Nọc độc từ những loài rắn Bothrops asper, Crotalus simus và Stenophrys Lachesis được thu thập bằng cách vắt sữa những con trưởng thành bị bắt ở Costa Rica và duy trì trong điều kiện nuôi nhốt tại Serpentarium của Viện Clodomiro Picado. Hồ chứa nọc độc đã chuẩn bị cho mỗi loài, ổn định bằng cách làm khô lạnh, và được lưu trữ tại 20 0C cho đến khi sử dụng. Các giải pháp nọc độc đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng 0,14 M NaCl, 0,04 M phosphate, pH 7.2 (PBS) là dung môi và được sử dụng ngay lập tức sau khi chuẩn bị.
Trang 11. Giới thiệu
Đánh giá độ tinh khiết là tập hợp các thông số kỹ thuật được sử dụng để đảm bảo chất lượng thuốc Trong trường hợp của sinh học và sản phẩm công nghệ sinh học, ước tính độ tinh khiết thường được thực hiện bởi lượng hoạt chất, chiếm hơn 90% thành phần của sản phẩm.Thông
thường, trong chế phẩm miễn dịch globulin của con người độ tinh khiết được xác định bằng các phương pháp hóa lý, chẳng hạn như sắc ký và điện di Các xét nghiệm xác định tỷ lệ globulin miễn dịch / protein
không globulin miễn dịch, một giá trị là chức năng cho IVIGs con người bởi vì trong những công thức tất cả các kháng thể (IgG) tạo thành chất hoạt tính.Tuy nhiên, có chế phẩm miễn dịch khác trong mà chất hoạt tính tạo nên kháng thể đặc hiệu chống lại một kháng nguyên hoặc nhóm kháng nguyên đặc biệt, đây là trường hợp công thức kháng độc rắn Kháng độc (Antivenoms) rắn là chế phẩm điều trị globulin miễn dịch động vật, hoặc các đoạn globulin miễn dịch, công thức đặc biệt để vô hiệu hóa một hoặc một số con rắn có nọc độc trong tai nạn bị rắn cắn
2. Vật liệu và phương pháp
2.1 Nọc độc rắn
Nọc độc từ những loài rắn Bothrops asper, Crotalus simus và
Stenophrys Lachesis được thu thập bằng cách vắt sữa những con trưởng
thành bị bắt ở Costa Rica và duy trì trong điều kiện nuôi nhốt tại
Serpentarium của Viện Clodomiro Picado Hồ chứa nọc độc đã chuẩn bị cho mỗi loài, ổn định bằng cách làm khô lạnh, và được lưu trữ tại -20 0C cho đến khi sử dụng Các giải pháp nọc độc đã được chuẩn bị bằng cách
sử dụng 0,14 M NaCl, 0,04 M phosphate, pH 7.2 (PBS) là dung môi và được sử dụng ngay lập tức sau khi chuẩn bị
2.2.Kháng độc
Trang 2Plasma Hyperimmune được lấy từ những con ngựa được tiêm chủng với một hỗn hợp nọc độc từ ba loài rắn trên Từ các plasma, kháng độc rắn được tạo bởi F (ab ') 2 đoạn hoặc toàn bộ các phân tử IgG thu được qua
sử dụng axit caprylic phân đoạn Trong trường hợp của F (ab ') 2
antivenom, plasma đã được phân hủy pepsin với 1% (w / v) trong 40 phút ở 25 0C và ở pH 3.0, tiếp theo là kết tủa axit caprylic Trong trường hợp IgG antivenoms, acid caprylic đã được thêm vào trong huyết tương
mà không cần điều trị trước đó.Kháng độc rắn đã được chuẩn bị (0,85 g /
dL NaCl, 0,25 g / dL phenol, pH 7,2), tiệt trùng bằng cách lọc qua một màng 0.22 mmpore, và phân phối 10 ml trong lọ borosilicate
2.3 Phân tích FPLC
Antivenoms được phân tích bằng sắc ký lỏng nhanh protein (Fplc) trong một Superdex 200 10/300 cột loại trừ kích thước GL (Amersham
Biosciences, Thụy Điển), sử dụng 20 mM Tris-HCl, 150 mM
NaCl, pH 7,5, như giai đoạn di động với tốc độ dòng chảy 0,5 ml / phút 2.4 Phân tích điện di
Phân tích điện di được thực hiện bởi SDS-PAGE, dưới điều kiệnkhông giảm, sử dụng nồng độ acrylamide 7,5% Gel được nhuộm màu với Coomassie Brilliant Blue R-250.Phân tích mật độ
Electrophoregramoptical được thực hiện bằng cách sử dụng chương trình phần mềm Image-J
2.5 Xác định các protein bằng phép đo phổ khối
