TỔNG QUAN
Tổng quan về họ Sargassaceae
Theo hệ thống phân loại thực vật, họ Sargassaceae có vị trí phân loại như sau:
Phân giới thực vật bậc thấp
Bộ rong Đuôi ngựa: Fucales
Họ Rong mơ: Sargassaceae Theo hệ thống phân loại của Agardh, J.G (1889), họ Rong mơ Sargassaceae gồm có 3 chi:
Chi Hormophysa Kuetzing 1843 (Rong Khế)
Chi Turbinaria Lamouroux 1828 (Rong Cùi bắp)
Chi Sargassum Agardh, C 1821 (Rong Mơ) gồm 5 phân chi:
Phyllotricha J Ag, Schizophycus J Ag, Bactrophycus J Ag, Arthrophycus J Ag, Eusargassum J Ag.[3]
1.1.2 Phân bố và thu hái 1.1.2.1 Phân bố
Họ Rong mơ (Sargassaceae) thuộc ngành Rong Nâu (Phaeophyceae) là nhóm rong biển chủ yếu phân bố ở vùng biển nhiệt đới Chúng có kích thước lớn và sản lượng cao nhất trong số các loài rong biển tại Việt Nam.
Họ Rong mơ chủ yếu phân bố ở các quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Australia và Philippines Tại Việt Nam, họ thường tập trung nhiều ở các đảo và ven biển của các tỉnh như Quảng Ninh, Hải Phòng, Thanh Hóa, Nghệ Tĩnh, Bình Trị Thiên, Nghĩa Bình, Phú Khánh, Thuận Hải, Đồng Nai và Kiên Giang.
Hình 1.1: Nghiên cứu hiện trạng rong biển tại 19 đảo: Họ Sargassaceae có số loài nhiều nhất (33 loài) trong tổng số 62 họ đã xác định [5]
Rong biển thường trưởng thành và phóng thích giao tử vào các tháng 3, 4, 5, với sản lượng cao nhất vào tháng 3 Tuy nhiên, vào thời điểm này, rong chưa hoàn toàn trưởng thành và hàm lượng acid alginis còn thấp, do đó, việc khai thác nên được thực hiện vào tháng 4 và các tháng tiếp theo Hành động này không chỉ giúp tối ưu hóa sản lượng mà còn bảo tồn nòi giống cho mùa vụ tiếp theo.
1.1.3 Đặc điểm hình thái các đại diện của họ Sargassaceae
Các đơn vị phân loại trong họ Sargassaceae sở hữu những đặc điểm hình thái độc đáo, tương tự như thực vật bậc cao Cơ quan bám của chúng có hình dạng giống rễ, với sự phân nhánh phát triển mạnh mẽ, đặc biệt ở các chi Hormophysa, Turbinaria và một số loài thuộc chi Sargassum.
Lá là cơ quan dinh dưỡng quan trọng với hình dạng và kích thước đa dạng, có khả năng phân nhánh Mép lá có thể có răng cưa to, nhọn hoặc cùn, thậm chí có thể trở nên trơn nhẵn Đặc biệt, rong mơ có một cơ quan chứa không khí gọi là phao hay túi khí, có mối liên hệ chặt chẽ với lá, cho thấy phao có nguồn gốc từ lá và có xu hướng chuyển hóa thành dạng riêng biệt.
Cơ quan sinh sản của cây được gọi là đế, có hình dạng khác nhau giữa cây đực và cây cái Đế đực thường có hình trụ, trong khi đế cái có thể dẹp hoặc có 3 cạnh, với các đặc điểm như răng hoặc gai Chúng có thể mọc đơn giản hoặc tạo thành chùm dày phân nhánh phức tạp.
