Phân tích thành phần STIPULEANOSID r2 trong các bộ phận của cây sâm vũ diệp

Chiết xuất saponin từ các bộ phận lá, thân, rễ Sâm Vũ Diệp...25 Trang 5 Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU LỜI CẢM ƠNTrong thời gian tiến hành nghiên cứu và hoàn thiện đề

TỔNG QUAN

Tổng quan về Sâm Vũ Diệp

Sâm Vũ Diệp có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem [1], SVD thuộc chi Sâm (Panax L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2].

Sâm Vũ Diệp là cây thân thảo lâu năm, ưa bóng và ẩm, với thân rễ dài có nhiều đốt và vết sẹo do thân rụng hàng năm Thân khí sinh cao từ 20 - 30 cm, thường mọc thẳng và rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đông và tái sinh từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 Lá kép chân vịt gồm 2 - 3 lá mọc vòng, với lá chét 5 - 7 thuôn dài từ 2,5 - 14 cm và rộng từ 1,5 - 4 cm, có gốc tròn, đầu nhọn, xẻ thùy không đều và mép có răng cưa.

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái Sâm Vũ Diệp 1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái

SVD phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc Việt Nam, với Sa Pa là điểm phân bố cuối cùng ở phía nam Cây SVD được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại núi Hàm Rồng, gần thị trấn Sa Pa, ở độ cao 1600 m Tuy nhiên, hiện nay, vùng phân bố của SVD đã bị thu hẹp đáng kể, và cây trở nên cực kỳ hiếm gặp ở độ cao từ 1800 m trở lên.

[1] Gần đây SVD đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang và Lào Cai [18].

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Hình 1.2 Đặc điểm thực vật và vùng phân bố Sâm Vũ Diệp.

Sâm Vũ Diệp thường mọc rải rác hoặc tập trung dưới tán rừng ẩm, nơi có sương mù quanh năm Đất nơi SVD phát triển là feralit có mùn, thường xuất hiện cùng với thảm rêu dày trên hốc đá hoặc gốc cây lớn Loài cây này ưa khí hậu ẩm mát, và các chỉ số khí hậu tại Trạm quan trắc đèo Hoàng Liên Sơn cho thấy SVD đã tồn tại và phát triển bền vững trong điều kiện nhiệt độ trung bình năm 12.8°C, lượng mưa 3552 mm/năm, lượng bốc hơi 494 mm/năm và độ ẩm không khí trung bình khoảng 90%.

Vào cuối tháng 2 và đầu tháng 3 hàng năm, chồi thân từ phần đầu mầm thân rễ phân nhánh sẽ mọc lên, phát triển nhanh chóng trong vòng một tháng và gần đạt chiều cao cực đại Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa, với quả xanh xuất hiện từ cuối tháng 4 đến tháng 6 Quả chín vào tháng 7 và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ, nhưng do lượng mưa lớn trong tháng 7 – 8, hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên Từ tháng 9 đến tháng 10, phần thân mặt đất tàn lụi qua mùa đông, để lộ những vết sẹo thân rễ, giúp xác định tuổi của cây.

Nghiên cứu về Sâm Vũ Diệp (SVD) hiện vẫn còn hạn chế, nhưng các kết quả cho thấy saponin là thành phần hóa học chính có hoạt tính trong SVD Theo nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự vào năm 2009, saponin tổng số trong thân rễ và rễ củ của SVD được định lượng bằng phương pháp trọng lượng của Namba là 5,86%.

Lá và thân rễ Sâm Vũ Diệp chứa chủ yếu các Saponin khung oleanan với hàm lượng cao, bên cạnh một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn.

Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã phân lập 13 saponin khung dammaran từ lá của cây này, trong đó có các ginseng saponin như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 Thân rễ SVD chứa saponin thuộc nhóm oleanan, bao gồm chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học của SVD còn mới mẻ; nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2002 cho thấy trong thân rễ và rễ củ SVD có hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin, cùng với acid béo và acid amin Qua thủy phân saponin, nghiên cứu cũng thu được acid oleanolic.

Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc đã phân lập và xác định 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2) là thành phần chính trong rễ cây SVD, được

Me: methyl Ara(f): α-L-arabinofuranosy Ara(p): α-L-arabinopyranosy

Năm 2017, Đỗ Văn Hào đã tách và xác định cấu trúc hóa học của ba hợp chất β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol từ rễ SVD, cụ thể là từ phân đoạn ethyl acetat Hình 1.3 minh họa cấu trúc hóa học của mười saponin được chiết xuất từ rễ SVD.

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol.

Năm 2018, Thạc sỹ Nguyễn Thu Thủy đã thành công trong việc phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hai hợp chất mới từ thân rễ SVD, bao gồm stipuleanosid R2 và aralosid methyl ester.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU a) Stipuleanosid R2. b) Aralosid A methyl ester.

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của Stipuleanosid R2(a) và Aralosid A methyl(b) ester.

Như vậy, tổng cộng có 23 hợp chất saponin đã được xác định từ các phần của cây SVD có liên quan đến tác dụng sinh học.

Bảng 1.1 Các thành phần hóa học đã nghiên cứu trong Sâm Vũ Diệp

Nhận xét : Các kết qủa nghiên cứu bước đầu chỉ ra rằng saponin

Stipuleanosid R2 là thành phần chính trong dược liệu SVD (thân rễ) với hàm lượng cao, cùng với một số saponin khung dammaran có hàm lượng thấp hơn Tuy nhiên, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào thân rễ của SVD, trong khi các bộ phận khác như lá và thân trên mặt đất chưa được khai thác nhiều Do đó, nghiên cứu này sẽ phân tích thành phần hóa học của thân, lá và thân rễ SVD trồng ở Sa Pa, đặc biệt là Stipuleanosid R2, nhằm so sánh thành phần và hàm lượng giữa các bộ phận, từ đó cung cấp cơ sở khoa học cho dược liệu SVD tại Việt Nam.

Tính vị, công năng: SVD có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [1].

Nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD cho thấy nó có độc tính cấp rất thấp khi thử nghiệm trên động vật, đồng thời tăng cường chức năng sinh lý và ảnh hưởng tích cực đến hệ thần kinh trung ương SVD cũng giúp tăng sức dẻo dai của cơ thể và sức đề kháng, cùng với tác dụng tán huyết Ngoài ra, một số Saponin trong SVD có tác dụng chống viêm, chống oxi hóa, chống ung thư, bảo vệ tim mạch, hỗ trợ điều trị tiểu đường và bảo vệ tế bào thần kinh, góp phần giải thích lợi ích dược học của SVD trong y học truyền thống.

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã chứng minh rằng SVD có khả năng chống stress, ngăn ngừa trầm cảm, bảo vệ gan và kích thích hệ miễn dịch.

Từ xa xưa, SVD đã được sử dụng như một loại thuốc bổ huyết, đặc biệt cho phụ nữ sau sinh và người cao tuổi Ngoài ra, SVD còn được bôi lên vết thương để cầm máu, tiêu sưng, và thúc đẩy quá trình lành vết thương Hơn nữa, SVD cũng được coi là thực phẩm tăng cường sinh lực và kích thích sinh dục thông qua việc ngâm rễ SVD và chiết xuất thành tinh sâm, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.

Trong y học cổ truyền Việt Nam, thân rễ của SVD được sử dụng để bồi bổ tinh thần và thể chất, cải thiện trí nhớ, giảm nguy cơ ung thư và hạ đường huyết cho bệnh nhân tiểu đường Tại Trung Quốc, SVD còn được áp dụng trong điều trị lao phổi, chảy máu cam, thổ huyết và các chấn thương do va đập.

