Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ Trang 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI VŨ THỊ KIM LIÊN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KEO DÁN FIBRIN TỰ THÂN TRONG PHẪU THUẬT CẮT MỘ
TỔNG QUAN
Giải phẫu kết mạc
Kết mạc là lớp màng nhầy trong suốt, liên kết và bao phủ mặt sau của mi, bề mặt củng mạc, và tiếp nối với biểu mô giác mạc tại vùng rìa Kết mạc được chia thành ba phần: kết mạc mi, kết mạc cùng đồ và kết mạc nhãn cầu.
Kết mạc nhãn cầu là phần mỏng nhất của kết mạc, cho phép nhìn thấy củng mạc và mạch máu bên dưới Nó dính lỏng lẻo với củng mạc, ngoại trừ vùng cách rìa giác mạc 3mm và chỗ bám của cơ trực Kết mạc nhãn cầu rộng nhất ở phía trên (13-16mm), tiếp theo là phía dưới (10-12mm), phía ngoài (12mm) và hẹp nhất ở phía mũi Kết mạc vùng rìa đồng nhất với biểu mô giác mạc và hợp nhất với bao tenon và củng mạc Trong ứng dụng lâm sàng, kết mạc vùng rìa ít di động nên có thể cố định bằng forcep trong phẫu thuật, và thường lấy mảnh ghép kết mạc từ vùng phía trên ngoài do độ rộng tối ưu của nó Khi lấy mảnh ghép, việc tách từ vùng rìa giúp dễ dàng lấy vạt kết mạc mỏng mà không chứa tenon và tổ chức dưới kết mạc.
Kết mạc nhãn cầu được cấu tạo từ ba lớp chính: lớp tế bào biểu mô bên ngoài, lớp đệm dưới biểu mô và lớp sợi Biểu mô kết mạc là loại biểu mô lát tầng không sừng hóa.
Biểu mô kết mạc bao gồm ba lớp tế bào: lớp tế bào hình trụ, lớp tế bào hình đa diện và lớp tế bào hình khối vuông Ngoài ra, trong biểu mô này còn có sự hiện diện của tế bào đài, tế bào sắc tố và tế bào Langerhans Tế bào đài là loại tế bào tiết nhầy, nằm xen kẽ giữa các tế bào biểu mô.
Tế bào đài, có nguồn gốc từ lớp đáy của biểu mô, phát triển lớn hơn khi tiếp xúc với bề mặt biểu mô Với hình dạng tròn hoặc oval và kích thước từ 10-12 µm, tế bào đài có khả năng sản xuất lên đến 2,2 ml chất nhầy mỗi ngày.
Bệnh Mộng mắt
Mộng mắt là một tổ chức u sợi tăng sinh từ biểu mô kết mạc, phát triển từ kết mạc nhãn cầu và xâm lấn vào giác mạc Tình trạng này gây ra cảm giác cộm vướng, viêm mạn tính và có thể dẫn đến giảm thị lực do mộng xâm lấn vào giác mạc gây loạn thị hoặc che khuất trục thị giác khi mộng bò qua đồng tử.
1.2.2.1 Tỷ lệ mắc và mắc mới
Tỷ lệ mắc mộng mắt thay đổi theo từng vùng địa lý, đặc biệt cao ở những khu vực có khí hậu nóng, khô và nhiều bụi, cũng như những nơi có mức độ tia UV cao Nhiều nghiên cứu tổng hợp đã chỉ ra rằng tỷ lệ mắc mộng trong quần thể có sự khác biệt rõ rệt.
10,2% đến 12% 19,20 Nghiên cứu Mắt Bắc Kinh trong 10 năm thấy tỷ lệ mắc mới ở người Trung Quốc trưởng thành là 4,9% 21 Tại Việt Nam theo thống kê
1996, mộng mắt chiếm tỉ lệ 5,24% trong tổng số dân điều tra, trong đó tập trung nhiều ở vùng biển miền Trung
Mộng mắt là tình trạng tăng sinh tổ chức, không phải thoái hóa Các yếu tố nguy cơ gây ra mộng mắt được phân loại thành ba nhóm chính: nhân chủng học, hành vi lối sống và yếu tố môi trường.
- Giới : Trong nhiều nghiên cứu thấy tỷ lệ mắc mộng trung bình ở nam nhiều hơn nữ 1,3 lần 20
Tỷ lệ mắc mộng mị tăng theo độ tuổi, với nhóm tuổi từ 50 đến 79 có tỷ lệ cao nhất Cụ thể, nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc mộng ở độ tuổi 40-49 là 7,8%, 50-59 là 11,2%, 60-79 là 16,7% và trên 80 tuổi là 19,5% Hiện tượng này rất hiếm gặp ở những người dưới 20 tuổi.
Mộng thường gặp ở người cao tuổi liên quan đến sự suy giảm nguồn dự trữ tế bào gốc tại vùng rìa và sự tích lũy bức xạ tia UV theo thời gian.
Tỷ lệ mộng gặp cao hơn ở những người thuộc tầng lớp kinh tế xã hội thấp và sống ở vùng nông thôn Những người làm việc ngoài trời, như thợ săn, nông dân và bộ đội, có nguy cơ mắc bệnh cao gấp 1,46 lần so với những người làm việc trong nhà Tuy nhiên, nghề nghiệp làm việc ngoài trời không phải là yếu tố nguy cơ độc lập, mà nó kết hợp với việc nhiễm bức xạ tia UV.
Tỷ lệ mắc mộng cao nhất thường xuất hiện ở các quốc gia có khí hậu nóng, bụi bặm và khô, đặc biệt là những khu vực gần xích đạo Vành đai mộng thường tập trung tại những vùng vĩ tuyến này.
30 0 Bắc - Nam quanh xích đạo do nhận nhiều bức xạ tia UV với cường độ mạnh hơn các vùng khác 24
Yếu tố di truyền, đặc biệt là gen P53, đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành mộng Gen P53, được biết đến như một gen ức chế khối u, sản xuất protein giúp bảo vệ sự tăng sinh và ngăn chặn sự chết tế bào khi DNA bị tổn thương do bức xạ tia UVB Tia UVB có khả năng gây đột biến gen P53, dẫn đến sự biến đổi nhanh chóng và bất thường của các tế bào biểu mô, từ đó hình thành mộng.
Một nghiên cứu tại Úc cho thấy tỷ lệ mắc mộng ở người dân nông thôn cao gấp 5 lần so với người dân thành phố, chủ yếu do hoạt động ngoài trời và tiếp xúc với tia UV Những người tham gia hoạt động ngoài trời có nguy cơ mắc mộng cao hơn 1,76 lần Ngoài ra, người uống rượu có nguy cơ mắc mộng cao hơn 10% so với người không uống rượu Tuy nhiên, một nghiên cứu khác chỉ ra rằng người hút thuốc lá có tỷ lệ mắc mộng thấp hơn 0,82 lần so với người không hút thuốc.
Một số yếu tố khác
Bệnh khô mắt gây tăng thẩm thấu nước mắt, dẫn đến sản xuất men tiêu hủy cấu trúc nền MMPs và ảnh hưởng đến chức năng của tế bào biểu mô đáy, từ đó hình thành mộng mắt Thời gian phá vỡ màng phim nước mắt giảm rõ rệt ở bệnh nhân có mộng mắt, cho thấy mối liên quan chặt chẽ giữa viêm bờ mi và mộng mắt Viêm bờ mi cùng với bất thường màng phim nước mắt là nguyên nhân chính dẫn đến tăng sinh mô xơ mạch của mộng mắt Ngoài ra, nhiễm virus herpes simplex, virus human papilloma, yếu tố tăng sinh mạch và các yếu tố miễn dịch cũng được xác định là nguy cơ đối với bệnh mộng mắt.
1.2.2.3 Cơ chế bệnh sinh của mộng và cơ chế hình thành mộng tái phát
Bức xạ tia UVB được xác định là nguyên nhân chính gây hình thành và phát triển mộng nguyên phát Nghiên cứu trên chuột cho thấy tia UVB gây thoái hóa màng Bowman và làm giãn lớp biểu mô giác mạc Tia UVB cũng gây tổn thương tế bào gốc vùng rìa và nguyên bào sợi, dẫn đến viêm, tăng sinh tế bào, xơ mạch và thoái hóa tổ chức hình thành mộng Thêm vào đó, tia UVB làm suy yếu tế bào Langerhans ở vùng rìa, khiến tế bào kết mạc không nhận diện được sự kết nối giữa kết mạc và giác mạc, dẫn đến hiện tượng biểu mô kết mạc xâm lấn vào giác mạc, từ đó hình thành mộng.
Mộng tái phát thường xảy ra sau phẫu thuật từ 1 đến 2 tháng, với bệnh khô mắt và độ tuổi trẻ là những yếu tố nguy cơ chính Nghiên cứu cho thấy bệnh nhân dưới 45 tuổi có nguy cơ mộng tái phát cao gấp 3 đến 4 lần Phản ứng viêm mạnh và tình trạng viêm bề mặt nhãn cầu đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành mộng tái phát Tăng phản ứng viêm sau phẫu thuật có thể làm tăng nguy cơ mộng tái phát Các yếu tố khác như cắt hạn chế tổ chức mộng, kích thước mảnh ghép không đủ, mảnh ghép dày, tổ chức Tenon, khâu chỉ nhiều và mảnh ghép xê dịch do cố định không tốt cũng góp phần vào tình trạng này.
Hình 1.1 Tia UVB ảnh hưởng tới quá trình hình thành mộng 35
Mộng mắt thường xuất hiện ở góc trong (93%), đôi khi ở góc ngoài (7%) hoặc hiếm khi ở cả hai góc (mộng kép) Một số giả thuyết cho rằng thị trường phía thái dương không bị che khuất bởi lông mày và gốc mũi, dẫn đến việc tia UV chiếu vào góc trong nhiều hơn Tia UV cũng chiếu trực tiếp lên góc ngoài giác mạc, khúc xạ qua tiền phòng và hội tụ tại vùng rìa góc trong với cường độ gấp 20 lần so với tia UV từ phía mũi Tác động mạn tính của tia UV gây tổn thương tế bào gốc biểu mô vùng rìa, làm phá vỡ hàng rào và sinh ra mộng Ngoài ra, khe mi góc trong không khép kín bằng góc ngoài, tạo điều kiện cho bụi và dị vật tích tụ, làm tăng nguy cơ hình thành mộng.
Khu vực chịu kích thích quang hóa nằm tại đỉnh hội tụ ở góc phương vị 0, tương ứng với vị trí 3h ở mắt phải và 9h ở mắt trái Khu vực này phát ra bức xạ theo hình tròn, tỏa ra lên trên và xuống dưới với khoảng cách ±.
Keo dán fibrin
1.3 1 Cấu tạo keo dán fibrin
Keo dán fibrin, hay keo sinh học, được sử dụng trong y học để kết dính tổ chức, cầm máu bề mặt và lấp đầy các khuyết thiếu trong phẫu thuật Thành phần chính của keo dán fibrin bao gồm fibrinogen và yếu tố XIII, kết hợp với thrombin, calci clorid và aprotinin, giúp tạo thành keo fibrin và ức chế các enzym làm tiêu cục máu đông.