Hình 1.2: Một số cơ quan đặc trưng của các loài thuộc họ Sargassaceae[3]
Họ Rong mơ Sargassaceae có thành phần hóa học rất phong phú và đa dạng với các hợp chất mang giá trị dinh dưỡng cao
Theo nghiên cứu, thành phần của rong biển chủ yếu bao gồm nước (chiếm khoảng 80-90%), protein (5-20,5% trọng lượng khô), 17 loại acid amin được xác định qua phương pháp sắc ký lỏng cao áp, lipid (0,2-0,6%), cùng với các sắc tố, khoáng chất, hợp chất chống oxy hóa và các nguyên tố đa lượng như K, Na, Mg, S.
…) và đặc biệt là các nguyên tố vi lượng (hàm lượng các nguyên tố Fe, Mn,
Cu và Zn trong Rong Mơ rất cao mà không phải loài thực vật nào trên cạn cũng đạt được).[7]
Rong Mơ chứa các sắc tố như diệp lục tố (Chlorophyn), diệp hoàng tố (Xantophyl), sắc tố màu nâu (Fucoxanthin) và sắc tố đỏ (Caroten) Tùy thuộc vào tỷ lệ các sắc tố này, rong có thể có màu sắc từ nâu, vàng nâu, nâu đậm đến vàng lục Nhìn chung, các sắc tố trong họ Rong Mơ khá bền.
Thành phần hóa học quan trọng của Rong nâu nói chung và họ Rong mơ (Sargassaceae) nói riêng là các glucid, chúng được chia thành 2 nhóm: monosaccharide và polysaccharide.
Nhóm monosaccharide bao gồm các đường đơn như mannitol, fucose, galactose, manose và xylose, trong đó mannitol là thành phần quan trọng nhất Hàm lượng mannitol trong rong khô dao động từ 14% đến 25% tùy thuộc vào điều kiện địa lý, thường cao hơn vào mùa hè và có xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng của rong.
Polysaccharide trong họ Rong mơ chiếm một tỷ lệ lớn, bao gồm acid alginic, laminaran, fucoidan và dẫn xuất của chúng. a) Acid alginic:
Acit alginic là polysaccharide chứa cacboxyl được tạo thành bằng cách tham gia axit β-D-mannuronic và axit α-L-guluronic thông qua liên kết β - (1
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Alginate
Hàm lượng acid alginic trong các loài rong mơ dao động từ 2-4% ở dạng tươi và 13-15% ở dạng khô Các thuộc tính lý, hóa và sinh học của alginate thay đổi tùy thuộc vào loài rong, giai đoạn trưởng thành, mùa vụ và môi trường sống.
Fucoidan là một polysaccharide sulfat tự nhiên hòa tan trong nước, có cấu trúc chính bao gồm các nhóm fucose và acid sulfuric Chất này chủ yếu được hình thành từ L-fucose thông qua liên kết glycosidic α-(1 → 3) và thể hiện hoạt tính sinh học mạnh mẽ Tỷ lệ fucose trong fucoidan dao động từ 18,6% đến 60%, trong khi sulfate chiếm từ 17,7% đến 39,2%.
Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của Fucoidan c) Laminaran:
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Laminarin
Laminarin là một polysaccharide β-glucan với trọng lượng phân tử thấp, được tìm thấy trong rong nâu Chất này có thể được biến đổi hóa học để nâng cao hoạt tính sinh học, và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như liệu pháp điều trị ung thư, phân phối thuốc và gen, kỹ thuật mô, cũng như trong các sản phẩm chống oxy hóa và chống viêm.
Laminarin có hàm lượng từ 10 – 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của họ Rong mơ [7]
1.1.4.3 Hợp chất chống oxy hóa:
Polyphenol là hợp chất chuyển hóa thứ cấp trong họ Rong mơ, chứa các nhóm OH gắn vào nhân benzen, bao gồm flavonoid, lignin, tannin và phlorotannin Những hợp chất này mang lại nhiều hoạt tính khác nhau.
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của Phlorotannin
Phlorotannins là nhóm tanin duy nhất trong họ Rong mơ ở biển, chiếm từ 1 đến 15% trọng lượng khô của Rong Mơ Chúng là hợp chất ưa nước và được biết đến với khả năng chống oxy hóa trong họ Sargassaceae.