Tổng quan về Saponin

Saponin, hay còn gọi là saponosid, là một nhóm glycoside có cấu trúc genin là triterpene hoặc steroid với 27 carbon, thường gặp trong thực vật và động vật như sao biển và hải sâm Truyền thống, saponin được định nghĩa qua một số đặc tính chung đặc trưng của nhóm hợp chất này.

 Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước.

 Làm vỡ hồng cầu ngay cả khi ở nồng độ loãng.

 Độc với cá, diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên…

 Kích thích niêm mạc mắt gây hắt hơi, đỏ mắt.

 Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3β-hydroxysteroid Tuy nhiên không phải tất cả steroid đều thể hiện tất cả tính chất trên.

Saponin có cấu trúc gồm hai phần chính: phần đường và phần aglycon (hay sapogenin) Chúng có thể có cấu trúc triterpen với khung 30C hoặc steroid với khung 27C, dẫn xuất từ cholestan Sự khác biệt giữa các sapogenin chủ yếu nằm ở mức độ oxi hóa và vị trí, số lượng của các nhóm thế như hydroxyl, oxo, hoặc sulfat Nhóm OH thường có định hướng β và gắn ở vị trí C3, là vị trí liên kết với đường trong hầu hết các saponin Đa số saponin có từ 1-2 mạch đường, được phân loại thành monodesmosid và bidesmosid, với phần đường gắn vào sapogenin chủ yếu ở vị trí cụ thể Sự đa dạng của saponin chủ yếu do thành phần, số lượng và vị trí của các đường trong phân tử.

Saponin là một hợp chất có thể chứa mạch đường thứ hai, với tổng số đơn vị đường có thể lên tới 11, trong khi số đường trên một mạch hiện tại được biết tối đa là 8 Thông thường, saponin có từ 1 đến 4 đơn vị đường, bao gồm các loại đường như β-D-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose và α-L-arabinose.

Saponin được chia thành hai nhóm lớn dựa trên cấu trúc hóa học của genin, bao gồm saponin triterpenoid và saponin steroid, mỗi nhóm lại có nhiều phân nhóm nhỏ Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng thành phần chủ yếu trong thân rễ và rễ củ của cây SVD là saponin thuộc nhóm triterpenoid khung oleanan, với sapogenin được xác định là acid oleanolic.

Hình 1.6 Thành phần saponin thuộc nhóm triterpenoid có trong Sâm Vũ Diệp.

Tổng quan về Stipuleanosid R2

Stipuleanosid R2 là một saponin quan trọng, đang thu hút sự chú ý nghiên cứu từ các nhà khoa học Hợp chất này đã được phân lập từ nhiều dược liệu như Sâm Vũ Diệp, Tam Thất hoang, Aralia taibaiensis và Aralia elata.

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Stipuleanosid R2

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (2S,3S,4R,5R,6R)-6- [[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b-heptamethyl-8a- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxycarbonyl- 1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]-3[(2S,3R,4R,5S)- 3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4-

[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2- carboxylic acid [16].

Tính chất lý hóa: Chất bột màu trắng, độ tan: 0,57 g/L, điểm nóng chảy

Tổng quan về một số nghiên cứu phân tích định tính và định lượng về thành phần hóa học trong Sâm Vũ Diệp

Vào năm 2009, Trần Công Luận và cộng sự đã tiến hành định lượng saponin tổng số trong thân rễ và rễ củ của Sâm vũ diệp, sử dụng phương pháp trọng lượng Namba, và đạt được kết quả là 5,86%.

Vào năm 2017, Đỗ Văn Hào và Nguyễn Thị Huệ đã thực hiện khảo sát để xác định điều kiện sắc ký và phát triển phương pháp định tính, định lượng acid oleanolic trong dược liệu SVD thông qua kỹ thuật HPLC–DAD Kết quả phân tích định tính và định lượng được trình bày trong bảng 1.2.