Fibrinogen là thành phần chủ yếu của keo fibrin, đóng vai trò quan trọng trong việc dính và cầm máu Mối liên hệ giữa lực căng và lực dính của keo fibrin với nồng độ fibrinogen cho thấy rằng nồng độ fibrinogen cao hơn sẽ cải thiện chất lượng keo dính Trong máu người bình thường, nồng độ fibrinogen dao động từ 2-4g/L, trong khi keo fibrin thương mại có nồng độ fibrinogen từ 75-110 mg/ml.
Thrombin là một enzym quan trọng, đóng vai trò thứ hai trong việc ảnh hưởng đến tốc độ hình thành mạng lưới fibrin Nồng độ thrombin cao sẽ làm tăng tốc độ phản ứng tạo keo.
Calci kích hoạt thrombin chưa hoạt động thành thrombin hoạt động, giúp chuyển fibrinogen thành phân tử fibrin đơn thân Các phân tử fibrin này kết nối với nhau để tạo thành các sợi fibrin, hình thành mạng lưới cục máu đông Ban đầu, các cầu nối giữa các fibrin là cầu nối hydro lỏng lẻo.
Yếu tố XIII, hay yếu tố ổn định fibrin, được hoạt hóa bởi thrombin sau vài phút, giúp thay thế các cầu nối hydro bằng cầu nối đồng hóa trị Quá trình này còn tạo ra các sợi nối chéo giữa các sợi fibrin lân cận, góp phần hình thành mạng lưới fibrin bền vững.
Aprotinin: là chất ức chế phân hủy fibrin được sử dụng để ngăn các khối keo sớm bị thủy phân bởi enzyme của cơ thể
1.3 2 Cơ chế hoạt động của keo dán fibrin
Khi tổ chức bị tổn thương, máu sẽ chảy ra và tự cầm lại nhờ vào sự hình thành cục máu đông, sản phẩm cuối cùng của quá trình đông máu Cục máu đông được tạo ra bởi keo dán fibrin, mô phỏng giai đoạn cuối của hiện tượng đông máu, mang lại khả năng kết dính Khi quá trình đông máu bắt đầu, yếu tố X được kích hoạt để chuyển đổi prothrombin thành thrombin, trong đó calci và phospholipid cũng đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của phức hợp prothrombinase, giúp kích hoạt prothrombin thành thrombin.
Thrombin và calci thủy phân fibrinogen để tạo ra fibrin đơn phân và fibrinopeptid Các fibrin đơn phân sau đó trùng hợp thành các phân tử fibrin hòa tan Cuối cùng, yếu tố XIII cùng với calci kích hoạt quá trình hình thành mạng lưới polymer của fibrin hòa tan thành fibrin không hòa tan Calci đóng vai trò quan trọng trong việc giúp các thành phần đông máu bám dính vào phospholipid, từ đó làm tăng độ dính và tạo thành cục máu đông vững chắc.
Hình 1.8 Sơ đồ minh họa giai đoạn cuối quá trình đông máu tự nhiên
1.3.3 Sản xuất keo dán fibrin
1.3.3.1 Nguyên lý tạo keo dán fibrin
Keo dán fibrin được tạo ra từ máu của người hoặc bò, thông qua quá trình ly tâm huyết tương để tách fibrinogen và thrombin Sau đó, khi bổ sung calci và aprotinin, keo dán fibrin sẽ được hình thành Do bản chất là protein và enzym, keo dán fibrin cần được bảo quản cẩn thận, vì sản phẩm có thể bị thoái triển theo thời gian.
Hình 1.9 Sơ đồ minh họa nguyên lý tạo keo dán fibrin
1.3.3.2 Phương pháp tách huyết tương
Máu toàn phần sau khi li tâm sẽ tách thành ba lớp: lớp dưới cùng chứa tế bào hồng cầu, lớp giữa là tiểu cầu và bạch cầu, trong khi lớp trên cùng là huyết tương Huyết tương ở trên được gọi là huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) với nồng độ fibrinogen cao, thường được sử dụng để tạo keo dán fibrin Ngược lại, phía dưới là huyết tương giàu tiểu cầu (PRP).
1.3.3.3 Phương pháp tách chiết fibrinogen và thrombin từ huyết tương
- Phương pháp t ủa đông (Cryoprecipitation)
Tủa đông được xem là tiêu chuẩn vàng trong việc tách chiết fibrinogen Huyết tương cần được đông ở nhiệt độ từ -20°C đến -80°C, sau đó được rã đông trong khoảng thời gian từ một đêm đến một ngày ở 4°C Sau khi rã đông, huyết tương sẽ được li tâm trong 5-15 phút với lực li tâm từ 1000 đến 6500g để thu được tủa fibrinogen, với nồng độ đạt từ 21,6 mg/ml đến 40 mg/ml Mặc dù phương pháp tủa đông cho phép thu được lượng lớn fibrinogen, quy trình tách chiết vẫn phức tạp, tốn thời gian cho việc rã đông, nồng độ fibrinogen chưa cao và yêu cầu lượng máu lớn.
- Phương pháp hóa học: tách chiết fibrinogen bằng protamin
Protamin là một protein đơn giản với trọng lượng phân tử thấp, giàu arginin và có tính kiềm mạnh, thường được sử dụng trong điều trị quá liều heparin, một loại thuốc chống đông máu có tính axit Khi kết hợp với heparin, protamin giúp giảm tác dụng của thuốc này Protamin được chiết xuất từ tinh dịch hoặc tinh hoàn của cá, vì vậy cần thận trọng khi sử dụng cho những người bị dị ứng với cá Thuốc có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng từ 15°C đến 30°C.
Fibrinogen có thể được tách chiết bằng cách kết hợp huyết tương với protamine Để thực hiện, cho dung dịch protamin vào huyết tương với nồng độ 10 mg/ml, sau đó ly tâm sẽ thu được tủa fibrinogen cùng với 50% yếu tố XIII trong huyết tương So với các phương pháp khác, phương pháp này cho nồng độ fibrinogen cao hơn, dễ thực hiện, nhanh chóng, tiết kiệm và có khả năng chiết xuất fibrinogen từ một lượng máu nhỏ.
Thrombin trong keo dán fibrin thương mại được chiết xuất từ huyết tương người hoặc huyết tương bò Mặc dù thrombin từ bò luôn sẵn có từ các nhà sản xuất, nhưng việc sử dụng sản phẩm từ máu khác loài có thể gây ra phản ứng kháng nguyên đối với yếu tố hình thành cục máu đông.
V, XI Do có các tác dụng không mong muốn như vậy, việc tạo thrombin của người sẽ an toàn hơn
Để chiết xuất thrombin từ máu, sử dụng máy chiết xuất thrombin TPD với 11 ml máu có chống đông và 4 ml tá dược gồm calci clorid 25mg/l và 66% ethanol, ủ trong 20 phút ở nhiệt độ từ 18°C đến 20°C để thu được thrombin hoạt động Trong trường hợp không có máy chiết xuất, có thể lấy huyết tương kết hợp với calci và ủ trong nước để thu được thrombin Theo quy trình của hãng Exactech, lấy 5 ml PPP và 0,2 ml CaCl2 10% cho vào ống thủy tinh và ủ trong nước.
37 0 C sẽ thu đượcdung dịch thrombin 75
1.3.4 Keo dán fibrin thương mại
Hiện nay trên thị trường thường sử dụng keo Tisseel của hãng Baxter và
Evicel của hãng Ethicon là sản phẩm chuyên dụng để cầm máu, hàn gắn và dính tổ chức Keo fibrin Tisseel được bảo quản ở nhiệt độ dưới -18°C và có thời hạn sử dụng lên đến 2 năm Tuy nhiên, sau khi mở bao bì, sản phẩm chỉ nên được sử dụng trong vòng 12 giờ Bộ kit keo Tisseel bao gồm nhiều thành phần cần thiết cho quá trình sử dụng hiệu quả.
1 Lọ xanh to: Protein đậm đặc (của người) để khô đông lạnh bao gồm: Protein 75-115 mg; Fibrinogen 70-110 mg; Fibronectin 2-9 mg; Yếu tố XIII 10-50 UI ; Plasminogen 40-120 àg
2 Lọ xanh nhỏ: dung dịch Aprotinin từ huyết tương bò 3000 KIU/ml
3 Lọ trắng bạc: Thrombin 4 (bò) khô đông lạnh chứa 4 UI/ml
4 Lọ đen to: Thrombin 500 (bò) khô đông lạnh chứa 500 UI/ml
5 Lọ đen nhỏ Dung dịch calci clorid, 40 mmol/l
Lấy 1+2 được thành phần fibrinogen Lấy 3+5 được thành phần thrombin dùng cho phản ứng tạo keo chậm Lấy 4+5 được thành phần thrombin dùng cho phản ứng tạo keo nhanh
Hình 1.10 K eo Tisseel của hãng Baxter 76
1.3.4.2 Lợi ích của keo dán fibrin
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu máu được thu thập từ những tình nguyện viên khỏe mạnh, không mắc các bệnh cấp tính hoặc mãn tính, không sử dụng rượu bia hay thuốc lá, và hoàn toàn
Thỏ thực nghiệm: Giống thỏ New Zealand, trên 5 tháng tuổi, trọng lượng trên 2,5kg, khỏe
Bệnh nhân mộng mắt nguyên phát
2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân
Bệnh nhân mắc mộng mắt nguyên phát độ II, được phân loại theo tổ chức đầu mộng bò qua giác mạc từ 2-4mm, có chỉ định phẫu thuật khi mộng gây hạn chế vận nhãn, viêm mạn tính, ảnh hưởng thẩm mỹ, và bệnh nhân có nhu cầu phẫu thuật.
- Bệnh nhân khỏe mạnh không mắc bệnh lý toàn thân cấp tính
- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu.
Bệnh nhân có mộng tái phát;
Bệnh nhân có bệnh bán phần trước nhãn cầu kèm theo;
Bệnh nhân đã phẫu thuật Glôcôm;
Bệnh nhân đang dùng thuốc chống đông máu, aspirin;
Bệnh nhân có rối loạn về đông máu;
Bệnh nhân không đến khám lại theo hẹn.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu thực nghiệm đã xây dựng quy trình tách chiết fibrinogen và thrombin từ máu người tình nguyện Tiếp theo, quy trình này được áp dụng trên thỏ, trong đó máu thỏ được tách chiết để tạo ra keo dán fibrin nhằm cố định mảnh ghép kết mạc mắt Kết quả mô học tổ chức ghép đã được đánh giá để xác định hiệu quả của phương pháp.
Nghiên cứu lâm sàng có đối chứng đã so sánh hiệu quả của việc sử dụng keo dán fibrin tự thân với chỉ khâu nylon 10/0 trong việc cố định mảnh ghép kết mạc cho bệnh nhân mộng mắt độ II Kết quả cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa hai phương pháp điều trị này, mở ra hướng đi mới trong việc cải thiện kết quả phẫu thuật cho bệnh nhân.
Lấy mẫu có chủ đích đã được thực hiện với 20 mẫu máu để xác định tỉ lệ kết hợp protamine với huyết tương nhằm thu được lượng fibrinogen tối đa Thêm vào đó, 13 mẫu máu được lấy để xác định tỉ lệ kết hợp giữa huyết tương và calci chlorid 10% nhằm tạo ra thrombin hoạt động Cuối cùng, 10 mẫu máu được phân tích để xác định thời gian tạo keo dán fibrin Ngoài ra, 18 con thỏ thực nghiệm đã được sử dụng để cố định mảnh ghép kết mạc, phục vụ cho việc đánh giá mô học tổ chức ghép.