1.1.4.4 Protein, chất khoáng và các hợp chất khác
Protein trong họ Rong mơ (Sargassaceae) có chất lượng cao, có thể so sánh với protein thực vật thông thường, mặc dù hàm lượng không cao Các loài trong họ Rong Mơ có thể được sử dụng làm thực phẩm Đặc biệt, protein của họ Sargassaceae thường kết hợp với iod, tạo thành iod hữu cơ như MonoIodinzodizin và DiIodinzodizin, có giá trị y học cao, được sử dụng trong phòng chống và chữa bệnh bướu cổ (Basedow).
Tổng quan về loài Rong Khế
Việt Nam sở hữu hơn 3.260 km bờ biển, mang đến nguồn tài nguyên rong biển phong phú Trong số đó, Rong Nâu là loại rong biển tự nhiên có giá trị lớn nhất, với hai chi rong có trữ lượng cao nhất là Sargassum (Rong Mơ) và Hormophysa (Rong Khế).
Hormophysa cuneiformis hay Hormophysa articulata (tên Tiếng Việt còn được gọi là Rong Khế) là loài thực vật thuộc chi Hormophysa họ Rong
Mơ Sargassaceae, ngành Rong Nâu Loài Rong Khế này được phát hiện trong bộ sưu tập Herbarium Pacificum của Bảo tàng Bishop.[23] Tại Việt Nam, có
Mẫu Hormophysa cuneiformis, được thu hái từ lâu, hiện vẫn được bảo tồn và sử dụng tại Bảo tàng Hải dương học, nơi lưu giữ tổng cộng 651 mẫu thuộc 209 loài rong biển khác nhau.
Hình 1.7: Hình ảnh mẫu vật Hormophysa cuneiformis
Hormophysa cuneiformis là một loại tản rong cao từ 20 – 50 cm, có màu nâu vàng hoặc nâu sẫm, bám vào vật thể bằng rễ giả hình trụ phân nhánh Cấu trúc của nó gồm 2 – 3 nhánh chính hình trụ, đường kính từ 1 – 2 mm, với nhiều nhánh sắp xếp xen kẽ theo mọi hướng trong nhiều mặt phẳng Phiến lá dài từ 0,5 - 3 cm và rộng tới 4 mm, có mép răng cưa lớn Phao hình thành chuỗi ở giữa lá và nhánh, mọc theo 2 hoặc thường 3 hướng khác nhau, có hình thuôn dài hoặc hình elip, dài 5-10 mm, tập trung nhiều trên các phiến lá hẹp hơn ở các nhánh phía trên cùng.
1.2.3 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
H cuneiformis là một nguồn tiềm năng của alginat và các sản phẩm tự nhiên khác bao gồm polyphenol, carotene, chlorophyll a, chlorophyll c,mannitol, fucoxanthin, tannins và laminarin Theo như báo cáo về kết quả nghiên cứu thành phần polysaccharide tách chiết từ Rong Nâu Hormophysa cuneiformis thu thập được ở vịnh Nha Trang cho thấy hàm lượng Fucoidan chiếm 2,03% trên trọng lượng rong khô.[25] Mặt khác, đối với các mẫu H. cuneiformis thu được từ Alabat, Quezon (Philippines), hiệu suất axit alginic là
A study reported that 41.8% of the samples collected from Magnetic Island, Queensland, Australia, exhibited a phenolic content of 2.3 ± 0.1% (dry weight) based on Folin-Denis testing In contrast, samples from Qatar in the Arabian Gulf showed a sterol content of 1.2%, which comprised 3.2% cholesterol, 86.7% fucosterol, and 10.1% 24-methylene-cholesterol.
Các chiết xuất metanol và hexan từ Hormophysa articulata (còn gọi là H cuneiformis) đã được nghiên cứu và cho thấy có hoạt tính kháng khuẩn, đặc biệt hiệu quả đối với vi khuẩn gram dương như Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus Tuy nhiên, không có chiết xuất nào cho thấy hoạt tính chống lại Klebsiella pneumoniae.
