Bởi vậy, song song vớinghiên cứu tìm các liệu pháp điều trị ung th− mới, các nhà khoa học còn tậptrung nghiên cứu ra các ph−ơng pháp chẩn đoán ung th− có hiệu quả cao hơn.Một trong các p
nghiên cứu lý thuyếtError! Bookmark not defined
Sơ l − ợc các Ph − ơng pháp chẩn đoán ung th − cận lâm sàng
Để phát hiện và chẩn đoán bệnh ung thư, bác sĩ thường kết hợp thăm khám lâm sàng và cận lâm sàng Các phương pháp cận lâm sàng cho phép chẩn đoán ung thư ở giai đoạn sớm hơn so với thăm khám lâm sàng Hiện nay, y học đã phát triển nhiều kỹ thuật thăm khám hiện đại với độ chính xác cao, trong đó có một số kỹ thuật phổ biến đã được ứng dụng trong chẩn đoán ung thư.
1.1.1.Ph−ơng pháp chẩn đoán hình ảnh [1]
Chụp X-quang, được phát hiện vào năm 1895, hiện nay là công cụ quan trọng trong chẩn đoán ung thư Phương pháp chụp X-quang kết hợp với các chất cản quang thường được chỉ định cho bệnh nhân có triệu chứng ung thư phổi hoặc ung thư dạ dày, mang lại kết quả tốt Tuy nhiên, chụp X-quang thông thường gặp khó khăn trong việc phát hiện các khối u nhỏ, dẫn đến việc không thể chẩn đoán chính xác các loại u, với tỷ lệ âm tính và dương tính giả khá cao.
Chẩn đoán nội soi là phương pháp thăm khám các hốc tự nhiên và một số cơ quan nội tại của cơ thể bằng thiết bị quang học, không cần phẫu thuật Qua camera, các cơ quan nội tạng được quan sát trực tiếp, giúp phát hiện những bất thường Hiện nay, kỹ thuật nội soi còn cho phép thực hiện các thủ thuật như sinh thiết, cắt, phá hủy hoặc đưa thuốc trực tiếp vào các vị trí trong cơ quan nội tạng.
Chụp cộng hưởng từ (MRI) là một kỹ thuật tiên tiến, được xem là cuộc cách mạng trong chẩn đoán y tế Khác với chụp cắt lớp, MRI cho phép hình ảnh cắt dọc ở bất kỳ trục nào, giúp phân biệt mức độ tổn thương tế bào dựa trên sự tập trung của proton trong ion Hydro Kỹ thuật này hứa hẹn mở ra hướng nghiên cứu mới về sinh học khối u và giám sát hiệu quả điều trị ung thư thông qua các phương diện hóa sinh.
Chụp hình qua đồng vị phóng xạ đã trở thành một phương pháp hứa hẹn trong việc chẩn đoán sớm ung thư trong khoảng 10 năm qua Việc gắn các nguyên tử đồng vị phóng xạ vào kháng thể đơn dòng cho phép chúng tìm đến các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt tế bào ung thư Khi được tiêm vào cơ thể bệnh nhân, các kháng thể này sẽ tập trung tại vị trí khối u, giúp đo được lượng đồng vị phóng xạ bằng máy đo Gamma Nhờ đó, vị trí và hình ảnh của khối u được xác định một cách rõ ràng.
Phương pháp này cho phép chẩn đoán các khối u nhỏ và ổ di căn rất nhỏ mà các phương pháp cổ điển chưa phát hiện được Tuy nhiên, kỹ thuật này có chi phí cao và cần thời gian để phổ biến rộng rãi.
Các phương pháp phân tích hình ảnh tổ chức u chủ yếu so sánh với tổ chức bình thường, do bản chất của ung thư là sự tăng sinh bất thường của tế bào, dẫn đến sự biến đổi về hình dạng và kích thước Các tế bào ung thư có thể lớn hơn nhiều lần so với tế bào bình thường, trong khi một số tế bào khác lại rất nhỏ và mang hình dạng nguyên thủy Quan sát qua hình ảnh X-quang hoặc cộng hưởng từ cho thấy nhân tế bào thường không cân đối so với tế bào xung quanh, với tỷ lệ có thể lên tới 1/4 hoặc 1/6 so với tỷ lệ bình thường.
1.1.2 Ph−ơng pháp chẩn đoán tế bào học: năm 1943 sự phát triển của kỹ thuật chuẩn đoán ung th− cổ tử cung do Papanicolaou và Trau đã mở đầu cho chuyên khoa tế bào học Ph−ơng pháp căn cứ vào sự phân loại của các phiến đồ của tế bào như : phiến đồ bình thường, phién đồ bất thường nhưng chỉ là viêm, nghi ngờ ác tính Một biến thể của ph−ơng pháp là xét nghiệm huyết học cho phép xác định bệnh bạch cầu.
1.1.3 Ph−ơng pháp sử dụng các chất chỉ điểm ung th−
Phương pháp phát hiện ung thư dựa trên sự xuất hiện của các chất do tế bào ung thư tổng hợp, thường không thấy hoặc chỉ có với số lượng rất ít ở tế bào lành Hiện nay, đã có khoảng năm chục chất chỉ điểm sinh học của ung thư, trong đó chỉ hơn mười loại có khả năng phát hiện sớm ung thư Kháng nguyên AFP (Alpha-fetoprotein) thường tăng cao trong ung thư gan hoặc ung thư tinh hoàn, trong khi kháng nguyên VCA lại được tìm thấy nhiều trong ung thư vòm họng Bên cạnh đó, còn một số loại kháng nguyên khác xuất hiện trong ung thư xương, tuyến tiền liệt và buồng trứng.
1.1.4 Ph−ơng pháp miễn dich học [4]
Người ta có thể phát hiện và định lượng hoạt tính sinh học của protein ung thư thông qua phương pháp miễn dịch học Từ sau năm 1980, sự phát triển của công nghệ tái tổ hợp ADN đã cho phép sản xuất kháng thể đơn clon quy mô lớn, giúp nhận dạng và tách chiết các gen liên quan đến ung thư Kỹ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi, với việc sử dụng kháng thể đặc hiệu để nhận diện protein của gen ung thư.