3 con thỏ x 2 nhóm (keo dán fibrin tự thân và chỉ khâu) x 3 lô (07 ngày, 14 ngày và 30 ngày)
Nghiên cứu can thiệp thử nghiệm lâm sàng
(|𝑝 1 − 𝑝 2 | − 𝑑) 2 Trong đó: n1: cỡ mẫu của nhóm can thiệp; n2: cỡ mẫu của nhóm chứng
Chọn α: mức ý nghĩa thống kê = 0,05; Hiệu lực mẫu 80%, β xác suất sai lầm loại II = 0,20
Tỷ lệ phẫu thuật thành công ở nhóm sử dụng chỉ đạt 84,1%, trong khi nhóm sử dụng keo có tỷ lệ thành công cao hơn, đạt 95,59%, theo nghiên cứu của Ratnalingam (2010) Sự chênh lệch tỷ lệ phần trăm thành công giữa hai nhóm là 11,49%, với độ lệch d là 6%.
Cỡ mẫu tính toán cho nghiên cứu là n1 = n2 = 36 mắt, với giả định khoảng 10% bệnh nhân có thể bỏ theo dõi sau phẫu thuật Mỗi nhóm nghiên cứu cần thu thập ít nhất 40 mắt, do đó tổng số mắt nghiên cứu tối thiểu phải đạt 80.
Nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm đã xây dựng quy trình tách chiết các thành phần tạo keo dán fibrin, sau đó tiến hành thí nghiệm trên thỏ để cố định mảnh ghép kết mạc bằng keo dán fibrin tự thân Các thỏ được nuôi theo lô và theo dõi, thực hiện xét nghiệm mô học tổ chức kết mạc ghép vào các ngày thứ 7, 14 và 30 Bệnh nhân đủ tiêu chuẩn được chọn và chia thành hai nhóm ngẫu nhiên: Nhóm can thiệp sử dụng keo dán fibrin tự thân từ máu bệnh nhân, trong khi nhóm chứng sử dụng chỉ nylon 10-0 để cố định mảnh ghép kết mạc Kết quả sau phẫu thuật được đánh giá và số liệu được ghi chép vào bệnh án nghiên cứu.
Các bước tiến hành nghiên cứu được mô tả tóm tắt ở sơ đồ nghiên cứu (Hình 2.1)
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu
- Máy ly tâm nghiêng (SMIC-80 Trung Quốc)
- Máy định lượng Fibrinogen (staRmax, Stago-France)
- Ống li tâm 15 ml, ống nghiệm 5 ml; Bơm tiêm 1 ml, 5 ml, 10 ml; Pipét (Dragon LAB, 1000àl, Trung Quốc).
- Natri citrat 3,8%, natri citrat 0,2M Calci clorid 10%, dung dịch protamin choay 1000UI
- Bảng đo thị lực; Máy sinh hiển vi khám; Máy sinh hiển vi phẫu thuật;
Bộ dụng cụ phẫu thuật mộng; Chỉ nylon 10-0; Thang điểm VAS đánh giá mức độ đau; Bệnh án nghiên cứutheo mẫu
2.2.5.1 Giai đoạn nghiên cứu thực nghiệm
Xây dựngquy trình tách chiết thành phần fibrinogen và thrombin
Lần 1 lấy 10 mẫu máu của người tình nguyện, mỗi mẫu lấy 20 ml máu có chống đông natri citrat 3,8% cho vào ống li tâm có nắp kín Đem li tâm 1500g trong 20 phút Lấy 2/3 huyết tương ở phía trên của mỗi ống Ở mỗi mẫu, lấy 1 ml huyết tương kết hợp với protamine choay ở các khối lượng khác nhau:
Để xác định tỉ lệ phần trăm fibrinogen thu được, tiến hành sử dụng các mẫu protamin với nồng độ từ 6 mg đến 12 mg, cùng với một mẫu chứng 0 mg Hỗn dịch tủa fibrinogen được ly tâm ở tốc độ 1000g trong 5 phút, sau đó loại bỏ phần dung dịch và thu lấy tủa fibrinogen Tủa này được hòa tan trong dung dịch natri citrat 0,2M để tạo thành dung dịch fibrinogen Cuối cùng, thực hiện định lượng dung dịch fibrinogen để xác định khối lượng protamin nào mang lại hiệu quả thu được nhiều fibrinogen nhất.
Từ kết quả lần 1loại những khối lượng protamin thu được ít fibrinogen
Tiếp tục làm thực nghiệm lần 2 với 10 mẫu máu khác để xác định lượng protamin nào kết hợp với huyết tương sẽ thu được nhiều fibrinogen nhất.
Lấy 10 mẫu máu của người tình nguyện, mỗi mẫu lấy 10 ml máu có chống đông natri citrat 3,8% cho vào ống li tâm có nắp kín Đem li tâm 1500g trong 20 phút lấy huyết tương Mỗi mẫu lấy 1 ml huyết tương kết hợp với calci chlorid 10% với các tỉ lệ khác nhau, đem ủ trong nước ấm 37 0 C Quan sát và tính thời gian tạo tủa để thu được dung dịch thrombin Tiếp tục làm thực nghiệm lại lần 2 với các mẫu có tỉ lệ tạo được tủa để xác định tỉ lệ nào thu được thrombin nhanh nhất.
Lấy 10 mẫu máu của người tình nguyện tham gia nghiên cứu, mỗi mẫu lấy 10 ml máu có chống đông natri citrat 3,8% cho vào ống li tâm có nắp kín Đem li tâm 1500 g trong 20 phút lấy phần huyết tương Lấy huyết tương kết hợp với khối lượng protamin đã xác định thu được nhiều lượng fibrinogen nhất Lấy huyết tương kết hợp calci clorid theo tỉ lệ đã xác định thu được thrombin trong thời gian nhanh nhất Kết hợp fibrinogen và thrombin theo tỉ lệ 1:1 tính thời gian tạo kết dính chắc
Quy trình tách chiết thành phần fibrinogen và thrombin để tạo keo dán fibrin tự thân được mô tả tóm tắt (Hình 2.2)
Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tách chiết các thành phần tạo keo dán fibrin Thực nghiệm trên động vật
Nghiên cứu thực nghiệm trên mắt thỏ được chia thành hai nhóm: Nhóm 1 sử dụng keo dán fibrin tự thân để cố định mảnh ghép kết mạc, trong khi Nhóm 2 áp dụng chỉ khâu để thực hiện việc này.
Mỗi con thỏ được lấy 10ml máu tĩnh mạch từ rìa tai để tách chiết fibrinogen và thrombin theo quy trình đã thực hiện ở bước đầu Dung dịch fibrinogen và thrombin được lưu trữ trong hai bơm tiêm 1 ml Thỏ được cố định trên giá để tiến hành thí nghiệm.
Gây mê tĩnh mạch rìa tai thỏ bằng ketamine hydrochloride 5mg/1kg cân nặng
Nhóm 1: Lấy mảnh ghép kết mạc ở kết mạc góc trên ngoài kích thước 5 x 8mm Nhỏ hai thành phần fibrinogen và thrombin lên nền ghép Úp mảnh kết mạc xuống nền ghép và luồn các mép mảnh ghép xuống dưới mép kết mạc nền Để mảnh ghép cố định yên trong 8 phút Nhóm 2: Cố định mảnh ghépkết mạc bằng chỉ vicryl 8/0 Thỏ được chăm sóc, thay băng mắt và tra dung dịch Oflovid
0,3% và dung dịch Maxitrol 4 lần /24h Nhóm chứng được cắt chỉ mảnh ghép sau
Đánh giá mô học tổ chức ghép sau phẫu thuật được thực hiện vào các thời điểm 07, 14 và 30 ngày bằng phương pháp nhuộm Hematoxylin – eosin (H&E) Mẫu bệnh phẩm được lấy từ mảnh cắt mô kết mạc ghép, sau đó cố định trong dung dịch Bouin trong 3 ngày Mảnh ghép được rửa dưới vòi nước trong 2-3 ngày, tiếp theo ngâm trong cồn để khử nước Để làm trong, miếng mô được ngâm trong dung dịch nến nhằm đẩy cồn ra ngoài, sau đó vùi vào khối nến để loại bỏ hoàn toàn dung môi Cuối cùng, phiến đồ được cắt, dán lên lam kính và nhuộm màu để hoàn thiện quá trình đánh giá.
2.2.5.2 Giai đoạn nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng
Bệnh nhân được thử thị lực, khám sinh hiển vi đánh giá: tính chất mộng
Thu thập số liệu và chỉ tiêu đánh giá
Chỉ tiêu đánh giá nghiên cứu thực nghiệm
- Xây dựng quy trình gồm các bước thực hiện tách chiết được thành phần fibrinogen và thrombin để tạo keo dán fibrin
- Đánh giá tình trạng mô học củamảnh ghép sau 07, 14, 30 ngày
Chỉ tiêu đánh giá nghiên cứu lâm sàng
Kết quả cố định mảnh ghép kết mạc
Thành công: Cố định được mảnh ghép với kết mạc nền
Thất bại: Mảnh ghép bong khỏi diện ghép phải chuyển sang cố định bằng chỉ khâu
Mức độ cố định mảnh ghép kết mạc
Cố định trung bình: mảnh ghép có 1 hoặc 2 cạnh cố định không tốt với cạnh của kết mạc nềnvà vùng rìa giác mạc, di lệch > 1mm
Cố định kém: mảnh ghép có 3 cạnh cố định không tốt với cạnh của kết mạc nền và vùng rìa giác mạc, di lệch > 1mm
Bong mảnh ghép: mảnh ghép bong khỏi diện ghép.
Kết quả phẫu thuật Đánh giá kết quả đạt được sau phẫu thuật 3 tháng
Khá là một mảnh ghép cố định liên kết với kết mạc nền, có đặc điểm tương tự như kết mạc nền nhưng dễ nhận diện ranh giới ghép Trong khu vực kết mạc ghép, có thể quan sát thấy một số mạch máu thượng củng mạc, tuy nhiên chúng chưa phát triển qua vùng rìa và không có hiện tượng tăng sinh xơ mạch trên nền ghép.
Diệnghép kết mạc thường có ranh giới ghép không phẳng do sự tăng sinh của dải xơ nhỏ ở bờ mảnh ghép Tuy nhiên, tình trạng này không gây xâm lấn giác mạc và không có hiện tượng viêm hay u hạt trên kết mạc.
Kém: Kết mạc diện ghép dày, tăng sinh tổ chức xơ mạch, có thể xâm lấn qua vùng rìa vào giác mạc
Tái phát mộng là hiện tượng khi tổ chức mộng tái phát xảy ra, đặc biệt khi tổ chức kết mạc ghép đỏ và tăng sinh xơ mạch phát triển trên nền mộng cũ, lan rộng qua vùng rìa vào giác mạc với kích thước lớn hơn 1mm.
113,114 Bắt đầu tính thời gian theo dõi mộng tái phát sau phẫu thuật 6 tháng 115 Nếu thời gian theo dõi > 1 năm, tính thời gian là lần khám cuối cùng
Thời gian tính từ lúc đặt vành mi để phẫu thuật đến khi hoàn thành phẫu thuật và băng mắt bệnh nhân Thời gian phẫu thuật tính bằng phút.