Hiện nay, nghiên cứu về các loại thuốc chống ung thư hiệu quả từ nguồn tự nhiên đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học Một nghiên cứu gần đây đã kiểm tra hoạt động chống ung thư của 6 loài rong biển khác nhau và phát hiện rằng chiết xuất từ H cuneiformis là hiệu quả nhất trong việc ngăn chặn 4 dòng tế bào ung thư, bao gồm HL60, A549 và HCT116.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu dự kiến là mẫu toàn cây Rong Khế (Hormophysa cuneiformis hay Hormophysa articulata) thu hái tại vùng biển Đồ Sơn thuộc thành phố Hải Phòng
Khi lựa chọn đối tượng nghiên cứu, cần chọn những mẫu không quá già và không quá non Đối với mẫu lớn, cần xác định các đặc điểm điển hình để thể hiện rõ cơ quan dinh dưỡng và sinh sản Đối với rong biển, cần chọn mẫu có đầy đủ các phần như đĩa bám, trục chính, các trục phụ, "lá" và túi bào tử.
Thời gian ngiên cứu dự kiến từ tháng 1 năm 2022 tại phòng thực hành
Bộ môn Thực vật – Dược liệu của Trường Đại học Y Dược Hải Phòng.
Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
- Hóa chất nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu của mẫu vật: Javen, acid acetic, xanh methylen 0,5%, đỏ carmin bão hòa, nước cất.
Hóa chất định tính là các thuốc thử được sử dụng để xác định thành phần hóa học có trong mẫu vật Các thuốc thử này không chỉ phục vụ cho phản ứng hóa học mà còn bao gồm các thuốc thử hiện màu sắc, đặc biệt là trong phương pháp sắc ký lớp mỏng Tất cả các thuốc thử này cần đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam VI để đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong phân tích.
- Dung môi: methanol, ethanol, chloroform, …
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị
Tại phòng thực tập Bộ môn Thực vật – Dược liệu, Trường Đại học Y Dược Hải Phòng, dụng cụ nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu của mẫu vật bao gồm kính hiển vi Leica và các dụng cụ cắt, lên tiêu bản vi phẫu như đĩa petri, mặt kính đồng hồ, kim mũi mác, phiến kính, lá kính, pipet, dao lam, chổi lông, khoai lang hoặc cà rốt.
- Dụng cụ định tính thành phần hóa học có trong mẫu vật:
Cân kỹ thuật Precisa, cân phân tích độ chính xác 10-3g Ohaus.
Kính hiển vi Primo Star, máy cô quay chân không RV 10 Basic.
Bếp điện, bếp đun cách thủy Memmert, tủ sấy Froilabo.
Bản mỏng tráng sắc ký Sillicagel 60 F254 (Merck).
Ngoài ra, cần chuẩn bị các dụng cụ thiết yếu như bình nón với dung tích 50ml, 100ml, 250ml; pipet với các kích thước 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml; bình chiết quả lê và cốc có mỏ với dung tích 50ml, 100ml, 200ml.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.1 Thu thập và chuẩn bị mẫu:
Sau khi thu hái, mẫu Rong Khế cần được loại bỏ tạp chất, rửa sạch bằng nước và sử dụng bàn chải mềm để chải sạch muối cùng đất cát bám trên bề mặt.
2.3.1.2 Ép và sấy mẫu tiêu bản Ép và sấy cho mẫu khô là hai quá trình không tách rời nhau, trong khi sấy cần ép chặt mẫu để lá khỏi nhăn nheo, để mẫu cây nằm đúng vị trí đính dán mẫu Sắp xếp rong trên giấy trắng và dưới một lớp giấy thấm để cố định trước khi sấy.
Lưu ý một số nguyên tắc khi sắp xếp:
- Trong số các lá ít nhất có một lá được lật lên.
