THỰC HÀNH kỹ THUẬT COLONY PCR

  ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM BỘ MÔN XÉT NGHIỆM PHÂN MÔN: Y SINH HỌC PHÂN TỬ  BÁO CÁO THỰC HÀNH  SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ  BẢN   GVHD: Ts Nguyễn Hoàng Tuyết Minh Ths Nguyễn Thị Trúc Anh Sinh viên: Nguyễn Thị Thu Hà Lớp: CNXN19 MSSV: 611198748 THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   BUỔI 1: 10/10/2022 THỰC HÀNH KỸ THUẬT COLONY PCR  I Mục đích - Để xxác ác định định xem xem tro ng plasm plasmid id của vi khuẩ khuẩnn có có chèn chèn đoạn đoạn DN DNA A mo mong ng muốn chuyển nạp hay không - Ưu điểm điểm:: nha nhanh nh dễ th thực ực hiện II Chuẩn bị Dụng cụ, thiết bị: - Găng tay không bột, tăm vô trùng - Micropipette, đầu côn, máy ly tâm eppendorf, Eppendorf 1,5 ml - Bếp đun, Máy Nanodrop Hoá chất: - Petri có khúm khuẩn chuyển nạp - Dung dịch (TE) III II I Qu Quy y trì tKTS5 rình nh th thực ực hi ện Colo Colony ny – PCR PCR Bước 1: Dùng pipette hút 25μl dung dịch KTS5 (TE) cho vào ống eppendorf ghi tên Bước 2: Lấy khúm khuẩn cần định danh tăm vô trùng Bước 3: Cho khúm khuẩn vừa lấy vào eppendorf có chứa 25 μl dung dịch TE, trộn hỗn hợp Bước 4: Đun hỗn hợp dung dịch 90 – 100oC phút Bước 5: Quay ly tâm tốc độ cao 13000 vòng/phút phút Bước 6: Hút 10 μl dung dịch vào eppendorf Bước 7: Hút μl để đo độ tinh máy nanodrop, phần lại thực phản ứng PCR IV Quy IV Quy trìn trình h kiể kiểm m tra tra độ tinh tinh sạc h bằn bằngg máy máy Nano Nanodr drop op Bước 1: Mở máy tính kết nối với máy chọn phần đo acid nucleic Bước 2: Hút μL nước cất nhỏ vào đầu đọc  đóng nắp máy nanodrop sau dùng giấy mềm lau Bước 3: Đo blank: hút μL KTS5 (dung dịch vừa pha với khúm khuẩn) cho vào giếng  đậy nắp xuống  Chọn blank Bước 4: Nhập ID sample Bước 5: Nhỏ μl dung dịch mẫu lên đầu đọc, đậy nắp Bước 6: Bấm Measure để đo Bước 7: Đọc kết V Nhận xét kết quả: THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   - Do m máy áy điện điện thoạ thoạii em em bị hư hư nên ảnh đồ đồ thị đo trên máy máy N Nano anodro dropp bị mất, mất,  bảng kết em em ghi lại dựa hình hình ảnh chụp từ máy của bạn Nồng độ DNA A260 A280 260/280 260/230 102.3 ng/  l 2.046 1.093 1.87 0.34 - Tỉ lệ 26 260/ 0/28 280: 0: 1.87 87,, tỷ lệ thể hi ện độ tinh tinh khiết ết củ củaa mẫu tách tách ch chiế iết, t, đố đốii với dsDNA tỷ lệ  1.6-1.8 tinh sạch, nên kết 1.87 tin cậy - Tỉ llệệ 26 260/ 0/23 230= 0= 0.1 0.11, 1, tỉtỉ lệ 260 260/2 /230 30 nên nên 1.8, mà kết thấp xác định nhiễm hợp chất hữu (phenol, alocohol, cacbohydrates) THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   BUỔI 2: 11/10/2022 TÁCH CHIẾT DNA – HBV BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHENOL CHLOROFORM AccuPid HBV Quantification Quantification Kit/Real-time PCR/Q01HBV02.2A I II Mục đích - Xử llýý mẫu mẫu huyế huyếtt than thanhh để th thuu được DNA DNA của HBV HBV Chuẩn bị Dụng cụ, thiết bị - Vật dụng tiêu hao (găng tay không phấn, ống eppendorf 1,5 ml, đầu tip dùng cho micropipettes có phin lọc) - Micropipettes (10 μl, 200 μl, 1000 μl) - Máy ly tâm cho ống eppendorf (vận tốc tối đa 13.000 - 14.000 vòng/phút) - Máy ly tâm ống máu - Máy lắc trộn (vortex) - Bồn ủ nhiệt khô o o Tủ lạnh C –20 C Máy Nanodrop Hóa chất thuốc thử mẫu: - Sử dụng với mẫu huyết không chứa chất chống đông EDTA hay heparin - Bộ hóa chất tách chiết DNA AccuRive pDNA PrepKit – EX-DNA01.1A - Nước cất - Dung dịch sát trùng III Thành phần hóa chất: Tên hóa chất Dung dịch KTS1 Thành phần Phenol pH 8.0 Guanidine isothyocinate β mercaptopethanol Tác dụng Phá vỡ cấu trúc protein màng tế bào người