luận văn phân tích đa hình di truyền các gene csn1s1 và β lg của dê nản định hóa bằng kỹ thuật pcr rflp

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THANH SƠN Tên đề tài: PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN CÁC GENE CSN1S1, β-LG CỦA DÊ NẢN ĐỊNH HÓA BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2014 – 2018 THÁI NGUYÊN, NĂM 2018 h ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THANH SƠN Tên đề tài: PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN CÁC GENE CSN1S1, β-LG CỦA DÊ NẢN ĐỊNH HÓA BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2014 – 2018 Người hướng dẫn : PGS TS Dương Văn Cường TS Nguyễn Xuân Vũ THÁI NGUYÊN, NĂM 2018 h i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hồn thành khố luận tốt nghiệp, ngồi nỗ lực cố gắng thân mình, tơi nhận giúp đỡ, hướng dẫn tận tình, bảo động viên thầy cô, bạn bè gia đình suốt thời gian thực tập hồn chỉnh khố luận tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc với thầy giáo PGS TS Dương Văn Cường, TS Nguyễn Xuân Vũ thuộc Khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Đại học Nông lâm Thái Nguyên ThS Ma Thị Trang tồn thể cán cơng tác Bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên, người trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài hồn chỉnh khố luận tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo, cán viên chức Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên toàn thể thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu thực đề tài Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè ln bên cạnh, ủng hộ động viên tôi, giúp đỡ vượt qua khó khăn suốt q trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày…tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thanh Sơn h ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Bp : Base paire Kb : Kilo base DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate PCR : Polymerase chain Reaction RFLP : Reaction Fragment Length Polymorphism DNA TE : Tris – EDTA SNP : Single Nucleotide Polymorphism Taq : Thermus aquaticus EtBr : Ethidium Bromide Rpm : Revolutions Per Minute Kg : Kilogram O C : Độ Celsius kDa : Kilodalton µl : Microlit h luan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflp iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR 22 Bảng 3.2:Thành phần phản ứng PCR 23 Bảng 3.3: Thành phẩn phản ứng cắt gene CSN1S1 enzyme XmnI 24 Bảng 3.4: Thành phẩn phản ứng cắt gene β-LG enzyme SacII 24 Bảng 3.5: Vị trí cắt enzyme giới hạn 24 Bảng 3.6: Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 26 Bảng 3.7: Danh mục hóa chất sử dụng đề tài 27 Bảng 4.1: Tỷ lệ kiểu gene CSN1S1 dê Nản 30 Bảng 4.2: Tần số allele gene CSN1S1 quần thể dê khác 32 Bảng 4.3: Tỷ lệ kiểu gene β-LG dê Nản 34 Bảng 4.4: Tần số allele gene β-LG quần thể dê khác 36 h luan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflp luan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflp iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Sơ đồ mơ allele gene CSN1S1 Hình 2.2: Sơ đồ mơ kiểu gene gene CSN1S1 11 Hình 2.3: Vị trí cắt enzyme giới hạn XmnI đoạn gene CSN1S1 12 Hình 2.4: Sơ đồ mơ allele gene β-LG 14 Hình 2.5: Sơ đồ mơ kiểu gene gene β-LG 15 Hình 2.6: Vị trí cắt enzyme giới hạn SacII đoạn gene β-LG 16 Hình 3.1: Chu kì nhiệt độ phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gene β-LG 23 Hình 3.2: Chu kì nhiệt độ phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gene CSN1S1 23 Hình 4.1: Kết tách chiết DNA tổng số 10 mẫu mô tai dê Nản 28 Hình 4.2: Sản phẩm PCR khuyếch đại từ cặp mồi CSN1S1 29 Hình 4.3: Kết phân tích đa hình đoạn gene CSN1S1 enzyme XmnI 29 Hình 4.4: Tỷ lệ kiểu gene tần số allele gene CSN1S1 quần thể dê Nản 30 Hình 4.5: So sánh tần số allele gene CSN1S1 quần thể dê Nản với quần dê khác giới 32 Hình 4.6: Sản phẩm PCR khuyếch đại từ cặp mồi β-LG Hình 4.7: Kết phân tích đa hình đoạn gene β-LG enzyme SacII Hình 4.8: Tỷ lệ kiểu gene tần số allele gene β-LG quần thể dê Nản 35 Hình 4.9: So sánh tần số allele gene β-LG quần thể dê Nản với quần thể dê khác giới 36 h luan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflp luan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflp v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv MỤC LỤC v Phần 1.MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Tổng quan dê Nản 2.1.2 Tổng quan sữa 2.1.3 Gene CSN1S1 - Alpha-S1 Casein 2.1.4 Gene β-lg - Beta-lactoglobulin 12 2.2 Cơ sở khoa học đề tài 16 2.2.1 Khái niệm đa hình gene 16 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 17 2.2.3 Phương pháp điện di kiểm tra 18 2.2.4 Kỹ thuật PCR 18 2.2.5 Kỹ thuật RFLP 19 2.2.6 Kỹ thuật PCR-RFLP 19 h luan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflp luan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflp vi Phần 3.ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Đối tượng nghiên cứu 21 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 21 3.3 Nội dung nghiên cứu 21 3.4 Phương pháp nghiên cứu 21 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu 21 3.4.2 Phương pháp tách chiết DNA 22 3.4.3 Phương pháp PCR 22 3.4.4 Phương pháp cắt enzyme giới hạn 24 3.4.5 Phân tích đa hình gene 25 3.4.6 Các phương pháp xử lý số liệu 25 3.5 Dụng cụ, thiết bị hóa chất nghiên cứu 25 3.5.1 Dụng cụ nghiên cứu 25 3.5.2 Thiết bị nghiên cứu 26 3.5.3 Hóa chất nghiên cứu 27 Phần 4.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô tai dê Nản 28 4.2 Kết phân tích đa hình chiều dài đoạn gene CSN1S1 28 4.2.1 Kết PCR khuyếch đại gene CSN1S1 cặp mồi đặc hiệu 28 4.2.2 Kết phân tích đa hình đoạn gene CSN1S1 enzyme XmnI 29 4.3 Kết phân tích đa hình chiều dài gene β-LG 33 4.3.1 Kết PCR khuyếch đại gene β-LG cặp mồi đặc hiệu 33 4.3.2 Kết phân tích đa hình đoạn gene β-LG enzyme SacII 33 Phần 5.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 Kết Luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC I 42 PHỤ LỤC II 44 h luan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflp luan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflp PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Dê loài gia súc nhai lại nhỏ dưỡng từ lâu đời đem lại nhiều lợi ích thiết thực cho đời sống người Ở nhiều nước giới, dê lồi vật ni có vai trị quan trọng ngành cơng nghiệp chăn ni Dê cung cấp nhiều loại sản phẩm phục vụ đời sống người như: thịt, sữa, da, lơng, sừng, móng,… cung cấp nguồn phụ phẩm để làm phân bón phục vụ cho sản xuất nơng nghiệp Chăn ni dê Việt Nam có từ lâu chủ yếu theo phương thức quảng canh, tự cung tự cấp Theo số liệu Tổng Cục thống kê năm 2000: Tổng đàn dê nước 525.000 con, chủ yếu giống dê Cỏ (dê địa phương) nuôi lấy thịt, phân bố chủ yếu tỉnh trung du miền núi phía Bắc Trên thực tế, giống dê Cỏ có tầm vóc nhỏ màu sắc lơng da tương đối khác Bên cạnh đó, độ pha tạp nhiều nên có hiệu suất chuyển hóa thức ăn thấp, tỉ lệ suy thoái cận huyết cao, khả nuôi dưỡng dẫn đến bệnh tật phát sinh nhiều [4] Chính vậy, từ năm 1993 Nhà nước bắt đầu giao nhiệm vụ nghiên cứu phát triển chăn nuôi dê nước cho Trung tâm nghiên cứu Dê Thỏ Sơn Tây thuộc Viện Chăn Nuôi - Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thơn Cho đến giống dê Cỏ địa phương hầu hết lai tạo với giống dê cho suất sữa thịt cao giới dê sữa Ấn Độ, dê Boer chuyên thịt dê Saanen, Alpine chuyên sữa (Mỹ) để tạo giống dê cho suất sữa thịt cao trước Tuy nhiên, số giống dê Việt Nam mang đặc điểm tốt dê Nản vùng núi Định Hóa Về giá trị thương phẩm, chất lượng thịt dê Nản tốt, thơm ngon, tỷ lệ nạc cao, giá trị dinh dưỡng cao, hàm lượng Cholesterol thấp, tốt cho sức khỏe người Vấn đề số lượng dê Nản chủng giảm mạnh xuống mức đáng lo ngại, cần có biện pháp để cải thiện khả sinh trưởng, sinh sản phát triển lồi dê h luan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflp luan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflp nhằm mục đích bảo tồn phát triển quy mơ chăn nuôi để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ thị trường [4] Trên giới có nhiều nghiên cứu việc chọn lọc giống vật nuôi thị phân tử có nghiên cứu gene CSN1S1 β-LG tính tương quan mật thiết gene với mức độ sinh trưởng phát triển loài Dê lồi động vật có vú khác Cụ thể, gene CSN1S1 mã hóa protein tối quan trọng bậc loại protein sữa Gene β-LG mã hóa loại protein có nhiều sữa động vật β-lactoglobulin có liên quan tới sản lượng chất lượng sữa Để bảo tồn phát triển dê Nản Đinh Hoá, tỉnh Thái Nguyên phê duyệt thực đề tài quỹ gene cấp tỉnh: “Bảo tồn lưu giữ nguồn gene dê Cỏ (dê Nản) Định Hoá tỉnh Thái Nguyên” Trong đó, thực nghiên cứu mối tương quan đa hình di truyền với tính trạng sinh trưởng, sinh sản tiêu quan trọng việc chọn lựa cá thể tốt để làm giống Từ sở khoa học trên, tơi lựa chọn đề tài: “Phân tích đa hình di truyền gene CSN1S1 β-LG dê Nản Định Hóa kỹ thuật PCR-RFLP” 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Phân tích đa hình di truyền gene CSN1S1 β-LG dê Nản Định Hóa 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Phân tích đa hình chiều dài đoạn gene CSN1S1 dê Nản - Phân tích đa hình chiều dài đoạn gene β-LG dê Nản 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài Xác định đa hình chiều dài đoạn gene CSN1S1 β-LG Làm sở cho nghiên cứu mối tương quan gene với tính trạng sinh trưởng dê Nản 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Có ý nghĩa quan trọng công tác bảo tồn chọn giống dê chủng có nhiều tính trạng q thị phân tử h luan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflpluan.van.phan.tich.da.hinh.di.truyen.cac.gene.csn1s1.va.Ỵ².lg.cua.de.nan.dinh.hoa.bang.ky.thuat.pcr.rflp