Bảng 1.2 Điều kiện sắc ký và kết quả phân tích định tính, định lượng acid oleanolic trong dược liệu Sâm Vũ Diệp

- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)

- Pha động: MeOH - Acid acetic 0,15%/H2O (85:15, v/v)

- Detector UV-DAD phát hiện ở bước sóng: 203 nm - Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Thể thớch bơm mẫu: 20 àl

- Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng

Vào năm 2018, Nguyễn Thị Thu Thủy đã xác định và định lượng thành phần chính stipuleanosid R2 trong mẫu thân rễ SVD với tỷ lệ 0,49% bằng phương pháp HPLC-DAD, được thực hiện theo các điều kiện cụ thể.

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity.

 Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm).

 Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203 nm.

 Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.

 Thể thớch bơm mẫu: 20 àl.

 Dung môi pha mẫu: Methanol.

 Pha động: Acetonitril (kênh A): 0,5% acid acetic/H2O (kênh B) với chương trình gradient như bảng 1.3.

Bảng 1.3 Chương trình pha động chạy HPLC-DAD

Kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy các chỉ số định tính và định lượng của thành phần Stipuleanosid R2 trong thân rễ cây SVD Hiện tại, chưa có công bố nào về phân tích các thành phần saponin cụ thể trong các bộ phận khác của cây SVD Nghiên cứu này đã thực hiện phân tích định tính và định lượng Stipuleanosid R2, saponin chính, bằng các phương pháp TLC và HPLC.

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mẫu nghiên cứu về thân rễ, thân và lá của Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 3 năm tuổi được thu hái tại Sa Pa, Lào Cai vào tháng 3/2016 Việc giám định tên khoa học được thực hiện bởi TS Phạm Thanh Huyền thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Mẫu tiêu 4 bản (PB-001/2016) hiện đang được lưu giữ tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN.

Hình 2.1 Mẫu dược liệu Sâm Vũ Diệp

- Chất chuẩn liên kết Stipuleanosid R2 của Wako Chemicals, Nhật Bản (độ tinh khiết 98%, mã sản phẩm 155-01701)

- Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC.

- Ethanol 70% được pha từ Ethanol PA.

- Acid acetic 0.5%/H 2 O được pha từ acid acetic PA (Merk, Đức) - Methanol dùng cho HPLC (Merk Đức).

- Nước cất hai lần đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV.

- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Metanol, acetonitril) của Merck, Đức.

- Sắc ký lớp mỏng pha đảo bằng silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức).

- Các dụng cụ dùng trong quá trình thực nghiệm như bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, ống nghiệm, ống đong, pipet, kim tiêm

- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức).

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (Precisa- Thụy Sĩ).

- Máy siêu âm Power sonic 405(Powersonic - Hàn Quốc).

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ).

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động.

2.2 PHƯƠNG PHÁP 2.2.1 Phương pháp chiết xuất Sâm Vũ Diệp

Nghiên cứu về Sâm Vũ Diệp cho thấy saponin là thành phần chính của dược liệu Để lựa chọn quy trình chiết xuất phù hợp cho từng bộ phận, có thể tham khảo tài liệu về chiết xuất saponin và saponinogen, cũng như luận văn thạc sĩ của Nguyễn Thị Thu Thủy về thành phần saponin của thân rễ SVD.

 Cân 500 g thân rễ SVD (độ ẩm được xác định là 7,81%), chiết bằng phương pháp chiết hồi lưu ở nhiệt độ 65-70℃ với dung môi ethanol 70% trong 3 giờ (chiết

 Mẫu thân và lá SVD được rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ Tiến hành chiết kiệt 450g mẫu bằng dung môi ethanol 70%, chiết hồi lưu 3 lần (mỗi lần 1500 mL trong

3 giờ) Gộp dung môi, lọc loại bỏ bã nguyên liệu, sau đó cất quay áp suất giảm loại bỏ EtOH ở nhệt độ 65-70℃ cho 57,6 g cao chiết tổng ethanol.