vỏ capsid HBV Hoạt động biến tính protein chất làm bất hoạt enzyme  phân hủy DNA có trong hỗn hợp DNA sau giải phóng di chuyển vào pha nước THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   Dung dịch KTS2 Chloroform Nhằm hút hoàn toàn phenol khỏi pha nước giúp phân tách pha nước pha hữu (phenolchloroform) trở nên rõ ràng Dung dịch KTS3 Iso-propanol, Glyco-Blue® Chuyển DNA pha nước sang trạng thái không tan Dung dịch KTS4 70% Ethanol Loại bỏ gốc isopropanol khỏi tủa DNA  đảm bảo việc làm DNA giữ DNA trạng thái khơng tan Dung dịch KTS5 Lưu ý: DEPC Hịa tan tủa DNA, bất hoạt RNAse, DNase +  Những hóa chất độc hại nên để hóa chất gần nơi thực tách chiết, sau lấy hóa chất phải đóng nắp lại + Cần trộn dung dịch trước sử dụng dụng IV Quy trình thực Bước 1: Chuẩn 1: Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Bật bồn ủ nhiệt khô 60°C Bước 2: Vortex 2: Vortex kỹ ống DNA-IC Cho vào eppendorf µl dung dịch DNA-IC Bước 3: Cho 3: Cho tiếp vào eppendorf 900 µl KTS1 Bước 4: Cho 4: Cho 100 µl huyết vào ống Vortex mạnh eppendorf giây cho tan hồn tồn protein biến tính Để n 10 phút Bước 5: Cho 5: Cho 200 µl KTS2 Lắc trộn thật kỹ Bước 6: Ly 6: Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Bước 7: Chuẩn 7: Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Bước 8: Chuyển 8: Chuyển 600 µl dịch sang eppendorf 1,5 ml Lưu ý: Chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch đục (protein biến tính) hai pha nước (trên) chloroform (dưới) Bước 9: Thêm 9: Thêm 600 µl KTS3 Bước 10: Vortex 10: Vortex nhẹ để trộn Để yên 10 phút THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   Bước 11: Ly 11: Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Bước 12: Cẩn 12: Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn Lưu ý:  ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh Bước 13: Thêm 13: Thêm 900 µl KTS4 Bước 14: Ly 14: Ly tâm 13.000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng Bước 15: Cẩn 15: Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn Lưu ý:  ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh Bước 16: Làm 16: Làm khô cặn 10 phút 60°C bồn ủ nhiệt khơ Bước 17: Hịa 17: Hịa cặn 20 µl KTS5 Nếu không tiến hành phản ứng PCR ngày, bảo quản DNA tách chiết 2-8°C vòng 2-3 ngày, -20°C vòng tháng - Quy trình kiểm tra độ tinh máy Nanodrop (với bước tương thực hành buổi 1) VI Nhận xét kết q uả: THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   - Nồng ồng độ độ:: 115 115.2 ng/µ ng/µll - A260: 2,303 - A280: 1.085 - Tỉ lệ 26 260/ 0/28 280: 0: 2.12 12,, tỷ lệ thể hi ện độ tinh tinh khiết ết củ củaa mẫu tách tách ch chiế iết, t, đố đốii với dsDNA dsDN A tỷ lệ  1.6-1.8 tinh Nhưng trường hợp đồ thị không đạt đỉnh 260 nm, nên dù tỉ lệ 1.8 mẫu có khả cao có hiệncủa chất hữu - Tỉ llệệ 26 260/ 0/23 230= 0= 0.1 0.11, 1, tỉtỉ lệ 260 260/2 /230 30 nên nên 1.8, mà kết thấp xác định nhiễm hợp chất hữu (phenol, alocohol, cacbohydrates)  Độ tinh vật liệu di truyền thấp, việc đọc kết PCR điện di không đáng tin cậy Cần phải tách chiết lại THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   BUỔI 3: 12/10/2022 CHẠY PCR MẪU DNA HBV Ở BUỔI I Mục đích - Khuếch đại đoạn DNA tách chiết buổi để tạo nhiều - Dùng để phát xem có DNA HBV tách chiết chiết - Kiểm tra kỹ thuật làm có hay khơng II Chuẩn bị Dụ Dụng ng cụ, cụ, thi thiết ết bị bị:: - Vật dụng tiêu hao (găng tay không phấn, ống eppendorf 0,2 ml/0,1 ml, đầu tip dùng cho micropipettes có phin lọc) - Máy Real-time PCR (đọc màu FAM, HEX) + hệ thống máy vi tính - Máy ly tâm cho ống eppendorf (vận tốc tối đa 13.000 - 14.000 