1.1.6 Ph−ơng pháp quang phổ huỳnh quang kích thích bởi Laser
Phương pháp này thuộc về Quang động học liệu pháp (Photodynamic Therapy), được Dougherty TJ áp dụng trong chẩn đoán lâm sàng tại Mỹ vào năm 1978.
Qua nghiên cứu thực nghiệm trên mô tế bào bị kích thích bởi laser, các nhà lý sinh học đã phát hiện rằng cường độ huỳnh quang có mối liên hệ chặt chẽ với hàm lượng fluorophores trong các mô thường và mô bệnh lý trên cơ thể sống Hàm lượng fluorophores được xác định thông qua việc đánh giá các dạng đường cong huỳnh quang.
Trong đó C i và I i f là hàm lượng và dạng đường cong huỳnh quang của thành phần chất phát huỳnh quang.
Huỳnh quang đặc trưng cho các tổ chức ung thư là một chỉ tiêu quan trọng trong việc xác định tính chất ác tính của tổ chức nghi ngờ Loschenov V.B và các cộng sự tại phòng thí nghiệm BiospectroscopyLab (Viện Vật lý Tổng quát, CHLB Nga) đã phát triển một phương pháp chẩn đoán ung thư hứa hẹn, dựa trên sự khác biệt về cường độ và dạng phổ huỳnh quang giữa mô lành và mô ác tính Phương pháp này sử dụng thiết bị đo phổ huỳnh quang trên mô tế bào sống, được kích thích bởi Laser He-Ne 632nm, với phép đo không tiếp xúc để giảm thiểu hiện tượng phản xạ Ánh sáng đỏ của Laser cho phép thông tin sâu hơn về tổ chức sinh học, giúp ghi nhận tín hiệu phổ dưới dạng đường cong Đường cong này phản ánh hàm lượng fluorochrom trong tổ chức nghiên cứu, từ đó cho phép bác sĩ đánh giá hình dạng phổ và đưa ra thông tin cần thiết cho chẩn đoán bệnh.
Hình 2.1: Sơ đồ nguyên lý thu huỳnh quang của mô sinh học bị kích thích bởi chùm tia Laser
Công thức thực nghiệm có ý nghĩa chẩn đoán theo Loschenov V.B (LB
Trong đó : I fc Cường độ huỳnh quang của khối u
I fn Cường độ huỳnh quang của mô lành liền kề
D k là đại lượng chuẩn đoán thực nghiệm cho các mô, với tỷ lệ tiêm chất Fotogem đạt 2-3 lần đối với ung thư biểu mô, đặc biệt ở da, dạ dày và vòm họng Tuy nhiên, một số loại ung thư khác chưa được nghiên cứu kỹ lưỡng, do đó chưa có tỷ lệ chính xác Kết quả chuẩn đoán chỉ đáng tin cậy cho một số loại ung thư nhất định, như ung thư biểu mô tế bào đáy, nơi có nhiều tổ chức sợi collagen.
Hình 2.2: (1) Huỳnh quang của mô lành tính lân cận khối u; (2) huỳnh quang tại trung tâm khối u ung th− biểu mô sau khi tiêm Phôtgem 24h
Phương pháp chẩn đoán này rất hiệu quả trong việc phát hiện ung thư ở da và vòm họng Loschenov đã được cấp bằng sáng chế số 4955489 vào năm 1990 cho phương pháp này Tuy nhiên, công thức chỉ có ý nghĩa tương đối do cường độ huỳnh quang giữa vùng tâm và vùng rìa khối u không đồng nhất, và cường độ này giảm dần khi khoảng cách đo xa hơn từ khối u.
Ph − ơng pháp chẩn đoán đ − ợc nghiên cứu trong luận văn
Qua nghiên cứu khảo sát luận văn lựa chọn ph−ơng pháp chẩn đoán ung th− bằng Laser vì những lý do sau:
Phương pháp chẩn đoán mới này đã được nghiên cứu thành công ở nước ngoài và hứa hẹn có nhiều triển vọng trong tương lai Đây là một phần của liệu pháp điều trị ung thư bằng hiệu ứng quang động học (Photodynamic Therapy) Hiện tại, liệu pháp này đã được thử nghiệm tại Bệnh viện Việt Đức và Học viện Quân y 103, cho kết quả khả quan Một số báo cáo khoa học trong nước đã đề cập đến phương pháp này, chẳng hạn như đề tài tiền sĩ học năm 2001 của Quản Hoàng Lâm tại Học viện Quân y, nghiên cứu về tác dụng của liệu pháp quang động học trên biến đổi hình thái mô ung thư thực nghiệm SARCOM 180, và báo cáo của nhóm tác giả Dương Chạm Uyên, Kiểu Đình Hùng về việc áp dụng quang động học trong điều trị u não tại Bệnh viện Việt Đức.
Phương pháp đánh giá đường cong quang phổ từ thiết bị quang phổ kế Laser cho phép xây dựng tiêu chí chẩn đoán thông qua công thức thực nghiệm Việc này tạo điều kiện thuận lợi cho việc lập trình các thuật toán đánh giá phổ dựa trên dữ liệu thu được Nhờ đó, có thể phát triển hệ phần mềm chẩn đoán ung thư nếu xây dựng được thư viện mẫu phổ cho từng loại ung thư Phương pháp này mang lại kết quả nhanh chóng chỉ trong vài phút, vượt trội hơn so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống.
Luận văn này nhằm nâng cấp khả năng của thiết bị quang phổ kế Laser đã được sử dụng tại Bệnh viện Việt Đức, phục vụ cho việc chẩn đoán ung thư.
Đối t − ọng và phạm vi nghiên cứu trong luận văn
Luận văn này nghiên cứu chẩn đoán khối u thông qua hai xét nghiệm:
1 Khối u biểu mô tế bào đáy đ−ợc tạo ra bởi mô hình ung th− thực nghiệm Sarcom 180 trên chuột
2.Khối u biểu mô tế bào đáy sụn vành tai của một bệnh nhân
Cơ sở lý thuyết chẩn đoán ung th− bằng Laser
3.1 Sự phát huỳnh quang của mô ung th− khi bị kích thích Laser Để tăng cường độ huỳnh quang nhận được từ mô ung thư người ta sử dụng thuốc nhạy quang tiêm vào cơ thể Các photon ánh sáng Laser khi đi sâu vào trong tế bào bị suy giảm năng l−ợng nên khả năng đâm xuyên bị hạn chế. Thuốc nhạy quang có tác dụng tăng khả năng hấp thụ các photon ánh sáng của mô tế bào đồng thời phát ra huỳnh quang ở bước sóng nhất định thuỳ thuộc loại hoạt chất Sự có mặt của thuốc nhạy quang càng nhiều ở mô nào thì cường độ phát huỳnh quang càng mạnh Từ đó ta có thể nhận được thông tin cần thiết một cách dễ dàng.