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết.

Hình 2.3 Dịch lọc rễ, thân, lá SVD

Cao chiết saponin thu được dùng làm mẫu để thực hiện các phương pháp phân tích tiếp theo.

`2.2.2 Phương pháp phân tích TLC

Pha tĩnh: bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức).

Phương pháp phát hiện: Phun thuốc thử acid sulfuric (10%)/ EtOH 96%, hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện.

 Tiến hành sắc ký đồng thời các dung dịch: dung dịch chất đối chiếu, dung dịch các cao chiết phân đoạn.

 So sánh vị trí, màu sắc các vết trên sắc ký đồ.

2.2.3 Phương pháp định lượng Stipuleanosid R2 bằng HPLC

Chúng tôi đã tham khảo phương pháp nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ của Nguyễn Thị Thu Thủy về thành phần saponin của thân rễ SVD và các nghiên cứu trước đó về định lượng Stipuleanosid R2 để lựa chọn phương pháp HPLC cho nghiên cứu này.

Để chuẩn bị mẫu cho quá trình sắc ký, cần cân chính xác khoảng 1,0 mg hợp chất stipuleanosid R2 và pha thành dung dịch gốc có nồng độ 1000 μg/ml với dung môi MeOH Sau đó, siêu âm dung dịch trong khoảng 10 phút và ly tâm để lấy dịch chiết Cuối cùng, lọc dịch chiết qua màng lọc có kích thước 0,45 μm để thu được dung dịch sẵn sàng cho quá trình sắc ký.

Để chuẩn bị mẫu thử cho sắc ký, cân chính xác khoảng 0,1g cao tổng thân rễ và 0,5g cao tổng thân và lá SVD (độ ẩm 7,8 %), cho vào bình định mức 10ml Thêm 7ml MeOH và lắc siêu âm trong 10 phút để hòa tan hoàn toàn Sau đó, lọc các dung dịch qua màng lọc kích thước 0,45µm để thu được dung dịch sẵn sàng cho quá trình sắc ký.

Mẫu trắng : dung dịch MeOH.

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity.

 Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm).

 Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203nm.

 Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.

 Thể thớch bơm mẫu: 20àl.

 Dung môi pha mẫu: Methanol.

 Pha động: Acetonitril (kênh A) - 0,5% Acid acetic/H2O (kênh B) với chương trình gradient như Bảng 2.1

Bảng 2.1 Chương trình dung môi chạy HPLC-DAD

Mục tiêu: phương pháp phân tích được xây dựng nhằm mục đích định tính và định lượng thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận khác nhau của SVD.

Nguyên tắc: sử dụng chất chuẩn liên kết Stipuleanosid R2 để xây dựng đường chuẩn.

2.2.3.2 Kết quả thẩm định phương pháp phân tích a) Tính đặc hiệu

Tiến hành sắc ký các mẫu trắng, mẫu chuẩn stipuleanosid R2 và mẫu thử theo quy trình phân tích đã đề ra Ghi lại sắc ký đồ và xác định thời gian lưu cùng với phổ để đảm bảo tính chính xác trong kết quả phân tích.

UV của pic stipuleanosid R2 trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn Kết quả thu được được trình bày trong các hình sau.

Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử

Kết quả phân tích cho thấy sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không có pic tại thời gian lưu tương ứng với stipuleanosid R2 trong dung dịch chuẩn Ngược lại, sắc ký đồ của dung dịch thử xuất hiện một pic có thời gian lưu khớp với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trong dung dịch chuẩn, cho thấy tính thích hợp của hệ thống.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân tích dung dịch chuẩn của stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần Qua quá trình sắc ký, các sắc ký đồ được ghi lại và giá trị thời gian lưu, diện tích pic, cũng như hệ số đối xứng đã được xác định Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu là 0,15%, diện tích pic là 2,75%, và hệ số bất đối là 1,21%, tất cả đều thấp hơn 3%, chứng tỏ tính ổn định và độ chính xác của phương pháp phân tích.