Mức độ đau Đo theo thang điểm VAS (Visual Analog Scale tính theo thang điểm từ
1 đến 10) Giải thích rõ với bệnh nhân về thang điểm VAS và hướng dẫn bệnh nhân cách tự đánh giá:
Mức độ 0: Không đau: 0 điểm;
Mức độ 1: Đau ít, dễ chấp nhận: 1-3 điểm
Mức độ 2: Đau gây khó chịu: 4-5 điểm
Mức độ 3: Đau gây ảnh hưởng sinh hoạt, giấc ngủ 6-7 điểm
Mức độ 4: Đau nhiều, ảnh hưởng nhiều đến sinh hoạt, giấc ngủ: 8-10 điểm
Mức độ cảm giác dị vật
Mức độ 0: không có cảm giác dị vật
Mức độ 1: Cộm vướng ít; bệnh nhân chấp nhận được
Mức độ 2: Cộm vướng, gây khó chịu ít cho bệnh nhân.
Mức độ 3: Cộm vướng nhiều, ảnh hưởng đến sinh hoạt và giấc ngủ
Biến chứng trong phẫu thuật: có/không
- Thủng, rách kết mạc thân mộng.
- Thiếu mảnh ghép kết mạc.
Biến chứng sau phẫu thuật:
- Hở cạnh, di lệch mảnh ghép: mảnh ghép kết mạc di lệch cách kết mạc nhãn cầu liền kề >1mm.
- Bong mảnh ghép Mảnh ghép bong khỏi diện ghép.
- Viêm mảnh ghép(đánh giá theo nghiên cứu của Srivasan và Mittal 96,116 )
+ Mức độ 0: không có mạch máu xoắn ngoằn nghèo trên diện ghép + Mức độ 1: có 1 mạch máu xoắn ngoằn nghèo bò trên diện ghép.
+ Mức độ 2: có 2 mạch máu xoắn ngoằn nghèo bò trên diện ghép
+ Mức độ 3: có >3 mạch máu xoắn ngoằn nghèo bò trên diện ghép
- Xuất huyết mảnh ghép (đánh giá theo nghiên cứu của Srivasan et al 96 )
+ Mức độ 0: không có xuất huyết trên diện ghép
+ Mức độ 1: xuất huyết < 25% diện ghép.
+ Mức độ 2: xuất huyết < 50% diện ghép
+ Mức độ 3: xuất huyết < 75% diện ghép.
+ Mức độ 4: xuất huyết toàn bộ diện ghép
Phù ít xảy ra khi có ít dịch tích tụ dưới mảnh ghép kết mạc, khiến cho mảnh ghép vẫn giữ được hình dáng phẳng Trong khi đó, phù trung bình xuất hiện khi lượng dịch dưới mảnh ghép đủ để làm cho mảnh ghép nhô cao hơn so với kết mạc nhãn cầu xung quanh.
+ Phù nhiều: có nhiều dịch ở dưới mảnh ghép đội mảnh ghép phồng cao.-
- U hạt: Tổ chức kết mạc phát triển tạo thành u kết mạc.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Giai đoạn 1 thực hiện tại Bộ môn Sinh lý và Bộ môn Mô phôi của trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên trong thời gian từ tháng 5 đến tháng 12 năm 2018
Bộ môn Sinh lý và Bộ môn Mô phôi trường Đại học Y Dược Thái Nguyên có phòng thí nghiệm với đủ vật chất phục vụ nghiên cứu thực nghiệm
Giai đoạn 2 của nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng có đối chứng được thực hiện trên bệnh nhân mộng mắt có chỉ định phẫu thuật tại Bệnh viện Mắt tỉnh Thái Nguyên từ tháng 05/2019 đến tháng 12/2020 Bệnh viện Mắt tỉnh Thái Nguyên, là cơ sở chuyên khoa tuyến tỉnh, cung cấp dịch vụ khám và điều trị các bệnh về mắt cho người dân trong tỉnh Thái Nguyên và các tỉnh lân cận.
Phân tích số liệu
Xử lý số liệu trên chương trình SPSS 16.0, sử dụng các thuật toán χ² và test T để phân tích kết quả Kết quả được trình bày dưới dạng tỷ lệ %, số trung bình, với sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05 Để so sánh tỷ lệ giữa nhóm can thiệp và nhóm chứng, áp dụng test Khi bình phương (Chi-square), trong trường hợp tần số lý thuyết < 5 thì sử dụng test Fisher’s exact So sánh giá trị p với mức ý nghĩa α Đối với việc so sánh trung bình của các biến số giữa 2 nhóm, sử dụng kiểm định T test và so sánh giá trị p với mức ý nghĩa α Cuối cùng, xác định mối liên quan giữa yếu tố nguy cơ của nhóm can thiệp và nhóm chứng thông qua tỷ suất chênh OR, với khoảng tin cậy 95% của OR không chứa 1 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Phương pháp khống chế sai số
- Bệnh nhân có đủ tiêu chí tuyển chọn vào nghiên cứu, đồng ý ký giấy chấp thuận nghiên cứu.
Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng đã phân bố ngẫu nhiên bệnh nhân vào hai nhóm: nhóm can thiệp sử dụng keo dán fibrin tự thân để cố định mảnh ghép kết mạc (mã hóa số 1) và nhóm chứng sử dụng chỉ khâu nylon 10/0 (mã hóa số 2) Tổng cộng, nhóm nghiên cứu tạo ra 50 mã số 1 và 50 mã số 2, sau đó bốc ngẫu nhiên để xác định phương pháp nghiên cứu tương ứng.
- Tất các các bệnh nhân được phẫu thuật theo 1 trình tự giống nhau.
Nghiên cứu này không gây mù cho phẫu thuật viên, vì họ cần hiểu rõ phương pháp phẫu thuật Đồng thời, bệnh nhân cũng nên nắm bắt phương pháp điều trị của mình để có thể phối hợp hiệu quả, từ đó đạt được kết quả tốt nhất trong quá trình điều trị.
Đạo đức trong nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu đóng góp tri thức cho y học lâm sàng Nhãn khoa bằng cách so sánh hiệu quả của việc cố định mảnh ghép kết mạc bằng keo dán fibrin tự thân và chỉ khâu Nghiên cứu này nhằm tìm ra phương pháp điều trị tối ưu cho bệnh nhân bị mộng mắt, từ đó mang lại lợi ích thiết thực cho người bệnh.
Nghiên cứu này đã được thực hiện sau khi được Hội đồng xét duyệt đề cương và Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học của Trường Đại học Y Hà Nội phê duyệt, theo giấy chứng nhận số 95/HĐ ĐĐ ĐHYHN ngày 30/5/2017.
Dự án khoa học công nghệ cấp tỉnh về nghiên cứu đã được phê duyệt theo Quyết định số 1651/QĐ-UBND ngày 16/6/2018 của UBND tỉnh Thái Nguyên, giao cho Bệnh viện Mắt Thái Nguyên tổ chức và chủ trì thực hiện.
- Bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu Bệnh nhân và gia đình bệnh nhân sẽ được:
+ Giải thích rõ mục đích của nghiên cứu
+ Nghiên cứu chỉ được tiến hành trên các bệnh nhân tự nguyện
+ Sẵn sàng tư vấn cho bệnh nhân khi bệnh nhân có yêu cầu
+ Thông tin kết quả lại cho bệnh nhân trong quá trình nghiên cứu
- Số liệu thu thập một cách chính xác, khách quan.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xây dựng quy trình tạo keo dán fibrin và đánh giá kết quả thực nghiệm trên thỏ
3.1.1 Quy trình tạo keo dán fibrin tự thân
Hình 3.1 Máu toàn phần sau khi ly tâm để tách lấy huyết tương
Thăm dò lần thứ nhấttrên 10 mẫu huyết tương: kết hợp 1ml huyết tương nghèo tiểu cầu với các khối lượng protamin 0 mg (chứng), 6 mg, 7 mg, 8 mg,
9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg Kết quả định lượng fibrinogen thu được như sau:
Bảng 3.1 Hàm lượng fibrinogen tách chiết được theo các khối lượng protamin ở lần thứ nhất
Hàm lượng fibrinogen thu được (g/L)
0 mg 6 mg 7 mg 8 mg 9 mg 10 mg 11 mg 12 mg
Nghiên cứu hàm lượng fibrinogen được thực hiện trên 10 mẫu, kết hợp 1ml huyết tương với các khối lượng protamin từ 6mg đến 12mg Kết quả cho thấy lượng fibrinogen trung bình thu được ở khối lượng protamin 6mg, 7mg, 8mg thấp hơn so với 9mg, 10mg, 11mg và 12mg Lượng fibrinogen trung bình tăng dần ở các mẫu huyết tương với khối lượng protamin 9mg, 10mg và 11mg Tuy nhiên, ở khối lượng protamin 12mg, lượng fibrinogen trung bình lại giảm so với 10mg và 11mg, trong khi lượng fibrinogen ở 10mg và 11mg gần tương đương nhau.
Từ kết quả thu được, loại bỏ ba khối lượng protamin không phù hợp và tiến hành thử nghiệm lần thứ hai trên 10 mẫu máu với khối lượng protamin kết hợp mới, bao gồm 0 mg (chứng), 9 mg, 10 mg, 11 mg và 12 mg, nhằm xác định lượng fibrinogen một cách chính xác.
Bảng 3.2 Hàm lượng fibrinogen tách chiết được theo các khối lượng protamin ở lần thứ 2
Hàm lượng fibrinogen thu được (g/L) % fibrinogen ở khối lượng protamin
0 mg 9mg 10 mg 11mg 12 mg 10mg
Kết quả thu được từ bảng 3.2 cho thấy hàm lượng fibrinogen tách chiết được theo các khối lượng protamin ở lần thứ 2 Cụ thể, khi sử dụng 10 mg protamin kết hợp với 1ml huyết tương, lượng fibrinogen trung bình thu được cao nhất là 2,3 g/L ± 0,36, tương đương với tỉ lệ % là 81,05 % ± 11,17 % Tiếp theo, khi sử dụng 11 mg protamin, lượng fibrinogen trung bình thu được là 2,1 g/L ± 0,45.
Lấy huyết tương nghèo tiểu cầu kết hợp với calci clorid 10% ở các tỉ lệ khác nhau để tách chiết thrombin Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.3 Tỉ lệ kết hợp giữa huyết tương và ca lci clorid để tạo thrombin
Tỉ lệ huyết tương : calci clorid
Calci clorid 10% Thời gian tạo tủa
1 1:1 1 ml 1 ml Không tạo tủa
2 5:1 1 ml 0,2 ml Không tạo tủa
3 10:1 1 ml 0,1 ml Không tạo tủa
4 15:1 1 ml 0,06 ml Không tạo tủa
5 20:1 1 ml 0,05 ml Tạo tủa sau 25 phút
6 25:1 1 ml 0,04 ml Tạo tủa sau 15 phút
7 30:1 1 ml 0,033 ml Tạo tủa sau 25 phút
8 35:1 1 ml 0,028 ml Không tạo tủa
9 40:1 1 ml 0,025 ml Không tạo tủa
10 45:1 1 ml 0,022 ml Không tạo tủa
Bảng 3.3 trình bày tỉ lệ kết hợp giữa huyết tương và calci clorid để tạo thrombin Cụ thể, với tỉ lệ huyết tương: calci clorid là 25:1, sau 15 phút sẽ hình thành tủa đông Đối với tỉ lệ huyết tương: calci clorid là 20:1 và 30:1, thời gian tạo tủa đông sẽ khác nhau.