3.1.1 Huỳnh quang của thuốc nhạy quang Photofrinđđđđđ
Sự phát huỳnh quang xảy ra khi các phân tử hấp thụ photon ánh sáng với bước sóng phù hợp, chẳng hạn như hợp chất Porphyrin hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 630nm Khi bị kích thích, các phân tử chuyển từ mức năng lượng thấp lên mức cao hơn, và sau đó trở về mức năng lượng ban đầu S₀ Mức năng lượng kích thích quan trọng của chất nhạy quang là mức Singlet Quá trình chuyển từ mức Singlet về mức cơ bản thường đi kèm với việc phát xạ ánh sáng có bước sóng dài hơn so với bước sóng kích thích, tạo ra hiện tượng phát xạ huỳnh quang.
Chất nhạy quang là các hợp chất màu sinh học có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh, trong đó Photofrin và Photogem, sản phẩm của Học Viện Công nghệ Hóa tinh vi Lomonosov Mv, được Bộ tế CHLB Nga phê duyệt cho ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư từ năm 1990 Thành phần chính của Photogem là hỗn hợp 90% hematorporphrin (HpD) hoặc dihematoporphyrin ether (DHE), bao gồm 8 loại porphyrin khác nhau, với các thành phần như porphyrin monomer và polyme của hematorphyrin, đóng vai trò quan trọng trong việc kết hợp với các tổ chức ung thư thông qua các phản ứng quang hóa.
Photofrin có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng từ 632,8 đến 630 nm và phát xạ huỳnh quang trong khoảng 650 đến 690 nm Nhờ vào đặc tính này, Photofrin rất phù hợp cho nghiên cứu chẩn đoán quang phổ sử dụng Laser làm nguồn kích thích.
Phổ huỳnh quang của Photofrin được thể hiện trong Hình 3.2, với đỉnh λ c2,8nm là do Laser kích thích Đỉnh phổ lý tưởng của Photofrin có dạng hình chuông với λ = 680nm Tuy nhiên, thực tế cho thấy λ = 650nm-700nm là của Photofrin, với đỉnh huỳnh quang hơi dịch về λ = 660nm do hiệu ứng Doppler làm dãn rộng vạch phổ.
Hình 3.2 cho biết phổ huỳnh quang của Photofrin,
3 1.2.Cơ chế hấp thụ thuốc nhạy quang của mô tế bào
Nghiên cứu về cơ chế hấp thụ chất nhạy quang tại mô tế bào cho thấy monomer của hematoporphirin (HpD) và trerasulphonated porphyrin được vận chuyển trong máu nhờ vào việc gắn kết với albumin và globulin Dimer và oligomer của HpD thường liên kết với lipid của lipoprotein huyết tương thấp (LDL), dễ dàng tích tụ tại tế bào ung thư do sự hiện diện của LDL trong tổ chức u và xu hướng tự kết hợp Đặc biệt, tại các khối u biểu mô có mật độ xơ dày đặc, chất nhạy quang gắn nhiều với mô sợi Nguyên nhân tích tụ chất nhạy quang liên quan đến sự tăng sinh tế bào ác tính, dẫn đến nhu cầu máu cao hơn và sự gia tăng tổ chức mạch máu Mức độ tích tụ của HpD, chiếm 90% trong Photofrin, còn liên quan đến nồng độ pH thấp trong tổ chức ung thư Lipoprotein cần thu thập cholesterol, và mật độ lớn của chúng quyết định sự tích tụ chọn lọc của chất nhạy quang nhờ vào tính kỵ nước của oligomer HpD gắn nhanh với LDL Ngoài ra, mô lành thường có nồng độ pH kiềm và oxy cao hơn, khiến phản ứng quang hoá diễn ra nhanh hơn so với khối u, dẫn đến quá trình đào thải thuốc nhạy quang cũng nhanh hơn.
Cơ chế quang động học (Photodynamic): là quá trình kết hợp của chất nhạy quang kết hợp với ánh sáng mạnh tạo ra các phản ứng quang hoá.
Thuốc nhạy quang hấp thụ photon ánh sáng, kích thích chuyển từ trạng thái năng lượng cơ bản lên mức cao hơn, đặc biệt là mức Singlet với thời gian tồn tại 10^-8 giây Khi chuyển từ trạng thái Singlet về mức cơ bản qua mức Triplet có năng lượng thấp hơn, thuốc nhạy quang tham gia vào phản ứng quang hóa Hai loại phản ứng quang hóa có thể xảy ra đồng thời, trong đó phản ứng truyền năng lượng cho phân tử oxy (O2) là quan trọng nhất, tạo ra ôxy singlet (1O2) tồn tại trong các mô sinh học từ 10^-6 đến 10^-4 giây Trong chuỗi phản ứng, PS đại diện cho thuốc nhạy quang, hν là lượng tử ánh sáng, 1PS* là trạng thái singlet, và 3R* là trạng thái triplet.
Hấp thụ và kích thích : PS + hν → 1 PS * → 3 PS *
Phản ứng tạo ra ôxy siglet: 3 R* + O 2 →PS + 1 O 2
Phản ứng phát huỳnh quang: 1 PS * →PS +hν
Sơ đồ phản ứng trên cho thấy quá trình hấp thụ ánh sáng tạo ra hai phản ứng phụ tiếp theo là tạo ra sự phát huỳnh quang.
Hinh 3.3.Sơ đồ chuyển mức năng l−ợng của thuốc nhạy quang
3 1.3.Thời gian bán huỷ chất nhạy quang
Cơ chế dược động học là quá trình đào thải thuốc sau khi được đưa vào cơ thể thông qua hệ tuần hoàn Các chất nhạy quang được phân bố tại các tế bào và mô trước khi được đào thải ra ngoài dưới dạng nguyên thủy hoặc dạng chuyển hóa Nghiên cứu về phân bố chất nhạy quang tại mô đã chỉ ra rằng mức độ đào thải của chúng ở tổ chức bình thường và tổ chức u rất khác nhau Đặc biệt, đối với Photofrin, chu kỳ bán huỷ của chất này theo hai đường cong hàm số mũ là 192 giờ.