- Không để đè các bộ phận của cây đè lên nhau.
- Cần sắp xếp đều trên diện tích cho phép.
- Cây dài có thể xếp theo hình chữ V, N hay hình khác.
- Nếu cần bỏ lá chú ý giữ cuống lá.
- Những phẩn nhỏ bị rụng cần đặt bên cạnh mẫu.
Các bộ phận sử dụng làm thuốc có thể được bảo quản bằng phương pháp phơi sấy khô hoặc ngâm trong dung dịch bảo quản Để thực hiện, hãy đặt các mẫu lên cặp ép (không dày quá 40cm), buộc cặp ép lại và tiến hành sấy.
35 – 40ºC trong khoảng 8 – 12 giờ Trong quá trình sấy cần thường xuyên thông thoáng Lấy cặp ép ra buộc lại và sấy tới khô.
2.3.1.3 Khâu hoặc dán mẫu cây lên tiêu bản
Giấy để khâu có kích thước 35 x 47 cm, thường được làm bằng bìa trắng và cần giấy dày hơn cho mẫu lớn Để thực hiện, đặt mẫu rong đã ép và sấy khô lên bìa, khâu và dán giấy lên các nốt khâu ở mặt trái Sau khi hoàn thành khâu và dán, hãy dán nhãn kích thước 8 x 13 cm ở góc phải phía dưới của tiêu bản.
2.3.2 Nghiên cứu về đặc điểm hình thái, giải phẫu rong
Phương pháp đánh giá bằng cảm quan bao gồm việc quan sát và mô tả đặc điểm hình thái của mẫu Rong Khế tươi hoặc mẫu Rong Khế khô sau khi ngâm trong nước 12 tiếng.
- Phương pháp làm tiêu bản vi học thực vật: Quan sát đặc điểm vi phẫu
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG
Bộ môn Thực vật – Dược liệu ––––––––––––––––––––
Người định danh: thực vật thông qua lát cắt ngang thân và ngang lá mẫu cây Rong Khế bằng kính hiển vi ở vật kính 10x và 40x.
Để làm tiêu bản vi học thực vật, đầu tiên ngâm một phần lá và thân cây Rong Khế khô trong nước cho đến khi chúng trương nở hoàn toàn Sau đó, sử dụng dụng cụ cầm tay để cắt vi phẫu, lựa chọn các lát mỏng nguyên vẹn để chuẩn bị lên tiêu bản Tiếp theo, tiến hành tẩy và nhuộm tiêu bản Cuối cùng, vi phẫu sau khi nhuộm được lên kính theo phương pháp giọt ép.
2.3.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học của Rong Khế 2.3.3.1 Định tính các nhóm chất trong Rong Khế dựa trên các phản ứng hóa học:
Cho 10g dược liệu vào bình nón 50ml, thêm 15ml dung dịch H2SO4 2% cho ngập dược liệu, sau đó đun sôi và để nguội Lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch Amoniac 6N đến pH 9 – 10 (kiểm tra bằng giấy quỳ tím hoặc chỉ thị vạn năng) Cuối cùng, chiết alkaloid bằng chloroform.
Dịch chiết chloroform được thực hiện 3 lần, mỗi lần 5ml, sau đó gộp lại và lắc với H2SO4 2% hai lần, mỗi lần 5ml Các dịch chiết nước được gộp lại và chia vào 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa khoảng 1ml, để tiến hành các phản ứng tiếp theo.
- Phản ứng với thuốc thử (TT) Bouchardat - H 3 [P(Mo 3 O 10 ) 4 ]:
Nếu xuất hiện kết tủa trắng thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng với TT Mayer - K 2 HgI 4 :
Nếu xuất hiện kết tủa trắng thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng với TT Dragendorff - KBiI 4:
Nếu xuất hiện kết tủa da cam thì phản ứng dương tính.