vòng/phút) - Micropipettes - Máy lắc trộn (vortex) Hóa chất chất thu thuốc ốc thử thử mẫu: mẫu: - Mẫu DNA tách chiết từ buổi - Hóa chất PCR AccuPid HBV Quantification Kit– Q01HBV02.2A III Thành phần hóa chất Thuốc thử Thành phần DNA IC DNA chứng nội ngoại sinh MasterMix Q01HBV02.2A-MM -Tris-HCL Ph 8.0, KCl, MgCl2 -dATP, dTTP, dCTP, dGTP -Taq DNA polymerase PrimobeMix Q01HBV02.2A-PM -Hệ mồi nhân vùng gene S HBV -TaqMan đặc hiệu cho HBV (FAM) -Hệ mồi nhân DNA IC -TaqMan đặc hiệu DNA IC (HEX) Chứng dương E3 (Positive control E3) Q01HBV02-PC3 DNA HBV nồng độ 103  copies/ µl Chứng dương E5 (Positive control E5) DNA HBV nồng độ 105  copies/ µl Q01HBV02- PC5 THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   Chứng dương E7 (Positive control E7) Q01HBV02- PC7 DNA HBV nồng độ 107  copies/ µl Eppendorf 0,2 ml/0,1 ml (tùy loại loại máy máy realrealtime sử dụng) IV- Quy trình thực Quy trình chuẩn bị chạy PCR  Bước 1: Rã 1: Rã đông ống MasterMix, PrimobeMix Chứng dương hồn tồn cách đặt nhiệt độ phịng tối đa 30 phút Sau ly tâm nhẹ (3.000-4.000 rpm) đặt vào rack lạnh Lưu ý: Thao ý: Thao tác Chứng dương tách biệt với ống MasterMix PrimobeMix để hạn chế nguy nhiễm Bước 2: Vortex 2: Vortex mạnh ống PrimobeMix hút 200 µl chuyển vào ống MasterMix Lưu Lư u ý: : Tránh : Tránh làm văng dung dịch lên nắp ống PrimobeMix trình vortex, dẫn đến việc khơng đủ thể tích hút Bước 3: Trộn 3: Trộn hỗn hợp có ống MasterMix micropipette Hút 20 µl hỗn hợp cho vào eppendorf 0,2 ml ghi sẵn tên mẫu Lưu ý:  Không trộn ống MasterMix máy vortex  Sử dụng eppendorf 0,2 ml phù hợp với máy Real-time PCR Bước 4: Vortex 4: Vortex nhẹ dung dịch DNA xét nghiệm, dung dịch Chứng âm tách chiết, dung dịch Chứng dương Bước 5: Cho 5: Cho µl dung dịch DNA xét nghiệm, dung dịch Chứng âm tách chiết, dung dịch Chứng dương nước cất lần vào ống eppendorf 0,2 ml riêng lẻ chuẩn bị Bước Lưu ý:  Phản ứng Real-time PCR phải đặt vào máy chạy vòng sau bổ sung dịch DNA THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   BUỔI 4: 13/10/2022 ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE I Mục đích: - Phát DNA mẫu dựa kích thước II Chuẩn bị Dụ Dụng ng cụ, cụ, thi thiết ết bị bị:: - Găng tay không bột, khăn giấy khơng bột - Ống đong hóa chất, bình thủy tinh 250ml - Lị vi sóng - Khay nhựa đựng gel, lược, dấu đầu - Buồng điện cực, dây dẫn - Máy chiếu đèn UV - Miccropipette đầu tip Hóa chất chất thu thuốc ốc thử thử mẫu: mẫu: - DNA chiết tách dung dịch PCR (ở buổi 2) - Thạch agarose, EB - Dung dịch điện di TAE - Dung dịch loadding dye - Dung dịch thang chuẩn III THÀNH PHẦN HÓA CHẤT - Gel AGAROSE: pha Agarose 1.5% + Chiết xuất từ rong biển + Tạo thành lưới xốp dạng gel + Nóng chảy 90-950C, đục agarose nồng độ cao + Khi pha thạch ý bước cho phẩm nhuộm huỳnh quang Ethidium bromide (EB) 0.5-1ug/mL vào nhiệt độ khơng q cao (khoảng 60-65 0C) cho vào lúc agarose cịn nóng EB bay gây độc - Dung dịch đệm: sử dụng TAE (Tris/Acetic Acid/ EDTA)  phổ biến nhất, DNA >4kbp, điện thấp, thời gian kéo dài, tốt DNA siêu xoắn: + TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethane): (tris(hydroxymethyl)aminomethane): buffer giúp trì pH ổn định + Acetic Acid: tăng hiệu buffer  + EDTA: liên kết kim loại - Dung dịch nạp mẫu (Loading dye) + Phẩm nhuộm: Bromophenol Blue + Chất có tỉ trọng nặng: glycerol IV QUY TRÌNH THỰC HIỆN Tạo 500 ml dung dịch đệm X TAE cách pha loãng 10 ml 50X TAE với 490 ml nước khử ion Đong 100 ml dung dịch đệm TAE X đổ vào bình thủy tinh 250 ml Cân  bình và1.5 lắcgam nhẹ.agarose cấp điện di thêm vào 100 ml dung dịch đệm TAE X THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   Đun nóng hỗn hợp lị vi sóng phút cơng suất lớn khuấy Mất khoảng15 phút để nhiệt độ gel nguội đến 50 oC Thỉnh thoảng xốy agarose nguội Làm khay đựng gel cách dán kín hai đầu khay nhựa Kiểm tra để xem có bị rị rỉ không sử dụng nước Đổ bớt nước lau khô khay khăn lau Kimpes Đặt lược vào khe đầu khay μl (Ecodye) gel agarose lắc 10.Thêm Đổ gel vàoethidium khay vàbromide để gel ngấm trongvào 30 phút 12 Lấy lược khỏi gel 13 Tháo dấu đầu 14 Đặt khay vào buồng điện di cho hai đầu gel mở ngăn hai bên buồng 15 Trong ống ly tâm siêu siêu nhỏ, trộn 10 μl PCR với μl chất nhuộm màu màu 16 Pipet μl mẫu DNA vào giếng gel bạn 17 Ghi lại thứ tự mẫu bạn vào sổ tay 18 Gắn hai điện cực vào hai cực buồng Đảm bảo điện cực màu đen phù hợp với cực (âm) gần giếng gel 19 Kết nối dây dẫn dương âm vào lỗ thích hợp nguồn điện 20 Bật nguồn điện chạy gel 100 Volts thuốc nhuộm di chuyển đến 2/3 gel cực dương (khoảng 20 phút) 21 Tắt nguồn điện 22 Xem dải DNA UV hình ảnh chúng 23 Vứt bỏ gel V KẾT QUẢ THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   BUỔI 5: 24/10/2022 TÁCH CHIẾT DNA H.PYLORI BẰNG PHƯƠNG PHÁP CỘT AccuPid H.pylori Detection Kit/Real-time PCR/Q01HPY01.2A I Mục đích - Tách chiết DNA Helicobacter pylori gây viêm loét ung thư dày, tá tràng từ mẫu sinh thiết dày II Chuẩn bị Dụ Dụng ng cụ, cụ, thi thiết ết bị bị:: - Vật dụng tiêu hao (găng tay không phấn, ống eppendorf 1,5 ml, đầu tip dùng cho micropipettes có phin lọc) - Micropipettes (10 μl, 200 μl, 1000 μl) - Máy ly tâm cho ống eppendorf (vận tốc tối đa 13.000 - 14.000 vòng/phút) - Máy ly tâm ống máu - Máy lắc trộn (vortex) - Bồn ủ nhiệt nhiệt khô khô - Tủ lạnh 4oC –20oC - Máy Nanodrop Hóa chất chất thu thuốc ốc thử thử mẫu: mẫu: - Mẫu (không thực hành): + Thu mẫu: Bấm mẫu sinh thiết dày thiết bị nội soi phẫu thuật chuyển vào eppendorf 1,5ml chứa sẵn 400 μl KTL2 + Vận chuyển: Mẫu cần vận chuyển điều kiện 2-4 oC lạnh phịng thí nghiệm để tiến hành xử lý phân tích +Bảo quản: Mẫu giữ nhiệt độ 2-4oC ngày hay đông lạnh -20oC tuần + Xử lý mẫu (không thực hành): Chuẩn bị loạt eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu thêm mẫu Chứng âm tách chiết Cho vào eppendorf 200 μl KTL2 + 50 μl KTL3 + 10 μl KTL4 Cho mẫu sinh thiết vào eppendorf tương ứng Cắt nhuyễn kéo vô trùng Lưu ý: mẫu chứng âm khơng cho thêm gì, cần lắc đảo nhẹ nhàng eppendorf Ủ 550C qua đêm 700C Mỗi lắc đảo nhẹ nhàng khoảng giây Dịch sau đồng hóa phải suốt - Hóa chất: + Hóa chất xử lý mẫu AccuRive HP ProcSample Kit - EX-PRO02.1A + Hóa chất tách chiết DNA AccuRive sDNA Prep Kit, EX-DNA02.1F III Thành phần hóa chất: + Hóa chất xử lý mẫu AccuRive HP ProcSample Kit - EX-PRO02.1A Dung dịch KTL2 x 36 ml Nhiệt độ phòng THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   Dung dịch KTL3 Dung dịch KTL4 x 1,5 ml x 0,6 ml Nhiệt độ phịng 2-8 oC + Hóa chất tách chiết DNA AccuRive sDNA Prep Kit, EX-DNA02.1F KTC1 lọ x 15 ml Nhiệt độ phòng KTC2 lọ x 10 ml Nhiệt độ phòng KTC3 lọ x 30 ml Nhiệt độ phòng KTC4 KTS5 KTL2 KTL4 Cột silica Eppendorf 2,0 ml Eppendorf 1,5 ml IV lọ x 30 ml lọ x ml lọ x ml ống x 500 µl 50 cột 100 100 Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phòng 2-8oC Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phịng Quy trình thực Tách chiết DNA Chuẩn bị loạt eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu thêm eppendorf cho Chứng âm tách chiết Cho tiếp 5 µl DNA IC (DNA IC cung cấp theo kit) Cho 200 µl dung dịch KTC1 vào loạt eppendorf Cho tiếp 200 µl dịch sinh thiết xử lý vào eppendorf tương ứng Trộn