25 phút Với các tỉ lệ calci clorid khác phản ứng không tạo được tủa
Trong thử nghiệm lần 2, huyết tương được kết hợp với calci clorid 10% theo ba tỷ lệ: 20:1, 25:1 và 30:1 Kết quả cho thấy tỷ lệ 25:1 tạo ra tủa đông nhanh nhất chỉ sau 15 phút, trong khi hai tỷ lệ còn lại cần đến 25 phút để thu được tủa Khi huyết tương được kết hợp với calci clorid 10% ở tỷ lệ 25:1 và ủ trong nước ở nhiệt độ 37°C, sau 15 phút thu được dung dịch thrombin hoạt động sau khi gạt bỏ tủa.
Từ 10 ml máu toàn phần có chống đông natri citrat 3,8%, sau li tâm thu được khoảng 4,5 ml huyết tương nghèo tiều cầu Lấy 3 ml huyết tương nghèo tiểu cầu kết hợp với protamin (10 mg/ml) thu được 0,5-1 ml dung dịch fibrinogen Lấy 1,5 ml huyết tương kết hợp 0,06 ml calci clorid 10% lắcđều ủ trong nước 37 0 C sau 15 phút thu được 0,5 ml đến 1 ml dung dịch thrombin
Lấy dung dịch fibrinogen và thrombin theo tỉ lệ 1:1, trộn đều trên lam kính Kiểm tra hỗn dịch sau mỗi 30 giây cho đến khi chuyển màu đục và hình thành khối kết dính, có thể kéo được keo dính bằng đũa thủy tinh Ghi lại thời gian từ khi hai dung dịch bắt đầu kết hợp đến khi tạo thành keo dính Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.4 Tỷ lệ % fibrinogen thu được và thời gian tạo thành keo fibrin
Mẫu Nồng độ fibrinogen chứng (g/L)
Nồng độ fibrinogen tách chiết (g/L)
% fibrinogen thu được Thời gian tạo kết dính
Bảng 3.4 trình bày tỷ lệ phần trăm fibrinogen và thời gian hình thành keo fibrin khi kết hợp fibrinogen với thrombin theo tỷ lệ 1:1 Tất cả 10 mẫu thử nghiệm cho thấy sự kết hợp này đều tạo ra khối keo fibrin kết dính Thời gian trung bình để hình thành keo kết dính là 8 phút.
QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT CÁC THÀNH PHẦN
Quy trình tách chiết fibrinogen và thrombin để tạo keo dán fibrin tự thân được tóm tắt theo các bước sau đây (Hình ảnh chi tiết ở phần Phụ lục 1)
Bước 1: Lấy 1 ml chống đông natri citrat 3,8%
Bước 2: Rút 9 ml máu tĩnh mạch Nhẹ nhàng lắc đều để máu và dung dịch chống đông trộn đều
Bước 1: Chuyển 10 ml máu từ bơm tiêm sang ống li tâm 15 ml Đậy nắp kín
Lấy ống li tâm khác cho 10 ml nước để tạo lực quay cân bằng
Bước 2: Đặt 2 ống li tâm vào lỗ đựng ống li tâm ở vị trí đối xứng nhau
Để tiến hành quy trình, đầu tiên, hãy đặt máy li tâm ở chế độ 1500g và chạy trong 20 phút Sau khi thời gian li tâm kết thúc, lấy ống li tâm ra khỏi máy và đặt thẳng đứng trên giá đỡ.
Bước 1: Cầm ống li tâm thẳng, mở nắp.
Bước 2: Dùng pipet 1000 nhẹ nhàng rút huyết tương nghèo tiểu cầu Để đầu ống pipét vừa chạm tới phần huyết tương
Bước 3: Rút 3 ml huyết tương ra ống li tâm có nắp đậy kín để tạo fibrinogen Bước 4: Rút 1,5 ml huyết tương cho vào ống thủy tinh để tạo thrombin
Bước 1: Rút 3 ml huyết tương ra ống li tâm có nắp đậy kín
Bước 6: Đểmáy li tâm chế độ 1000g trong 5 phút Bật máy li tâm hoạt động
Bước 7: Hết thời gian li tâm, lấy ống tạo fibrinogen ra khỏi lỗ li tâm
Bước 8:Mở nắp, gạn bỏ dung dịch Giữ lại phần tủa ở đáy ống li tâm.
Bước 9: Hòa tan vừa đủ tủa fibrinogen bằng dung dịch natri citrat 0,2M
Bước 10: Rút dung dịch fibrinogen vào bơm tiêm 1ml để sẵn chờ tạo keo
Bước 1: Cho 1,5 ml huyết tương cho vào ống thủy tinh có nắp kín
Bước 2: Cho 0,06 ml calci clorid 10% vào ống thủy tinh đã có huyết tương Đậy nắp
Bước 3: Lắc đều ống thủy tinh 5 lần để huyết tương và calci clorid 10% trộn đều nhau
Bước 4: Đem ống thủy tinh đi ủ trong nước ở nhiệt độ 37 0 C trong thời gian 15 phút đến khi tạo khối tủa.
Bước 5: Bỏ khối tủa để lấy dung dịch thrombin
Bước 6: Dùng bơm tiêm rút lấy dung dịch thrombin vào bơm tiêm 1ml đểsẵn chờ tạo keo
Bước 1 Nhỏ dung dịch thrombin lên diện cần ghép
Bước 2: Nhỏ tiếp dung dịch fibrinogen lên diện ghép Tỉ lệ thrombin và fibrinogen tương đương nhau.
Bước 3: Trộn đều hỗn dịch fibrinogen và thrombin Chờ thời gian kết dính
Hình 3.2 Quy trình tạo keo dán fibrin tự thân
3.1.2 Kết quả thực nghiệm keo dán fibrin trên thỏ
Nghiên cứu thực nghiệm trên thỏ được thực hiện với ba lô thí nghiệm: 7 ngày, 14 ngày và 30 ngày Mỗi lô bao gồm 03 con thỏ sử dụng keo dán fibrin tự thân và 03 con thỏ sử dụng chỉ khâu Nhóm thí nghiệm với keo dán fibrin cho thấy kết quả đáng chú ý trong quá trình can thiệp.
09 con thỏ đều lấy được máu tĩnh mạch rìa tai Li tâm và tách chiết fibrinogen và thrombin theo đúng quy trình đã thực nghiệm ở giai đoạn đầu
Hình 3.3 Fibrinogen và thrombin thu được từ huyết tương thỏ
A.Tủa fibrinogen tạo được khi huyết tương kết hợp với protamin
B Huyết tương kết hợp với calci clorid ủ trong nước tạo thrombin
Hình 3.4 Ghép kết mạc mắt thỏ
A Mảnh ghép kết mạc cố định bằng keo dán fibrin tự thân
B Mảnh ghép kết mạc cố định bằng 4 mũi chỉ vicryl 8/0
3.1.2.1 Mô học tổ chức kết mạc ghép sau phẫu thuật 7 ngày
Hình 3.5 Tổ chức mô học mảnh ghép kết mạc mắt 7 ngày
A Kết mạc cố định bằng keo dán fibrin tự thân, số lượng tế bào biểu mô đều (mũi tên đỏ), xuất hiện nhiều mạch máu tân tạo (mũi tên đen); B Kết mạc cố định bằng chỉ khâu: lớp tế bào biểu mô mỏng (mũi tên đỏ) mô liên kết phản ứng viêm dầy (mũi tên đen 2 đầu) Nhuộm H&E x 400
3.1.2.2 Mô học tổ chức kết mạc ghép sau phẫu thuật 14 ngày
Đánh giá hiệu quả và tính an toàn của keo dán fibrin tự thân trong phẫu thuật cắt mộng ghép kết mạc
3.2 1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trên 66 bệnh nhân với 92 mắt phẫu thuật Có
Trong nghiên cứu này, có 26 bệnh nhân được phẫu thuật cả hai mắt và 40 bệnh nhân phẫu thuật một mắt Nhóm can thiệp sử dụng keo dán fibrin tự thân để cố định mảnh ghép kết mạc ở 45 mắt, trong khi nhóm chứng sử dụng chỉ khâu cho 47 mắt Trong nhóm can thiệp, 17 bệnh nhân phẫu thuật cả hai mắt, trong đó 9 bệnh nhân được phẫu thuật bằng hai phương pháp khác nhau: một mắt dùng keo dán fibrin và một mắt dùng chỉ khâu; 8 bệnh nhân còn lại đều được phẫu thuật bằng keo dán fibrin cho cả hai mắt, thực hiện trong hai ngày khác nhau.
3.2.1.1 Phân bố bệnh nhân theo giới
Bảng 3.5 Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo giới
Giới tính Nhóm can thiệp Nhóm chứng Chung p n % n % N %
Nghiên cứu thực hiện trên 66 bệnh nhân trong đó tỉ lệ bệnh nhân nữ
(74,2%) cao hơn bênh nhân nam (25,8%) Nhóm can thiệp dùng keo fibrin có
Trong nghiên cứu, có tổng cộng 37 bệnh nhân, trong đó 9 bệnh nhân nam (24,3%) và 28 bệnh nhân nữ (75,7%) Nhóm chứng bao gồm 29 bệnh nhân, với 8 bệnh nhân nam (27,6%) và 21 bệnh nhân nữ (72,4%) Tỷ lệ giới tính giữa nhóm can thiệp và nhóm chứng không có sự khác biệt đáng kể, với giá trị p = 0,784.
3.2.1.2 Tuổi bệnh nhân nghiên cứu
Tuổi trung bình của bệnh nhân tham gia nghiên cứu là 52,02 ± 11,98 tuổi Tuổi thấp nhất là 26 và cao nhất là 74tuổi
Bảng 3.6 Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi và nhóm nghiên cứu
Nhóm tuổi Nhóm can thiệp Nhóm chứng Chung n % n % N % p
Tỉ lệ bệnh nhân ở các nhóm tuổi giữa nhóm can thiệp và nhóm chứng không có sự khác biệt đáng kể (p = 0,781) Nhóm tuổi phẫu thuật nhiều nhất là từ 30 đến 49 chiếm 45,5%, tiếp theo là nhóm từ 50 đến 69 với 43,9% Trong khi đó, nhóm tuổi dưới 30 chỉ có 1,5% bệnh nhân và nhóm từ 70 tuổi trở lên chiếm 9,1%.
Tất cả 92 mắt nghiên cứu (100%) đều có mộng ở vị trí góc trong mắt
Bảng 3.7 Phân loại mộng trong nhóm nghiên cứu
Nhóm can thiệp Nhóm chứng Chung p n % n % N %
Trong 45 mắt phẫu thuật của nhóm can thiệp có 33 mắt mộng tiến triển (73,3%); 9 mắt mộng xơ (20%) và 3 mắt mộng máu (6,7%) Trong 47 mắt phẫu thuật của nhóm chứng có 40 mắt có mộng tiến triển (85,1%); 3 mắt mộng xơ
(6,4 %) và 4 mắt mộng máu (8,5%) Không có sự khác biệt về tỉ lệ phân loại mộng giữa hai nhóm nghiên cứu (p = 0,174)
3.2.3.1 Thời gian tách chiết các thành phần tạo keo dán fibrin
Thời gian trung bình để tách chiết các thành phần của keo dán fibrin tự thân là 42,33 ± 2,52 phút, thấp nhất là 40 phút, cao nhất là 45 phút
3.2.3.2 Thời gian phẫu thuật trung bình
Bảng 3.8 So sánh t hời gian phẫu thuật trung bình giữa 2 nhóm nghiên cứu
Nhóm nghiên cứu n Thời gian trung bình ± SD p
Thời gian phẫu thuật trung bình ở nhóm sử dụng keo dán fibrin là 28,5 ± 2,7 phút, trong khi nhóm chỉ khâu mất trung bình 37,2 ± 2,9 phút Sự khác biệt trung bình về thời gian phẫu thuật giữa hai nhóm là -8,702, với khoảng tin cậy 99% của sự khác biệt là (-9,877; -7,526), không chứa giá trị 0 Kết quả cho thấy thời gian phẫu thuật ở nhóm keo fibrin tự thân ngắn hơn đáng kể so với nhóm chỉ khâu, với mức độ ý nghĩa thống kê 99%.
