Tối ưu hóa điều kiện nuôi trồng haematoous pluvialis, giàu astaxanthin làm thứ ăn sống ho á hồi

pluvialis được nuụi trong mụi trường RM ở thể tớch bỡnh nhựa 1,5lit Hỡnh 20 Sự thay đổi mật độ tế bào, trọng lượng khụ của tảo H.. pluvialis được nuụi trong mụi trường RM ở thể tớch bỡnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-***

HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS, GIÀU

ASTAXANTHIN LÀM THỨC ĂN SỐNG CHO CÁ HỒI

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - Năm 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-***

HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS, GIÀU

ASTAXANTHIN LÀM THỨC ĂN SỐNG CHO CÁ HỒI

Chuyên ng nh: Công ngh Sinh h à ệ ọc

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PGS TS Đặ ng Di m Hồng ễ

Viện CNSH & Thực phẩm i Luận văn thạc sỹ khoa học

Trớc tiên tôi xin chân thành cảm ơn PGS.Ts Đặng Diễm Hồng – Trởng phòng Công nghệ Tảo – Viện công nghệ sinh học Viện Khoa học Công nghệ Việt , Nam đã chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian tôi làm luận văn Tôi xin chân thành biết ơn sự giúp đỡ to lớn và quý báu đó

Xin chân thành cảm ơn toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện

và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và làm luận văn

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo cùng toàn thể các cán bộ trong Khoa Công nghệ sinh học và thực phẩm – Trờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền

đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên sâu sắc từ gia đình, bè bạn

đã ủng hộ, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn của mình

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2011

Học viên

Đinh Đức Hoàng

ViÖn CNSH & Thùc phÈm ii LuËn v¨n th¹c sü khoa häc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn khoa học của tôi Các

số liệu được sử dụng tham khảo có nguồn trích dẫn rõ ràng, các kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực

Đinh Đức Hoàng

ViÖn CNSH & Thùc phÈm iv LuËn v¨n th¹c sü khoa häc

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Nguồn cung cấp astaxanthin khác nhau

Bảng 2 Nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên

Bảng 3 Thành phần môi trường C và RM dùng trong nghiên cứu

Bảng 4 Kết quả đo OD trong phương pháp xây dựng đường chuẩn

protein

Bảng 5 Bảng tổng kết hình thái, kích thước và tỷ lệ astaxanthin/

chlorophyll a ở các giai đoạn trong vòng đời của H pluvialis nuôi

ở bình tam giác 1 lít

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Con đường sinh t ng h p astaxanthin t ổ ợ ừHaematococcus pluvialis

Hình 2 Cấu h nh của astaxanthinì

Hình 3 Ảnh minh họa Bioastin

Hình 4 Sự thay đổi hình thái tế bào trong vòng đời của tảo H.pluvialis

Hình 5 Hệ thống bioreactor dạng 2 lớp có sục khí và chiếu sáng

Hình 6 Hệ thống hồ nuôi H pluvialis 500 nghìn lít của tập đoàn Cyanotech (Mỹ)

Hình 7 Hệ thống bể nuôi ngoài trời của Ấn Độ

Hình 8 Hệ thống bioreactor sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời cho nuôi trồng

H pluvialis của Israel

Hình 9 Hệ thống bioreactor cho nuôi trồng H pluvialis của Mỹ

Hình 10 Hệ thống hồ nuôi hở dùng cho nuôi trồng H pluvialis của tập đoàn Cyanotech

(Mỹ)

Hình 11 Mẫu Haematococcus pluvialis phân lập ở Hòa Bình

Hình 12 Phương pháp tạo micropipette từ các pipette Pasteur

Hình 13 Thao tác sử dụng micropipette để phân lập 1 tế bào tảo duy nhất

Hình 14 Đường chuẩn protein được xác lập giữa hàm lượng protein (µg) theo giá trị

OD ở bước sóng 720nm

Hình 15 Hút một tế bào H pluvialis bằng bằng micropipette

Hình 16 Lưu giữ thành công vi tảo lục H pluvialis trên môi trường thạch và trong

môi trường lỏng C và RM

Hình 17 Hình ảnh chụp nuôi trồng tảo H pluvialis trong môi trường dinh dưỡng C

hoặc RM ở các bình nhựa 1,5 lit và 10 lit

Hình 18 Sự thay đổi mật độ tế bào và trọng lượng khô của tảo H.pluvialis được nuôi

ViÖn CNSH & Thùc phÈm vi LuËn v¨n th¹c sü khoa häc

trên môi trường RM ở thể tích bình nhựa 1,5 lit

Hình 19 Sự thay đổi hàm lượng sắc tố và protein ở tảo H pluvialis được nuôi trong

môi trường RM ở thể tích bình nhựa 1,5lit

Hình 20 Sự thay đổi mật độ tế bào, trọng lượng khô của tảo H pluvilis được nuôi

trong môi trường C ở thể tích bình nuôi 1,5 lit

Hình 21 Sự thay đổi hàm lượng sắc tố và protein ở tảo H pluvialis được nuôi trong

môi trường C ở thể tích bình nuôi 1,5lit

Hình 22 Sự thay đổi mật độ tế bào, trọng lượng khô của tảo H pluvialis được nuôi

trong môi trường RM ở thể tích bình nuôi 10 lit

Hình 23 Sự thay đổi hàm lượng sắc tố chlorophyll a, astaxanthin và protein ở tảo H

pluvialis được nuôi trong môi trường RM ở thể tích bình nuôi 10 lit

Hình 24 Sự thay đổi hình thái và kích thước tế bào trong vòng đời của vi tảo H

pluvialis được quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400

lần

Hình 25 Sự thay đổi mật độ tế bào của H pluvialis ở bình tam giác 1 lít trong môi

trường RM

Hình 26 Sự thay đổi của thành phần các sắc tố và protein của H pluvialis nuôi ở

bình tam giác 1 lít trong môi trường RM

Hình 27 Một số hình ảnh miêu tả sự thay đổi hình thái của tế bào ở các giai đoạn

khác nhau trong vòng đời của H pluvialis

Hình 28 Sự thay đổi mật độ tế bào của H.pluvialis nuôi ở bình nhựa 1,5 lít trong

môi trường RM

Hình 29 Sự thay đổi hàm lượng sắc tố (chla, astaxanthin) và protein của H pluvialis

nuôi ở bình tam giác 1,5 lít mL trong môi trường RM

Hình 30 Một số ảnh hình thái tế bào ở các giai đoạn trong vòng đời của H pluvialis

nuôi ở bình nhựa 1,5 lít trong môi trường RM

Hình 31 Sự thay đổi mật độ tế bào của tảo H pluvialis nuôi ở bình nhựa 10 lít trong

môi trường RM

Hình 32 Sự thay đổi hàm lượng sắc tố (chlorophyll a, astaxanthin) và protein của H

pluvialis được nuôi ở bình tam giác 10 lít mL trong môi trường RM

Hình 33 Một số hình ảnh tế bào trong vòng đời của tảo H pluvialis nuôi ở bình

nhựa 10 lít trong môi trường RM

Hình 34 Hình ảnh minh họa việc nuôi trồng thành công vi tảo lục H pluvialis ở các

cấp độ bình tam giác 1 lít, bình nhựa 1,5 lít và 10 lít

Hình 35 Sự thay đổi mật độ tế bào của H pluvialis trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha

với pha 2 là pha đói đạm

Hình 36 Sự thay đổi hàm lượng protein của H pluvialis trong thí nghiệm nuôi cấy 2

pha với pha 2 là pha đói đạm

Hình 37 Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll a của H pluvialis trong thí nghiệm nuôi

cấy 2 pha với pha 2 là pha đói đạm

Hình 38 Sự thay đổi hàm lượng astaxanthin của H pluvialis trong thí nghiệm nuôi

cấy 2 pha với pha 2 là đói đạm

Hình 39 Một số ảnh hình thái tế bào tảo ở thí nghiệm nuôi cấy 2 pha

Hình 40 Ảnh bình thí nghiệm ở pha đói đạm (bình đối chứng và bình thí nghiệm) và

ở giai đoạn nảy mầm

Hình 41 Sự thay đổi mật độ tế bào của H pluvialis ở thí nghiệm nuôi cấy 2 pha với

pha 2 tảo được chiếu ánh sáng có cường độ 7-10klux

Hình 42 Sự thay đổi hàm lượng protein của H pluvialis ở thí nghiệm nuôi cấy 2 pha

với pha 2 tảo được chiếu ánh sang có cường độ 7-10 klux

Hình 43 Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll a của H pluvialis ở thí nghiệm được

nuôi cấy 2 pha với pha 2 tảo được chiếu ánh sang có cường độ 7-10 klux

Hình 44 Sự thay đổi hàm lượng astaxanthin của H.pluvialis ở thí nghiệm nuôi cấy 2

pha với pha 2 tảo được chiếu ánh sang có cường độ 7-10 klux

ViÖn CNSH & Thùc phÈm viii LuËn v¨n th¹c sü khoa häc Hình 45 Một số ảnh hình thái tế bào ở các giai đoạn trong quá trình nuôi cấy 2 pha

với pha 2 có cường độ ánh sáng cao

M ỤC LỤ C

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH M C C C CHỤ Á Ữ VIẾT TẮT iii