ủ 70 0C 20 phút Thêm vào 100 µl dung dịch KTC2 trộn Đưa hỗn hợp bước vào cột Ly tâm 8000 vòng / phút phút Chuẩn bị loạt eppendorf 2,0 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Dùng kéo vô trùng cắt bỏ nắp eppendorf (nếu eppendorf có nắp) Chuyển cột sang eppendorf 2,0 ml Cho vào cột 600µl dung dịch KTC3 Ly tâm 8.000 vòng / phút phút 10 Chuyển cột sang eppendorf 2,0 ml Cho vào cột 600µl dung dịch KTC4 Ly tâm 8.000 vòng / phút phút Đổ bỏ dịch lọc 11 Ly tâm 13.000 vòng / phút phút để loại bỏ hết tất dấu vết dung dịch KTC4 12 Chuẩn bị loạt eppendorf 1,5 ml tương tự bước Chuyển cột sang eppendorf 1,5 ml Cho vào 20 20 µl  µl KTL2 Ủ nhiệt độ 70 0C 20 phút 13 Ly tâm 13.000 vòng / phút phút để thu DNA Lưu mẫu sau tách chiết -20 - 20oC (tối đa tháng) không thực phản ứng PCR V NHẬN XÉT KẾT QUẢ - Một nhóm nhóm bbạn, ạn, thực thực hành hành theo theo nhóm, nhóm, bạn làm làm mẫu mẫu - bạ bạnn Thu Thu Hà Hà,, Minh Minh Anh, Anh, Vân Vân Anh Anh làm làm cchun hungg mẫ mẫuu 28 287 THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR     Nồng độ DNA: 342.4 ng/l 260/280=1.55, kết thấp 1.6-1.8, độ tinh không cao 260/230=1.06, kết thấp 1.8 => ngoại nhiễm hợp chất hữu cơ   Kết tách chiết DNA không tin cậy, nên thực tách chiết lại THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   BUỔI 7: 26/10/2022 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PCR H.PYLORI - Thự Thựcc hiện đọc kết qu quảả trên phần phần mềm mềm Quan Quantst tstudi udio: o: + Cả kênh màu lên tín hiệu => hợp lệ + Tín hiệu huỳnh quang chứng âm tách chiết có Ct = 30  1.65, kết nhóm đo 30.185 => Đạt + Tín hiệu huỳnh quang chứng nội mẫu xét nghiệm có Ct = 30  1.65, kết nhóm 31.482 => đạt + Mẫu xét nghiệm có giá trị Ct xác định => Dương tính với DNA H.pylori THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   BUỔI 8: 27/10/2022 GIẢI TRÌNH TỰ GENE HBV hbv-1 - 1st_BASE_1681077_313_M13_FP hbv-1 - 1st_BASE_1681078_313_M13R_pUC 26 hbv-1 - 1st_BASE_1681079_320_M13_FP.ab1 hbv-1 - 1st_BASE_1681080_320_M13R_pUC 26 hbv-2 - 1st_BASE_1681081_335_M13_FP.ab1 hbv-2 - 1st_BASE_1681082_335_M13R_pUC 26 hbv-2 - 1st_BASE_1681083_336_M13_FP.ab1 B B B B B B C SUBG ENOT YPE B1 B1 B1 B1 B3 B3 C2 hbv-2 - 1st_BASE_1681084_336_M13R_pUC 26.ab1 hbv-3 - 1st_BASE_1681085_342_M13_FP hbv-3 - 1st_BASE_1681086_342_M13R_pUC 26 hbv-3 - 1st_BASE_1681087_345_M13_FP hbv-3 - 1st_BASE_1681088_345_M13R_pUC 26 hbv-4 - 1st_BASE_1681089_347_M13_FP hbv-4 - 1st_BASE_1681090_347_M13R_pUC 26 hbv-4 - 1st_BASE_1681091_348_M13_FP hbv-4 - 1st_BASE_1681092_348_M13R_pUC 26.ab1 hbv-5 - 1st_BASE_1681093_395_M13_FP hbv-5 - 1st_BASE_1681094_395_M13R_pUC 26 hbv-5 - 1st_BASE_1681095_764_M13_FP hbv-5 - 1st_BASE_1681096_764_M13R_pUC 26 hbv-6 - 1st_BASE_1681097_768_M13_FP hbv-6 - 1st_BASE_1681098_768_M13R_pUC 26 hbv-6 - 1st_BASE_1681099_770_M13_FP hbv-6 - 1st_BASE_1681100_770_M13R_pUC 26 hbv-7 - 1st_BASE_1681101_771_M13_FP hbv-7 - 1st_BASE_1681102_771_M13R_pUC 26.ab1 B B B C C B B B B C C B B B B C C B B B1 B1 B1 C2 C2 B1 B3 B1 B3 C2 C2 B1 B1 B1 B1 C2 C2 B1 B1 Không có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc hbv-7 - 1st_BASE_1681103_772_M13_FP hbv-7 - 1st_BASE_1681104_772_M13R_pUC 26.ab1 hbv-8 - 1st_BASE_1681105_775_M13_FP.ab1 hbv-8 - 1st_BASE_1681106_775_M13R_pUC 26 hbv-8 - 1st_BASE_1681107_776_M13_FP.ab1 hbv-8 - 1st_BASE_1681108_776_M13R_pUC 26 hbv-9 - 1st_BASE_1681109_781_M13_FP hbv-9 - 1st_BASE_1681110_781_M13R_pUC 26 hbv-9 - 1st_BASE_1681111_782_M13_FP hbv-9 - 1st_BASE_1681112_782_M13R_pUC 26 hbv-10 - 1st_BASE_1681114_783_M13R_pUC 26 hbv-11 - 