẶT VẤ N Đ Ề

sNăm 2020 ắp qua và chúng ta đã được ch ng ki n sứ ế ự phát tri n vượ ậể t b c của khoa học công nghệ Mặc dù sự phát tri n này đem lạ ấể i r t nhiều l i ích cho ợloài người, tuy nhiên sự phát tri n quá nhanh cũng đem lạể i nhi u v n đ khi n ề ấ ề ếchúng ta phải lo lắng

Mỗi năm trên th giới có hàng ngàn vụ ảế th m họa thiên tai, hàng triệu vụ án

mạng, mất tích, khủng bố quy mô r ng Trong bộ ất kỳ ộ m t trường h p nào, ở ấợ b t cứ quốc gia nào thì việc xác định rõ tung tích nạn nhân là vấn đ u tiên đ t ra cần ề đầ ặgiải quy t Khoa hế ọc hiện đ i với công nghệạ ADN làm mũi nh n đã tiến tớọ i kh ảnăng nhận biết truy nguyên đến mức đ cá th b ng chính những thông tin được ộ ể ằ

mã hóa trong hệ gen c a mỗủ i ngư i Trong những năm gần đây, thế ớờ gi i đã chứng kiến những vụ th m họa lớn xảy ra như vụả kh ng b vào tòa tháp đôi ở Trung tâm ủ ốthương mại th gi i t i New York ngày 11 tháng 9, vế ớ ạ ụ th m họả a sóng thần khu ở vực Đông Nam Á, những vụ tai n n máy bay, những vụ đánh bom liềạ u ch t cư p ế ớ

đi sinh mạng c a hàng trăm người… Trong r t nhiủ ấ ều trư ng h p ADN đư c coi ờ ợ ợnhư là dấu vết và bằng chứng đưa đến nh ng k t lu n cu i cùng ữ ế ậ ố

Việc ứng d ng kụ ỹ thu t phân tích ADN đã giúp ích r t nhi u cho viậ ấ ề ệc đi u ềtra phá án, đồng th i cho phép truy nguyên cá thể ớờ v i đ chính xác cao hơn h n ộ ẳcác phương pháp nhận dạng truyền thống Dấu v t sinh phế ẩm thu đượ ởc hi n ệtrường c a các v án thườủ ụ ng là r t ít ho c b phân h y nghiêm trọng nhưng thông ấ ặ ị ủqua phân tích ADN có thể cho chúng ta những ch ng cứ ứ quan tr ng giúp truy ọnguyên thủ phạm của vụ án hoặc truy tìm tung tích nạn nhân một cách chính xác [1]

Một marker chỉ th , hay một locus ADN nhân mang tính khoa học đượị c s ửdụng (được coi là đặc trưng cá th ) n u nó có nhi u alen khác nhau trong quần thể ể ế ề(nhiều hơn 5 alen) và kiểu gen dị ợ h p của các cá thể trong quần thể ớ l n hơn 70% [1] [2] Do đó, càng nhiều vị trí ADN (locus ADN) được phân tích để tìm đ c ặtrưng ADN, thì khả năng xác định mẫu sinh học nào đó của một ngư i càng cao ờ

Vì thế, việc xác đ nh đ c trưng cá thể ềị ặ v phương diện ADN gi a mẫữ u sinh ph m ẩ

Trang 13

2

thu được và mẫu sinh ph m đ i ch ng c a mộẩ ố ứ ủ t cá th nghi ngờể ho c v i ngân hàng ặ ớ

d ữ liệu ADN (nếu có) là cực kỳ quan tr ng ọ

Hiện nay, trên thế gi i công tác giám định pháp y, đặớ c bi t là trong khoa ệ

học hình sự chủ ếu sử ụng các marker STR (Short Tandem Repeat), đây là các y dđoạn ADN có c u trúc l p lấ ặ ại từ 2-6 bp, có tính bảo thủ cao, được di truy n qua ềcác thế ệ h và mang tính đặc trưng cá thể M t locus STR đư c sử ụộ ợ d ng cho mục đích nhận dạng và xác định cá thể ph i có tính đa hình và mứả c đ d hộ ị ợp tử cao, có kích thước ngắn t ừ 100 500bp và ph i có tính di truy n đ c l p [2] Trên th c t , - ả ề ộ ậ ự ếtần suất xuất hiện các Alen của locus STR trong quần thể ở các n c khác nhau, ướcác tộc ngư i khác nhau cũng có sự khác bi t Có nhờ ệ ững Alen chỉ ấ th y xuất hiện ở

tộc ngư i này nhưng lại không th y xuờ ấ ất hiện ở ộ t c ngư i khác hoặc rất hiếm gặờ p [3] Vì thế, việc nghiên cứu tần suất alen của các tộc ngư i khác nhau có ý nghĩa ờquan trọng trong việc đánh giá và áp dụng có hi u qu thông qua phân tích các ệ ả locus STR, giúp truy nguyên cá thể một cách nhanh chóng, chính xác [4]

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng d ng kụ ỹ thu t phân tích STR trong nhận ậdạng cá thể ngư i cũng đã đượờ c phát tri n mạnh mẽ ừể t nh ng năm 2000 đến nay, ữ

hầu hết c c ph ng th nghiệá ò í m đ u đang sử ụề d ng các b kit marker STR để xác định ộquan hệ huyết thống, nh n dậ ạng ngư i Trư c đây t i cáờ ớ ạ c ph ng th nghiệm ởò í Vi t ệNam thường ch s d ng b kit nhân gen 16 locus th bây giỉ ử ụ ộ ì ờ khoa h c công nghệ ọphát triển đã cho ra các bộ kit nhân gen 24 locus, cho độ nhậy và độ ích nh x c cao áhơn

Tại Khoa x t nghié ệm - Viện Ph p Y Quân đá ội, hiện đang sử ụ d ng b kit ộnhân gen Global filer 24 locus Hàng năm chúng tôi tiếp nh n vậ à giải quyết hàng trăm vụ án: cư p c a, gi t ngư i, hi p dâm, nh n dớ ủ ế ờ ế ậ ạng các nạn nhân của c c vá ụ thảm họa như: vụ rơi máy bay Mi 171, vụ rơi máy bay CaSa Hầu hết dấu vết trong các vụ n cướ á p c a, gi t ngư i, hi p dâm thườủ ế ờ ế ng r t nghèấ o n n, nhi u mà ề ẫu

b ịphân hủy không có khả năng phân tích đủ 24 locus trong nh n dậ ạng Do đó để đánh giá độ chính xác hay mức đ tin c y c a xét nghiộ ậ ủ ệm này cần có các thống kê

c ụ thể ề ần suất alen, t v t ần suất dị ợ h p tử của từng locus STR đối v i ngư i Vi t ớ ờ ệNam Từ đó tính toán kh năng phân biả ệ ủ ừt c a t ng locus, đ chính xác cũng như ộ