3.2.3.3 Thời gian theo dõi trung bình
Thời gian theo dõi trung bình 12,8 ± 1,6 tháng Thời gian theo dõi thấp nhất là 11,8 tháng, cao nhất là 24,3 tháng.
3.2.3.4 Kích thước mảnh ghép kết mạc
Bảng 3.9 Kích thước mảnh ghép kết mạc
Nhóm nghiên cứu n Kích thước trung bình ±SD p
Nhóm can thiệp 45 Rộng 7,09 mm 0,87 mm
Nhóm chứng 47 Rộng 6,28 mm 0,94 mm
Kích thước trung bình của mảnh ghép kết mạc ở nhóm keo dán fibrin là 7,09 mm x 9,04 mm, trong khi ở nhóm chỉ khâu là 6,28 mm x 8,47 mm Sự khác biệt này cho thấy nhóm chỉ khâu có kích thước mảnh ghép kết mạc nhỏ hơn đáng kể so với nhóm dùng keo dán fibrin tự thân (p < 0,01).
3.2.4 Biến chứng trong phẫu thuật
3.2.4.1 Tình trạng xuất huyết mảnh ghép kết mạc
Bảng 3.10 Tình trạng xuất huyết mảnh ghép trong phẫu thuật
Tình trạng xuất huyết mảnh ghép
Nhóm can thiệp Nhóm chứng Chung p n % n % N %
Nghiên cứu cho thấy không có trường hợp nào mảnh ghép kết mạc bị xuất huyết toàn bộ trong phẫu thuật Tỉ lệ xuất huyết một phần ở nhóm keo dán fibrin chỉ là 2,2%, thấp hơn đáng kể so với 25,5% ở nhóm chỉ khâu Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 Tỉ suất chênh OR = 15,086 cho thấy khả năng mảnh ghép không bị xuất huyết ở nhóm keo dán fibrin cao gấp 15,086 lần so với nhóm chỉ khâu, với khoảng tin cậy 99% không chứa giá trị 1.
3.2.4.2 Tình trạng xuất huyết kết mạc nền
Bảng 3.11 Tình trạng xuất huyết kết mạc nền trong phẫu thuật
Tình trạng xuất huyết kết mạc nền
Nhóm can thiệp Nhóm chứng Chung p n % n % N %
Trong nghiên cứu về tình trạng xuất huyết kết mạc nền trong phẫu thuật, không có sự khác biệt đáng kể giữa hai nhóm, với giá trị p = 0,259 (p > 0,05) theo kiểm định hai phía và độ tin cậy 95% Cụ thể, có 8 mắt (16,3%) trong nhóm keo dán fibrin và 13 mắt (27,7%) trong nhóm chỉ khâu bị xuất huyết một phần kết mạc nền.
3.2.5 Kết quả cố định mảnh ghép
Bảng 3.12 Kết quả cố định mảnh ghép kết mạc sau phẫu thuật 1 ngày
Tình trạng cố định mảnh ghép
Nhóm can thiệp Nhóm chứng n % n % p
Keo dán fibrin tự thân đã thành công trong việc cố định mảnh ghép kết mạc ở 43/45 mắt, đạt tỷ lệ 95,6%, trong khi chỉ có 2/45 mắt thất bại, chiếm 4,4% Tất cả các mảnh ghép đều được cố định bằng chỉ khâu, với giá trị p = 0,237 cho thấy không có sự khác biệt về khả năng cố định giữa hai phương pháp keo dán fibrin tự thân và chỉ khâu, với độ tin cậy 95%.
Bảng 3.13 Đặc điểm cố định mảnh ghép kết mạc sau phẫu thuật 1 ngày Đặc điểm cố định mảnh ghép kết mạc
Nhóm can thiệp Nhóm chứng n % n % p
Nhóm keo dán fibrin tự thân cho thấy tỷ lệ mảnh ghép kết mạc cố định tốt ở 32/45 mắt, đạt 71,11%, trong khi 9 mắt bị hở cạnh mũi (20%), 1 mắt hở cạnh trên (2,21%), 1 mắt hở cả cạnh mũi và dưới (2,22%), và 2 mắt bị bong (4,45%) Ngược lại, nhóm chỉ khâu có 46/47 mắt mảnh ghép cố định tốt, đạt tỷ lệ 97,9% Sự khác biệt về đặc điểm cố định mảnh ghép sau phẫu thuật 1 ngày giữa hai nhóm nghiên cứu là rõ rệt với giá trị p = 0,001 < 0,01, cho thấy độ tin cậy 99% Mảnh ghép bị hở cạnh nhiều hơn ở nhóm sử dụng keo dán fibrin so với nhóm chỉ khâu.
Bảng 3.14 Đặc điểm cố định mảnh ghép kết mạc sau phẫu thuật 1 tuần Đặc điểmcố định mảnh ghép
Nhóm can thiệp Nhóm chứng p n % n %
Sau phẫu thuật 1 tuần, nhóm keo dán fibrin có 39/43 mắt mảnh ghép cố định tốt (90,7%), có 4/43 mắt mảnh ghép còn hở cạnh mũi (9,3%) Với giá trị p
= 0,189 > 0,05 không có sự khác biệt về đặc điểmcố định mảnh ghép kết mạc sau phẫu thuật 1 tuần giữa 2 nhóm nghiên cứu.
3.2.6 Triệu chứng lâm sàng sau phẫu thuật
3.2.6.1 Tình trạng phù mảnh ghép sau phẫu thuật
Bảng 3.15 Mức độ phù mảnh ghép sau phẫu thuật 1 ngày
Mức độ phù mảnh ghép
Nhóm can thiệp Nhóm chứng Chung p n % n % N %
Tổng 43 100 47 100 90 100 Đánh giá mức độ phù mảnh ghép sau phẫu thuật 1 ngày: Ở nhóm keo dán fibrin 44,2% mảnh ghép phù ít; 39,5% mảnh ghép phù trung bình và 16,3% mảnh ghép bị phù nhiều Ở chỉ khâu, 27,7% mảnh ghép phù ít, 68,1% mảnh ghép phù trung bình và 4,3% mảnh ghép phù nhiều Với giá trị p = 0,014 < 0,05 có sự khác biệt về mức độ phù mảnh ghép giữa 2 nhóm nghiên cứu có ý nghĩa thống kê, độ tin cậy 95% Nhóm chỉ khâu có mảnh ghép phù nhiều hơn so với nhóm keo dán fibrin tự thân ở 1 ngày sau phẫu thuật
Bảng 3.16 Mối liên quan giữa mức độ phù mảnh ghép và tình trạng hở cạnh mảnh ghép sau phẫu thuật 1 ngày
Mức độ phù mảnh ghép
Hở cạnh mảnh ghép Nhóm can thiệp Nhóm chứng Chung p n % n % N %
Sau phẫu thuật 1 ngày, trong nhóm keo dán fibrin, có 11 mắt hở cạnh mảnh ghép, trong đó 7 mắt (58,3%) có phù mảnh ghép mức độ trung bình và 4 mắt (41,7%) có phù mức độ nhiều Ngược lại, ở nhóm chứng, chỉ có 1 mắt hở cạnh mảnh ghép với mảnh ghép kết mạc phù mức độ nhiều Kết quả cho thấy có sự khác biệt đáng kể giữa hai nhóm về tình trạng hở cạnh mảnh ghép và mức độ phù mảnh ghép với giá trị p < 0,05 và độ tin cậy 95% Hở cạnh mảnh ghép xuất hiện nhiều hơn ở những mắt có phù mảnh ghép ở mức độ trung bình và nhiều.
Bảng 3.17 Mức độ phù mảnh ghép sau phẫu thuật 1 tuần
Mức độ phù mảnh ghép
Nhóm can thiệp Nhóm chứng Chung n % n % N % p
Sau phẫu thuật 1 tuần, mức độ phù mảnh ghép đã giảm hơn ngày đầu
Cả hai nhóm nghiên cứu chỉ còn lại mảnh ghép phù mức độ trung bình và phù ít, không còn mảnh ghép phù mức độ nhiều Nhóm keo fibrin có 65,1% mảnh ghép phù ít và 34,9% phù trung bình, trong khi nhóm chỉ khâu có 44,7% mảnh ghép phù ít và 55,3% phù trung bình Tỷ lệ mảnh ghép phù mức độ ít cao hơn ở nhóm keo dán fibrin Với giá trị p = 0,052 > 0,05, không có sự khác biệt về mức độ phù mảnh ghép giữa hai nhóm nghiên cứu sau một tuần phẫu thuật, với độ tin cậy 95%.
Bảng 3.18 Mức độ phù mảnh ghép sau phẫu thuật 1 tháng
Mức độ phù mảnh ghép
Nhóm can thiệp Nhóm chứng Chung p n % n % N %
Sau một tháng phẫu thuật, mức độ phù mảnh ghép đã giảm đáng kể Trong nhóm sử dụng keo dán fibrin, 67,4% mảnh ghép đã hết phù, trong khi 32,6% còn lại chỉ có phù nhẹ Đối với nhóm chỉ khâu, tỷ lệ mảnh ghép hết phù là 55,3%, còn 44,7% mảnh ghép vẫn còn phù nhẹ Giá trị p cho thấy sự khác biệt giữa hai nhóm là có ý nghĩa.
= 0,239 > 0,05 không có sự khác biệt về mức độ phù mảnh ghép giữa 2 nhóm nghiên cứu sau phẫu thuật 1 tháng, độ tin cậy 95%
3.2.6.2 Tình trạng xuất huyết mảnh ghép sau phẫu thuật
Bảng 3.19 Tình trạng xuất huyết mảnh ghép sau phẫu thuật 1 ngày
Tình trạng xuất huyết mảnh ghép
Sau 1 ngày phẫu thuật, tỷ lệ mảnh ghép không bị xuất huyết ở nhóm keo dán fibrin đạt 60,5%, trong khi nhóm chỉ khâu chỉ có 21,3% Tỷ lệ mảnh ghép xuất huyết dưới 25% ở nhóm keo dán fibrin là 34,9%, so với 53,2% ở nhóm chỉ khâu Đặc biệt, nhóm chỉ khâu có 2,1% mảnh ghép bị xuất huyết toàn bộ, trong khi nhóm keo dán fibrin không ghi nhận trường hợp nào Sự khác biệt về tình trạng xuất huyết mảnh ghép giữa hai nhóm sau phẫu thuật là rõ rệt với p = 0,00 < 0,01, cho thấy nhóm dùng chỉ khâu có tỷ lệ xuất huyết cao hơn so với nhóm sử dụng keo dán fibrin tự thân.