1st_BASE_1681115_786_M13_FP hbv-11 - 1st_BASE_1681116_786_M13R_pUC 26 hbv-11 - 1st_BASE_1681117_787_M13_FP.ab1 hbv-11 - 1st_BASE_1681118_787_M13R_pUC 26 B B B B B B B B C C B C C B B B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 C2 C2 B1 C2 C2 B1 B1 Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc GENOTY PE ĐỊNH DANH ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR genotype mồi xi ngược khác nhau, lộn vị trí THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   hbv-12 - 1st_BASE_1681119_790_M13_FP hbv-12 - 1st_BASE_1681120_790_M13R_pUC 26 hbv-12 - 1st_BASE_1681121_791_M13_FP.ab1 hbv-12 - 1st_BASE_1681122_791_M13R_pUC 26 hbv-13 - 1st_BASE_1681123_792_M13_FP.ab1 hbv-13 - 1st_BASE_1681124_792_M13R_pUC 26 hbv-13 - 1st_BASE_1681125_796_M13_FP hbv-13 - 1st_BASE_1681126_796_M13R_pUC 26 B B B B B B B B B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc hbv-14 hbv-14 1st_BASE_1681127_797_M13_FP.ab1 1st_BASE_1681128_797_M13R_pUC 26.ab1 hbv-14 - 1st_BASE_1681129_799_M13_FP hbv-14 - 1st_BASE_1681130_799_M13R_pUC 26 hbv-15 - 1st_BASE_1681131_801_M13_FP hbv-15 - 1st_BASE_1681132_801_M13R_pUC 26.ab1 hbv-15 - 1st_BASE_1681133_3879_M13_FP hbv-15 - 1st_BASE_1681134_3879_M13R_pUC 26 hbv-16 - 1st_BASE_1681135_4675_M13_FP hbv-16 - 1st_BASE_1681136_4675_M13R_pUC 26 hbv-16 - 1st_BASE_1681137_5835_M13_FP hbv-16 - 1st_BASE_1681138_5835_M13R_pUC 26 hbv-17 - 1st_BASE_1682335_783_M13_FP.ab1 B B C C B B B B B B B B B B B11 C2 C2 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 K Khhơơnngg ccóó đđộộtt bbiiếếnn kkhháánngg tthhuuốốcc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc Khơng có đột biến kháng thuốc - Tỷ lệ ge geno noty type pe B= 24 24/3 /31= 1= 77.4 77.4% % - Tỷ lệ ge geno noty type pe C= 7/31 7/31 = 222 2.6% 6%  Xác định kiểu gene HBV trang web: https://www.geno2pheno.org/ THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   BUỔI 9: 31/10/2022 THỰC HÀNH TÁCH CHIẾT RNA HCV BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHENOL CHLOROFORM AccuPid HCV Quantification Kit/Real-time RT-PCR/Q01HCV02.1A I Mục đích - Xử lý mẫu huyết để thu RNA HCV II Chuẩn bị Dụ Dụng ng cụ, cụ, thi thiết ết bị bị:: - Vật dụng tiêu hao (găng tay không phấn, ống eppendorf 1,5 ml, đầu tip dùng cho micropipettes có phin lọc) - Micropipettes (10 μl, 200 μl, 1000 μl) - Máy ly tâm cho ống eppendorf (vận tốc tối đa 13.000 - 14.000 vòng/phút) - Máy ly tâm ống máu - Máy lắc trộn (vortex) - Bồn ủ nhiệt khô - Tủ lạnh 4oC –20oC - Máy đo Nanodrop Hóa chất chất thu thuốc ốc thử thử mẫu: mẫu: - Sử dụng với mẫu huyết không chứa chất chống đông EDTA hay heparin - Bộ hóa chất tách chiết tủa RNA AccuRive pRNA Prep Kit, EX-RNA01 EX-RNA01.1A 1A - Nước cất - Dung dịch sát trùng III Thành phần hóa chất Hóa chất Thành phần Dung dịch KTS1-R  Phenol pH 4.0, Guanidine isothiocyanate, β-mercaptoethanol Dung dịch KTS2 Chloroform Dung dịch KTS3 Iso-propanol Dung dịch KTS4 70% Ethanol Tác dụng Phá vỡ cấu trúc protein màng tế  bào người vỏ capsid capsid HCV  Ngồi ra, hoạt động biến tính  protein chất chất làm  bất hoạt enzyme enzyme phân hủy RNA có hỗn hợp Thu hút hoàn toàn phenol khỏi  pha nước giúp phân phân tách  pha nước pha hữu (phenolchloroform) trở nên rõ ràng Chuyển RNA pha nước sang trạngbỏ tháicác không tan Loại gốc isopropanol khỏi THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   Dung dịch KTS5 IV DEPC tủa RNA  đảm bảo việc làm RNA giữ RNA trạng thái khơng tan Hịa tan tủa RNA, bất hoạt RNAse, DNase Quy tr trình th thực hi hiện: Tách chiết RNA - Lưu ý: Huyết  Huyết phải được bảo quản theo quy định