độ tin c y c a phép phân tích trong từậ ủ ng trư ng h p c th ờ ợ ụ ể

Trang 14

3

Mặt kh c hiện nay ở Việt Nam chỉá có b ng tần suất alen của 15 locus hệ ảIdentifiler, powerplex 16 , tần suất alen của hệ Power plex Fusion System Cho đến nay, chưa có một nghiên cứu nào được công bố ề v kh o sát sựả phân b t n ố ầsuất các alen c a các locus gen hủ ệ Globalfiler (gồm 24 locus gen) trong quần thể người Kinh Theo Tổng điều tra dân số và nhà năm 2019, người Kinh ởở Vi t ệNam có dân số 82.085.826 người, chi m 85.3% ế dân số ả nước, cư trú tạ ấ ả c i t t c

63 nh tỉ , thành phố Các tỉnh, thành phố có s lượố ng ngư i Kinh l n nh t là: Thành ờ ớ ấphố ồ H Chí Minh, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An Đồng Nai, An Giang [5] đây ,

là những điểm nóng v tình hình an ninh và trề ật tự xã h i, số ụộ v án trong cộng

đồng ngư i Kinh có di n bi n phờ ễ ế ức tạp với xu hướng ngày càng gia tăng Các v ụ

án về nhận d ng, truy nguyên cạ á thểtrên quần thể ngư i Kinh cũng phổ biến nhất ờ

háXuất p t từ những yêu cầu th c tiự ễn chúng tôi đã chọn đề tài nghiên cứu:

" Nghiên cứu t n su ầ ấ t alen 21 locus đa hình STR quầ ở n th ngư i Kinh Vi t ể ờ ệ

Nam"; với c c mục tiêu sau: á

1 Xây dựng b s liệu tầộ ố n su t alen c a 21 locus đa hình STR cấ ủ ủa quần thểngười Kinh Vi t Nam ệ

2 Đánh giá các chỉ ố thống kê đặc trưng củ ầ s a t n su t alen, chỉ ốấ s đa d ng ạ

di truyền quần thể

3 So sánh đối chiếu với tần suất tương ứng mộ ốở t s nước trong khu vực và trên thế giới Đánh á gi khả năng phân biệ ủt c a chúng trong nh n dậ ạng cá thể

Trang 15

4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀ I LIỆ U

1.1 Tng quan về t ần suất alen.

1.1.1 Tần suất alen là gì

Tần su t alen đượấ c hi u là t l xu t hi n c a một alen nào đó trong quầể ỉ ệ ấ ệ ủ n th ể

ở m t locus gen trên nhiễm sắc thểộ [6] T n suất alen đượầ c tính b ng s l n alen ằ ố ầđược quan sát th y trong quần thể trên tổng số alen c a locus cấ ủ ụ ể th nào đó trong quần thể Tần suất alen có thể được th hi n dướể ệ i d ng s th p phân, phần trăm ạ ố ậhoặc phân số Trong một qu n th t n su t alen ph n áầ ể ầ ấ ả nh sự đa dạng di truyền

Hiện nay, trong phân tích ADN có đến hàng chục locus gen được ch tạo và ế

s dử ụng ở ạng bộ Kit thương phẩm bán trên thị trườ d ng th gi i; các locus gen này ế ớnằm trên các nhiễm s c th khác nhau t c p s 1 đ n c p s 23 Các nhà nghiên ắ ể ừ ặ ố ế ặ ố

cứu ADN thư ng sử ụng nh ng locus gen khác nhau trên nhờ d ữ ững nhiễm sắc thể khác nhau để ả b o đảm tính phân ly độ ậc l p và tính đa hình cao Các hãng sản xu t ấtrên thế giới ngày nay thường cho ra đời các b Kit phân tích ADN bao gồm nhiều ộgen khác nhau; phổ biến là Kit của hãng Appliedbiosystem: Profiler plus 10 gen, Codis 13 gen, Identifiler GlobalFiler 24 gen và có thể mở ộ r ng thêm s locus gen ố nhiều hơn nữa Thêm vào đó trong mỗi locus gen i có nhi u alen khác nhau (alen lạ ề

là những trạng thái biểu hi n khác nhau cệ ủa một gen chiếm một vị trí xác định trên nhiễm sắc thể) Do vậy sẽ có rất nhiều đ c điặ ểm khác nhau được phân tích

Để xác đ nh đượ ầị c t n su t alen các nhà nghiên cứu về ADN đã phải nghiên ấcứu, khảo sát và công bố ế k t quả ề v một gen ho c nhi u gen thuặ ề ộc mộ ố ột s t c người nh t đ nh trên thế ớấ ị gi i trong đó có cả ầ t n su t c a các alen Sở dĩ ph i như ấ ủ ảvậy là để xác định tính đa hình của gen đó, sự khác biệt gi a tộữ c ngư i này v i t c ờ ớ ộngười khác; gen có bị độ t biến hay không, tỷ ệ độ l t biến cao hay thấp…Để ừ t đó quyết đ nh có nên sử ụị d ng gen đó hay không Muốn xác định đượ ầc t n su t alen ấcần phải thu thập được mẫu, m u này là c a nh ng ngư i đã bi t chính xác về ẫ ủ ữ ờ ếnguồn gốc (t c người, không có quan hộ ệ ọ h hàng huyết thống với những mẫu khác,

ở nhi u vùng địa lý khác nhau trong mỗề i qu c gia) Sốố lư ng các mẫợ u c n phân ầtích phải đ l n đ b o đ m đư c đ ủ ớ ể ả ả ợ ộ tin cậy cao, có nghĩa là kết qu phân tích ảthống kê t n sầ ố alen và kiểu gen ph i phù hả ợp giữa mẫu nghiên c u và quứ ần thể lý thuyết, và sử dụng tiêu chuẩn Khi bình phương (Chi square) để thẩm đ nh Chỉ khi ị

Trang 16

5

nào đạt đư c tiêu chuẩn này thì tầợ n su t alen đó m i có giá trị [7] Khi có đượấ ớ c s ốliệu tần suất alen của các gen thì tần suất này được s d ng xác đ nh đ tin c y ử ụ để ị ộ ậtrong truy nguyên cá thể và xác đ nh quan hị ệ huyết thống Hiện nay ch duy nhỉ ất

b ộ kit Globalfiler 24 locus gen của hãng Appliedbiosystem là được Vi n Pháp y ệQuân đội xác đ nh tầị n su t và áp d ng cho hệấ ụ gen ngư i Việờ t đ giám đ nh ADN ể ịtruy nguyên cá thể hay xác định huy t th ng ế ố

1.1.2 Tầm quan trọng của việ c nghiên c u tần suất alen ứ

Một bảng gồm các giá trị tương đ i củố a các alen c a tủ ừng locus trong một quần thể ụ c thể được gọi là một cơ sở d ữ liệu tần su t STR.[8] ấ

Các cơ s d ở ữ liệu tần suất STR của một qu n th người đượầ ể c xây d ng cho ựviệc đánh giá và phân tích Dựa trên các cơ sở ữ ệ d li u có th truy xuất từ mộ ộể t b

h ồ sơ ADN của một ngư i nào đó v thông tin ngu n gờ ề ồ ốc, chủng tộc của ngư i ờnày Một cơ sở ữ ệ d li u ph i đượả c xây d ng trên mộự t kích thư c mẫớ u đ lớn nhằm ủ