Bảng 3.20 Tình trạng xuất huyết mảnh ghép sau phẫu thuật 1 tuần
Tình trạng xuất huyết mảnh ghép
Nhóm can thiệp Nhóm chứng Chung p n % n % N %
BÀN LUẬN
Tóm tắt vấn đề nghiên cứu, mục tiêu và những phát hiện chính
Phương pháp cắt mộng ghép kết mạc tự thân hiện nay được xem là phương pháp điều trị tối ưu với tỷ lệ tái phát thấp, an toàn và ít biến chứng Được giới thiệu bởi tác giả Kenyon vào năm 1985, phương pháp này sử dụng mảnh ghép kết mạc tự thân được khâu cố định bằng chỉ Tuy nhiên, vào năm 2004, tác giả Koranyi đã cải tiến kỹ thuật bằng cách sử dụng keo fibrin thương mại Tisseel Baxter để cố định mảnh ghép kết mạc thông qua phương pháp ‘cắt’ và ‘dán’, thay thế cho chỉ khâu Việc sử dụng keo fibrin giúp rút ngắn thời gian phẫu thuật, giảm viêm và kích thích sau mổ, đồng thời hạn chế tái phát mà không làm tăng nguy cơ biến chứng.
Keo dán fibrin thương mại là nguyên liệu quan trọng trong y học, được sử dụng để dính tổ chức mô, cầm máu và lấp đầy tổ chức khuyết trong phẫu thuật Trong lĩnh vực Nhãn khoa, keo dán fibrin chủ yếu được áp dụng để cố định mảnh ghép kết mạc trong phẫu thuật mộng.
Nam keo dán fibrin thương mại không thực sự có sẵn để mua và giá thành đắt hơn chỉ khâu và chỉ có thời hạn sử dụng nhất định.
Y học cá thể hóa được dự đoán sẽ là mô hình y học trong tương lai, với tiềm năng tách chiết fibrinogen và thrombin từ máu tự thân của bệnh nhân để sản xuất keo dán fibrin Việc sử dụng keo dán fibrin tự thân mang lại nhiều lợi ích, bao gồm chi phí thấp, không lo ngại về lây nhiễm hay dị ứng, và khả năng
Chúng tôi đã nghiên cứu quy trình tách chiết các thành phần của keo dán fibrin và đánh giá hiệu quả cố định mảnh ghép vi thể trên động vật thực nghiệm Nghiên cứu cũng so sánh hiệu quả cố định mảnh ghép của keo dán fibrin tự thân với chỉ khâu trong phẫu thuật mộng mắt trên bệnh nhân.
Những phát hiện chính của nghiên cứu
Huyết tương nghèo tiểu cầu kết hợp với protamin 10mg/ml cho ra lượng fibrinogen trung bình đạt 2,3 ± 0,36 g/l, tương đương với tỉ lệ 81,05% ± 11,17% so với lượng fibrinogen tự do trong máu Khi kết hợp huyết tương với calci clorid 10% theo tỉ lệ 25:1 và ủ trong nước, ta thu được dung dịch thrombin hoạt động Việc kết hợp fibrinogen và thrombin theo tỉ lệ 1:1 sẽ tạo ra keo kết dính.
Kết quả mô học tổ chức kết mạc ghép khi nhuộm H&E ở ngày thứ 7 và
14 sau phẫu thuật thấy phản ứng viêm ở nhóm dùng keo dán fibrin tự thân ít hơn và liền tổ chức nhanh hơn so với nhóm chỉ khâu
Keo dán fibrin tự thân cố định mảnh ghép kết mạc với tỉ lệ thành công là
Sau 12 tháng theo dõi, tỷ lệ tái phát ở nhóm sử dụng keo dán fibrin tự thân là 0%, trong khi nhóm chỉ khâu có tỷ lệ tái phát 2,1% Hiệu quả cố định mảnh ghép của keo dán fibrin tự thân không chỉ tương đương mà còn mang lại nhiều lợi ích như giảm thời gian phẫu thuật, giảm viêm, hạn chế kích thích cho bệnh nhân và không cần cắt chỉ sau phẫu thuật.
Bàn luận kết quả nghiên cứu
4.2.1 Xây dựng quy trình tách chiết các thành phần tạo keo dán fibrin
Fibrinogen là một loại protein hòa tan trong máu, chiếm 0,2% tổng số máu trong cơ thể, với nồng độ bình thường từ 2-4 mg/ml Huyết tương nghèo tiểu cầu có nồng độ fibrinogen cao, được sử dụng để tách chiết fibrinogen Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, khi kết hợp huyết tương nghèo tiểu cầu với protamin ở nồng độ 10 mg/ml, lượng fibrinogen kết tủa đạt tối đa 81,05 ± 11,17%.
Cơ chế tách chiết fibrinogen bằng protamin dựa trên nguyên lý tạo liên kết ion không đặc hiệu giữa fibrinogen và protamin trong huyết tương, dẫn đến sự hình thành tủa không hòa tan Qua quá trình ly tâm, tủa fibrinogen được thu hồi và hòa tan trong dung dịch natri citrat 0,2M, tạo thành dung dịch fibrinogen đậm đặc Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là tính đơn giản và thời gian thực hiện ngắn, cho phép điều chỉnh khối lượng máu cần tách chiết từ rất ít đến nhiều Tuy nhiên, nhược điểm là protamin không phải là thuốc phổ biến và dễ dàng mua được.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự với nghiên cứu của Alston (2007): ở điều kiện tiêu chuẩn nhiệt độ 22 0 C dùng protamin thu được
Fibrinogen trong huyết tương đạt 96% ± 4% Nghiên cứu của Alston cho thấy mức fibrinogen trung bình cao hơn, có thể do họ thực hiện trong điều kiện tiêu chuẩn ở nhiệt độ 22°C, trong khi chúng tôi tiến hành ở nhiệt độ phòng khoảng 27°C Dù vậy, lượng fibrinogen cao nhất mà chúng tôi ghi nhận cũng đạt tới 96,08%.
Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện qua hai lần thăm dò nhằm xác định khối lượng protamin sulfate tối ưu để thu được lượng fibrinogen cao nhất từ huyết tương Thăm dò lần 1 xác định khối lượng protamin từ 0,6 mg đến 12 mg, trong khi thăm dò lần 2 tập trung vào khối lượng 0,9 mg đến 12 mg, cho thấy khối lượng 10 mg protamin cho lượng fibrinogen cao nhất, đạt từ 67,42% đến 96,08% (trung bình 81,05 ± 11,17%) so với nhóm chứng Mặc dù kết quả ở cùng khối lượng 10 mg có sự khác biệt giữa hai lần thăm dò (2,3 ± 0,36 g/l và 1,92 ± 0,39 g/l), chúng tôi đã sử dụng nhóm chứng để đảm bảo tính chính xác Ở khối lượng 11 mg và 12 mg, lượng fibrinogen thu được cũng gần tương đương, nhưng khó tan hơn khi hòa tan với natricitrat 0,2M, dẫn đến giảm nồng độ và chất lượng dính của keo fibrin Chúng tôi nhận thấy khối lượng protamin 10 mg/ml là tối ưu để tách chiết fibrinogen, vừa thu được nhiều nhất vừa dễ hòa tan Sự có mặt của protamin không ảnh hưởng đến tính chất hay sức bền của keo dán fibrin, đồng thời việc lấy huyết tương tự thân giữ lại một phần yếu tố XIII, làm tăng tính bền vững của liên kết fibrin khi có calci.
Nghiên cứu của Huỳnh Duy Thảo (2015) đã sử dụng keo dán fibrin tự thân để cố định mảnh ghép trong phẫu thuật cắt mộng ghép kết mạc Phương pháp tách chiết fibrinogen bằng cách tủa đông được áp dụng, tuy nhiên, nó tốn nhiều thời gian hơn và yêu cầu thiết bị làm lạnh Quá trình rã đông qua đêm cũng tiềm ẩn nguy cơ nhiễm khuẩn nếu không được thực hiện cẩn thận Trong khi đó, thời gian tách chiết fibrinogen trong nghiên cứu của chúng tôi chỉ mất khoảng 40 đến 45 phút.
Huyết tương được kết hợp với calci clorid 10% theo tỉ lệ 25:1 và ủ trong nước ở nhiệt độ 37°C trong 15 phút để thu được dung dịch thrombin hoạt động Phương pháp tách chiết thrombin được thực hiện theo quy trình của Accelerate Thrombin trong máu thường tồn tại dưới dạng tiền enzyme chưa hoạt động Cơ chế tách chiết thrombin tự thân bằng calci clorid hoạt động dựa trên nguyên lý rằng calci clorid khi thêm vào huyết tương chống đông sẽ kích thích prothrombinase, từ đó hoạt hóa prothrombin thành thrombin hoạt động Thrombin hoạt động có khả năng biến fibrinogen thành mạng lưới fibrin, làm cho fibrinogen và thrombin trở thành thành phần chính trong keo dán fibrin, giúp cầm máu và dính tổ chức trong phẫu thuật.
Tạo keo dán fibrin tự thân
Khác với một số nghiên cứu khác, chúng tôi đã tạo keo dán fibrin hoàn toàn từ hai thành phần tự thân, trong đó fibrinogen là protein tự do trong máu và dễ tách chiết hơn thrombin, vốn là sản phẩm thương mại Phương pháp tủa đông được coi là tiêu chuẩn vàng để tách chiết fibrinogen, tuy nhiên, quy trình này yêu cầu ít nhất một ngày một đêm để thực hiện.
Chúng tôi đã phát triển quy trình tách chiết đồng thời fibrinogen và thrombin trong khoảng 42,5 phút, từ 10 ml máu toàn phần thu được khoảng 4,5 ml huyết tương nghèo tiểu cầu Kết hợp 3 ml huyết tương với 10 mg/ml protamin cho ra 0,5-1 ml dung dịch fibrinogen, trong khi 1,5 ml huyết tương kết hợp với 0,06 ml calci clorid 10% ủ ở 37°C sẽ tạo ra 0,5-1 ml dung dịch thrombin hoạt động Thrombin tồn tại dưới dạng tiền enzyme và chỉ được kích hoạt khi có tổn thương mạch máu Đối với diện ghép kết mạc nhỏ, chỉ cần 10 ml máu tự thân có chống đông; nếu cần nhiều keo hơn, cần lấy thêm máu Tỷ lệ kết hợp fibrinogen và thrombin là 1:1, với thời gian tạo kết dính trung bình là 8 phút.
Keo dán fibrin Tisseel có nồng độ fibrinogen (72 mg/ml) và thrombin (400 UI/ml) cao hơn nhiều so với mức sinh lý bình thường, giúp hình thành keo fibrin nhanh chóng hơn Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy nồng độ fibrinogen trung bình đạt 81,05%, tuy nhiên nồng độ thrombin còn thấp dẫn đến thời gian tạo keo chậm Mặc dù chưa xác định chính xác nồng độ thrombin do thiếu phương tiện, chúng tôi nhận thấy thrombin thu được vẫn tạo phản ứng kết dính, mặc dù chậm Việc kết dính chậm này có lợi, giúp sắp xếp mảnh ghép kết mạc vào vị trí mong muốn.
Thị trường keo dán sinh học đang phát triển nhanh chóng nhờ vào những ưu điểm vượt trội của chúng Keo dán fibrin tự thân đang cạnh tranh với keo fibrin thương mại và ngày càng trở nên quan trọng do chi phí thấp, tính an toàn cao, và khả năng sản xuất theo nhu cầu mà không lo bị thoái triển Phương pháp tạo keo dán fibrin tự thân thay thế keo thương mại mang lại giá trị thực tế cao, với việc sử dụng protamin và calcium chloride để tách fibrinogen và thrombin từ huyết tương, có thể thực hiện tại các cơ sở y tế Thời gian tách chiết ngắn giúp quy trình này có thể được thực hiện ngay trước khi phẫu thuật, đồng thời cho phép sản xuất số lượng keo fibrin tự tạo ra theo nhu cầu sử dụng.