Hinh 3.4 Đồ thị thay đổi của Photofrin trong té bào lành(2) và khối u (1) khi tiêm 10mg/kg vào cơ thể ng−ời
Thời gian sau khi tiêm (h)
Quan sát từ đồ thị hình 3.4 cho thấy chỉ còn dưới 10% Photofrin tồn tại trong tế bào lành, trong khi nồng độ Photofrin trong tổ chức khối u dao động từ 3% đến 40% Sự khác biệt rõ rệt về tỷ lệ chất nhạy quang giữa mô lành và khối u diễn ra trong khoảng thời gian 24h – 96h sau khi đưa vào cơ thể, với cực đại tích tụ của Photofrin xảy ra trong khoảng 24h-48h Thời điểm này là thời điểm thích hợp nhất để đo và ghi lại huỳnh quang Tỷ lệ chất nhạy quang tích tụ ở mô lành so với khối u cho phép đánh giá tính chất dị thường của tế bào, với tỷ lệ có thể dao động từ 1:2 đến 1:20 tùy thuộc vào loại chất nhạy quang và đặc điểm mô tế bào Đối với da người, tỷ lệ này là 1/2 (mô lành/khối u), trong khi với Colo 26 trên chuột là 1:10 Thời gian kích thích tối ưu được xác định là trong khoảng 24-96 giờ sau khi chất nhạy quang được đưa vào cơ thể; nếu muộn hơn, quá trình đào thải chất nhạy quang sẽ bắt đầu, làm giảm độ chính xác của kết quả phân tích.
Kết luận, chúng ta đã phân tích cơ sở lý thuyết của phương pháp chẩn đoán ung thư thông qua quang phổ huỳnh quang của khối u khi được kích thích bằng Laser ánh sáng đỏ Quan trọng là tế bào không tự phát ra huỳnh quang hoặc chỉ phát ra rất ít khi gặp ánh sáng phù hợp Quang phổ huỳnh quang trong phương pháp này chủ yếu đến từ chất nhạy quang Photofrin (Photogem) có trong khối u Hơn nữa, sự tán xạ trên bề mặt đối tượng của Laser không đóng vai trò trong chẩn đoán vì không phản ánh bản chất sinh học của đối tượng nghiên cứu.
Thực hành
Xây dựng Algorithm chẩn đoán
Để chẩn đoán ung thư bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang, cần sử dụng thiết bị quang phổ Laser với cấu hình đặc biệt Tuy nhiên, thiết bị này chỉ có khả năng đo và thu tín hiệu quang phổ, do đó cần phát triển một thuật toán để xử lý dữ liệu thu được Trong phần này, chúng ta sẽ xem xét các yếu tố liên quan đến việc xây dựng thuật toán này.
Algorithm do luận văn này đề xuất.
4.1.1 Việc tiền xử lý tín hiệu phổ
Hệ thống quang phổ, dù hiện đại, vẫn chịu ảnh hưởng lớn từ nhiễu, trong đó nhiễu do quang sai của hệ thống quang học là một nguồn gây nhiễu mạnh mẽ.
Hiệu ứng chiếu sáng phụ là hiện tượng nhoè ảnh do các tia phản xạ từ bộ phận gá gương, đầu ốc vít, và tia huỳnh quang phát ra từ các bề mặt anốt hoá trong buồng tối.
Hiệu ứng chồng phổ xảy ra khi mật độ khắc vạch thấp và những sai lệch nhỏ trong vị trí gá lắp làm cho bề mặt cách tử không còn ở vị trí ban đầu Điều này dẫn đến việc các bước sóng λ i và λ i ± δλ chồng lên nhau theo cùng phương β, tạo ra hai bước sóng cùng pha trên một phần tử của đầu thu, với biên độ tổng hợp Hiện tượng này thường xuyên xuất hiện do sự giảm chất lượng của hệ quang học, gây ra sự thăng giáng khó kiểm soát và xác định quy luật của đường cong phổ.
Hiệu ứng bóng ma xảy ra khi những sai lệch nhỏ về khoảng cách d giữa các cách tử hoặc bụi bẩn có thể tạo ra những bước sóng giả do hiện tượng giao thoa.
Những cực đại không mong muốn ấy xuất hiện với một góc tới cho trước α và ra khỏi cách tử theo những ph−ơng giả gọi là vạch “ma”
Hiện tượng nhiễu xạ lạc thường xảy ra do hệ quang giảm chất lượng, như bẩn và mốc, dẫn đến sai số trong thiết bị Những yếu tố này tạo ra nguồn nhiễu tổng hợp, gây khó khăn cho quá trình đánh giá phổ.
Tiền xử lý tín hiệu là bước quan trọng để tạo ra tín hiệu sạch trước khi tiến hành phân tích và đánh giá Quá trình này bao gồm việc lọc bỏ nhiễu bằng các bộ lọc và nâng cao chất lượng tín hiệu thông qua chỉ tiêu tỉ số tín hiệu/nhiễu bằng các phương pháp trung bình cộng tín hiệu.
Chất lượng tín hiệu được xác định bởi tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (SNR), phản ánh mối quan hệ giữa biên độ thực của tín hiệu và độ lệch chuẩn của tín hiệu bị nhiễu SNR càng cao, chất lượng tín hiệu càng tốt, cho thấy tín hiệu rõ ràng hơn so với nhiễu.
Để cải thiện tỷ số tín hiệu/nhiễu (SNR), việc lặp lại phép đo nhiều lần và lấy trung bình tín hiệu là rất quan trọng Trong các phép đo quang phổ, đặc biệt chú trọng đến dạng tín hiệu và vị trí đỉnh phổ ở bước sóng nào, vì tỷ số SNR cao giúp dễ dàng xác định các đặc điểm của phổ như vị trí đỉnh và mức độ dãn nở Điều này không chỉ làm cho việc đo đạc trở nên chính xác hơn mà còn đơn giản hóa việc lập trình phép đo trên máy tính Hơn nữa, với việc sử dụng cảm biến ma trận kiểu CCD, dữ liệu thu được thực chất là ảnh quang phổ Do đó, phương pháp cải thiện tỷ số SNR trong nghiên cứu này là áp dụng thuật toán trung bình cộng tín hiệu Savitzky-Golay, một phương pháp hiệu quả thường được sử dụng trong các phép đo quang phổ.