đảm b o gi m sai s do kích thước mẫả ả ố u M c đích l n nh t c a vi c xây d ng cơ ụ ớ ấ ủ ệ ự

s d ở ữ liệu nhằm tạo dựng bộ thông tin di truy n cề ủa một qu n th v các alen phổ ầ ể ềbiến trong quần thể đó [9], [10]

Mỗi cá thể người có cấu trúc di truy n riêng không ai giề ống ai, trừ những trường h p sinh ra cùng mộợ t tr ng N u xét rộng trong cả ộứ ế m t qu n th thì m t sầ ể ộ ố

đặc đi m di truyền - ể ADN ở các cá thể khác nhau v n có thẫ ể ố gi ng nhau [11] Mặt khác mỗi m t qu n th ngư i khác nhau c ng có nhữộ ầ ể ờ ũ ng đ c đi m di truyềặ ể n đ c ặtrưng thể hiện bằng sự phân bố ầ t n suất alen trong m i quỗ ần thể [12], [13] Do vậy, trong giám định ADN các nhà khoa h c hình sọ ự ngoài lựa ch n, nghiên cứu những ọlocus có tính đa alen cao thì cần khảo sát t n su t phân bố các alen trong quần thể ầ ấcủa từng locus để ử ụ s d ng trong tính toán và kết luận giám định Quần thể được nghiên cứu kh o sát phả ải đ t được các yêu cầu trong th ng kê, di truyạ ố ền như: các mẫu dùng trong nghiên c u phứ ải đảm b otính ngẫu nhiên, không có quan hệ huyết ảthống trong 3 đời [14], [15]

Để có đượ ầc t n su t c a mỗấ ủ i alen, trư c h t ph i tìm đượớ ế ả c s l n xu t hi n ố ầ ấ ệcủa mỗi alen trong quần thể nghiên cứu sau đó tính tần su t lý thuy t c a alen đó ấ ế ủtheo định luật di truy n quầề n th [16ể ] Khi có đượ ầc t n su t th c t và t n su t lý ấ ự ế ầ ấthuyết của mỗi alen, chúng ta tiến hành kiểm định xem tần suất alen có được ch p ấ

Trang 17

6

nhận với mức xác su t đã ch n Giám định gen (ADN) đòi hỏi cơ sởấ ọ khoa h c ọ

vững chắc đ tính toán xác suất mể ột người ngẫu nhiên trong quần thể là ngư i có ờcấu trúc di truyền đặc trưng trùng lặp với ADN trong các mẫu vật, d u vết thu thập ấtrong quá trình điều tra

Nếu không có tần suất alen thì không tính toán đượ ầc t n su t xu t hi n c a ấ ấ ệ ủmột kiểu gen nào đó trong một qu n th nhất định, đó cũng là cơ sởầ ể khoa h c để so ọsánh độ tin cậy trong trường h p phân tích đượợ c nhi u locus gen hoặc ít locus gen ềhơn [16], [17]

1.2 Tng quan về STR, Alen, locus gen

1.2.1 STR ( Short tandem repeat) là gì

STR là đoạn trình tự đa hình nằm trong vùng không mã hóa, có u trúc gcấ ồm các đoạn l p l i c a mộặ ạ ủ t trình t nucleotit có đ dài kho ng 2 – 6 bp, chiếm ự ộ ảkhoảng 3% hệ gen ngư i Do nằm ngoài vùng mã hóa, các STR rất đa dạờ ng gi a ữngười với người v ề độ dài có th lên đ n hàng nghìn base, trình tể ế ự đoạn lặp mà không ảnh hưởng đ n ho t đ ng sinh hế ạ ộ ọc c a tủ ế bào Các đoạn l p l i này nặ ạ ằm rải rác ở kh p nơi trong hắ ệ gen c a ngư i T nhữủ ờ ừ ng năm 1990 đ n nay đã có hàng ếchục nghìn STR trên các nhiễm sắc thể (NST) được phát hi n [18], [19] ệ

Các cấu trúc STR đều mang tính bảo thủ cao, được di truy n qua các th h ề ế ệ

và mang tính đặc trưng cho cá th Các gen này thưể ờng có tính đa hình cao, ít đột biến, tương đối b n vữề ng và cho phép đồng th i th c hi n ờ ự ệ được ph n ng nhân ả ứgen của nhi u gen khác nhauề [1], [2], [3], [4] Dựa trên tính đa hình của các cấu trúc STR về chi u dài: M t sề ộ ố ố g c nucleotid được l p đi l p l i nhi u l n trên ặ ặ ạ ề ầchiều dài của đoạn ADN

Ví dụ: tại locus TH01 của một cá th , các alen phân biệt nhau bằng s ể ốđoạn lặp AATG

Alen thứ nhất: AATG AATG AATG AATG AATG AATG -> có 6 đoạn

lặp AATG

Alen thứ hai: AATG AATG AATG AATG AATG AATG AATG

AATG AATG -> c 9 đoạn lặp AATG ó

Locus TH01 này là dị ợ h p tử ớ v i các alen là: 6 - 9

Trang 18

7

Hì nh 1.1 Locus TH01 của 01 cá th ể

Ngoại trừ trường h p song sinh cùng trứợ ng, s lượố ng l p l i c a các STR là ặ ạ ủ

độc nh t cho từng cá thể, đượấ c di truy n từ b mề ố ẹ sang con cái và phân biệt các cá thể không có quan hệ huyết thống trực hệ Vì vậy các cá thể khác nhau sẽ có s ốlượng l p l i c a cáặ ạ ủ c STR kh c nhau Bộá ch th gồm nhiều các STR n m trên các ỉ ị ằnhiễm sắc thể khác nhau cho phép phân biệt các cá thể riêng bi t, ngay cệ ả ớ v i những cá thể có quan h h hàng gần gũi Đốệ ọ i v i nghiên cứu di truy n quớ ề ần thể,

cơ sở di truy n c a nghiên cứu dựa trên hai đề ủ ịnh luật căn bản c a di truy n h c ủ ề ọMendel đó là định luật di truyền phân ly độc lập và định luật di truy n phân ly Do ề

đó, các chỉ ố ề s v di truy n liên k t cân bằng và cân bằng Hardy-Weinberg được ề ếkiểm đ nh đồng thời các phép tính thống kê đượị c s d ng nhằm tăng tính chính ử ụxác, giảm sai số trong phân tích [18], [19]

Trong giám định Pháp y, xác định danh tính có thể được hi u là s so sánh ể ự

h ồ sơ ADN của một ngư i nào đó, lấy từ các mẫờ u d u v t sinh h c vương lại như ấ ế ọ

vết m u, đầ ọc thuốc l , b n chải đánh răng, lông, tóc, hoặc từá u l á à các d u v t c a ấ ế ủ

một vụ án hiếp dâm như: dịch âm đạo, bao cao su, d ch trên qu n lị ầ ót, băng vệ sinh với một ngư i khác có mối liên quan, hoặc nghi can giờ ả đị nh nhằm xác định danh tính hoặc lo i trạ ừ khả năng