DANH M C BỤ ẢNG iv

DANH M C HỤ ÌNH v

MỤC LỤ C ix MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I – T NG QUAN TÀI LI U 4Ổ Ệ I ASTAXANTHIN 5

1 Đặc điểm chung 5

2 Nguồn astaxanthin 7

3 Vai trò và ứng dụng của astaxanthin 9

3.1 Vai trò 9

3.2 Ứng dụng 13

4 Sản xuất astaxanthin từ Haematococcus pluvialis 15

5 Một số sản phẩm từ astaxanthin 17

5.1 Bioastin 18

5.2 Ứng dụng trong mỹ phẩm 19

II Tổng quan về vi tảo lục H pluvialis 19

1 Các đặc điểm sinh học 20

2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và sự hình thành astaxanthin ở vi tảo lục Haematococcus pluvialis 22

3 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng H pluvialis trên thế giới và ở Việt Nam 24

4 Một số mô hình nuôi trồng H pluvialis trên thế giới 26

5 Nuôi trồng H pluvialis những cơ hội và thách thức 28

ViÖn CNSH & Thùc phÈm x LuËn v¨n th¹c sü khoa häc

CHƯƠNG II 31

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 31

2.1.1 Chủng tảo được sử dụng trong nghiên cứu 31

2.1.2 Thành phần các môi trường sử dụng cho chủng giống 31

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 33

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.2.1 Phương pháp phân lập và lưu giữ vi tảo 34

2.2.2 Phương pháp xác định sinh trưởng của tảo 37

2.2.2.1 Phương pháp đo mật độ quang học (OD) 37

2.2.2.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào bằng buồng đếm Burker – Turk 37

2.2.2.3 Xác độ sinh trưởng qua trọng lượng khô 38

2.2.2.4 Xác định các thông số tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ) của tảo theo MĐTB 38

Tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ, /ngày)

2.2.2.5 Phương pháp xác định hình thái tế bào tảo H pluvialis 38

2.2.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll a, b, carotenoit (astaxanthin) ở vi tảo H pluvialis 39

2.2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng protein của tế bào vi tảo H pluvialis 40

CHƯƠNG III 44

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Phân lập và lưu giữ Haematococcus pluvialis trong phòng thí nghiệm 44

3.2 Lựa chọ điều kiện môi trường nuôi cấy H pluvialis trong các thể tích bình n nuôi 1,5 và 10 lít 45

3.3 Sự thay đổi hình thái, kích thước cũng như các thành phần nội bào trong vòng đời tự nhiên của vi tảo lục H pluvialis ở các thể tích bình nuôi 1, 1,5 và 10 lít 50

3.3.1 Nghiên cứu vòng đời tự nhiên của H pluvialis ở thể tích bình nuôi 1 lít 52 3.3.2 Nghiên cứu vòng đời tự nhiên của tế bào tảo H pluvialis ở thể tích bình nuôi

1,5 lít 56

3.3.3 Nghiên cứu vòng đời tự nhiên của tế bào vi tảo H pluvialis được nuôi ở thể tích bình nhựa 10 lít 60

3.4 Nghiên cứu sinh trưởng của vi tảo lục H pluvialis trong điều kiện nuôi trồng 2 pha 65

3.4.1 Nghiên cứu sinh trưởng của vi tảo lục H pluvialis trong điều kiện nuôi trồng thiếu hụt nito 65

3.4.2 Nghiên cứu sinh trưởng của H pluvialis trong điều kiện sốc ánh sáng (sau khi tảo được chuyển vào điều kiện ánh sáng cao) 71

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77

KẾT LUẬN 77

KIẾN NGHỊ 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

DANH S CH C C B I B O CÔNG BÁ Á À Á Ố 91

MỞ ĐẦU

Sinh khối tảo trên trái đất là rất lớn chiếm khoảng 1/3 khối lượng thực vật Khoảng 70% nước biển là môi trường sống của tảo Tảo có mặt khắp nơi trên trái đất, có khoảng 40.000 loài vi tảo (VT) đã được phát hiện, trong đó có khoảng 50 loài đã được nghiên cứu sâu về mặt sinh hóa, sinh lý và sinh thái học Hiện nay, VT đang là một đối tượng thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới

Tảo đóng góp vào bầu khí quy n tể ừ 40-50% lượng oxi T o còn là ngu n ả ồcacbon được tìm th y trong dấ ầu thô và khí đố ựt t nhiên (Andersen, 2005)

VT có khả năng sử ụng nguồn năng lượng là ánh sáng mặt trời và các hợp dchất vô cơ để làm nguyên liệu sống cho b n thân mình Nhi u loài ả ề VT chứa một hàm lượng protein khá cao (có th t i 70% sinh kh i khô cể ớ ố ủa cơ thể) VT cũng rất giàu vitamin, sắc tố, các khoáng đa và vi lượng… Do đó chúng là một ngu n ồnguyên li u tệ ự nhiên phong phú để ch biế ến ra nhi u s n ph m có ho t tính sinh hề ả ẩ ạ ọc khác nhau

Tảo có rất nhiề ứng dụng khác nhau trong đời sống của con người Ngày u nay VT được sử ụng rộng rãi làm thực phẩm chức năng cho người và động vật dnuôi, làm nguyên liệu cho Y, dược, mỹ ẩ ph m, sản xu t phân bón, xấ ử lý môi trường, góp ph n gi m thiầ ả ểu biến đổi khí h u toàn c u thông qua vi c gi m thiậ ầ ệ ả ểu lượng khí C0R 2 R trong khí quyển (Ganta và Svircev, 2008) Gần đây VT còn được đánh giá là đối tượng đầy tiềm năng cho sản xu t nhiên li u sinh h c ấ ệ ọ

Trong tự nhiên, VT là thành phần cơ bản c a chu i th c ăn c a thu v c ủ ỗ ứ ủ ỷ ự

Với kích thước cơ thể phù hợp, giàu dinh dưỡng, d tiêu hoá ít gây ô nhi m môi ễ ễtrường, nhi u loề ại không có độ ốc t và có kh ả năng nuôi sinh khố ới l n nên VT đã trởthành ngu n thồ ức ăn không thể thiếu trong các giai đoạn sinh trưởng c a nhuy n thủ ễ ểhai m nh vả ỏ, giai đ ạo n ấu trùng của một số loài giáp xác, các giai đoạn sinh trưởng

sớm của một số loài cá hoặ ểc đ sản xuất khối lượng lớn các động vật phù du như

Artemia, Luân trùng (Rotifer) Đó chính là lý do khiến vi c s d ng VT trong nuôi ệ ử ụ

trồng thủy sản (NTTS) đang ngày được được quan tâm nghiên c u ứ

Việt Nam là nước có thế ạnh về m xuất khẩu thuỷ ả s n v i l i nhuớ ợ ận năm

(32TUdat-gan-5-ti-usd.htmU) Mặc dù tôm là mặt hàng xuất khẩu chủ ực và chiếm tỉ ọ l tr ng lớn nhất trong danh mục các sản phẩm thủy sản chính của Việt Nam nhưng cá hồi cũng là một lo i th y s n có giá tr kinh tạ ủ ả ị ế cao và đang được đưa vào nuôi trồng ởnước ta t i các tỉnh Lào Cai, Sơn La, Yên Bái, Lâm Đồạ ng… Do cá h i không tự ồ

http://phapluattp.vn/20110126112558935p0c1014/xuat-khau-thuy-san-nam-2010-tổng hợp được astaxanthin trong cơ thể mà phải được cung cấp từ ức ăn nhân tạ th o nên VT được sử ụng như là một nguồn cung cấp astaxanthin phù hợp và có giá dthành th p Trong các loài ấ VT, Haematococcus pluvialis là loài tảo lục có khả năng tích lũy astaxanthin cao nhất Do chúng ta chưa nuôi trồng thành công được loài VT này Viở ệt Nam, nên tất cả thức ăn dùng trong nuôi cá hồ ềi đ u phải nhập ngoại, gây khó khăn rấ ớt l n trong vi c tri n khai nuôi trệ ể ồng đại trà cá h i Tuy nhiên công ngh ồ ệnuôi Haematococcus pluvialis và sản xuất astaxanthin quy mô lớn vẫn đang là thách

thức đối với các nhà khoa học hiện nay

Để góp ph n tháo g nh ng khó khầ ỡ ữ ăn nêu trên chúng tôi đã tiến hành th c ự

hiện đề tài “Tối ưu hóa điều kiện nuôi trồng Haematococcus pluvialis, gi u à

cơ bản về điều kiện nuôi trồng tối ưu loài VT lục nêu trên, cung cấp cơ sở khoa học cho việc nuôi trồng 2 pha sản xuất sinh khối tảo đạt năng suất cao giàu astaxanthin