Tính diện tích phần bao bởi đ−ờng (S1)
Làm trơn đồ thị phổ d2
Tính diện tích phần bao bởi đ−ờng (S2)
Tính tỷ lệ D k = Peak2/Peak1
Tính tỷ lệ D s = S2/S1 Đ−a ra kết luận chuẩn đoán
Hình 4.1 : Sơ đồ Algorithm chẩn đoán d2; đường đồ thị phổ của tế bào nghi ung thư d1: đ−ờng dồ thị phổ của tế bào binh th ờng−
S2: diên tích hinh bao bởi d2
S1 diện tích bao hình bởi d1
Peak1 : đỉnh phổ của d1 tại 680nm
Peak2: đinh phổ cuả d2 tại 680nm d2 d1
Hình 4.2 : Ví dụ về đồ thị phổ cần đánh giá
Các thuật toán sử dụng để đánh giá phổ
4.2.1 Thuật toán làm trơn đ−ờng cong phổ
4.2.1.1 Sự trung bình cộng các điểm lân cận
Trong bài viết này, chúng ta xem xét một đường tín hiệu quang phổ f(λ) được biểu diễn dưới dạng hàm tổng quát f(λ) = s(λ) + η(λ), trong đó s(λ) là tín hiệu thực cần đo và η(λ) là nhiễu ngẫu nhiên Sau khi thực hiện phép đo, chúng ta thu được một tập hợp dữ liệu f(λi, yj) tương ứng với N điểm trên đồ thị tọa độ, được coi là số liệu thô chưa qua xử lý Để làm sạch dữ liệu, chúng ta chọn một điểm Pj(λi, yj) bất kỳ trên đồ thị và xác định các điểm lân cận trái và phải với số lượng n Giá trị y_i của điểm Pj sẽ được thay thế bằng giá trị g_i, là trung bình cộng của y_i với các điểm lân cận Thủ tục này được lặp lại cho tất cả các giá trị i từ 0 đến N, dẫn đến việc thu được công thức làm trơn đường đồ thị phổ.
Cửa sổ trung bình được định nghĩa là khoảng giá trị chứa m điểm trên trục hoành (Xem Hình 4.3) Nếu n là số điểm lân cận bên trái và bên phải của điểm giữa i, thì tổng m = 2n + 1 xác định độ dài của cửa sổ làm trơn, với trọng số C n = 1 / (2n + 1).
Việc tính toán trung bình cộng có trọng số C n chỉ chính xác khi các điểm trên đường đồ thị có mối quan hệ tuyến tính.
Hình 4.3 minh họa phương pháp trung bình với cửa sổ trung bình m=3 và Cn=1/3, cho thấy sự thăng giáng của đường cong thô trở nên mềm mại hơn sau khi áp dụng kỹ thuật làm trơn.
4.2.1.2 Ph−ơng pháp Savizky- Golay a/Néi dung
Các kết quả đo thực nghiệm thường có mối quan hệ phi tuyến, vì vậy mục tiêu của Savitzky là xác định hệ số C n nào đó để phản ánh chính xác tính chất này.
Phương pháp Savitzky-Golay là kỹ thuật làm trơn dữ liệu nhiễu phổ biến trong quang phổ học Đây là một cải tiến của thuật toán đã được đề cập trong phần 4.2.1.1, giúp cải thiện độ chính xác của các phép đo Phương pháp này thường được áp dụng để phân tích và xử lý dữ liệu quang phổ một cách hiệu quả.
Giá trị tinh Giá trị thô
Hình 4.3 Minh hoạ về ph−ơng pháp làm trơn đ−ờng cong với m=3, C n =1/3
Cửa sổ trung bình nhằm sấp xỉ một đa thức mô tả tín hiệu mong muốn với số liệu thực lọt trong một cửa sổ trung bình.
Xét một điểm i trên đồ thị, ta chọn n điểm lân cận trái và phải, với độ dài cửa sổ trung bình là m = 2n + 1 Tồn tại một đường cong bậc M đi qua các điểm trong cửa sổ trung bình Để xác định hệ số của đường cong này, ta sử dụng phương pháp bình phương cực tiểu để xấp xỉ đa thức bậc M với tập giá trị f trong cửa sổ Đường cong có dạng đa thức bậc M, được biểu diễn bởi công thức yi = a0 + a1i + a2i^2 + + aMi^M.
Suy ra dạng biểu thức tổng quát là:
(4-4) Để −ớc l−ợng hệ số a k , ta sử dụng ph−ơng pháp bình ph−ơng cực tiểu Ký hiệu
Q (a) là hàm mục tiêu, điều kiện bình ph−ơng cực tiểu t−ơng đ−ơng với min Q(a) 2
M k k k i a i f = 0 (4-5) hàm mục tiêu viết d−ới dạng ma trận
Trong đó: A: ma trận lũy thừa có dạng A i k = i k với k = 0 M; i = -nl +nr
M bậc của đa thức; nl = nr =n và m=2n+1 độ rộng cửa sổ trung bình
(4-7) lấy đạo hàm theo và cho bằng 0 ta thu đa −ợc f A a A
Ta lại có công thức tính ma trận
= nr i nl i nr i nl i i j j ji
{ (4-12) thay thế vecto f bởi vecto đơn vị e n -nl ≤ n ≤ nr và từ (3-9) công thức vecto hệ số a n của đa thức bậc M đi qua các điểm trong cửa sổ sẽ là
Vì a n cũng t−ơng ứng C n tại điểm nên nếu di chuyển cửa sổ theo trục hoành của đồ thị ta thu đ ợc công thức tính−
* (4-14) trong đó C ma trận hệ số Savitzky tính đ ợc từ công thức (4-13)−
Để tính tổng số điểm của đồ thị f i, ta sử dụng tập các giá trị đầu vào được lấy từ bảng số liệu g i, trong đó giá trị đầu ra là kết quả sau khi áp dụng phương pháp làm trơn Quy trình thực hiện được mô tả bởi thuật toán cụ thể.