Từ nghiên c u cứ ủa Gill và CS (1996), Carracedo và Lareu (1998) [4] Tiêu chuẩn của các locus STR s dử ụng trong nhận dạng cá thể ồm: g

 Có tính b n về ững cao (tần suất đột bi n th p) ế ấ

 Locus STR phải có tính đa hình, khả năng phân biệt cao (thư ng l n hơn ờ ớ0,9) và các dạng dị ợ h p tử quan sát đượ ớc l n hơn 70% Điều này giúp các nhà phân

Trang 19

 Chiều dài đo n (locus) ADN đượạ c nhân b i trong khoảng 90 – 500bp, ộ

với kích thư c đo n ADN ngắn phù hợp cho việc phân tích nhớ ạ ững mẫu d u vấ ết bị suy thoái thườn gg ặp trong lĩnh vực hình sự

Hì nh 1.2 Các locus trên một nhiễm sắc thể Năm 1997, Cục đi u tra Liên bang của Mỹ (FBI) công bố lựa chọn 13 locus ềSTR để ạ t o thành cơ sở ữ d li u quốc gia Hoa Kỳ, gồm: D5S818, D7S820, ệD8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, FGA, TH01, TPOX, vWA [38] Vào đầu năm 2015, FBI thông báo dự n nghiên c u b sung thêm 7 locus v o h á ứ ổ à ệ Codis, có hiệu lực từ ngày 1 tháng 1 năm 2017 gồm: D1S1656, D2S441, D2S1338, D10S1248, D12S391, D19S433, D22S1045 Đây đều là các locus trong

h ệ Global filer

Trang 20

9

Hì nh 1.3 V í c a 13 Locus trong ị tr ủ CoDis trên NST

1.3 Tình h nh nghiên cì ứu trong và ngoài nước

1.3.1 Tình h nh nghiên cì ứu trong nước

Giám định ADN trong Pháp y ở Vi t Nam bắt đầệ u phát tri n mạể nh m t ẽ ừnhững năm 2000 Đầu tiên được tri n khai tại Viện Khoa học hình s B Cể ự ộ ông n ABan đầu ch là cáỉ c bộ kit 10 locus, 13 locus, và gần đây là 16 locus, 24 locus

ó

Sau đ công tác gi m định ADN đượá c nhi u cơ quan, viện nghiên cứu, ềcông ty thương mại tham gia như: Viện Pháp y Quân đội - B Qu c òộ ố ph ng, Viện công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam, Công ty Gentis, công ty CGAT

Năm 2000, đề tài c p Bộ nghiên cứu khảo sát và xây dựng tần suất của ấcác gen trong hệ Nineplex (10 locusgen, trong đó có 1 locus gen xác định giới tính) được tri n khai vào năm 2002 đã được nghiệm thu đưa vào ể s dử ụng làm

cơ sở tính toán kết quảgiám nh ADN [11] tại Viện Khoa Hđị ọc ình Sự H

Năm 2006, Viện Pháp y Quân Đội được trang bị và tri n khai sử dụng kit ểphân tích ADN h powerplex 16 (gệ ồm 15 locus gen và 1 locus gen xác định giới tính) để tăng hiệu qu phân tích gen (ADN) phục vụ cho công tác điều tra, phá án, ảtìm kiếm nạn nhân trong các vụ việc cũng như trong các vụ giám đ nh ngoài tố ị

tụng

Trang 21

10

Đến năm 2011, mộ ềt đ tài c p b do Viện Khoa học hình sự chủ trì đã hoàn ấ ộthành việc kh o sát t n su t alen các locus gen hệ Identifiler trong ả ầ ấ quần thể ngư i ờViệt (Kinh) với 170 cá thể

Từ 2014 đ n 2018 có nhi u đ tài v kh o sát t n su t như: Xây dựế ề ề ề ả ầ ấ ng cơ s ở

d ữ liệu về tần số allele 22 locus đa hình STR trên nhiễm s c th thườắ ể ng qu n th ở ầ ểngười Mông tại Hà Giang, Vi t Nam cệ ủa tác giả Trần Huyền Linh (2018); đề tài: Khảo sát tần suất các alen trong các locus gen(ADN) hệ Identifiler của dân tộc H’Mông phục vụ cho công tác giám định gen ở Vi t Nam của táệ c giả Nguyễn Như Giang (2014)

Đến năm 2016 Viện Pháp y Quân đội đưa vào sử ụng bộ Kit obalfiler d Gl 24 locus gen Ở Vi t Nam, cho đến nay chưa có một nghiên ệ cứu hoàn ch nh nào ỉđược công bố v ề khảo sát sự phân bố ần suất các alen ủa các locus gen hệ t cGlobalfiler trong qu n thầ ể người Kinh được công bố

1.3.2 Tình h nh nghiên cứu trên thế giới ì

Trên thế ớ gi i, công nghệ ági m đ nh ADN phát triển mạnh mẽị , nh t là t i M , ấ ạ ỹnơi có khoa học công nghệ phát triển nhất toàn c u [26] ầ Các nhà khoa học, c c áphòng gi m định gen, c c trung tâm nghiên cá á ứu đ u đề ã nghiên cứu, khảo sát và công bố ế k t quả ủ c a mình về ự s phân bố ầ t n suất các alen c a các gen hình sủ ự Ví

d ụ như t p đoàn Applied Biosystem (Mậ ỹ) kh o sát 15 gen củả a ngư i Mỹ - Phi, ờngười Mỹ - Tây Ban Nha Kết quả khảo sát 15 gen của ngư i Hán - ờ Trung Quốc, Malaisya, Hàn quốc, Th i Laná đã được công bố Đây là những s li u r t có giá ố ệ ấtrị không chỉ đố i với lĩnh v c giám định gen của các nước đó mà còn có giá trị ềự v mặt khoa học đ i với các giám định viên và các nhà khoa học nghiên c u vố ứ ề gen

s dử ụng trong giám định ADN trên th giới [22] [23]ế , , [24]

Trong giám định ADN, bên c nh viạ ệc sử ụ d ng rộng rãi bộ kít c a hãng ủApplied Biosystem, bộ kít c a hãng Promega cũng đượủ c nhi u nơi sử dụng [25] ề

Ví dụ ạ t i M , mỗi bang có từ 1 đếỹ n nhi u phòng thí nghiề ệm giám định ADN và có thể dùng kit hệ Identifiler hoặc kit PowerPlex Để th ng nhất trên toàn nước Mỹ, ốcảnh sát liên bang Mỹ (FBI) hiện dùng cơ sở ữ ệ d li u tần su t c a 13 locus gen ấ ủ(trùng nhau trong hệ Identifiler và hệ PowerPlex) trong ph n mầ ềm CODIS (Combined DNA index system) - một phần mềm n i ti ng đ truy xuất, tìm kiếm, ổ ế ể

Trang 22

11

so sánh dữ liệu trong giám định ADN [27] Phần mềm này đang được tri n khai ể ở

49 qu c gia và vùng lãnh thố ổ trên th giới ế

Trong những năm gần đây, có nhi u công trình nghiên cứu công bố ầề t n suất alen trong hệ Globalfiler trên thế giới như:

Dữ liệu di truy n quề ần thể ủ c a 21 markers STR ở các tỉnh biên giới phía Nam của Th i Laná , năm 2017 của nhóm tác giả N Boonderm, D Suriyanratakonrn, S Sangpueng

Dữ ệ li u di truy n quề ần thể ủ c a 21 locus STR trên nhiễm sắc thể thường h ệGlobalfiler của quần thể người Bahrain, năm 2019

Dữ liệu dân số và cấu tr c ph t sinh lo i của quần thể người H n, tỉnh ú á à áGiang Tô, Trung Quốc trên hệ GlobalFiler, năm 2018

Dữ liệu di truy n quề ần thể ủ c a 21 locus STR ở quần thể ngư i Akan của ờGhana, tháng 8 năm 2020 [28], [29], [30]

Đây là những s li u r t có giá trị trong công tố ệ ấ ác gi m địá nh ADN trong nước và trên th giới ế

Nội dung nghiên cứu củ a đ tài g m các bước: ề ồ

- Thu 200 mẫu tế bào c a 200 cá th ngư i Kinh Các mẫu đượủ ể ờ c l y t ấ ừnhững ngư i ngẫu nhiên trong quần thể không có quan hờ ệ ọ h hàng huyết thống (trong vòng 3 đời)

- Phân tích mẫu bao gồm các bước:

 Tách chiết ADN

 Định lượng ADN

 Nhân bội ADN

 Điện di trên máy điện di mao quản

 Phân tích kiểu gen của 200 mẫu nghiên cứu

- Xử lý s li u th ng kê, t nh to n tố ệ ố í á ần suất alen và các chỉ ố phá s p y So

sánh kết quả thu được v i các nghiên cớ ứu khác trong khu vực và trên thế giới

Trang 23

12

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁ P NGHIÊN CỨU

2.1 Vt liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Thu 200 mẫ ếu t bào từ nhiều ngu n kh c nhau ồ á như: máu, t c, mô, niêm ó

mạc miệng, m ng tay của 200 cá thể người Kinh Trong đó có 96 mẫu niêm mạc ómiệng, 55 mẫu tóc c chân, 36 mẫu máó u lấy bằng thẻ FTA, 13 mẫu móng tay

- Mẫu được thu và lưu trữ tại Khoa Xét nghiệm - Việ Ph p y Quân đội n á

2.1.2 Hóa chất, thiết bị ử ụ s d ng trong nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất, thi t b ế ị ử ụ s d ng trong tách chiết ADN.

 Dung dịch Chelex 100, tỷ ệ l 5% (Bio rad - M ) ỹ

 Dung dịch PBS (Phosphate - Buffered Saline) (Bio rad - M ) ỹ

 Thẻ FTA thu mẫu (Mỹ)

 SDS (Sodium dodecyl sulfate) (Bio rad - M ) ỹ

 DDT (Dithiothreitol 1M -Mỹ) Bio rad - Mỹ) (

 Proteinase k (Thermo Scientific - Mỹ)

 Nước c t kh ion và khử trùấ ử ng (free DNA) (Thermo Scientific - Mỹ)

 Cồn 70o (Việt Nam)

 Block nhi t khô cho ệ ống 1,5ml (100oC) kèm nhiệt kế (Thermo Scientific

- Mỹ)

 Máy li tâm Sigma ống 1,5ml 13.000v/p (Sigma - Đức)

 Tủ an toàn sinh học (Bio rad - Mỹ)

 Ống tách chiết 1,5ml (Thermo Scientific - Mỹ)

 Các đầu típ 10 μl, 200 μl và 1000 μl cùng pipet tương ứng (Thermo Scientific - Mỹ)

 Găng tay cao su

2.1.2.2 Hóa chất, thi t b ế ị ử ụ s d ng trong đ nh lư ị ợng ADN

 Quantifiler™ Trio DNA Quantification Kit (Thermo Scientific - Mỹ)

 Optical plate 96 well (Thermo Scientific - Mỹ)

 Optical seal (Thermo Scientific - Mỹ)

 Máy Realtime PCR 7500 (Applied biosystems)

Trang 24

13

 Các loại đ u típ 10 μl, 200 μl và 1000 μl cùng pipet tương ứng (Thermo ầScientific - Mỹ)

 Tủ an to n sinh học (Bio rad - Mỹ) à

2.1.2.3 Hóa chất, thi t b ế ị ử ụ s d ng trong nhân gen và giải trình t ự

 Máy giải trình t Applied biosystems 3500(Applied Biosystems-ự

ThermoFisher, Mỹ)

 Máy PCR 9700 96 well (Applied biosystems)

 Máy PCR Veriti 96 well (hãng Applied biosystems)

 Kit GlobalFiler™ PCR Amplification của hãng Applied

biosystems

 POP 4 (ABI)

 Liz 600 Gene scan (Applied Biosystems ThermoFisher, M- ỹ)

 HIDI formamide Applied Biosystems ThermoFisher, M ( - ỹ)

 Buffer 10X for AB - 3500 Applied Biosystems ThermoFisher, M ( - ỹ)

 Capilary 3500(36cm x 50μl) (Applied Biosystems-ThermoFisher, Mỹ)

 Optical plate 96 well (Applied Biosystems ThermoFisher, M- ỹ)

 Septa (Applied Biosystems ThermoFisher, M- ỹ)

 Ống PCR (0,25 ml) và điện di (0,5 ml) (Applied

Biosystems-ThermoFisher, Mỹ)

 Các loại đầu típ 10 μl, 200 μl và 1000 μl cùng pipet tương ứng (Applied Biosystems-ThermoFisher, Mỹ)

 Buồng thao tác PCR (Bio rad - M ) ỹ

2.1.2.4 Phần mềm s d ng ử ụ

 GenMapper ID_X software

 HID real time PCR analysis software

Trang 25

14

2.1.3 Đc điểm của bộ kit GlobalFiler™ PCR Amplification Kit

Hình 2.1 ộ Kit GlobalFiler™ PCR Amplification Kit B Đây là bộ kit đầu tiên có 6 dye màu, cho phép khuếch đại và phân tích cùng lúc 24 locus Có thể nói đây là b ộ Kit t t nh t hiố ấ ện nay phù hợp v i nhu cớ ầu giám định Ph p y do cá ó thời gian khuếch đ i ngắn, khả năng phân biệạ t vư t tr i, giúp ợ ộcho các ph ng th nghiệm ADN pháp y trên thế ớò í gi i tối đa hóa việc khôi phục và hoàn thiện thông tin của c c má ẫu nghèo dấu vết

Đặc đi m c a b kit Globalfiler 24 locus: ể ủ ộ

 H ệ thống đ m vệ à hóa chất đư c tối ưu hóợ a, h m lượà ng ADN đ u v o ầ àđược mở ộ r ng, đem lại đ nhạy tối đa cho các mẫộ u d u v t, hi n trư ng nghèo ấ ế ệ ờADN

 Cân bằng màu đượ ốc t i ưu hóa, gi p dễú dàng phân biệt và phân tích c c ámẫu nhiễm, hỗn hợp