để ứng dụng trong NTTS Các kết quả nghiên cứu của đề tài nêu trên là ộm t ph n ầtrong hướng nghiên c u c a đ tài “Nghiên c u công ngh nuôi vi t o ứ ủ ề ứ ệ ả H.pluvialis và công nghệ chiết xu t astaxanthin” do B Nông nghi p và Phát tri n Nông thôn cấ ộ ệ ể ấp kinh phí nghiên cứu trong 3 năm 2010-2012, thuộc Đềán Phát tri n Công nghể ệ sinh

học trong NTTS cho Phòng Công nghệ ảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa T

học và Công nghệ ệt Nam Vi

Tuy tên đề tài được đặt ra là tối ưu h a điềó u ki n nuôi tr ng ệ ồ H pluvialis

nhưng trong quá trình th c hi n, do yêu c u th c t không c n thi t ph i s d ng các ự ệ ầ ự ế ầ ế ả ử ụphương pháp tối ưu hóa ph c t p, mà đây d a trên vi c phân tích các công trình ứ ạ ở ự ệ

khoa học của thế ới đã đượ gi c công bố trên đối tượng này sẽ được kế ừa áp dụng thvới điều kiện của Việt Nam như thế nào nên ch ng tôi chú ỉ ầ c n thực hiện việc lựa chọn các điều ki n thệ ích hợp cho từng giai đoạn sinh trưởng của lo i tảo n y Với à à

mục tiêu củ ềa đ tài đặt ra l nghiên cứu th nh công quy tr nh nuôi sinh kh i tà à ì ố ảo giàu astaxanthin để làm thức ăn cho cá h i, chúồ ng tôi đ bướã c đầu thành công trong vi c ệnuôi trồng lo i vi tảo n y trong điều kiện phòng thí nghiệm và quy mô pilot à à

CHƯƠNG – T I Ổ NG QUAN TÀI LIỆ U

Ngày nay thế giới có r t nhi u vấ ề ấn đề đáng quan tâm, mang tính toàn cầu như an ninh lương thực, năng lượng, bi n đ i khí h u toàn c u, dân s … Các nguế ổ ậ ầ ố ồn nguyên liệu tự nhiên đang bị con người khai thác c n kiạ ệt, cộng thêm s bùng nự ổ dân số ẫn đến lương thự d c th, ực phẩm cũng như các nguồn năng lượng hiện có không thể đáp ứng được nhu c u cầ ủa con người Vì v y,ậ vấn đ đặt ra cho chúng ta ề

là phải tìm ra được những nguồn nguyên li u thay thệ ế, chủ động trong nguồn lượng

thực, thực phẩm đủ ớn để nuôi sống được con người l

Ngành NTTS là một trong những ngành nghề đóng vai trò quan trọng trong

việc chủ động tạo ra được lượng thực phẩm cho con người nhằm hạn chế ệc kh vi ai thác và đánh bắt th y h i s n t t ủ ả ả ừ ự nhiên, đóng góp quan trọng trong vi c gi m thi u ệ ả ểsuy thoái của các hệ sinh thái nước hiện nay (Đặng Đình Kim và cs., 1999), (Đặng

Tố Vân Cầm, 2007) VT là mắt xích đầu tiên trong chu i th c ăn c a m i th y v c ỗ ứ ủ ọ ủ ự

do vậy, chúng là thức ăn không thể thiếu được đối v i h u h t các đối tượng nuôi ớ ầ ếtrong NTTS Việc nuôi trồng thành công trên quy mô lớn các loài VT giàu dinh dưỡng làm th c ăn sứ ống cho các đối tượng nuôi là m t trong nh ng bí quy t công ộ ữ ếngh ệquan trọng đảm bảo cho việc phát triển bền vững ngành NTTS với sản lượng

và chất lượng cao, con gi ng s ch bố ạ ệnh… và đem lại hi u qu kinh t cao (Đặng ệ ả ếDiễm Hồngvà cs., 1995)

Cá h i là m t lo i th c ph m có giá trồ ộ ạ ự ẩ ị dinh dưỡng cao, đã được nuôi trồng trên quy mô l n nh m khôngớ ằ ngừng đáp ứng được nhu c u ngày càng cao c a con ầ ủngười đối v i loài cá này Vi c nuôi tr ng thành công lo i cá này trên các quy mô ớ ệ ồ ạcông nghi p hay bán công nghiệ ệp khác nhau đã đáp ứng được phần nào nhu cầu của

th ị trường vốn trước đây chỉ ết sử ụng cá h bi d ồi từ đánh bắt tự nhiên (Đặng Diễm Hồng và cs., 2010) Thức ăn không thể thi u cho cá h i là H pluvialis, một loại VT ế ồ

lục có khả năng tích lũy astaxanthin với hàm lượng cao chiếm từ 4 đến 6% trọng lượng khô c a t o Astaxanthin t H pluvialis ủ ả ừ không chỉ là thức ăn bổsung không

th thiể ếu được đối với cá hồi do chúng là nguồn dinh dưỡng quan trọng và duy nhất quyết định lên màu sắc và chất lượng của thịt cá hồi mà chúng còn có thể được sử

dụng với nhiều mục đích khác nhau trong Y, dược và m ph m ỹ ẩ (Đinh Đức Ho ng à

và cs., 2011 Chính vì v) ậy, trước tiên tôi xin gi i thi u mớ ệ ột vài nét sơ lược về astaxanthin và m t sộ ố ả s n ph m làm tẩ ừ ạ lo i sắc tố này

sắc tố đặc trưng thuộc nhóm carotenoit (Higuera-Ciapara và cs., 2006)

P

C Chúng không hoà tan trong các dung dịch lỏng và hầu hết các dung môi hữu cơ Tuy nhiên, chúng có thể hoà tan trong các dung môi không phân cực như acetone, dimethyl sulfoxide ngay ở -nhiệt độ phòng So với các loại carotenoit khác, astaxanthin dễ dàng được hấp thụ

và tích luỹ

Có hai con đường sinh tổng hợp astaxanthin: con đường thứ nhất bắt đầu với quá trình oxi hoá β- carotene tạo thành các chất trung gian là echinenone, canthaxanthin và adonirubin; con đường thứ hai bắt đầu bằng quá trình hydroxyl hoá β carotene tạo thành các chất trung gian là β- -cryptoxanthin, zeaxanthin và adonixanthin (hình 1)

Hình 1 Con đường sinh tổng hợp astaxanthin từ Haematococcus pluvialis

(Kaewpintong, 2004)

Hình 2 Cấu h nh của astaxanthin (Kaewpintong, 2004) ì

Phân tử astaxanthin có hai cacbon không đối xứng ở vị trí 3 và 3P

`

P

của vòng benzene Astaxanthin có ba dạng cấu hình là astaxanthin tự do, astaxanthin monoester và astaxanthin diester (hình 2) Nhóm ester tạo ra mối liên kết astaxanthin và protein Vì vậy astaxanthin không thể gắn kết với protein nếu liên kết ester không tồn tại Astaxanthin từ tảo bao gồm 20% diester, 75% mono ester và -5% ở dạng tự do Trong khi đó astaxanthin nhân tạo chứa 100% astaxanthin dạng tự

do Astaxanthin tự do không thể liên kết với protein nên chúng chỉ có thể tạo ra màu

đỏ mà không tạo ra các màu sắc khác như trắng, xanh hay đen…, thêm vào đó astaxanthin tự do cũng rất dễ bị chuyển hoá Điều này giải thích tại sao astaxanthin tổng hợp có thể phân bố ở da và vẩy cá nhưng khi bổ sung không đúng thời gian thì

sự chuyển hoá nhanh của astaxanthin làm cho da cá bị bạc trắng

Cùng với sự phát triển của công nghệ sản xuất astaxanthin tự nhiên, việc quản lý các astaxanthin tổng hợp trở nên nghiêm ngặt hơn ở tất cả các nước trên thế giới Uỷ ban quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (Food and Drug Administration – FDA) đã nghiêm cấm việc bổ sung astaxanthin tổng hợp vào các loại thực phẩm và các loại thức ăn cho động vật

2 Nguồn astaxanthin

Có hai nguồn astaxanthin chính là: nguồn astaxanthin tổng hợp hoá học và astaxanthin tự nhiên

1. Nguồn tổng hợp hoá học: Hiện nay, astaxanthin tổng hợp là nguồn cung cấp

chủ yếu cho nuôi trồng thuỷ sản Hơn 95% astaxanthin tổng hợp trên thị trường được sử dụng làm thức ăn nhằm tạo ra các mầu sắc của đối tượng nuôi khác nhau Tuy nhiên, astaxanthin tổng hợp có giá thành rất cao và quy trình sản xuất chúng tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây hại