Các dải nhuộm Coomassie cho thấy cường độ cao nhất là được cắt ra từ gel, bị giảm với dithiothreitol và alkyl hóa với iodoacetamide, tiếp theo
là tiêu hóa trong gel với trình tự lớp bò trypsin trên một phân hủy tự động (ProGest, Digilab), theo hướng dẫn của nhà sản xuất Mỗi
Trang 3tryptic tiêu hóa sau đó được phân tích trong một MALDI-TOF-TOF Ứng dụng hệ thống sinh học 4800-Plus khối phổ kế Kết quả
phổ được phân tích bằng ProteinPilot v.2.0.1 (ABSciex) để xác định protein Tryptic tiêu hóa không xác định bởi MALDI-TOF-TOF là bị nano electrospray ion hóa (Nesi) -MS/MS phân tích trên một dụng cụ Q-Trap 3200 (Ứng dụng hệ thống sinh học) Kết quả CID phổ được giải thích với sự trợ giúp của v.1.5 BioAnalyst
(http://www.absciex.com)
(Sản phẩm / Phần mềm / Phần mềm-BioAnalyst) hướng dẫn sử dụng công cụ lập trình tự và trình tự thu được là trình BLAST
2.6 Tổng quyết protein
Tổng nồng độ protein được xác định bằng một kiểm tra sửa đổi của
Biuret.Trong đó 50 ml mẫu (hoặc tiêu chuẩn protein) được trộn với 2.5
ml thuốc thử Biuret và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Hấp thụ ở 540
nm được ghi lại và nồng độ protein đã được tính toán bằng cách sử dụng phương trình của đường cong thu được bằng cách vẽ độ hấp thụ tiêu chuẩn của nồng độ protein
2.7 ELISA xác định kháng thể antivenom
Nồng độ globulin miễn dịch antivenom rắn đã được xác định bằng cách
so sánh ELISA hiệu giá của toàn bộ antivenoms IgG với những tiêu chuẩn rắn antivenom globulin miễn dịch được chuẩn bị bởi thanh lọc kháng thể nọc độc đặc hiệu bằng sắc ký ái lực.Một thời gian ngắn, tấm lọc được phủ dung dịch nọc độc (0.03 mg / ml)
Trang 4Sau đó pha loãng khác nhau toàn bộ antivenom IgG rắn Phản ứng được phát triển bằng cách thêm IgG thỏ và peroxidase ngựa H2O2 và o-phenylenediamine
2.8 Khảo nghiệm gây chết trung hòa
Gây chết nọc độc trung hòa đã được đánh giá và ước tính bằng Probits Sau đó, tỷ lệ protein tiềm năng / antivenom đã được tính toán cho từng
công thức antivenom, sử dụng công thức: ED50/total protein
3. Kết quả và thảo luận
3.1 Đánh giá độ tinh khiết của IgG và F (ab ') 2 antivenoms
Để kiểm tra khả năng phương pháp hóa lý phân biệt giữa hoạt chất và tạp chất, chúng ta đánh giá độ tinh khiết của IgG và F (ab ') 2
antivenoms (cả hai công thức chế biến từ cùng một nguồn gen trong huyết tương) bằng cách lọc gel trên FPLC (Hình 1) và bằng điện (Hình 2) Theo các thông số, cả hai antivenoms có một độ tinh khiết tương tự (Bảng 1) Tuy nhiên, như thể hiện trong hình 1A và 2A, độ phân giải của lọc gel FPLC không cho phép phát hiện tạp chất có tiềm năng như IgA, IgE, và ceruloplasmin, mà trùng với đỉnh lớn tương ứng với
IgG và albumin Theo đó, SDS-PAGE phát hiện các mức thấp của
ceruloplasmin trong toàn bộ IgG antivenom (Hình 2) Do đó, gel
lọc FPLC rất hữu ích để phát hiện các phân tử có khối lượng lớn Trong khi SDS-PAGE cho phép phát hiện chất gây ô nhiễm proteinkhác nhau Mặt khác, không có những kỹ thuật có thể phân biệt giữa kháng thể và kháng thể antivenom đối với kháng nguyên không nọc độc
Tiếp theo, chúng ta kiểm tra độ tinh khiết của các chế phẩm này trên cơ
sở tỷ lệ tiềm năng để hàm lượng protein IgG và F (ab ') 2 antivenoms đã được xây dựng để có một tiềm năng trung hòa tương tự trong khảo
Trang 5nghiệm chuột Tuy nhiên, theo tỷ lệ hiệu lực / protein, F (ab ') 2
antivenom có độ tinh khiết cao hơn so với IgG antivenom (p <0,05) 1,5 lần Sự khác biệt này, mà không được phát hiện bằng cách sử dụng sắc