 B ộ kit c chứa 10 mini STR, ó giúp cho vi c phân tệ ích c c mẫá u d u v t ấ ếnghèo ADN đem lại hiệu quả cao hơn

 Đây là b ộ kit duy nhất chứa tấ ảt c các maker c a hủ ệ codis và các maker

s dử ụng trên toàn cầu

 B Kíộ t gồm 1 ng Mastermix, 1 ng primer, 1 ố ố ống đ i chứng dương, 1 ốống Liz600, 1 ng thang alen chuố ẩn Allelic ladder

Trang 26

15

Hình 2.2 Locus củ a GlobalFiler™ PCR Amplification Kit

 Đặc đi m c a các locus gen STR trong bộ kit này: ể ủ

- Locus gen D8S1179 n m trên nhiằ ễm sắc thể ố s 8, dài 108 176 c- ặp bazơ, có 15 alen: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19

- Locus gen D21S11 n m trên nhiằ ễm sắc thể ố s 21, dài 180 247 c- ặp bazơ, có 24 alen: 24, 24.2, 25, 26, 27, 28, 28.2, 29, 29.2, 30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2, 33, 32.2, 33, 33.2, 34, 34.2, 35, 35.2, 36, 37, 38

- Locus gen D7S820 n m trên nhánh dài nhiằ ễm sắc thể ố s 7, dài 257 -305cặp bazơ, có 10 alen: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15

- Locus CSF1PO nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể ố s 5, dài 277 - 325 cặp bazơ, có 10 alen: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15

- Locus gen D3S1358 n m trên nhánh ngằ ắn nhi m s c th s 3, dài 91- ễ ắ ể ố

147 cặp bazơ, có 12 alen: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20

- Locus TH01 nằm ở intron 1 c a gen tyrosine hydroxylaseủ người, trên nhánh ngắn nhi m s c th s 11, dài 174 220 cễ ắ ể ố - ặp bazơ, có 10 alen: 4, 5,

6, 7, 8, 9, 9.3, 10, 11, 13.3

Trang 27

- Locus gen D22S1045: d i 83 127 cà - ặp bazơ, có 12 alen: 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19

- Locus gen SE33: d i 306 444 cà - ặp bazơ, có 34 alen: 4.2, 6.3, 8, 9, 11,

12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20.2, 21, 21.2, 22.2, 23.2, 24.2, 25.2, 26.2, 27.2, 28.2, 29.2, 30.2, 31.2, 32.2, 33.2, 34.2, 35, 35.2, 36, 37

- Locus gen D10S1248: d i 80 132 cà - ặp bazơ, có 12 alen: 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19

Trang 28

Các alen trong thang alen

chuẩn Allelic ladder

17, 18, 19, 20

FAMTM

Trang 29

18

13.2, 14, 14.2, 15, 16, 17, 18,

19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

27 DYS391 Yq11.21 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 11 D2S441 2p14 8, 9, 10, 11, 11.3, 12, 13,

17, 15.2

Trang 30

19

35, 35.2, 36, 37 D10S1248 10q26.3 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,

Trang 31

20

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Mẫu được nghiên c u vứ à phân tích theo sơ đồ tổng quát sau:

2.2.1 Phương phá p thu mẫu:

- Thu mẫu tế bào trực tiếp của những ngư i ngẫu nhiên, thuộc dân tộc ờKinh, không có quan hệ huyết thống trong vòng 3 đời:

 Đối v i m u máu, mẫu đượớ ẫ c thu b ng th FTA chuyên dụng kích thước ằ ẻ2×2 mm

 Đối v i tóc, mẫớ u thu t 2 đến 10 sợi tóc có chân và bảo quản trong ừphong bì riêng biệt, đư c đánh sốợ ký t ựlưu mẫu

 Đối v i m u niêm mạớ ẫ c, m u đượẫ c thu b ng tăm bông y tếằ chuyên d n ụ g

 Đối v i m u móng tay: dớ ẫ ùng k m cắì t phần móng tay sát nhất với ngón tay

Thu mẫu: Má u, t c c chân, ó ó niêm mạc miệng, móng tay

Tách chiết ADN bằng chelex 5%

Định lượng ADN bằng máy Real time PCR

7500

Nhân bội (PCR) ADN bằng GlobalFiler™

PCR Amp lification

Giải trình tự ADN trên máy 3500

Phân tích kết quả trên phần mềm Genmapper

- IDX

Trang 32

21

Mẫu thu đ m bảo chấả t lư ng, không bợ ị ẫ l n, nhiễm, phơi khô tự nhiên, đóng gói riêng rẽ M u sau khi dùẫ ng, được lưu và bảo quản trong tủ lưu m u ẫ ởnhiệt độ -20oC

2.2.2 Phương phá p phân t ch mẫu.í

2.2.2.1 Tách chiết ADN b ng Chelex ằ

Hiện nay tại hầu hết c c ph ng th nghiệm, giám định ADN đ u sử ềdụng Chelex cho việc t ch chiá ết mẫu tế bào tươi

Chelex là một lo i nh a t o ph c có ái l c cao đố ớạ ự ạ ứ ự i v i các ion kim loại

đa hoá trị Nó là h p chợ ất trùng ngưng styrene divinylbenzene có chứa các c p ion ặimminodiaxetat hoạt đ ng là nhóm t o phộ ạ ức Sự có mặt c a chelex nhi t đ ủ ở ệ ộ

100oC sẽ ngăn cản sự biến tính của ADN vì nó gắn được v i các ion kim loại đa ớhoá trị như magnesium (Mg2+) Nhờ vi c lo i bệ ạ ỏ Mg2+ ra khỏi phản ứng thì các enzym phân huỷ ADN (nuclease) sẽ ị ấ b b t ho t và do vậy mà các phân tử ADN ạđược b o v [31].ả ệ

Tách chiết ADN bằng chelex là phương pháp vô cơ, có ưu điểm thao tác đơn giản, ít b nhi m và t n ít th i gian Có thểị ễ ố ờ tách chi t ADN bằng phương ếpháp Chelex các loại mẫu sinh học sau đây: chân tóc, niêm mạc mi ng, máu toàn ệphần, vết máu, móng tay, mô, tủy xương từ các mẫu xương tươi

200 mẫ ếu t bào c a 200 cá th ngư i Kinh đượủ ể ờ c tách chi t b ng Chelex ế ằtheo quy trình dưới đây:

a) Tách chiết ADN bằng Chelex từ chân tóc

1 Ghi nhãn các ống nghiệm 1.5 ml

2 Hút 1ml PBS vào ống nghiệm 1.5 ml

3 Sử ụ d ng kéo s ch cho mỗi mẫạ u, c t vào ng nghi m kho ng 2mm tóc ắ ố ệ ả

có chân c a 2ủ -3 sợi tóc

4 Vortex với tốc đ cao, ủ ởộ nhi t độ phòng ít nh t 30 phút.ệ ấ

5 Ly tâm ống nghi m 13.000 vòng trong 1 phút.ệ

Trang 33

6 Loạ ỏ ịi b d ch n i ổ

7 Thêm vào ống nghiệm 200µl Chelex 5%

8 Ủ ở 560C trong vòng ít nhất 30 phút

9 Đun sôi cách thủy mẫu trong 8 phút

10 Ly tâm ống nghiệm 13.000 vòng trong 3 phút, thu ADN

11 Bảo quản mẫ ở ủu t -20oC

c) Tách chiế t ADN b ng Chelex từ máu toàn ph n, huy t thanh và máu ằ ầ ế

khô (trên gạc hoặc giấy FTA)