2 Nguồn tự nhiên:

a Từ các loại giáp xác: đó là các sản phẩm phụ (byproducts) từ giáp xác được

sử dụng làm nguồn nguyên liệu để tách chiết sắc tố tự nhiên cho cá hồi Tuy nhiên, chúng có hàm lượng astaxanthin tương đối thấp trong khi đó độ ẩm, hàm lượng tro

và các chất dinh dưỡng khác lại cao gây ra một số khó khăn trong việc sản xuất thức

ăn cho động vật

b Nấm men: Phaffia rhodozyma là một loài nấm men duy nhất được biết đến

hiện nay, có khả năng tổng hợp astaxanthin Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin trong chủng P rhodozyma tự nhiên là khá thấp, không thích hợp cho mục đích sản xuất thương mại Hiện nay, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật biến đổi gen, đã tạo ra được các chủng P rhodozyma có hàm lượng astaxanthin khá

lớn (chiếm từ 300 đến 2000 mg/kg sinh khối khô SKK, tương ứng 0,03- -0,2% SKK) để sử dụng trong công nghiệp sản xuất astaxanthin Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin laị phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm sinh học của chủng, phương pháp

và điều kiện nuôi cấy (Johnson và cs., 1991)

c Tảo: Astaxanthin có thể được sản xuất từ các loại tảo khác nhau như

Ankistrodesmus branuii, Chlorella zofingiensis và Dunaliella salina (Đặng Diễm

Hồngvà cs., 1998), Euglena rubida Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin ở các chủng tảo nêu trên tương đối thấp và không thích hợp để sản xuất ở quy mô lớn Loại VT lục Haematococcus pluvialis thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu bởi chúng có khả năng tích luỹ một lượng lớn astaxanthin từ 4 đến 6% trọng lượng khô (Kang và cs., 2005)

d Các vi sinh vật khác: Một số loại vi khuẩn như Mycobacterium lacticola,

Brevibacterium sp và một số chủng nấm thuộc chi Peniophora cũng có khả năng tích luỹ astaxanthin Hàm lượng carotenoit của những vi sinh vật này rất thấp đồng thời chúng cũng sinh trưởng rất chậm

Bảng 1 chỉ ra nguồn cung cấp astaxanthin và bảng 2 hàm lượng astaxanthin ở các

cơ thể khác nhau

Bảng 1 Nguồn cung cấp astaxanthin khác nhau (Borowitzka, 1999)

Bảng 2 Nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên (http://www.algatech.com/astax.htm)

- Astaxanthin là một chất chống oxi hoá

Các gốc tự do (OH, các gốc peroxyl) và các dạng oxi có khả năng phản ứng cao được sản sinh trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất Bất lợi về sinh lý, ô nhiễm môi trường, khói thuốc, phơi nhiễm với các chất hoá học hoặc tia UV có thể

là nguyên nhân chính thúc đẩy sản sinh ra những chất nêu trên Các gốc tự do có thể phá huỷ cấu trúc của phân tử DNA, protein và màng lipit Các chất chống oxi hoá như carotenoit có thể giúp ngăn chặn một số bệnh ở người (Papas và cs.,1999) Carotenoit có khả năng hấp thụ năng lượng kích thích của vỏ oxygen vào chuỗi carotenoit, dẫn đến sự phá huỷ của phân tử carotenoit nhưng lại ngăn chặn được sự

phá huỷ của các phân tử và các mô khác (Mortensen và cs., 1997), (Beutner và cs.,

2001 Chúng cũng có thể ngăn chặn sự hình thành chuỗi phản ứng của các gốc tự do bắt đầu bằng sự phá huỷ của các axit béo không bão hoà đa nối đôi và dẫn đến phá huỷ màng lipit Astaxanthin có tác dụng bảo vệ phospholipit màng và các lipit khác (Palozza và cs., 1992), (Naguib và cs., 2000) Hoạt tính chống oxi hoá của astaxanthin được chứng minh trong rất nhiều công trình nghiên cứu đã được công

bố Trong một số trường hợp, astaxanthin có hoạt tính chống oxi hoá cao hơn nhiều lần so với vitamin E và beta- carotene (Kurashige và cs., 1990), (Shimidzu và cs., 1996) Tính chất chống oxi hoá của astaxanthin được cho là có vai trò chìa khoá trong việc bảo vệ chống lại sự quang oxi hoá (do tia UV gây ra), kháng viêm, chống ung thư, ngăn chặn sự nhiễm Helicobacter pylorri, các bệnh liên quan đến tuổi hoặc thúc đẩy các phản ứng miễn dịch, chức năng gan và bảo vệ tim, mắt, các khớp và tuyến tiền liệt

Astaxanthin là một photoprotectant

Sự tiếp xúc của lipit và các mô với ánh sáng, đặc biệt là với UV có thể dẫn đến sự sản sinh ra các gốc tự do và dẫn đến sự phá huỷ chúng Astaxanthin có khả năng ngăn chặn quá trình quang oxi hoá các lipit bởi tia UV với hiệu quả cao hơn so với beta-carotene và lutein (Papas và cs., 1999 O’Connor và cs.,1998).) (,

Astaxanthin và sức khoẻ của mắt

Cấu trúc của astaxanthin rất giống với cấu trúc của lutein và zeaxanthin nhưng nó có hoạt tính chống oxi hoá mạnh hơn Astaxanthin không được tìm thấy trong mắt (Tso, M.O.M và cs., 1996 Tuy nhiên, một nghiên cứu trên động vật đã )chứng tỏ rằng astaxanthin có khả năng vượt qua hàng rào máu não và đến võng mạc của các động vật có vú (O’Connor và cs., 1998 Các quang thụ thể trên võng mạc )của chuột được ăn astaxanthin ít bị phá huỷ bởi tia UV hơn và phục hồi nhanh hơn

so vớ những chuột không ăn astaxanthii n

Astaxanthin và lợi ích đối với da

Astaxanthin được cho là có tác dụng bảo vệ da khỏi sự quang oxi hoá bởi tia

UV và có thể làm giảm nguy cơ ung thư da (Fuchs và cs., 1998, (Savoure và cs., 1995), (Black và cs., 1998)

Astaxanthin và tính chất kháng viêm

Astaxanthin có tác dụng chống lại các triệu chứng viêm gây ra bởi

Helicobacter pylori Astaxanthin làm giảm các triệu chứng viêm dạ dày và cũng

liên quan đến những thay đổi của phản ứng viêm (Bennedsen và cs., 1999)

Astaxanthin và sức khoẻ của tim

Hàm lượng LDL cholesterol cao trong máu làm tăng nguy cơ bị xơ vữa động mạch Trong khi đó, hàm lượng HDL cao trong máu có tác dụng bảo vệ chống lại

-sự xơ vữa động mạch Thông thường LDL trong huyết tương không bị oxi hoá và

sự oxi hoá LDL góp phần thúc đẩy sự phát triển của xơ vữa động mạch (Frei, 1995) Astaxanthin có thể có lợi cho sức khoẻ của tim bằng cách thay đổi hàm lượng cholesterol LDL và HDL trong máu (Tracy, 1999)

Astaxanthin và các tế bào

Hiệu quả ủa astaxanthin trong vi c ệc ngăn chặn sự oxi hóa ty th c a cáể ủ c tế

bào gan chuột có th ể cao gấp 10 lần so với tác dụng của vitamin E (Kurashige và cs., 1990) Điều này khẳng định vai trò của astaxanthin trong việc bảo về chức năng

của ty thể Vai tr ủa astaxanthin trong ệc bảo vệò c vi màng tế o được cho l bà à xu t ấphát từ ả năng bảo vệ kh phần bên trong v ề ặt ngo i của m ng tế o chống lạà b m à à bà i quá trình oxi h a (Goto và cs., 2001), (Barros và cs., 2001ó ), (Matsushita và cs., 2000) Các chất ch ng oxi hố óa, đặc biệt là carotenoit c n thi t cho tầ ế ế bào không chỉ

bởi ch ng cú ó kh ả năng bảo vệ c th nh phần của tế o chống lại quá trình oxi h a cá à bà ó

mà còn bởi ch ng c vai tr điều khiển sự ểu hiện gen v ả ứng mối liên hệú ó ò bi à c m

giữa c c tếá bào (Allen và cs., 2000, (Bertram và cs., 1999) Gần đây, astaxanthin được cho là có vai trò u khi n gen CYP trong tđiề ể ế bào gan chu t mộ ặc dù úch ng vẫn chưa biểu hi n tác đ ng g lên cệ ộ ì ác t bào này (Kistler và cs., 2002).ế

Khả năng chống ung thư củ a astaxanthin

Một số nghiên cứu đã ch ng minh r ng astaxanthin c vai trứ ằ ó ò chống ung thư

ở độ ng v t cậ ó vú (Tanaka và cs., 1994) Tác d ng b o v c a astaxanthin th m chí ụ ả ệ ủ ậ

còn cao hơn cả beta-carotene (Tanaka và cs., 1995) Astaxanthin có tác dụng chống

lại ung thư vú bằng c ch l m giảm khả năng sinh trưởng của c c khối u, hoạt t nh á à á íchống ung thư vú của astaxanthin cao hơn so với beta carotene v- à canthaxanthin (Chew và cs., 1999) Astaxanthin ức chế enzym 5-alpha-reductase chịu tr ch nhiệm ácho sự phát triển của tuy n tiế ền liệt Việc bổ sung astaxanthin được xem như là phương pháp nh m ch ng l i s ằ ố ạ ự tăng sản tuyền ti n li t và ung thư tuyến tiền liệt ề ệ(Anderson và cs., 2001)