Thuật toán làm trơn nhiễu được trình bày trong Hình 4.4, trong đó m đại diện cho chiều dài cửa sổ trung bình, M là bậc của đa thức trong cửa sổ, và f là tập hợp các giá trị đầu vào cũng như các giá trị đầu ra.
Cho đầu vào f Chọn giá trị đặt m
Hình 4.4: Sơ đồ Algorithm thực hiện
Tính diện tích hình bao bởi đ ờng cong phổ −
4.3.1 Ph−ơng pháp Monter Carlo Để tính phần diện tích bên dưới đường cong trên đồ thị như hình vẽ, ta có công thức tính diện tích tổng quát :
Trong đó F(x,y) : phương trình đường cong a,b : khoảng lấy tích phân
Hiện nay, có nhiều phương pháp để tính diện tích, bao gồm phương pháp hình thang và tính diện tích theo tích phân Monte Carlo Trong luận văn này, chúng tôi chọn phương pháp tính diện tích bao bởi đường cong f(x) thông qua tích phân Monte Carlo Phương pháp này dựa trên phép thử nghiệm thống kê để mô hình hóa toán học các đại lượng ngẫu nhiên Một trong những ưu điểm nổi bật của phương pháp là khả năng tính diện tích của bất kỳ hình dạng nào mà không cần biết hàm số mô tả nó Nội dung cụ thể của phương pháp sẽ được trình bày chi tiết trong bài viết.
Hình 4.4: Minh hoạ ph−ơng pháp tính tich phân Monter Carlo
Giả sử ta xét phần diện tích S 1 trong một hình vuông có diện tích S Nếu gọi
M là số lượng phép thử ngẫu nhiên, hay số điểm rơi vào diện tích S, trong khi N là tổng số điểm rơi ngẫu nhiên vào diện tích S Tỷ lệ xác suất để một điểm rơi vào diện tích S1 được tính dựa trên số lượng điểm rơi vào S.
Suy ra tích phân của S = ∫ b f x dx = N M S
Khi số điểm N tăng lên, độ chính xác I cũng sẽ cao hơn Tích phân S 1 cho phép chúng ta tạo ra các giá trị ngẫu nhiên trong khoảng [a, b] và đếm số giá trị nằm dưới đường cong f(x) để xác định số điểm N Chúng ta có thể xây dựng một thuật toán để thực hiện việc này đối với đường f(x).
Xác định hình vuông có diện tích S = b x b sao cho b ≥ max f(x).
1 Chọn các giá trị ngẫu nhiên x (trục tung) và y (trục hoành) theo phân bố đều Có nghĩa là chia nhỏ hình vuông thành các ô vuông có kích thước k.
Ta đ−ợc có M hình vuông hay M phép thử
2 Đếm số ô vuông N nằm d−ới đ ờng bao f (x).−
4.3.2 áp dụng Algorithm với đ−ờng cong phổ của luận văn
Từ Algorithm tổng quát trên ta xây dựng thuật toán tính diện tích đ−ờng cong nh− sau:
1 Đặt toàn bộ đ−ờng cong phổ trong một hình vuông có diện tích S = b x b với bằng số điểm nằm trên trục b−ớc sóng = 2048 giá trị.
2 Chia nhỏ hình vuông nói trên thành M ô vuông với kích thước k = 2 đơn vị Tổng số sẽ có M = 1024 x 1024 ô vuông t−ơng ứng với số phép thử làM= 1024 x1024 = 1048576 phép thử
3 Đếm số l−ợng ô vuông (N) nằm d−ới đ−ờng f (λ) Giá trị f(λ) có đ−ợc từ bảng số liệu đo.
Ch − ơng 5 chẩn đoán ung th− dựa trên số liệu thực nghiệm
Phần thực nghiệm được thực hiện nhằm áp dụng thuật toán đánh giá phổ huỳnh quang nh− đã trình bày trong Ch−ơng 4, dựa trên số liệu thu thập từ mô hình ung thư SARCOM 180, do Bộ môn Phôi - Học viện Quân y cung cấp.
103 cung cấp Sơ đồ thực hiện gồm các bước sau đây §−a ra kÕt luËn chuÈn đoán căn cứ tiêu chuẩn phân loại
Làm trơn đường đồ thị phổ
Thực nghiệm
Số liệu quang phổ trong phần thực nghiệm được thu thập vào tháng 5/2005 tại Trung tâm Công nghệ Laser thuộc Viện UDCN, Bộ KHCN Nghiên cứu invivo sử dụng dòng tế bào sarcom180 gây u trên chuột BALB/C, với liều Photogem là 10mg/kg được tiêm Sau 24 giờ, tiến hành đo phổ huỳnh quang tại tổ chức u và mô lành Hệ thiết bị bao gồm nguồn phát Laser He-Ne bước sóng 632,8 nm, công suất 25mW, cùng với sợi quang dẫn sáng SMA-905, có dải bước sóng từ 600nm-800nm và cường độ phổ tương đối từ 0-1000 (a.u).
Số liệu quang phổ đ−ợc phần mềm LASE 6 ghi lại d−ới dạng File số liệu d−ới dạng bảng số liệu tương ứng với bước sóng và cường độ phổ.
Hình 5-2: Sơ đồ nguyên lý hệ ghi nhận quang phô huỳnh quang
Trong quá trình đo, chùm sáng Laser He-Ne được chiếu lên bề mặt tổ chức đã được tiêm chất nhạy quang, tạo ra ánh sáng phát huỳnh quang Ánh sáng này được dẫn qua sợi quang học tới hệ quang học, nơi các kính lọc thông giải phổ hẹp được sử dụng để loại bỏ bước sóng không mong muốn, chỉ cho phép ánh sáng trong khoảng λ: 400 -> 780 nm đi qua Kính lọc suy giảm λ = 632,8nm giúp giảm cường độ Laser tán xạ từ mô Ánh sáng sau khi phản xạ qua gương sẽ tới bộ chia sóng, phân tách ánh sáng thành các bước sóng hẹp từ 400nm đến 780nm với độ phân giải quang học là 2nm Tại mặt phẳng cảm biến thu, ảnh tán sắc chứa thông tin về đối tượng nghiên cứu được ghi nhận bởi ma trận CCD 2048 phần tử, tương ứng với 2048 kênh đo Tín hiệu từ mỗi kênh được đọc và chuyển đổi thành số liệu qua bộ ADC, với tốc độ biến đổi từ 333ksps đến 500ksps Phần mềm Lesa Ver6 sẽ xử lý và hiển thị dạng phổ, đồng thời lưu trữ thông tin dưới dạng bảng số liệu trên máy tính.