Các điều kiện sắc ký được lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng cho phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp đã cho thấy tính ổn định và sự phù hợp cao.

Bảng 3.3 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc với các hệ số pha loãng khác nhau Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, mỗi dung dịch được tiêm 3 lần, ghi lại sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic Phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn trong mẫu so và đáp ứng pic được xác định bằng phương pháp bình phương tối thiểu Kết quả cho thấy có tương quan tuyến tính giữa diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch, theo phương trình y = 2,6081x + 49,1185 với hệ số tương quan R² = 0,9988.

Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 15,625 đến 400 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ stipuleanosid, với hệ số tương quan rất cao (R²).

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2 STT Nồng độ (àg/ml) Diện tớch pic (mAU*s)

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 d) Giới hạn phát hiệu (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện là LOD = 1,953 àg/ml, giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,445 àg/ml.

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp đã phát triển có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương đối phù hợp để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong Sâm Vũ Diệp, đồng thời cho thấy độ lặp lại của phương pháp này.

Đã tiến hành định lượng 6 mẫu thử độc lập, mỗi mẫu được tiêm 3 lần để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 Phương pháp sử dụng đường chuẩn để xác định khoảng tuyến tính, với độ lặp lại được đánh giá qua giá trị RSD (%) Kết quả cho thấy hàm lượng stipuleanosid R2 trong mẫu có độ lệch chuẩn tương đối RSD < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt và có khả năng ứng dụng trong phân tích stipuleanoside R2 (PBF41) trong sâm vũ diệp.

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp

Nồng độ cao (mg/ml)

Khi thêm các lượng stipuleanosid R2 chuẩn khác nhau, phương pháp cho độ thu hồi ổn định và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trong khoảng cho phép Kết quả này chứng minh rằng phương pháp phát triển có độ thu hồi tốt, thích hợp cho việc định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp, như được trình bày trong Bảng 3.6.

Bảng 3.6 Khảo sát độ thu hồi

Lượng tìm lại (àg) Độ thu hồi (%)

 Định lượng các mẫu dược liệu

Tiêm riêng biệt các dung dịch mẫu thử, mỗi mẫu thử lặp lại 3 lần, ghi nhận sắc ký đồ và ghi lại đáp ứng của chất cần phân tích.

Nồng độ của stipuleanosid R2 trong dung dịch thử được xác định dựa trên công thức:

Với S là diện tích pic stipuleanosid R2; a,b là các hệ số của phương trình đường chuẩn y = ax+b, H là độ tinh khiết của chất đối chiếu (%).

Hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu được xác định dựa trên công thức:

X: hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu (%).

C: Nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch thử, xác định được bằng đường chuẩn (àg/ml). a: độ ẩm của dược liệu (%).

+ Tập hợp kết quả và loại bỏ giá trị thô theo test Dixon.

+ Tính giá trị trung bình:

+ Tính độ lệch chuẩn tương đối:

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ

Hiệu suất của cắn 3 phân đoạn so với cắn toàn phần và so với nguyên liệu khô được trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1 Hàm ẩm nguyên liệu thu được từ các bộ phận

Lần đo Hàm ẩm thân lá (%) Hàm ẩm thân rễ (%)

Bảng 3.2 Hiệu suất chiết các bộ phận

Bộ phận Khối lượng nguyên liệu (g)

Khối lượng cao tổng EtOH (g)

3.2 Định tính bằng TLC thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận Sâm

Tiến hành chạy sắc ký TLC để định tính Stipuleanosid R2 trong cao chiết từ các bộ phận SVD bằng hệ dung môi triển khai Sau khi phun thuốc thử dung dịch H2SO4 10% trong EtOH và sấy ở 120°C, các vết được quan sát dưới ánh sáng thường Kết quả cho thấy giá trị hệ số di chuyển Rf của Stipuleanosid R2 so với chất đối chiếu, từ đó xác định được sự hiện diện của hợp chất này trong mẫu.