Vai trò c ủ a astaxanthin trong việc giả độc v chức năng gan i à

Astaxanthin có hiệu quả ả b o v ty thệ ể ủ c a các tế bào gan ch ng l i số ạ ự phá

hủy bởi oxi h a cao hơn so với vitamin E (Kurashige và cs., 1990) Astaxanthin ó

cũng cả ứng c c enzym chuyển h a c c xenobiotic trong gan chu t, trong phm á ó á ộ ổi và thận (Gradelet và cs., 1998)

Astaxanthin v à ph n ả ứ ng mi n d ễ ịch

Trong c c thá í nghiệm in vitro người ta đã chứng minh r ng astaxanthin có ằvai trò tăng cường s n xu t kh ng thả ấ á ể ủ c a các tế bào lá lách chu t vộ à cũng có th ể

phục hồi c c phả ứng miễn dị ởá n ch chuột (Jyonouchi và cs., 1993) C c nghiên cá ứu

in vitro trên các tế o m u ngườ ũng đã bà á i c chứng tỏ vai tr ủa astaxanthin trong ò c

việc tăng cường quá trình sản xuất c c globulin miễn dịch để đ p ứng với c c ká á á ích thích phụ thuộc tế o T (Jyonouchi và cs., 1995) bà

Astaxanthin v à các bệ nh suy tho i th n kinh á ầ

Nhiều bằng chứng cho thấy sự bất lợi về oxi h a l nguyên nhân hoặc t nhất ó à í

là yếu tố ụ ph thuộc gây ra c c bệnh suy tho i thần kinh như Alzheimer, Huntington, á áParkinson… Kh u phẩ ần ăn già áu c c ch t chốấ ng oxi hó óa g p phần làm giảm nguy cơ

mắc c c bệnh kểá trên (Grant, 1997), (Borlongan và cs., 1996), (de Rijk và cs., 1997), (Ferrante và cs., 1997) Astaxanthin có kh ả năng vượt qua h ng r o m u nà à á ão

ở độ ng v t có vú và có th bi u hi n ho t tính nh ng v ng ngo i h ng rậ ể ể ệ ạ ở ữ ù à à ào, do đó

astaxanthin là một chất thử nghiệm l tưởng cho c c thý á í nghiệm liên quan đến bệnh Alzheimer và các bệnh thần kinh kh c (Tso and Lam,á 1996), (Guerin và cs., 2003).

3.2 Ứng dụng

Ứng dụng trong kỹ thuật nuôi cá hồi

Cá hồi không tự tổng hợp được astaxanthin trong cơ thể mà phải được cung cấp từ thức ăn nhân tạo Sự hấp thụ và lắng đọng của astaxanthin trong khẩu phần

ăn tạo nên màu sắc của thịt cá(Steven, 1948), (Kitahara, 1984).Hiện nay, nguồn cá hồi tự nhiên đang đứng trước nguy cơ giảm sút nghiêm trọng, nhưng ngành nuôi trồng cá hồi lại đang trên đà phát triển mạnh mẽ Vì vậy vấn đề đặt ra là tìm nguồn , thức ăn phù hợp để có thể nuôi trồng cá hồi đạt năng suất và chất lượng cao

Thành phần các ester của astaxanthin trong H pluvialis giống như ở trong loài tôm, đây là thức ăn tự nhiên của cá hồi Astaxanthin được tích lũy trong giai đoạn cyst của H pluvialis có khoảng 70% là monoester, 25% - diester và 5% là dạng tự do Một nghiên cứu gần đây ở Nauy đã chứng minh rằng cá hồi Đại Tây Dương giai đoạn còn non sẽ phát triển tốt khi được cung cấp đầy đủ astaxanthin trong khẩu phần ăn (Christiansen và cs., 1995) Astaxanthin trong khẩu phần ăn

<5,3 ppm chỉ cho sự phát triển ở mức dưới ngưỡng; nếu lớn hơn 5,3 ppm, sẽ giúp cho cá phát triển bình thường và hàm lượng lipít trong thịt cá cao hơn đáng kể Khi

cá hồi bột được cung cấp astaxanthin ở mức <1ppm, tỷ lệ sống sót giảm đi đáng kể (50% cá bột bị chết) Nếu hàm lượng astaxanthin trong khẩu phần ăn cao hơn, tỷ lệ sống sót đạt trên 90% Vì vậy, astaxanthin được xem như một loại vitamin thiết yếu với hàm lượng cần thiết tối thiểu là 5,1 ppm.Tuy nhiên, nếu hàm lượng astaxanthin trong khẩu phần ăn đạt 13,7 ppm thì hàm lượng lipít trong thịt cá sẽ tăng lên 20%

và sự phát triển của cơ thể sẽ đầy đủ hơn so với mức 5,3 ppm astaxanthin (Lorenz

và Cysewski, 2000)

Ứng dụng t rong kỹ thuật nuôi cá cảnh

Cá cảnh không tự tổng hợp được carotenoit mà lấy từ nguồn thức ăn nh VT, ưsan hô hoặc con mồi có chứa loại chất màu này Astaxanthin và tunaxathin là những loại carotenoit phổ biến được tìm thấy ở tất cả các động vật biển Một trong những

thách thức lớn nhất của ngành công nghiệp nuôi cá cảnh là phải tạo được màu sắc giống như màu tự nhiên của cá Rất nhiều loạ thức ă đ đưi n ã ợc đưa ra thử nghiệm

để giải quyết vấn đề này và astaxantin tự nhiên từ Haematococcus ã đ được chứng minh là cho hiệu quả cao nhất và ổn định nhất (Lorenz và Cysewski, 2000) Do astaxanthin không phải là hoocmon nên chúng không gây hại đến khả năng sinh sản của cá Cá sẽ chuyển hóa astaxanthin có trong thức ăn thành tuaxanthin và tích lũy chúng trong da và làm cho cá có màu sắc rực rỡ Cá có khả năng hấp thụ các loại carotenoit tốt theo thứ tự như sau: zeaxanthin (không phổ biến) > astaxanthin > lutein (có nhiều trong các loại thực vật như ngô…) Các kết quả thực nghiệm đã cho thấy cá khi được bổ sung astaxanthin vào khẩu phần ăn liên tục từ 7 đến 10 ngày sẽ

có màu sắc rất rực rỡ Vĩnh Khang (2007( ), (Ako và cs.,1999)

Ứng dụng trong việc phòng bệnh đốm xanh ở tôm

Sự thiếu hụt astaxanthin trong khẩu phần ăn của Penacus monodon là nguyên nhân gây ra bệnh đốm xanh Sau 4 tuần cho ăn thức ăn chứa 50 ppm astaxanthin, P

monodon lại có màu sắc xanh-nâu như bình thường Các phân tích trên mô của chúng cho thấy hàm lượng carotenoit đ ăng lên >300% so vớiã t 14% carotenoit ở P monodon được cung cấp loại thức ăn thương mại không chứa astaxanthin Hàm lượng carotenoit tổng số trong vỏ tôm được cung cấp đầy đủ astaxanthin đạt 26,3 ppm Ngược lại, nếu tôm bị bệnh đốm xanh thì hàm lượng carotenoit trong vỏ chỉ

đạt 4 7 ppm Khi - được nấu chín, tôm bị bệnh đốm xanh có màu vàng xám, không đạt yêu cầu về mặt thẩm mỹ, ngược lại tôm bình thường có màu đỏ tươi (Katayama

và cs., 1972), (Menasveta và cs., 1993), (Yamada và cs., 1990)

Ảnh hưởng của thức ăn chứa carotenoit trong việc tạo màu được nghiên cứu bằng việc cho P monodon ăn 100 ppm các loại carotenoit (β-carotene, canthaxanthin và astaxanthin) Kết quả cho thấy cả 3 loại carotenoit được giữ ở trong mô tế bào Tuy nhiên, nếu trong thức ăn chứa astaxanthin thì trong mô của động vật nuôi sẽ có hàm lượng astaxanthin cao nhất (16,5 mg/ kg cơ thể) Kết quả này cao hơn 23% so với việc cho ăn thức ăn có canthaxanthin và 43% - -carotene β

đã chứng minh một điều rằng astaxanthin là nguồn carotenoit hiệu quả nhất đ tạo ể màu sắc cho cá (Lorenz và cs., 2000)

Ứng dụng trong nuôi gia cầm

Astaxanthin đã được dùng làm phụ gia trong chế biến thức ăn nuôi gia súc, gia cầm, làm tăng màu vàng cam cho lòng đỏ trứng, tăng tỷ lệ nở con, giảm khả năng nhiễm khuẩn Salmonella (Lorenz và cs., 2000), (Elwinger và cs., 1997), (Inborr, (1998), (Lee và cs., 1986)