Cân 5g dược liệu vào bình nón dung tích 250ml Thêm 100ml ethanol(EtOH) 25º rồi ngâm trong 24h Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích
250ml Thêm 3ml chì acetat 30% khuấy đều lọc qua giấy lọc gấp nếp vào cốc có mỏ dung tích 250ml.
Để kiểm tra lượng chì acetat, nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat; nếu có tủa xuất hiện thì ngưng lọc Tiếp theo, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào toàn bộ dịch chiết, khuấy đều và lọc lại cho đến khi dịch lọc không còn tủa Sau đó, chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn 250ml và lắc kỹ hai lần với 8ml CHCl3 mỗi lần Gạn dịch chiết CHCl3 vào cốc có mỏ, gộp các dịch chiết và loại bỏ nước bằng Na2SO4 khan Cuối cùng, chia đều dịch chiết vào ba ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô, đặt lên giá và bốc hơi trên nồi cách thủy cho đến khi khô để tiến hành các phản ứng tiếp theo.
- Phản ứng Liebermann- Burchardat: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn
1ml anhydric acetic Lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45 o Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống
Nếu giữa 2 chất lỏng trong ống xuất hiện vòng tròn màu đỏ tím thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml EtOH 90º, lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt TT Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều
Nếu dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính.
Phản ứng Baljet được thực hiện bằng cách cho vào ống nghiệm chứa 0,5ml EtOH 90º, sau đó lắc đều để hòa tan hoàn toàn Tiếp theo, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha, bao gồm 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%.
Nếu xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng Keller – Kiliani: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml EtOH
Lắc đều dung dịch cho đến khi tan hết, sau đó thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% đã pha trong acid acetic Tiếp tục lắc đều và nghiêng ống nghiệm 45 độ Nhỏ từ từ 0,5ml acid sulfuric đặc theo thành ống, chú ý không làm xáo trộn chất lỏng bên trong.
Nếu ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng tím đỏ thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng Borntraeger: Cho 5g dược liệu vào bình nón dung tích
Để thực hiện quy trình chiết xuất, đầu tiên thêm 10ml dung dịch H2SO4 25% vào 100ml dung dịch dược liệu và đun sôi trong vài phút Sau khi nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn và lắc với 5ml CHCl3 Cuối cùng, lấy 1ml dịch CHCl3 đã thu được cho vào ống nghiệm và thêm 1ml NaOH 10%, sau đó lắc kỹ để hoàn tất quy trình.
Nếu quan sát thấy lớp NaOH có màu đỏ thì phản ứng dương tính.
Lấy 10g dược liệu cho vào bình nón 100 ml, thêm 50 ml EtOH 90º Đun cách thủy sôi trong 5 phút, sau đó lọc nóng Dịch lọc được cô cách thủy còn 9-10 ml để thử các phản ứng tiếp theo.
- Phản ứng với hơi amoniac (NH 3 ): Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút
Nếu tờ giấy lọc sau khi được sấy và hơ trên miệng lọ amoniac có vệt màu vàng đậm thì phản ứng dương tính.
- Phản ứng với dung dịch kiềm loãng (NaOH 10%): Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%.
Nếu xuất hiện tủa màu vàng thì phản ứng dương tính.
Để thực hiện phản ứng Cyanidin, đầu tiên cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, sau đó thêm khoảng 10mg bột Magie kim loại Tiếp theo, nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt) vào ống nghiệm Cuối cùng, để hỗn hợp yên trong vài phút và quan sát kết quả phản ứng.
Nếu xuất hiện màu đỏ cam (vàng cam) đậm hơn ban đầu thì phản ứng dương tính
- Phản ứng với dung dịch sắt (III) chlorid: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl 3 5%.
Nếu xuất hiện màu xanh đen thì phản ứng dương tính.
Cho 5g dược liệu vào bình nón, thêm 20 ml EtOH 90º, đun cách thủy sôi 3 - 5 phút, lọc nóng Dịch lọc thu được tiến hành các phản ứng sau:
- Phản ứng đóng mở vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết: Ống 1: Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2: Giữ nguyên.
Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội Nếu ống 1 có tủa đục vàng, ống 2 trong thì tiếp tục tiến hành:
Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước cất, lắc đều, ống
1 trong suốt, ống 2 có tủa đục.
Thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, nếu ống 1 đục trở lại như ống
2 thì phản ứng dương tính.
Phản ứng Diazo hóa là quá trình xác định sự hiện diện của các hợp chất trong dược liệu Để thực hiện, cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết dược liệu và kiềm hóa bằng dung dịch Na2CO3 2% Sau đó, đun cách thủy hỗn hợp, để nguội và thêm vài giọt thuốc thử Diazo Nếu xuất hiện màu đỏ cam, phản ứng được coi là dương tính.
DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu đặc điểm thực vật
3.1.1 Đặc điểm hình thái ngoài
Quan sát và ghi lại đặc điểm hình thái cơ bản của Rong Khế bao gồm:
- Cụm Rong: Rong H cuneiformis mọc thành bụi nhỏ, tản rong cao từ
- Màu sắc: Rong có màu nâu vàng.
- Đĩa bám: nhỏ dạng rễ giả hình trụ, phân nhánh chằng chịt, giúp thân rong bám vững chắc trong môi trường nước chuyển động mạnh.
- Trục chính: rất ngắn, mang 2 – 3 nhánh chính hình trụ, đường kính từ
1 – 2 mm, phân thành nhiều nhánh bên, sắp xếp xen kẽ các nhánh theo mọi hướng, trong nhiều mặt phẳng
Lá cây có hình dạng mỏng, bầu dục dài hoặc giống như mũi giáo, với số lượng lớn Phiến lá có chiều dài từ 0,5 đến 3 cm và rộng tối đa 4 mm, mép lá có răng cưa lớn Cuống lá thon và gân lá rõ nét.
Phao là một cấu trúc hình chuỗi nằm giữa lá và nhánh, có hình dạng thuôn dài hoặc elip, với kích thước từ 5-10 mm Chúng thường tập trung nhiều trên các phiến lá hẹp ở các nhánh phía trên cùng.
3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 3.1.2.1 Vi phẫu thân
Lên tiêu bản vi phẫu và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 10x và 40x để mô tả đặc điểm vi phẫu của thân Rong Khế Quy trình này bao gồm việc phân tích cấu tạo từ lớp ngoài vào trong, giúp hiểu rõ hơn về các đặc điểm hình thái và cấu trúc của mẫu vật.
Lên tiêu bản vi phẫu và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 10x và 40x giúp phân tích cấu trúc của “lá” Rong Khế Đặc điểm vi phẫu của lá được mô tả theo thứ tự từ ngoài vào trong, cho thấy sự phân bố và cấu tạo của các lớp tế bào, góp phần vào việc hiểu rõ chức năng và đặc tính sinh học của loài thực vật này.
Nghiên cứu về thành phần hóa học
3.2.1 Định tính các nhóm chất trong Rong Khế dựa trên các phản ứng hóa học
Tiến hành các phản ứng hóa học một cách tuần tự để xác định các nhóm chất có trong Rong Khế Kết quả định tính sẽ được trình bày trong bảng dưới đây.
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận
1 Saponin Hiện tượng tạo bọt
P/ứ với TT Mayer P/ứ với TT Dragendorff P/ứ với TT Bouchardat
P/ứ với hơi ammoniac P/ứ với FeCl 3
6 Coumarin P/ứ đóng mở vòng lacton
8 Đường khử P/ứ với TT Fehling
9 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc
10 Sterol P/ứ với H 2 SO 4 /anhydride acetic
12 Acid hữu cơ Xuất hiện bọt khí
13 Acid amin P/ứ với TT Ninhydrin
15 Polyphenol P/ứ với TT Folin – Ciocalteu
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong Rong Khế
3.2.2: Định tính bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)
Chiết siêu âm 10g mẫu rong biển bằng 50 ml MeOH trong 1h, sau đó cất dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay đến khô Độ ẩm của cao dược liệu được xác định Cao toàn phần hòa tan vào 20ml nước cất nóng tạo hỗn dịch, sau đó lắc và chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan (25ml, chia 3 lần: 10, 10, 5ml) và ethylacetat (25ml, chia 3 lần: 10, 10, 5ml) để thu được các phân đoạn có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethylacetat, nước Các phân đoạn này được làm khô và định tính bằng SKLM.