4.2.2 Đánh giá kết quả t h ực nghiệm trên thỏ
Sau khi xây dựng quy trình tách chiết fibrinogen và thrombin từ huyết tương người, nghiên cứu này không đánh giá lại trên thỏ thực nghiệm mà tập trung vào việc so sánh quá trình liền tổ chức mảnh ghép kết mạc giữa keo dán fibrin tự thân và chỉ khâu Mặc dù không thể thực hiện trên bệnh nhân, thí nghiệm trên mắt thỏ cung cấp thông tin cụ thể Kết quả cho thấy keo dán fibrin tự thân không chỉ cố định mảnh ghép kết mạc hiệu quả mà còn giảm phản ứng viêm và thúc đẩy quá trình liền tổ chức nhanh hơn so với chỉ khâu.
Geggel (1984) đã thực hiện nghiên cứu về quá trình hàn gắn biểu mô ở mắt thỏ và phát hiện rằng vào ngày đầu tiên, lớp tế bào biểu mô kết mạc bắt đầu di chuyển về trung tâm tổn thương mà không có tế bào hình đài ở bờ tổn thương Đến ngày thứ hai, biểu mô kết mạc tiếp tục tiến về trung tâm với bờ tổn thương rõ ràng hơn Các tế bào ở bờ tổn thương trở nên phẳng và dẹt Vào ngày thứ ba, bề mặt tổn thương được phủ bởi một hoặc hai hàng tế bào biểu mô Sau một tuần, bề mặt kết mạc được tái tạo với hai đến ba hàng tế bào biểu mô dày Cuối cùng, sau 2-3 tuần, bề mặt biểu mô tái tạo gần như hoàn toàn và số lượng tế bào hình đài trở lại gần mức bình thường.
4.2.3 Đánh giá hiệu quả và tính an toàn của keo dán fibrin tự thân trong phẫu thuật cắt mộng ghép kết mạc
4.2.3.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu
Tuổi trung bình củacác bệnh nhân trong nghiên cứu là 52,02 tuổi ± 11,98 tuổi, với 47% bệnh nhân ở nhóm tuổi dưới 50 và 43,9% ở nhóm tuổi từ 50 đến
69 Trong nghiên cứu của Alsarhani và cộng sự (2021) độ tuổi trung bình của bệnh nhân phẫu thuật mộng mắt là 53,32 tuổi ± 14,12 tuổi 118
Trong nghiên cứu của chúng tôi, 51,1% bệnh nhân có thị lực bình thường khi nhập viện, trong khi 39,1% có thị lực giảm nhẹ và một số bệnh nhân có thị lực giảm trung bình Sự suy giảm thị lực chủ yếu liên quan đến bệnh đục thủy tinh thể và độ tuổi cao Mộng gặpnhiều hơn ở người cao tuổi, có thể do sự suy giảm nguồn dự trữ tế bào gốc vùng rìa theo tuổi tác hoặc do tác động tích lũy của bức xạ UVB theo thời gian.
Thời gian tách chiết hai thành phần chính của keo fibrin
Thời gian trung bình để tách chiết fibrinogen và thrombin nhằm tạo ra keo dán fibrin tự thân là 42,33 ± 2,52 phút Trong quá trình này, chúng tôi đã tách chiết đồng thời cả hai thành phần Thời gian tách chiết của chúng tôi tương đương với thời gian pha trộn các thành phần của keo fibrin thương mại, và ngắn hơn nhiều so với nghiên cứu của một số tác giả sử dụng phương pháp tủa đông để tách chiết fibrinogen.
Thời gian phẫu thuật trung bình
Trong nghiên cứu phân tích gộp từ 17 nghiên cứu của Lan và cộng sự
Bàn luận điểm mạnh và hạn chế của nghiên cứu
4.3.1 Điểm mạnh của nghiên cứu Điểm mạnh nhất của nghiên cứu là thiết kế nghiên cứu bao gồm cả nghiên cứu thực nghiệm và thử nghiệm lâm sàng có nhóm chứng so sánh Giai đoạn 1 nghiên cứu thực nghiệm xây dựng được quy trình tách chiết các thành phần của keo dán fibrin từ máu toàn phần Nghiên cứu thực nghiệm trên động vật đánh giá hiệu quả của keo dán fibrin tự thân bằng minh chứng mô học tổ chức ghép nhuộm H&E Giai đoạn 2 nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng có đối chứng so sánh hiệu quả keo dán fibrin tự thân và chỉ khâu cố định mảnh ghép trong phẫu thuật cắt mộng ghép kết mạc Điểm mạnh của nghiên cứu là xây dựng được quy trình tách chiết đồng thời cả hai thành phần chính của keo fibrin tự thân từ một lượng máu ít, trong thời gian ngắnvới những thiết bị không quá đắt và phức tạp Đây là keo dán fibrin tự thân theo đúng nghĩa vì cả 2 thành phần chính được tách chiết từ chính máu của bệnh nhân Không như các nghiên cứu khác thường chỉ có thành phần fibrinogen là tự thân còn thrombin là sản phẩm thương mại sẵn có Nghiên cứu của chúng tôi đã tách chiết được thrombin hoạt động từ tiền enzyme (prothrombine) ở trong máu, đủ để kích hoạt biến fibrinogen thành fibrin tạo phản ứng kết dính.
Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trên thỏ để đánh giá mô học tổ chức ghép sau phẫu thuật ở các thời điểm 07, 14 và 30 ngày Kết quả nghiên cứu này cung cấp minh chứng quan trọng trong việc so sánh tác động của keo dán fibrin tự thân và chỉ khâu đối với mô học tổ chức ghép.
Nghiên cứu lâm sàng có đối chứng đã được thực hiện để đánh giá hiệu quả của phương pháp dùng keo dán fibrin tự thân trong việc cố định mảnh ghép kết mạc so với phương pháp khâu truyền thống Kết quả cho thấy, keo dán fibrin tự thân mang lại hiệu quả tương đương với chỉ khâu, đồng thời có những ưu điểm vượt trội như rút ngắn thời gian phẫu thuật, giảm đau cho bệnh nhân và loại bỏ sự khó chịu từ việc cắt chỉ sau phẫu thuật.
Nghiên cứu này tập trung vào các bệnh nhân có mộng độ II góc trong mắt, với tiêu chuẩn chọn bệnh được đồng nhất Đây là nghiên cứu đầu tiên đánh giá hiệu quả của việc dính mảnh ghép bằng keo dán fibrin tự thân, do đó chúng tôi đã chọn bệnh nhân có mộng độ II để đảm bảo tính phù hợp Sau phẫu thuật, bệnh nhân được điều trị nội trú tại bệnh viện, giúp quá trình theo dõi sau phẫu thuật diễn ra một cách cẩn thận.
Nghiên cứu của chúng tôi có thời gian theo dõi trung bình 1 năm, đủ dài để đánh giá tỉ lệ tái phát của phương pháp phẫu thuật Đặc biệt, trong nghiên cứu có 9 bệnh nhân được áp dụng đồng thời phương pháp can thiệp bằng keo dán fibrin tự thân và phương pháp đối chứng dùng chỉ khâu để cố định mảnh ghép kết mạc cho cả hai mắt Kết quả nghiên cứu trên những bệnh nhân này có giá trị cao trong việc đánh giá triệu chứng cơ năng do tính đồng nhất trong cùng một bệnh nhân.
4.3.2 Hạn chế của nghiên cứu
Nghiên cứu mới chỉ tập trung vào bệnh nhân mắc mộng mắt độ II, do đó kết quả có thể không phản ánh đầy đủ tình trạng của tất cả bệnh nhân mộng mắt, đặc biệt là những người có độ mộng nặng hơn.
Hạn chế của nghiên cứu là nồng độ thrombin tự thân thu được thấp, dẫn đến phản ứng tạo keo diễn ra chậm, với thời gian kết dính trung bình là 8 phút, trong khi keo fibrin thương mại chỉ cần 1-2 phút Tuy nhiên, điều này có lợi cho phẫu thuật cắt mộng ghép kết mạc, vì cần thời gian để căn chỉnh mảnh ghép vào vị trí mong muốn Nghiên cứu không đủ thiết bị để định lượng nồng độ thrombin và độ dính của keo fibrin Ngoài ra, một số yếu tố khác như nhiệt độ phòng, mức độ tuân thủ của bệnh nhân và độ rộng của thân mộng ở vùng rìa cũng chưa được đánh giá, ảnh hưởng đến kết quả phẫu thuật.
Thời gian theo dõi trong nghiên cứu chưa đủ dài, với số lượng bệnh nhân tham gia còn khiêm tốn, và đối tượng nghiên cứu chỉ giới hạn ở bệnh nhân mộng mắt nguyên phát độ.
II Nghiên cứu cần được theo dõi trong thời gian dài hơn để đánh giá đúng tỉ lệ tái phát và mở rộng nghiên cứu với mộng mắt độ lớn hơn và số bệnh nhân nghiên cứu nhiều hơn Một số tác giả tin rằng nếu theo dõi trong thời gian đủ dài thì tỉ lệ tái phát sẽ cao hơn so với những nghiên cứu đã công bố trước đây 41 Trong nghiên cứu có sự không cân đối về giới tính với tỉ lệ nữ nhiều hơn nam ở cả hai nhóm nghiên cứu
Nghiên cứu thực nghiệm trên thỏ đã so sánh mức độ viêm và khả năng phục hồi tổ chức giữa keo dán fibrin tự thân và chỉ khâu vicryl 8/0, cho thấy sự khác biệt rõ rệt khi so với chỉ nylon 10/0 được sử dụng trên bệnh nhân.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
Nghiên cứu mới đang tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình tách chiết thrombin nhằm đạt nồng độ cao hơn, từ đó tăng tốc độ phản ứng tạo keo Đồng thời, việc nâng cao nồng độ fibrinogen cũng sẽ cải thiện khả năng dính của keo, mang lại hiệu quả tốt hơn trong ứng dụng.
Mở rộng nghiên cứu tìm tỉ lệ kết hợp giữa fibrinogen và thrombin để có hiệu quả kết dính nhanh nhất
Để nâng cao hiệu quả của phương pháp phẫu thuật, cần nghiên cứu kỹ lưỡng cách lấy mảnh ghép sao cho mảnh ghép sau phẫu thuật phù hợp và khít với diện ghép, từ đó tạo ra kết quả thẩm mỹ đẹp Thời gian theo dõi sau phẫu thuật cũng nên được kéo dài hơn để đánh giá chính xác hiệu quả của kỹ thuật này.
Nghiên cứu mở rộng về các trường hợp mộng mắt độ III và mộng tái phát với số lượng bệnh nhân lớn hơn sẽ giúp làm rõ hiệu quả điều trị Xu hướng tương lai là so sánh hiệu quả của dính mảnh ghép kết mạc bằng keo dán fibrin tự thân và máu tự thân Nếu máu tự thân chứng minh hiệu quả tương đương với keo dán fibrin tự thân, quy trình phẫu thuật cắt mộng ghép kết mạc sẽ trở nên đơn giản hơn, giảm thiểu quy trình tách chiết fibrinogen và thrombin, mang lại lợi ích cho cả bệnh nhân và bác sĩ phẫu thuật nhãn khoa.