Ứng dụng trong y học

Astaxanthin là dẫn xuất của β-caroten Nhưng nó có thể dùng với hàm lượng

t ng ươ đối cao, thay thế cho vitamin A mà không gây nguy hiểm như vitamin A Khi thừa β-caroten chúng sẽ được tích lũy ở gan của cơ thể (Amcoff và cs., 1998) Astaxanthin có khả năng dễ dàng xuyên qua hàng rào máu não, bảo vệ võng mạc –của mắt, góp phần chống lại các tác nhân oxy hóa, chống lại sự thiếu hụt các tế bào cảm thụ quang Do astaxanthin có vai trò trong việc bảo vệ được nơron võng mạc nên chúng cũng sẽ tham gia bảo vệ nơron não và tủy sống, ngăn chặn đáng kể tác hại do các gốc tự do được hình thành gây ra Ngoài ra, việc sử dụng astaxanthin thường xuyên có thể làm giảm nguy cơ thoái hóa điểm vàng Hiện nay, astaxanthin

là một trong những thành phần quan trọng của nhiều loại dược phẩm được dùng trong điều trị các chứng viêm ruột, viêm dạ dày do nhiễm khuẩn Helicobacter gây

ra và được bổ sung vào thành phần của một số chế phẩm vitamin đang được l u ưhành trên thị trường trong vài năm gần đây, nhằm bổ sung chế độ dinh dưỡng hàng ngày cho con người (Guerin và cs., 2003)

pluvialis

Nấm men Phaffia zhodozyma (hay còn gọi là Xanthophyllomyces

năng tổng hợp sắc tố astaxanthin tự nhiên Astaxanthin được tổng hợp ở H pluvialis

có thể đạt được tối đa là 9,2 mg/g sinh khối khi được nuôi cấy trên môi trường BAR, dưới điều kiện chiếu sáng liên tục (345 μmol photon mP

có sục khí Trong khi đó, ở nấm men Phaffia zhodozyma thì astaxathin đạt được là

1850 µg/g sinh khối với chủng đã được biến đổi gen R1 sinh trưởng trên môi trường

có bổ sung nước dừa (Haard, 1988) Năng suất tối đa đạt được ở nấm men là 370 µg sinh khối/g ngày với chủng R1, còn ở H pluvialis 290 – từ 428 µg/g ngày tế bào (môi trường nuôi BG 11 hoặc BAR)- (Hayman và cs., 1995), cường độ chiếu sáng

yế nghiên cứu quy trình sản xuất và thu nhận astaxanthin từ u H.pluvialis Đã có rất nhiề công trình trên thế giới công bố về việc nuôi trồng loài tảo này Tuy nhiênu , ở Việt Nam thì vấn đề này lại rất mới mẻ Hiện nay chưa có một cơ sở nào có thể , thương mại hóa sản phẩm astaxanthin từ H pluvialis được vì chưa nuôi cấy thành công được loài tảo này

Quá trình chiết sắc tố

i

Vớ P rhodozyma, tế bào được rửa và trộn với 1 ml aceton, 1 ml dầu hỏa và

1 ml NaCl với tỷ lệ 20% trọng lượng/thể tích Bước tiếp theo là chiết sắc tố, mẫu được ly tâm trong 5 phút với tốc độ là 3500 x g Carotenoit tổng số được xác định bằng việc đo mật độ quang bằng máy quang phổ và các tiêu chuẩn đã được thương mại hóa cũng được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) theo công bố của Jian-Ping và cộng sự (1997)

Thành phần sắc tố của H pluvialis được định lượng theo phương pháp của Britton (1985) V ới 5 ml dịch nuôi tảo được ly tâm ở 900 – 1000 x g trong 5 phút Cặn tế bào được rửa 2 lần với 5 ml nước cất, sau đó thêm vào 5 ml cát thủy tinh và

5 ml hexane/acetone/ethyl alcohol (100:70:70) Sắc tố được trích rút và định lượng bằng việc đo mật độ quang ở bước sóng 474 nm với hệ số tắt dần đối với carotenoit

sử dụng quy vét có độ dày 1% là 2100, tương ứng hệ số tắt dần cho astaxanthin là

1600 cho astaxanthin (Sokal and Rohlf 1981) , Astaxanthin cũng được định lượng bằng HPLC theo phương pháp của Jian-Ping và cộng sự (1997)

Sản xuất astaxanthin từ Phaffia rhodozyma

Phaffia rhodozyma I (chủng đã được biến đổi gen) có thể lên men sử dụng

nguồn cacbon là glucose và các loại đường khác Sinh khối nấm men giàu astaxanthin (Johnson và An 1991) Nấm men này có thể phát triển tốt trên môi trường có sử dụng rỉ đường mía (Haard1988), dịch đường mía (Fontana và cs., 1996), phần dịch dư của cỏ linh lăng (Okagbue và Lewis 1984), dịch nho đã thủy phân thành than bùn (Meyer và du Preez 1994a Acheampong và Martin 1995; ), phần thủy phân còn lại của ngô (Leather, 2003), nước dừa (Domínguez- Bocanegra

và Torres Munoz 200- 7) Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số tác nhân lên quá trình sinh tổng hợp carotenoit ở loài nấm men này như oxy, perxyt cũng đã được công bố (Johnson và Schroeder, 1995)

Sản xuất astaxanthin ở H pluvialis

Quy trình công nghệ sản xuất thương mại astaxanthin gồm hai giai đoạn nuôi cấy khác nhau:

+/ Giai đoạn tăng sinh khối tế bào (Giai đoạn xanh - Green Stage): Ở giai đoạn này,

H pluvialis được nuôi trồng dưới điều kiện hoàn toàn tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển nhằm mục đích tăng số lượng tế bào tối đa; Mật độ tế bào cực đại có thể đạt được hiện nay ở giai đoạn này là 4 6 triệu tế bào/ml -

+/ Giai đoạn tăng cường sinh tổng hợp astaxanthin: ở giai đoạn này, quá trình tổng

hợp astaxanthin được tăng cường bằng cách thay đổi điều kiện môi trường theo hướng bất lợi (stress), chủ yếu là chiếu ánh sáng với cường độ cao và thay đổi thành phần môi trường dinh dưỡng Trong giai đoạn này, các tế bào Haematococcus bắt đầu hình thành dạng bào tử và tiến hành tổng hợp, tích luỹ astaxanthin dưới dạng ester hoá (Fa´bregas và cs., 2001)

5 Một số sản phẩm từ astaxanthin

Astaxanthin có ứng dụng rất lớn trong lĩnh vực NTTS như đã nói ở trên Ngoài ra, astaxanthin cũng được các nhà nghiên cứu khai thác tối đa các hoạt tính sinh học của nó để phục vụ lợi ích của con người với các sản phẩm thương mại nổi tiếng như: Bioastin (thực phẩm chức năng) các sản phẩm mỹ phẩm như; : Multivitamin & mineral man, WellnessPack Man, WellnessPack for Woman…

5.1 Bioastin

Bioastin Natural Astaxathin (hình 3) là thương hiệu hàng đầu có hoạt tính chống oxi hóa cao.Astaxanthin, được chiết xuất từ Haematococcus pluvialis Hoạt tính chống oxi hóa của Astaxanthin được tách chiết từ H pluvialis lớn gấp 550 lần

so với beta-caroten, gấp 10 lần so với vitamin E; sản phẩm có thể sử dụng hàng ngày và không có phản ứng phụ nào Công ty Cyanotech sản xuất BioAstin đầu tiên được sử dụng làm thực phẩm cho con người Năm 1999, BioAstin được Cục Quản Lý Dược Hoa Kỳ (FDA) công nhận là thực phẩm cho con người mà không có một phản ứng phụ nào, được bán rất rộng rãi tại thị trường Mỹ

Một số t ác dụng của Bioastin như sau

1 - Là chất chống ôxi hóa mạnh nhất;

2 – Có hoạt tính kháng viêm cao;

3 - Kháng viêm khớp cổ tay cho các vận động viên tennis và các nhân viên văn phòng làm việc đánh máy liên tục;

4 - Giảm tổn thương do bị stress liên tục (US patent);

5 - Ức chế protein hoạt động lại với C (C-reactive protein);

6 - Giảm tác hại do tia tử ngoại (US Patent);

7 – Có tác dụng giảm đău cơ và khớp do tập luyện thể thao;

8 - Cải thiện chức năng não bộ và hệ thần kinh;

9 - Cải thiện mắt người khi bị thoái hóa do già;

10 - Tăng cường hoạt động của hệ miễn dịch;

11 - Giảm hàm lượng cholesterol có hại và mỡ máu;

12 - Làm đẹp da và cải thiện sắc đẹp phụ nữ Hình 3: Ảnh minh họa Bioastin

13 – Giúp ngăn ngừa sâu răng;

14 - Tăng cường sự dẻo dai của cơ bắp;