Cao toàn phần và cao phân đoạn được hòa tan trong methanol (MeOH) thu được dịch chiết có nồng độ 1mg/ml để tiến hành chấm sắc ký.
- Thuốc thử: dd H2SO4 10% trong EtOH.
Hệ dung môi triển khai sắc ký: n-hexan:ethyl acetat (5:1) Quan sát bản mỏng ở ánh sáng thường; dưới ánh sáng UV (ở bước sóng
254 nm, 366 nm) và sau khi hiện màu bằng TT H2SO4 10% trong EtOH.
DỰ KIẾN BÀN LUẬN
Về đặc điểm thực vật
Mẫu nghiên cứu cho thấy các đặc điểm hình thái thực vật chung của họ Rong mơ Sargassaceae, bao gồm cơ quan bám dạng rễ phân nhánh phát triển mạnh, mép lá có răng cưa lớn, và sự hiện diện của cơ quan chứa không khí gọi là phao, tạo thành chuỗi ở giữa lá và nhánh với hình dạng thuôn dài hoặc elip.
Mẫu rong thu hái có đặc điểm hình thái và vi phẫu (lá, thân) phù hợp với mô tả của loài H cuneiformis Do đó, mẫu rong này có thể được sơ bộ định danh là Hormophysa cuneiformis (J F Gmelin) P C Silva, hay còn gọi là Rong Khế.
Về thành phần hóa học
4.2.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học
Kết quả định tính sơ bộ cho thấy dược liệu này chứa các nhóm chất quan trọng thông qua các phản ứng hóa học đặc trưng Mẫu nghiên cứu cho thấy dương tính mạnh với
4.2.2 Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng.
Sắc ký đồ dưới ánh sáng thường và tia UV (254nm, 366nm) cùng với hiện màu bằng TT H2SO4 10% trong cồn cho thấy các phân đoạn chứa hợp chất hữu cơ, tạo cơ sở cho việc phân lập các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao trong Rong Khế Nghiên cứu trước đó đã chỉ ra rằng H cuneiformis là chiết xuất hiệu quả nhất trong việc ngăn chặn 4 dòng tế bào ung thư, bao gồm HL60, A549, và HCT116.
DỰ KIẾN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Dự kiến kết luận
Sau khi nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và thành phần hóa học của Rong Khế (Hormophysa cuneiformis) thu hái tại Hải Phòng”, chúng tôi đã rút ra một số kết luận quan trọng về hình thái, cấu trúc giải phẫu và thành phần hóa học của loài rong này.
- Loài Rong Khế thu hái tại Hải Phòng sơ bộ xác định tên khoa học là…
- Qua định tính sơ bộ cho thấy loài Rong Khế có thành phần hóa học chính là …
Sau khi thực hiện SKLM, hệ dung môi n-hexan:EA được chọn để đạt kết quả tách tối ưu Sắc ký đồ thu được được quan sát dưới ánh sáng thường và tia UV ở 254nm và 366nm, đồng thời hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 10% trong cồn.
Dự kiến kiến nghị
Từ những kết quả thu được, đề tài đưa ra một số kiến nghị như sau:
- Tiếp tục tiến hành chiết xuất và phân lập các hợp chất chính từ loài Rong Khế này.
- Tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế một số dòng tế bào ung thư từ dịch chiết Rong Khế.
1 Thu thập và chuẩn bị mẫu
2 Lên tiêu bản dược liệu khô
Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu
4 Định tính bằng phản ứng hóa học