Khi tiến hành đo, cần chú ý đặt sợi quang thu cách xa bề mặt khối u từ 2-3cm và nghiêng một góc nhỏ để đảm bảo độ chính xác Tuy nhiên, việc này có thể khó khăn đối với những người chưa có kinh nghiệm Hơn nữa, bụi bẩn trong hệ thu quang học có thể làm giảm chất lượng ảnh tán xạ trên cảm biến CCD, dẫn đến việc ảnh phổ bị nhiễu.
4.2) Vì vậy để thực hiện đánh giá phổ cần phải thực hiện bước tiền xử lý số liệu trước khi đánh giá phổ.
Hình 5-2b: Hình ảnh chuột mang khối u ung th− thẻ biểu mô sarcom
Cho xác suất P tìm h t khoảng đáng tin ∆ ’ 12 =h st σ * x
Hình 5.3 Sơ đồ Algorithm gia công kết quả đo
5.2.2.Kết quả thực nghiệm Để nâng cao độ chính xác của kết quả ta lấy mẫu nhiều lần sau 10 lần đo ta thu đ−ợc N = 10 mẫu tín hiệu quang phổ Thực hiện gia công kết quả đo theo Algorithm trong Hình 5.3 và nếu chọn xác xuất P = 0,99, hệ số phân bố xác suấtlấy theo bảng phân bố Student là h st =3,25 Ta thu đ−ợc kết quả nh Hình−
Hình 5.4a: Đồ thị phổ huỳnh quang mô nghi ung th − của chuột
Xử lý số liệu
5.3.2 Làm trơn đồ thị phổ
Tín hiệu phổ thường bị ảnh hưởng bởi nhiễu ngẫu nhiên, do đó, để giảm thiểu nhiễu, chúng ta áp dụng thuật toán làm mịn đường cong Savitzky-Golay, như đã
Hình 5.4b: Đồ thị phổ huỳnh quang mô bình th − ờng trên cùng đối t − ợng
Hình 5-2 trình bày sơ đồ nguyên lý của hệ ghi nhận quang phô huỳnh quang Dựa trên số liệu đầu vào với N = 2048, chúng ta tiến hành tính hệ số C_n theo thuật toán đã nêu trong Chương 4, và kết quả thu được được hiển thị trong Hình 5.5 (a, b).
Ch−ơng trình thực hiên trên Mat lab nh− sau function CT4=CT4 clf; clc; mau=importdata ('c:\matlab6\work\norm.dat');
The data is loaded from the specified file using MATLAB, and the length of the data is determined The step size for the x-axis is calculated based on the range from 660 to 700 nm, and a plot is generated to visualize the fluorescence spectrum of a normal organization The plot is displayed with specific axis limits, and the title and x-axis label are formatted with appropriate font sizes for clarity.
Figure 5.5 illustrates the signals before and after smoothing, highlighting the impact of the smoothing process The y-axis is labeled 'Relative Intensive (a.u)' with a font size of 12 The grid is enabled for better visualization, and the program waits for a button press to proceed Users can input parameters for the filter length (Num) and the order of the filter (M) in a dialog box, with default values set to 40 and 2, respectively The numerical value for the filter length is then extracted from the user input.
[nl,nr,Y]= thamsoloc(F,nn,num,M);
The article discusses the process of signal processing using the Savitzky-Golay filter, represented by the function g=SG(F,nn,nl,nr,M) It begins by plotting the original signal (F) against the wavelength (xf) within a specified axis range of 660 to 700 nm, highlighting the original signal in blue The filtered signal is then computed and plotted in red, with specific values set to zero to enhance clarity The graph is titled "Pho tin hieu sau loc Savitzky-Golay," indicating the filtered signal's representation, and includes labeled axes for wavelength and relative intensity A legend distinguishes between the original and filtered signals, alongside a note on the window length (W) The visualization concludes with a prompt for user interaction.
The plot visualizes the filtered signal using the Savitzky-Golay method, with a red line indicating the filtered output The axis is set to display values between 660 and 700 on the x-axis and 0 to 1000 on the y-axis The title of the plot is "Filtered Signal Histogram Savitzky-Golay," presented in a font size of 13 A legend is included to differentiate the filtered signal, the window length W, and the measured signal (S2) alongside the original signal (S1), emphasizing the ratio between them.
% Savitzky-Golay Flters function g=SG(F,nn,nl,nr,M)
A=zeros(nl+nr+1,M+1); for i=-nl:nl; for j=0:M;
A(i+nl+1,j+1)=i^j; end end h=zeros(M+1,1); h(1)=1; b=inv(A'*A)*h; c=zeros(nl+nr+1,1); for k=-nl:nr nm=k.^[0:M]; c(k+nl+1)=nm*b; end for i=1+nl:nn-nr, g(i) = c' * F (i-nl:i+nr); end end
Kết quả từ phần 4.2.2b cho thấy đỉnh phổ tại bước sóng 690nm được xác định với các giá trị I1 λ = 690 = 780.083 và I2 λ = 690 = 343 Để tính đại lượng chuẩn đoán Dk, chúng ta áp dụng công thức phù hợp.
D k I = 2.2743 Đối với phần diện tích nằm bên d−ới đ−ờng cong (1) và (2) Ta tính diện tích theo ph−ơng pháp Monter Calor với thuật toán nh− sau:
Từ Algorithm tổng quát trên ta xây dựng thuật toán tính diện tích đ−ờng cong nh− sau:
4 Đặt toàn bộ đ−ờng cong phổ trong một hình vuông có diện tích S = b x b với bằng số điểm nằm trên trục b−ớc sóng = 2048 giá trị.
5 Chia nhỏ hình vuông nói trên thành N ô vuông với kích thước k = 2 đơn vị. Tổng số sẽ có M = 1024 x 1024 ô vuông t−ơng ứng với số phép thử là M
6 Đếm số l−ợng ô vuông N1 nằm d−ới đ−ờng f 1 (λ) là đ−ờng mẫu Giá trị f(λ) có đ−ợc từ bảng số liệu đo.