15 - Cải thiện chức năng sinh lý của nam giới

(http://www.cyanotech.com/bioastin.html)

Wellness

Đây là sản phẩm do hãng mỹ phẩm nổi tiếng Origlame (Thụy Điển) sản xuất, các sản phẩm cho nam và nữ được sản xuất dựa trên nguyên liệu là astaxanthin chiết xuất từ H pluvialis Astaxanthin giúp bảo vệ tế bào khỏi các gốc tự do và tác hại của tia UV giúp bảo vệ tế bào da Hoạt tính chống oxi hóa độc đáo của astaxanthin được biết đến với khả năng chống oxi hóa gấp 100 lần so với các vitamin E thông thường khác Wellness cũng chứa Omega 3 giúp cải thiện chức -năng của não bộ cũng như giúp bảo vệ sức khỏe của hệ thống tim mạch Ngoài ra, hỗn hợp Wellness cân bằng giữa các vitamin tổng hợp với các khoáng chất được bổ sung thêm axit folic, canxi và sắt giúp cung cấp đầy đủ dưỡng chất cho cơ thể mỗi ngày

WellnessPack for Woman

Làm mềm mại làn da và cải thiện độ ẩm cho da từ bên trong, cung cấp vitamin thiết yếu và khoáng chất cho cơ thể, hỗ trợ các chức năng não bộ và sức khỏe hệ tim mạch

WellnessPack for Man

, Tăng cường hoạt động cơ bắp duy trì sự dẻo dai, cung cấp các vitamin thiết yếu và khoáng chất, hỗ trợ chức năng não bộ và sức khỏe hệ tim mạch

VT là một đối tượng được thế giới đặc biệt quan tâm vì những lợi ích lớn

lao mà nó mang lại Trong tự nhiên, VT là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn nên chúng là nguồn thức ăn không thể thiếu của nhiều đối tượng thủy sản như nhuyễn thể ở hầu hết các giai đoạn, giai đoạn ấu trùng của giáp xác và cá do có kích thước phù hợp, dễ tiêu hóa, ít gây ô nhiễm môi trường, không có độc tố, có thể

chuyển hóa trong chuỗi thức ăn, có tỷ lệ phát triển nhanh, có khả năng nuôi sinh khối lớn và cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho đối tượng nuôi Trên nhiều đối tượng VT khác nhau, con người đã làm chủ được công nghệ để có thể nhân nuôi, điều khiển quá trình sống, quá trình tạo các sản phẩm mong muốn từ VT

VT lục H pluvialis là một loài ví dụ điển hình mà con người đã có những ứng dụng rộng rãi vào việc làm thức ăn cho cá hồi cũng như các sản phẩm chứa astaxanthin được chiết xuất từ loài VT này Con người đã chủ động được quá trình nhân nuôi quy mô lớn, điều khiển các quá trình của H pluvialis nhằm tạo được sinh khối có hàm lượng astaxanthin cao

Đặc điểm hình thái trong vòng đời của H pluvialis

Nhìn chung vòng đời của tế bào VT lục Haematococcus pluvialis (nuôi cấy trên môi trường có bổ sung acetat và FeP

2+

P

) gồm có 4 giai đoạn: Tế bào sinh trưởng

sinh dưỡng tế bào nang tế bào chín và tế bào nảy mầm ; ; Ở mỗi một giai đoạn nêu trên, tế bào tảo có những đặc trưng khác nhau như tỷ lệ giữa các thành phần sắc tố (carotenoit/chlorophyll) và thành phần protein nội bào

Sự thay đổi hình thái học của tế bào H pluvialis: Vòng đời của tế bào H pluvialisi sử dụng môi trường nuôi có chứa acetat được tách ra thành 4 giai đoạn

khác nhau (hình 4) Trên hình 4 đã chỉ ra các giai đoạn khác nhau của tế bào như: giai đoạn I: tế bào sinh trưởng sinh dưỡng; giai đoạn II: tế bào nang (chuyển từ tế bào sinh dưỡng sang tế bào trưởng thành); giai đoạn : tế bàoIII chín (tế bào chuyển

từ trưởng thành sang tế bào chín); giai đoạn IV: Tế bào nảy mầm (tế bào trưởng thành thành chuyển sang tế bào sinh dưỡng)

Tế bào sinh dưỡng dạng hình elip có khả năng chuyển động với 2 roi và kéo dài trong khoảng 4 ngày Người ta cấy tế bào sinh dưỡng vào trong môi trường 0- có

hàm lượng acetat cao trong 4 ngày sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho tảo phát triển và trở thành tế bào nang dạng hình cầu (thời gian kéo dài từ đến 6 ngày) Thời kỳ 4 chín kéo dài từ 6 đến 9 ngày Trong đó, sinh tổng hợp carotenoit trong tế bào nang tăng lên đáng kể khi thêm vào ion FeP

2+

P

ở ngày thứ 6 Khi tế bào trưởng thành đến ngày thứ 9 sẽ được chuyển sang môi trường mới Khi đó, các tế bào con được giải phóng từ các tế bào trưởng thành vào trong môi trường, và các tế bào sinh dưỡng đã được tái sinh từ các tế bào con và tiếp tục sinh trưởng trên hỗn hợp dinh dưỡng kéo dài khoảng từ đến 19 4 ngày

Trong vòng đời của tảo, tế bào sinh dưỡng chứa hàm lượng chlorophyll và protein o ca nhưng hàm lượng carotenoit lại rất thấp Khi tế bào tảo ở giai đoạn nang bào sẽ kèm theo việc giảm hàm lượng cholophyll và protein Khi tế bào trưởng thành sẽ xuất hiện kèm theo tăng quá trình sinh tổng hợp carotenoi và giảm t hàm lượng protein Trong giai đoạn tế bào nảy mầm sẽ k m theo hiện tượng tăng cường ètổng hợp chlorophyll và protein nhưng lại giảm hàm lượng carotenoit Tất cả 4 giai đoạn nêu trên của tế bào tảo H pluvialis đều có thể quan sát được dưới kính hiển vi

cả quang học và điện tử Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố cho thấy sự tích lũy astaxanthin có thể nhận biết và đánh giá qua giá trị của tỷ lệ

(Kobayashi và cs., 1997)

carotenoit/chlorophyll Sử dụng tỷ lệ nêu trên chúng ta có thể phân biệt được rõ rết

tế bào tảo đang ở giai đoạn nào trong vòng đời của chúng Ví dụ tỷ lệ sắc tố nêu trên vào khoảng 0,5; 1 0 và 7, ,0 khi tế bào tảo ở giai đoạn sinh dưỡng (có màu xanh lục), non (có màu nâu và chín (có màu đỏ rực), tương ứng (Kobayashi và cs., 1997)

Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của tảo H pluvialis đã cho thấy

quá trình sinh trưởng cũng như quá trình hình thành astaxanthin bị ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố môi trường khác nhau Một số yếu tố môi trường thường được tập trung nghiên cứu như: Ánh sáng, nhiệt độ, pH, tỉ lệ C/N, nồng độ NaCl, tỉ lệ dịch nuôi cấy hiệu quả (thể tích dịch nuôi cấy/thể tích bình tam giác được sử dụng cho nuôi trồng tảo)…

Ảnh hưởng của hàm lượng vitamin B

VTVitamin B có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng của , dù chỉ cần một lượng rất nhỏ nhưng không thể thiếu trong thành phần dinh dưỡng của VT Ví dụ, vitamin B1 được coi như là yếu tố cần thiết cho sinh trưởng, B12 được xem như là một chất

kích thích sinh trưởng cho tảo (Pringsheim, 1966) Ở các nồng độ khác nhau của

vitamin thì H pluvialis cũng sinh trưởng khác nhau Mật độ tế bào đạt cao nhất ở

nồng độ của B12 là 20µg/L trên môi trường F1 Với nồng độ này của vitamin B12 thì sinh trưởng tăng 75% so với môi trường F1 không bổ sung vitamin (Miss Kamonpan Kaewpintong, 2004)

Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng

Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn tới sinh trưởng cũng như sự hình thành astaxanthin ở tảo H pluvialis Điều kiện ánh sáng thích hợp cho sinh trưởng của H pluvialis vào khoảng 2 klux (40µmol photon/mP

2

P

s) Tại cường độ ánh sáng thấp hoặc trong tối, H pluvialis không tổng hợp astaxanthin mà tồn tại dưới dạng sinh dưỡng với 2 roi chuyển động (Orosa và cs., 2001) Khi gặp điều kiện ánh sáng có cường độ cao (>50 µmol photon/mP

2

P

s), tế bào chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng sang bào nang (cyst) đồng thời quá trình tổng hợp astaxanthin cũng diễn ra rất mạnh Đây cũng là một cơ chế rất đặc biệt ở cơ thể tỏa này và đã giúp H pluvialis có khả năng chống chịu lại với điều kiện khắc nghiệt của môi trường (Kobayashi và cs., 1992)