2 Hút 1ml PBS vào ống nghiệm 1.5 ml

3 Thêm vào ống từ 2 - 3 µl máu toàn ph n, 5 10 µl huyầ - ết thanh, 3mm2

gạc ho c gi y FTA ch a máu khô ặ ấ ứ

6 Loạ ỏ ịi b d ch n i (r a l i b ng nướổ ử ạ ằ c kh ion 3 lần) ử

7 Thêm vào ống nghiệm 200µl Chelex 5%, 10 µl protein K

8 Ủ ở 560C trong vòng ít nhất 30 phút

10 Ly tâm ống nghi m 13.000 vòng trong 3 phút, thu ADNệ

d) Tách chiết ADN bằng Chelex từ mẫu móng tay, móng chân

Trang 34

23

2 Hút 1ml cồn tuyệt đối vào ống nghiệm 1.5 ml

3 Thêm vào ng 2mmố 2 móng tay (móng chân), ủ ở nhiệ ột đ phòng từ 3-6 giờ

4 Rửa siêu âm ống nghi m trong vòng 5 phút.ệ

12 Ly tâm ống nghi m 13.000 vòng trong 3 phút, thu ADNệ

2.2.2.2 Định lượng ADN sau khi tách chi ết, sử dụng bộ kit

Quantifiler™ Trio DNA Quantification Kit trên máy Realtime PCR

7500

Định lượng ADN trên máy Realtime PCR là công nghệ ử ụ s d ng kỹ thu t ậPCR có gắn mồi hu nh quang, mụỳ c đích đ phát hi n chính xác s lượng ADN ể ệ ốngười có trong mẫu c n phân tích ầ

200 mẫu ADN c a 200 cá th ngư i Kinh sau khi tách chiết, đư c đưa vủ ể ờ ợ ào máy Realtime 7500 đ đo nể ồng đ theo quy tr nh sau:ộ ì

Bướ c 1: Chu n b Standard (ADN chuẩ ẩ ị n có n ng đ bi t trước) ồ ộ ế

1 Chuẩn b 5 ng nghiệm 1,5 ml, đánh số ầị ố l n lượt Std1, Std2, Std3, Std4, Std5

2 Vortex 1 phút Quantifiler® THP DNA Dilution buffer và Quantifiler® THP DNA Standard, sau đó ly tâm nhẹ cho dung d ch không bám ị ở thành ống

3 Thêm 10 µl Dilution buffer vào ng nghi m Std1, 90 µl Dilution buffer ố ệvào các ống nghi m Std2, Std3, Std4, Std5.ệ

Trang 35

Bướ c 2: Chu n b phả ứ ẩ ị n ng Realtime PCR

1 Tính th tích cể ủa mỗi thành ph n c n chuầ ầ ẩn b cho phị ản ứng, dựa vào bảng sau:

4 Vortex hỗn h p trong ng nghiợ ố ệm từ 3 - 5 giây, sau đó ly tâm nhẹ

5 Chuẩn b plate 96 giếng, chia 18 µl PCR mix vào mỗị i gi ng ế trên plate

6 Thêm 2 µl ADN mẫu, standard, mẫu âm, m u dương vào từng giếng ẫ

7 Dán plate với Optical Adhesive Cover, sau đó ly tâm plate 300 vòng trong 20 giây

Trang 36

25

Mỗi phản ứng Realtime PCR sẽ kèm theo mẫu đ i ch ng âm và m u đ i ố ứ ẫ ốchứng dương (nhà sản xuất cung cấp), để xác định tính ch nh x c c a ph n ứng í á ủ ả Bước 3: Chạy plate đã chuẩn b trên Real time PCR 7500 ị

1 Khở ội đ ng máy tính và máy Realtime PCR 7500

2 Tạo plate trên máy

3 Cho plate vào khay

4 Chọn protocol phù h p vợ ới chu trình nhiệt:

Bảng 2.3 Chu tr nh nhi t c a phả ứì ệ ủ n ng PCR trên máy Realtime 7500

Nhiệt độ Thời gian Số chu k ỳ

6 Sau khi máy ch y xong xem kạ ết quả tính toán nồng đ ADN ộ

2.2.2.3 Nhân bội ADN (PCR - Polemerase Chain Reaction)

 Khái qu t về phản ứng PCRá

Nhân bội ADN (PCR) nghĩa là làm tăng lượng ADN lên hàng triệu bản sao

từ ộm t lư ng rấợ t ít ban đ u [21] Lượng ADN sau nhân bộầ i đ l n đ có th phát ủ ớ ể ểhiện được b ng các phương ph p thông thưằ á ờng

K ỹ thuật PCR do Karry Mullis và các cộng sự phát minh vào năm 1985 đã tạo ra một cu c cách mạng trong sinh h c phân tộ ọ ử ở b i khả năng áp dụng của nó trong phân tích ADN Kỹ thuật này là một phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích các gen Các phòng thí nghiệm phân tích ADN và ngành khoa h c hình sọ ự đã có những thành tựu vượ ật b c nh vào k thu t này [20] ADN ờ ỹ ậthu được t hi n trư ng thường ít và chất lượng không tốt do v y nhi u mừ ệ ờ ậ ề ẫu s ẽkhông thể phân tích được

Kỹ thu t PCR s giúp khắc ph c h n chậ ẽ ụ ạ ế này vì nó có thể tạo ra hàng triệu phiên b n cả ủa một trình t ADN khuôn ban đầu trong vòng vài giờ nhờ hai đoạn ựmồi oligonucleotit tương hợp với hai đầu 3' ở ả c hai s i cợ ủa đoạn ADN đích (target

Trang 37

26

sequence) với s tham gia cự ủa ADN - polymerase,deoxynucleotide triphosphate (dNTPs), đệm PCR [22]… Ph n ứng PCR là một chuỗi nhi u chu kả ề ỳ ố n i tiếp nhau,

mỗi chu kỳ ồm 3 bước: g

Bước : Giai đoạ1 n bi n tính: Phân tử ế ADN được biến tính ở nhiệt độthường là 94ở oC - 95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút Khi đó các liên kết Hydro trong phân tử ị b b ẻ gãy và ADN sợi kép bị tách thành hai sợi đơn

Bước 2: Giai đoạn b t mồi: Nhiệắ t độ được h th p (th p hơn Tm của các ạ ấ ấmồi) cho phép các mồ ắ ặi b t c p v i khuôn, nhiệ ộớ t đ này dao động trong kho ng 40 ả

- 70 oC tuỳ thu c Tm của các mồ ử ụộ i s d ng kéo dài từ 30 giây đến 1phút

Bước 3: Giai đoạn kéo d i chu i (extension): Nhiệt độ được tăng lên có thể à ỗđến 72oC giúp cho ADN polymerase ho- ạt đ ng t ng hộ ổ ợp tốt nh t, th i gian tùy ấ ờthuộc vào đ dài c a trình tộ ủ ự ADN c n khuếầ ch đ i Thường kéo dài từ ạ 30 giây đến vài phút