ký hoặc các phương pháp điện di, có thể được giải thích bởi thực tế rằng khối lượng phân tử của toàn bộ các phân tử IgG cao hơn 1,5 lần hơn so với F (ab ') 2 đoạn.Do đó, tổng số nồng độ của protein giảm so với
antivenom IgG
Một lời giải thích có thể cho kết quả này, có thể là pepsin ưu tiên tiêu hóa lớp kháng thể IgG, ảnh hưởng đến sự tiềm năng của F cuối cùng (ab') 2 antivenom
3.2 Đánh giá độ tinh khiết của antivenoms chuẩn bị từ huyết tương
với nội dung khác nhau của các kháng thể antivenom
Độ tinh khiết của hai công thức antivenom IgG với nhau nội dung của kháng thể antivenom được đánh giá sử dụng hóa lý và phương pháp hóa miễn dịch (Bảng 2) Các antivenoms đã được tinh chế bằng axit Caprylic phân đoạn từ hai nguồn gen huyết tương ngựa với nhau ELISA hiệu giá
kháng thể đối với nọc độc của B asper Đối với cả hai công thức, sắc ký
(Hình 1 B) và điện di (Hình 2B) ước tính độ tinh khiết globulin miễn dịch của hơn 90% (Bảng 2) Ngược lại,khi độ tinh khiết được ước tính tỷ
lệ kháng thể antivenom /protein và antivenom hiệu lực / protein, kết quả cho thấy ít hơn 40% tổng số protein trong việc xây dựng chuẩn bị từ trong huyết tương của con ngựa với antivenom cao độ chuẩn là hướng đến nọc độc thành phần (Bảng 2) Khi một phân tích tương tự được thực hiện với antivenom chuẩn bị từ huyết tương của con ngựa có một hiệu giá thấp,thấy rằng ít hơn 13% protein là hướng đến nọc độc thành phần (p <0,05 khi so sánh với độ chuẩn cao antivenom)
Trang 6Những quan sát này chỉ ra rằng việc lựa chọn plasma từ động vật có hiệu giá kháng thể cao là một thông số quan trọng cho việc tăng độ tinh khiết của công thức antivenom (Bảng 2)
3.3 Độ tinh khiết của antivenom polyspecific
Khi đánh giá bằng phương pháp sắc ký và điện di, độ tinh khiết
antivenom là như nhau bất kể các loại antivenom (monospecific hoặc polyspecific) Tuy nhiên, kể từ khi các nọc độc khác nhau được sử dụng như tác nhân gây miễn dịch được vô hiệu hóa đến một mức độ khác nhau bằng các kháng thể trong antivenoms polyspecific, độ tinh khiết của antivenom, ước tính trên cơ sở những tiềm năng /tỷ lệ protein, khác nhau tùy theo nọc độc mà đang được vô hiệu hóa trong các thử nghiệm hiệu lực (Bảng 3) Khái niệm này cũng áp dụng khi phân tích độ tinh khiết của antivenoms được thử nghiệm chống lại dị nọc độc, được trung hoà bởi các antivenom do miễn dịch phản ứng chéo
4. Nhận xét kết luận
Độ tinh khiết là một vấn đề quan trọng phải được xác định để đánh giá chất lượng của các sản phẩm sinh học Trong trường hợp antivenoms, đánh giá độ tinh khiết có thể được thực hiện bởi hai phương pháp tiếp cậnkhác nhau là phân tích hóa lý và hóa miễn dịch phân tích Phân tích sắc ký hoặc điện di hiện được sử dụng để xác định sự vắng mặt của globulin miễn dịch và protein chất gây ô nhiễm không globulin miễn dịch (ví dụ albumin, fibrinogen hoặc globulin không kháng thể), nên được bổ sung bằng việc đánh giá tỷ lệ hiệu lực / protein hoặc hiệu giá ELISA /tỷ lệ protein, sau này có lợi thế là giảm sử dụng chuột Đánh giá hóa miễn dịch như vậy, cùng với sắc ký hoặc phân tích điện di, tạo thành một nhiều hơn dự toán hoàn chỉnh có độ tinh khiết antivenom
Mặt khác, những nỗ lực để sản xuất công thức kháng độc rắn gia tăng độ tinh khiết phải được tập trung không chỉ về việc tiếp tục giảm lượng
Trang 7protein không IgG, mà còn gia tăng tỷ lệ antivenom để globulin miễn dịch antivenom không Một cách để đạt được điều này là sử dụng ái lực sắc ký, tức là bằng lựa chọn chủ yếu là kháng thể chống lại các thành phần nọc độc