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những yếu tố để kiểm soát sinh trưởng cũng như khả năng hình thành astaxanthin của H pluvialis Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của H pluvialis là 15-27P

H pluvialis sinh trưởng ở pH trung tính, pH tối ưu cho sinh trưởng vào

khoảng 6,5-8 (Hata và cs., 2001) Ở pH cao >9, sự tổng hợp astaxanthin diễn ra mạnh mẽ

Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng

Sinh trưởng của H pluvialis cần đến các yếu tố vi lượng và đa lượng Các yếu tố đa lượng như cacbon, nito, photpho… Một số dinh dưỡng vi lượng cần thiết cho sinh trưởng của tảo đ được biết gồm sắt, boron, mangan, đồng và các ã vitamin… Đặc biệt với nito, khi trong môi trường bị thiếu hụt nguồn dinh dưỡng này, H pluvialis sẽ chuyển sang giai đoạn nang bào rất nhanh chóng, đồng thời

astaxanthin cũng được tổng hợp khá mạnh chỉ sau 2 3 ngày đói đạm (thiếu nito) (Kobayashi và cs., 1991)

-Yếu tố dinh dưỡng sắt (Fe) cũng là một trong những yếu tố quan trọng trong

sự sinh trưởng của H pluvialis Tuy nhiên, ảnh hưởng của FeP

3+

P

dưới dạng EDTA

cao hơn so với FeP

-EDTA là 18µmol/L của thì mật

độ tế bào sinh dưỡng tăng một cách nhanh chóng, và có thể đạt tối đa là 2,9x10P

5

P

tế bào/mL Trong khi đó ở cùng một nồng độ cao như vậy của FeP

2+

P

-EDTA thì mật độ tối đa lại chỉ đạt được là 0,25x10P

liên tục còn làm tăng quá trình tích lũy astaxanthin với hàm lượng cao nhất đạt được

có thể lên tới 77,2 mg/g sinh khối (Kang và cs., 2005) Nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ C/N lên sinh trưởng và khả năng tích lũy astaxanthin đã cho thấy, ở các tỉ

lệ C/N là 1,4; 2,8; 5,6 và 11,2 thì giá trị C/N càng cao thì khả năng tích lũy astaxanthin càng diễn ra nhanh chóng và cho năng xuất cao hơn (Usha TripathL và cs., 2002)

Từ những lợi ích mà astaxanthin mang lại, con người đã không ngừng tìm tòi các nguồn tự nhiên có khả năng tổng hợp lên nó H pluvialis được đánh giá là loài

có tiềm năng nhất để khai thác loại sắc tố này H pluvialis là loài có chu trình sống cũng như nhu cầu dinh dưỡng hết sức phức tạp, muốn thương mại hóa sản phẩm từ

nó thì ta phải có sự nghiên cứu sâu để có thể nắm bắt được các đặc điểm sinh trưởng cũng như các yếu tố môi trường ảnh hưởng để từ đó có thể điều khiển đượ sinh trưởng và phát triển của tảo nhằm tối ưu hóa quá trình tổng hợp astaxanthin

Hiện nay trên thế giới cũng đã có nhiều công bố chuyên sâu về loài tảo này Các nghiên cứu về quy trình nuôi trồng từ các cấp độ nhỏ trong phòng thí nghiệm, pilot đến các bể và hồ nuôi ngoài trời với quy mô hàng nghìn lít, các hệ thống ống nuôi kín sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời Đặc biệt đã có nhiều công ty ứng dụng thành công công nghệ nuôi trồng loài tảo này như: tập đoàn Cyanotech (Hawaii, Mỹ) (Lorenz và cs., 2000) đã nuôi H pluvialis trong các hồ h vở ới thể tích

lên tới 500 000 lít và hàm lượng astaxanthin đạt được 1,5 3,0% sinh kh– ố Ởi Israel, công ty Algae technology là một công ty hàng đầu v nuôi tr ng H pluvialis với ề ồcác hệ ố th ng b ph n ng quang sinh (photobioreactor) s dể ả ứ ử ụng năng lượng ánh sáng m t tr i cho nuôi tr ng tặ ờ ồ ả ởo c ả hai giai đoạn tảo có màu xanh và đỏ (nuôi

trồng 2 pha) Hàm lượng astaxanthin của H pluvialis được nuôi trồng trong các hệ

thống nêu trên có hàm lượng đạt đến 4% trọng lượng khô (http://www.algatech.com/astax.htm) Ở Ấn Độ, nuôi trồng H pluvialis cũng đã

được công ty Parry Nutraceuticals phát tri n ể m nh ạ(http://www.parrynutraceuticals.com/products/astaxanthin.aspx) Tại Úc, công ty Global Natural Medicine Pty Ltd đã sản xuất astaxanthin từ H pluvialis để làm

thức ăn cho cá hồi, mở ra cơ hội to l n cho vi c phát tri n ngành nuôi trồng cá hồi ớ ệ ể(http://www.globalnaturalmedicine.com/astaxanthin) Trung Quốc là một quốc gia

có ngành nuôi trồng tảo khá phát triển, một số công ty như Wefirst Biotechnology

Co, Ltd., Kunming Biogenic Co., Ltd., Yunnan Green A Biological Project Co., Ltd., cũng đang tiến hành nuôi trồng H pluvialis ở quy mô r t l n ấ ớ(http://astawefirst.food188.com), (http://www.ec21.com/kc-haematococcus-pluvialis) ỞHàn Quốc có Công ty BOBO Corp cũng nuôi trồng rất thành công loài

VT lục nêu trên (http://www.ec21.com/kc-haematococcus-pluvialis)

VT

Ở Việt Nam, lục H pluvialis là một đối tượng hoàn toàn mới Các

nghiên cứu trên đối tượng này mới chỉ ở bước đầu với những quy mô nhỏ trong phòng thí nghiệm tại phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam H pluvialis có tốc độ sinh trưởng chậm và vòng đời phức tạp nên việc nuôi trồng chúng trên các quy mô khác nhau để đạt năng suất cao

là rất khó khăn Do đó, muốn triển khai được trên quy mô lớn để thu được sinh khối tảo giàu astxanthin đòi hỏi cần phải có những nghiên cứu cơ bản nhằm hiểu được các đặc điểm sinh học cũng như các đặc điểm chính trong vòng đời của loài tảo này

4 Một số mô hình nuôi trồng H pluvialis trên thế giới

Dựa trên các kết quả nghiên cứu thu được về đặc điểm sinh học và chu trình sống của H pluvialis, các nhà công nghệ đã không ngừng cải tiến thiết kế những hệ thống nuôi phù hợp nhằm đưa ra được các điều kiện tối ưu hóa cho quá trình sinh trưởng cũng như hình thành astaxanthin Các hệ thống nuôi cấy chủ yếu dựa vào quá trình sinh trưởng hai pha của H pluvialis Ở pha sinh trưởng, yêu cầu các yếu tố môi trường phải đảm bảo cho tế bào luôn ở trạng thái sinh dưỡng và tăng sinh khối tối đa Còn ở pha tích lũy astaxanthin, một trong các yếu tố môi trường nuôi cấy trở thành yếu tố giới hạn chính và dẫn tới cảm ứng quá trình sinh tổng hợp astaxanthin được tăng lên rất nhiều lần so với ở pha nuôi cấy ban đầu

Ở quy mô nhỏ, phòng thí nghiệm, người ta đã chế tạo các hệ thống ống nuôi kín có chiếu sáng nhân tạo, hệ thống sục khí và đảo trộn khí nhằm tối ưu hóa khả năng tiếp xúc giữa tế bào với môi trường Ví dụ như hệ thống photobioreactor nuôi cấy dạng 2 lớp cho do tác giả In Soo Suh và cộng sự (2006) đưa ra (hình 5)

Hình 5 Hệ thống bioreactor dạng 2 lớp có sục khí và chiếu sáng a: ảnh chụp bềngoài; b: Cấu tạo; c: Cấu tạo nhìn từ đỉnh của hệ thống 1 Vỏ: trong, 2: áo ngoài, Vỏ3: Đèn; i: Cổng truyền chủng, ii: ổng lấy mẫu, iii: Cổng tiếp môi trường, iv: Cổng C

thoát khí, v: Cổng đường khí vào (In Soo Suh và cs., 2006)

Hệ thống nuôi cấy được chỉ ra trên hình 5 đã cho thấy đây là một hệ thống bảo đảm tối ưu nhất cho nuôi trồng 2 pha loài tảo nêu trên nhằm mục đích tạo astaxanthin với hàm lượng cao nhất Cường độ ánh sáng tối ưu cho tích lũy astaxanthin là 770±20 µEmP

Hình 6 là hình ảnh minh họa cho thấy hệ thống nuôi H pluvialis trên quy mô

lớn của tập đoàn Cyanotech (Mỹ) Đây là hệ thống hồ nuôi hở với quy mô rộng lớn

Hình 6. Hệ thống hồ nuôi H pluvialis 500 nghìn lít của tập đoàn

Cyanotech (Mỹ) (Lorenz và cs., 2000)