5, Lặp lại b−ớc 3 Tính S 2 với số l−ợng ô vuông là N2
Sau khi tính toán ta thu đ−ợc tỷ lệ D s = S2/S1=2.1406
Hình 4.7: Đồ thị phổ huỳnh quang cuả mô nghi ác tính (2) và mô lành tính (1)
Nh− vậy kết quả tính đ−ợc tỷ lệ D k =Peak1(680)/Peak2(680)=2.2833
Chương trình tính diện tích S1 và S2 được viết bằng ngôn ngữ Matlab bao gồm hai hàm: hàm dientich1(mau) để tính diện tích S1 và hàm dientich2(mau) để tính diện tích S2.
Toàn bộ các kết quả trên đ−ợc thực hiện bởi đoạn ch−ơng trinh viết bằng ngôn ngữ Matlab nh− sau: function S1= dientich1(mau)
Hình 4.7: Đồ thị phổ huỳnh quang cuả mô nghi ác tính (2) và mô lành tính (1)
Toàn bộ các kết quả trên đ−ợc thực hiện bởi đoạn ch−ơng trinh viết bằng ngôn ngữ Matlab nh− sau:
So sánh kết quả tính toán ở phần trên ta có giá trị D s = 2.1406 >1.7 và
Khi so sánh cường độ quang phổ mô nghiên cứu với mô bình thường của cùng một đối tượng, ta thu được kết quả cường độ phổ lớn hơn 2 lần, với D k = 2.2833 Theo tiêu chuẩn phân loại phổ, tỷ số này cho thấy đối tượng nghiên cứu có thể đã mắc u ác tính Kết quả này hoàn toàn phù hợp với mô hình thực nghiệm SARCOM 180 và các kết quả xét nghiệm tế bào được thực hiện bởi Bộ môn phôi – Học viện quân Y 103 trong thời gian qua.
KÕt luËn
Trong chương này, tôi trình bày kết quả của việc áp dụng thuật toán chẩn đoán ung thư dựa trên dữ liệu quang phổ huỳnh quang từ tế bào trên đối tượng sống Nghiên cứu được thực hiện bằng cách cấy tế bào ung thư vào đối tượng nghiên cứu, sau đó sử dụng thiết bị quang phổ kế để ghi lại huỳnh quang của khối u và mô lành tính xung quanh Kết quả đo được xử lý để loại bỏ nhiễu và tính toán nhằm đưa ra kết luận chẩn đoán Qua việc so sánh với mô hình thực nghiệm, tôi nhận thấy rằng kết quả tính toán từ thuật toán mà tôi phát triển là đáng tin cậy.
1 Luận văn đã nghiên cứu và hoàn thành một số nội dung
Nghiên cứu tổng quan về các phương pháp chẩn đoán ung thư cho thấy rằng việc lựa chọn phương pháp chẩn đoán phù hợp là rất quan trọng Trong số các công nghệ hiện có, thiết bị đo quang phổ Laser nổi bật nhờ khả năng cung cấp kết quả chính xác và nhanh chóng trong việc phát hiện khối u ung thư Việc áp dụng công nghệ này trong thực hành chẩn đoán không chỉ nâng cao hiệu quả mà còn giúp cải thiện quá trình điều trị cho bệnh nhân.
- Nghiên cứu về ung th− và các thể khối u ung th phổi.−
Nghiên cứu phương pháp làm trơn đồ thị đường cong phổ của Savitzky-Golay, một kỹ thuật phổ biến trong phân tích và xử lý đồ thị phổ, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu hóa sinh học Phương pháp này giúp cải thiện độ chính xác và tính khả thi của dữ liệu phổ, từ đó hỗ trợ các nhà nghiên cứu trong việc rút ra những kết luận chính xác hơn từ các thí nghiệm hóa học.
- Nghiên cứu ph−ơng pháp Monter Calor tính diện tích
- Nghiên cứu đ−ợc nguyên lý thu nhận phổ huỳnh quang bằng thiết bị Laser
Về mặt thực hành: đã có một số kết quả nhất định
- Xâydựng đ−ợc Algorithm chẩn đoán ung th biểu mô thể tế bào đáy có− trong da.
- Thực nghiệm kiểm chứng Algorithm với số liệu thu đ−ợc từ thực nghiệm
So sánh kết quả rhực nghiệm với lý thuyết đạt kết quả tốt.
- Khắc phục đ−ợc hiện t ợng nhiễu thăng giáng trên đ ờng comg phổ của− − thiết bị Laser
2.Những hạn chế của đề tài
Do hạn chế về điều kiện thực hành thí nghiệm, như thiếu thuốc nhạy quang Photogem và không có khả năng thực hành trên người bệnh, luận văn này phải dựa vào các kết quả nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu tại Trung tâm Công nghệ Laser từ năm 1999.
- Số l−ợng thí nghiệm còn ít chỉ có 2 thí nghiệm nên việc đánh giá
- Việc xây dựng phần mềm đánh giá phổ mới dừng lại ở thuật toán chạy thử trên Matlab
3.H−ớng nghiên cứu trong thời gian tới
Để khắc phục những hạn chế trong nghiên cứu hiện tại, tôi sẽ tiếp tục phát triển một thuật toán nhằm xây dựng phần mềm chẩn đoán tự động Phần mềm này sẽ kết nối trực tiếp với Card đo của thiết bị quang phổ Laser, biến thiết bị thành hệ thống chẩn đoán ung thư hiệu quả.
Bệnh viện Việt Đức, phối hợp với Bộ môn Phôi Học viên Quân Y 103, đang tiến hành thử nghiệm trên nhiều mẫu bệnh phẩm để xây dựng thư viện mẫu phổ cho các loại ung thư khác nhau.
- Nghiên cứu sử dung mạng Nơron để phân loại ung th−.
Việc giải quyết bài toán chẩn đoán ung thư đòi hỏi nỗ lực, tài chính và sự hỗ trợ từ nhiều đồng nghiệp Nghiên cứu về các phương pháp chẩn đoán sớm bệnh ung thư là một cuộc đấu tranh lâu dài của con người, hứa hẹn nhiều thách thức trong quá trình thực hiện.