tr ên từ thu đến thực  phản ứng  Lưu ý: Nên ý: Nên làm thêm mẫu mẫu chứng âm tách chiết cách dùng 100 l nước cất dung dịch KTS5 (trong phần thực hành không làm Chứng âm) Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu thêm eppendorf cho Chứng âm tách chiết Bật bồn ủ nhiệt khô 600C Cho vào eppendorf 900 l KTS1-R Cho 100 l huyết vào ống, 100 l nước cất lần dung dịch KTS5 Chứng âm tách chiết Vortex mạnh eppendorf giây cho tan hồn tồn protein biến tính Để n 10 phút Cho 200 l KTS2 Lắc trộn thật kỹ Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Chuyển 600 l dịch sang eppendorf 1,5 ml Lưu ý: ý: Chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch đục (protein biến tính) hai pha nước (trên) chloroform (dưới) Thêm 600 l KTS3 Lưu ý: ý: Dung dịch KTS3 cần được trộn trướ trướcc sử dụng  Vortex nhẹ để trộn Để yên 10 phút 10 Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng 11 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn Lưu ý: ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh 12 Nhẹ nhàng thêm vào 900 l KTS4 13 Ly tâm 13.000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng 14 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn 15 Làm khô cặn 10 phút 60C bồn ủ nhiệt khơ 16 Hịa cặn 50 l KTS5 (thực tế cho 20 l KTS5  cô đặc RNA) Thực phản ứng phiên mã ngược RT V Nhận xét kết THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   - Nồng độ độ R RN NA = -2.7 ng ng/l - Các ggiá iá trị trị đo ra âm, âm, thực thực tế tế trong quá trình trình hút hút nhỏ m mẫu ẫu bị lỗi: bấm  pippette khơng đủ thể tích => không đủ lượng mẫu để đo nên dẫn đến sai só sótt - Nhưn Nhưngg lượng lượng thể tích tích mẫu mẫu cịn cịn lại để chạy chạy PCR PCR hoặc điện điện di nên nên chỉ tiến tiến hành đo lần THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   BUỔI 10: 2/11/2022 THỰC HÀNH KỸ THUẬT RT RNA HCV THU ĐƯỢC Ở BUỔI AccuPid H.pylori Detection Kit/Real-time PCR/Q01HPY01.2A I Mục đích: - Taq  Taq DNA polymerase phản ứng PCR khơng sử dụng RNA làm mạch khn cho q trình  trình nhân Vì vậy, để phản ứng PCR xảy ra, RNA HCV cần phải chuyển thành cDNA  cDNA thông qua phản ứng phiên mã ngược II Chuẩn bị: Dụng cụ, thiết bị: - Vật dụng tiêu hao (găng tay không phấn, ống eppendorf 0,2 ml/0,1 ml, đầu tip dùng cho micropipettes có phin lọc) - Máy Real-time PCR (đọc màu FAM, HEX) + hệ thống máy vi tính - Máy ly tâm cho ống eppendorf (vận tốc tối đa 13.000 - 14.000 vòng/phút) - Micropipettes - Máy lắc trộn (vortex) Hóa chất thuốc thử mẫu: - Mẫu RNA tách chiết từ buổi - Hóa chất PCR AccuPid HBV Quantification Kit– Q01HBV02.2A III Quy trình thực hiện: A Tách chiết RNA: Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu thêm 1eppendorf cho Chứng âm tách chiết Bật bồn ủ nhiệt khô 600C Cho vào eppendorf 900 l KTS1-R Chođối 100với  huyế huyếtt vàochiết ống, 100 eppendorf l nước cấttrong lầníthoặc dịc h KTS5 vớil Chứng âm tách Vortex mạnh dung giâydịch cho tan hồn tồn protein  protein biến  biến tính Để n 10 phút phút Cho 200 l K KTS2 TS2 Lắc trộn thật kỹ Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Chuyển 600 l dịch sang sang eppendorf 1,5 ml mới Lưu ý: Chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch đục (protein biến tính) hai  pha nước (trên) chloroform chloroform (dưới) Thêm 600 l KTS3 THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   Lưu ý: Dung dịch KTS3 cần trộn trước sử dụng  Vortex nhẹ để trộn Để yên 10 phút 10 Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng 11 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn Lưu ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh 12 Nhẹ nhàng thêm vào 900 l KTS4 13 Ly tâm 13.000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng 14 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn 15 Làm khô cặn 10 phút 60 C bồn ủ nhiệt khơ 16 Hịa cặn 50 l KTS5 Thực phản ứng phiên mã ngược RT B Thực phản ứng RT Cho l dung dịch Buffer RT vào eppendorf 0,2 ml chứa Mix RT RT Cho 15 l dị dịch ch RNA tách chiết vào eppendorf 0,2 ml chứa l hỗn hợp hợp phản phản ứng RT trên.  trên. Phản ứng tiến hành rack lạnh Các ống eppendorf đặt vào máy luân nhiệt Chạy chương trình “RT HCV” sau: chu kì 25oC – phút 11 chu phút chu kì kì 42oC 85oC –– 30 phút Giữ mẫu 4oC Nếu không tiến hành phản ứng PCR ngya ngày, bảo quản cDNA 2-8 oC vòng 2-3 ngày, -20 oC tháng IV Nhận xét kết Các bạn nhóm đem mẫu qua bên trường để chạy PCR  THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR   Buổi 11: 7/11/2022 GIẢI TRÌNH TỰ GENE HCV Định danh hcv 1stt_B _BA ASE SE_1 _18870 7046 467_ 7_T T11 11_C _C11 11 M1 M13_ 3_F FP hcv - 1s hcv - 1s hcv 1stt_B _BA ASE SE_1 _18870 7046 468_ 8_T T19 19_D _D11 11_M _M13 13_F _FP P hcv 1stt_B _BA ASE SE_1 _18870 7046 469_ 9_T T46 46_E _E11 11_M _M13 13_F _FP P hcv - 1s hcv - 1s hcv 1stt_B _BA ASE SE_1 _18870 7047 470_ 0_T T48 48_F _F11 11_M _M13 13_F _FP P - 1st_BASE_1870471_T53_G11_M13_FP - 1st_BASE_1870472_T89_H11_M13_FP 21st_BA 1st _BASE SE_18 _18704 70475_ 75_T11 T11_C1 _C12_M 2_M13R 13R_pU _pUC C 26 26 21st_BASE_1870476_T19_D12_M13R_pUC 31st_BA 1st _BASE SE_18 _18704 70477_ 77_T46 T46_E1 _E12_M 2_M13R 13R_pU _pUC C 26 26 Kiểu gene 1b 1b 1b 1b 1b 2j Kháng thuốc không kháng thuốc không kháng thuốc không kháng thuốc không kháng thuốc không kháng thuốc không kháng thuốc 1b không kháng thuốc 1b không kháng thuốc 1b không kháng thuốc 31st - _BASE 1st_BA SE_18 _18704 70478_ 78_T48 T48_F1 _F12_M 2_M13R 13R_pU _pUC C 26 26 1st_BASE_1883314_T05_M13_FP.ab1  bt02-1 - 1st_BASE_1883314_T05_M13_FP.ab1  bt02-1 1st_ 1s t_BA BASE SE_1 _188 8833 3315 15_T _T05 05_M _M13 13R_ R_pU pUC_ C _26 6.ab ab11  bt02-1 - 1st_BASE_1883316_T09_M13_FP.ab1 1st_BASE_1883316_T09_M13_FP.ab1 1st_BASE_1883318_T16_M13_FP.ab1  bt02-1 - 1st_BASE_1883318_T16_M13_FP.ab1  bt02-2 1st_ 1s t_BA BASE SE_1 _188 8833 3319 19_T _T16 16_M _M13 13R_ R_pU pUC_ C _26 6.ab ab11  bt02-2 - 1st_BASE_1883320_T20_M13_FP.ab1 1st_BASE_1883320_T20_M13_FP.ab1  bt02-2 1st_ 1s t_BA BASE SE_1 _188 8833 3321 21_T _T20 20_M _M13 13R_ R_pU pUC_ C _26 6.ab ab11  bt02-2 - 1st_BASE_1883322_T21_M13_FP.ab1 1st_BASE_1883322_T21_M13_FP.ab1  bt02-3 1st_BASE_1886763_T09_M13R_pUC 26  bt03-1 1st_ 1s t_BA BASE SE_1 _188 8833 3325 25_T _T22 22_M _M13 13R_ R_pU pUC_ C _26 6.ab ab11 1st_BASE_1883326_T67_M13_FP.ab1  bt03-1 - 1st_BASE_1883326_T67_M13_FP.ab1  bt03-1 1st_ 1s t_BA BASE SE_1 _188 8833 3327 27_T _T67 67_M _M13 13R_ R_pU pUC_ C _26 6.ab ab11 1st_BASE_1883328_T78_M13_FP.ab1  bt03-1 - 1st_BASE_1883328_T78_M13_FP.ab1  bt03-2 1st_ 1s t_BA BASE SE_1 _188 8833 3329 29_T _T78 78_M _M13 13R_ R_pU pUC_ C _26 6.ab ab11 1b 2m không kháng thuốc không kháng thuốc 2m 1a 1a không kháng thuốc không kháng thuốc không kháng thuốc 1a 1b không kháng thuốc không kháng thuốc 1b 1b không kháng thuốc không kháng thuốc 1a không kháng thuốc 1b 2m không kháng thuốc không kháng thuốc 2m 2a không kháng thuốc không kháng thuốc 2a không kháng thuốc 1st_BASE_1883330_T81_M13_FP.ab1  bt03-2 - 1st_BASE_1883330_T81_M13_FP.ab1 6h không kháng thuốc THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR THUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCRTHUC.HANH.ky.THUAT.COLONY.PCR