Hình 3.3 Kết quả TLC Stipuleanosid R2 của các bộ phận dược liệu Sâm Vũ Diệp 1: mẫu cao tổng của thân và lá.

2: mẫu cao tổng của thân rễ.

Nhận xét : kết quả TLC cho thấy vết sắc ký của Stipuleanosid R2 xuất hiện ở cả cao chiết của phần thân lá và thân rễ SVD.

3.3 Định tính thành phần Stipuleanosid R2 trong cao chiết từ các bộ phận Sâm Vũ Diệp bằng HPLC

Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 (A) và các mẫu cao của thân rễ

(B), thân và lá (C) Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.).

Chương trình phân tích HPLC đã được sử dụng để xác định chất tinh khiết stipuleanosid R2 và các mẫu cao toàn phần từ thân rễ, lá và thân của SVD Kết quả phân tích HPLC cho thấy sắc ký đồ của các bộ phận này xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với chất chuẩn stipuleanosid R2 (t R = 15,565-15,85 phút), cùng với thông số độ tinh khiết pic và chồng phổ UV từ đầu dò DAD Ngoài ra, các tín hiệu chính khác cũng cho thấy sự tương đồng, đặc biệt là tín hiệu tại t R = 16,616 ở thân rễ và t R = 16,166 phút, cho thấy sự hiện diện của thành phần saponin chưa xác định trong các bộ phận rễ, thân và lá.

3.4 Định lượng Stipuleanosid R2 trong các bộ phận Sâm Vũ Diệp bằng HPLC

Kết quả định tính từ TLC và HPLC, kết hợp với các nghiên cứu trước đây, xác nhận rằng saponin khung oleanan là thành phần chính trong SVD, với stipuleanosid R2 là hợp chất quan trọng Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng stipuleanosid R2 nhằm đánh giá SVD theo kế hoạch nghiên cứu Kết quả sẽ được trình bày trong phần tiếp theo.

Bảng 3.7 Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD

STT Khối lượng nguyên liệu (g)

Hàm lượng Stipuleanosid R2 trong nguyên liệu khô

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU b) Định lượng stipuleanosid R2 trong thân và lá SVD

Bảng 3.8 Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân và lá SVD

STT Khối lượng nguyên liệu (g)

Hàm lượng Stipuleanosid R2 trong nguyên liệu khô (%)

Hình 3.5 Sắc ký đồ cao tổng lá và thân SVD

CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN

4.1 Về chiết xuất và xác định thành phần saponin có trong các bộ phận của Sâm Vũ Diệp

4.2 Về định lượng sơ bộ thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận của Sâm Vũ Diệp bằng HPLC

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

 Tiến hành thẩm định lại phương pháp HPLC trên cao chiết EtOH bộ phận thân và lá cây Sâm Vũ Diệp.

 Triển khai phân lập và tinh chế thêm các hợp chất Stipuleanosid R2 trong thân và lá cây Sâm Vũ Diệp.

 Tiến hành các nghiên cứu thêm về thành phần hóa học trong thân và lá SVD.

 Xây dựng chất chuẩn stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp.

 Tiến hành khảo sát động thái tích lũy, sự thay đổi thành phần hóa học theo độ tuổi.

 Dựa trên kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học, cần tiếp tục nghiên cứu tác dụng sinh học của loài này.

Tiêu đề	Phân Tích Thành Phần Stipuleanosid R2 Trong Các Bộ Phận Của Cây Sâm Vũ Diệp
Tác giả	Trần Thị Ngọc Hà
Người hướng dẫn	GV.TS. Nguyễn Hữu Tùng
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp đại học
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	45
Dung lượng	1,48 MB