Trước chu kỳ đầu tiên thư ng có mộờ t bư c kh i đ ng nóng ở 94ớ ở ộ oC trong vòng 4 – 5 phút để làm biến tính hoàn toàn ADN khuôn Một chu k bao gỳ ồm 3 bước trên s đượ ặẽ c l p đi l p l i nhi u l n, m i l n s làm tăng gấp đôi lượặ ạ ề ầ ỗ ầ ẽ ng m u ẫ

của lần trư c Đây là s khuếch đạớ ự i theo c p s nhân, theo tính toán sau 30 chu kỳ ấ ố

sự khuếch đạ ẽi s là 106so vớ lượi ng m u ban đầu [22] ẫ

 Nhân bội ADN (PCR) 200 mẫ u sau khi đ nh lư ng ị ợ

Sau khi đ nh lưị ợng 200 mẫu ADN, chúng tôi tiến hành phản ứng khuếch

đại ADN S dử ụng bộ kit GlobalFiler™ PCR Amplification Kit Đây là bộ kit

đặc hi u nhân cùng lúc 21 locus STR và 3 marker giới tính ệ

Ngoài c c mẫu nghiên c u, trong má ứ ỗi ph n ng PCR sẽả ứ có thêm m u đ i ẫ ốchứng âm, mẫu đ i chứng dương (do nhà sản xuất cung cấố p) đ xác th c tính ể ựchuẩn xác của phản ứng

1 Tính th tích cể ủa mỗi thành ph n cầ ần chu n b cho phẩ ị ản ứng, dựa vào bảng sau:

Trang 38

2 Thêm (7,5 * n) µl Master mix, (2.5 * n) µl Primer set vào ống nghiệm 1,5

ml, trong đó n là số ẫ m u ADN c n khuyếch đại ầ

3 Vortex hỗn h p trong ng nghiợ ố ệm từ 3 - 5 giây, sau đó ly tâm nhẹ

4 Chuẩn b plate 96 giếng, chia 10 µl PCR mix vào mỗị i gi ng trên plate ế

5 Thêm 15 µl ADN mẫu (sau khi đã pha với TE đ có n ng đ chu n cho ể ồ ộ ẩ

ph n ả ứng), m u âm, m u dương vào từẫ ẫ ng gi ng ế

6 Dán plate với Optical Adhesive Cover, sau đó ly tâm plate 300 vòng trong 20 giây

7 Cho plate vào máy PCR 9700, Phản ứng nhân gen (PCR) được ti n hành ếtrên máy nhân gen PCR 9700 của hãng AB

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt trên máy PCR 9700

Trang 39

28

alen chuẩn (ladder) được nhà s n xu t cung c p theo ả ấ ấ GlobalFiler™ PCR Amplification Kit (AB, Mỹ)

 Nguyên lý của điện di mao quản trên má y giải tr nh tựì

Điện di mao quản (hay điện di huỳnh quang) bắ ầt đ u được s d ng vào cuối ử ụnhững năm 1980 Vào giữa những năm 1990 người ta b t đ u s n xu t các máy ắ ầ ả ấđiện di mao quản K t đó k thu t điể ừ ỹ ậ ện di mao quản phát tri n nhanh chóng và ểngày càng phổ bi n.ế

Nguyên lý của điện di mao quản là dùng tia lase kích hoạt các đo n ADN ạkhuôn đã được gắn hu nh quang đ thu đưỳ ể ợc các ph quang học Điểm khác của ổđiện di mao quản là sử ụ d ng mao quản có ch a gel, tia lase chứ ỉ chiếu vào một đi m ể

c ố định trên mao qu n cho tả ừng mẫu một [32], [3 ] 3

Các ặp mồ c i đư c đánh dấu bằng các chất nhuộm huỳnh quang khác nhau ợ

vì vậy s n phả ẩm sau PCR có các locus gen được gắn các ch t nhu m hu nh quang ấ ộ ỳtương ứng Kỹ thu t hiện màu huỳnh quang cho xác đ nh đưậ ị ợc màu xanh da trời, xanh lá cây, vàng, đỏ, tím, cam tương ng v i các chứ ớ ất đánh dấu: 6 - FAM, VIC, NED,TAZ, SID và LIZ, dựa trên sự ấ h p th và phát x ánh sáng của các chất ụ ạnhuộm màu huỳnh quang này Các hạt huỳnh quang hấp thụ năng lượng t nguồn ừsáng laze sau đó phát xạ ánh sáng ở m c năng lượứ ng th p hơn (bước sóng cao ấhơn) Một màng l c sáng đượọ c s d ng đ l c ánh sáng ởử ụ ể ọ nh ng bước sóng xác ữ

định ho c mộặ t kho ng bước sóng nào đó [32] ả

Hiện nay đã có nhi u loại máy điện di mao quản đượề c s d ng t i các ử ụ ạphòng thí nghiệm sinh h c phân tọ ử cũng như các phòng giám định gen hình sự như: ABI Prism 310 Genetic Analyzer với một mao qu n, ABI Prism 3100Avant ảGenetic Analyzer với 4 mao qu n, ABI Prism 3700 GeneticAnalyzer vả ới 4 mao quản, ABI Prism 3130 Genetic Analyzer với 4 mao qu n, ABI Prism 3130XL ảGenetic Analyzer với 16 mao quản, ABI Prism 3500 Genetic Analyzerv i 16 mao ớ

quản …[ ] 32

Trang 40

29

Bảng 2.6 Các chấ t nhu m màu hu nh quang s d ng trong bộ ộ ỳ ử ụ Kit Globalfiler

6-FAMTM Xanh da trời Samples, allelic ladders,

Sau khi ch n buẩ ị mẫu, cho mẫu vào đi n di trên máy điện di mao quản AB ệ

3500 Kết quả thu được được x lý b ng ph n mử ằ ầ ềm Genemapper ID_X để xác

định ki u gen của mỗể i m u, t đó cho ta bảẫ ừ ng s li u tập hợp kiểu gen của 200 cá ố ệthể ngư i Kinh ờ

2.2.3 Phân tích xử lí s liệu và tí ố nh to n tần suất alen á

2.2.3.4 Phân tích tr nh tự ADN của từng mẫu nghiên cứu ì

Mẫu ADN sau khi giải trình tự (điện di mao quản), được phân tích b ng ằphần mềm GeneMapperTM ID-X trên hệ thống AB3500 Genetic Analyzer

Tiêu đề	Nghiên Cứu Tần Suất Alen 21 Locus Đa Hình STR Ở Quần Thể Người Kinh Việt Nam
Tác giả	Đỗ Thị Xao Mai
Người hướng dẫn	PGS. TS Trương Quốc Phong, TS. Nguyễn Văn Lợi
Trường học	Đại học Bách Khoa Hà Nội
Chuyên ngành	Công nghệ sinh học
Thể loại	luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2020
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	99
Dung lượng	3,44 MB