(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thực vật thuộc chi agrimonia họ hoa hồng (rosaceae)

HỒ ĐẮC HÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THUỘC CHI AGRIMONIA HỌ HOA

HỒ ĐẮC HÙNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ LỒI THỰC VẬT THUỘC CHI AGRIMONIA HỌ HOA

chất có hoạt tính sinh học-Viện Hóa học-Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam

Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Gia Điền, Trưởng phịng Cơng nghệ chất có hoạt tính sinh học người ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập làm luận văn, người thầy hướng dẫn hồn thành luận văn

Tơi xin chân thành cảm ơn TS Bùi Kim Anh tận tình bảo, giúp đỡ trình làm luận văn, cảm ơn nhà thực vật học Nguyễn Kim Đào việc thu hái mẫu định tên Xin cảm ơn đồng nghiệp thuộc phịng Cơng nghệ chất có hoạt tính sinh học-Viện Hóa học động viên giúp đỡ nhiều

Nhân dịp này, tơi xin bày tỏ kính trọng cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Hóa học tới thầy giáo Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập hồn thành luận văn

Hà nội, ngày tháng năm 2013

Hồ Đắc Hùng

EI-MS Phổ khối ion hóa va chạm electron

1.1 Vài nét thực vật chi Long nha thảo (Agrimonia) 3

1.2 Một số kết nghiên cứu hóa thực vật chi Agrimonia 3

2.1 Cơng dụng số lồi thực vật chi Agrimonia sử dụng

trong y học dân tộc Việt Nam:

12

2.2 Những nghiên cứu nước ngồi hoạt tính sinh học thực vật chi Agrimonia :

13

3.1 Đặc điểm thực vật Long nha thảo (Agrimonia pilosa

Ledeb.)

19

3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất: 23

3.4 Kết khảo sát hoạt tính sinh học cặn dịch chiết từ Long nha thảo:

36

4.5 Hằng số vật lý liệu phổ chất thu đƣợc: 43

cứu để phục vụ cho nhiều lĩnh vực sống, đặc biệt y học Thiên nhiên không nguồn nguyên liệu cung cấp hoạt chất quí để tạo biệt dược mà cung cấp chất dẫn đường để tổng hợp loại thuốc Từ tiền chất phân lập từ thiên nhiên, nhà khoa học chuyển hóa chúng thành hợp chất có khả trị bệnh cao Các kết thống kê gần cho thấy hợp chất đăng ký làm thuốc tồn giới 61% hợp chất thiên nhiên chất có liên quan tới chúng Trong có 6% hợp chất thiên nhiên, 27% dẫn xuất hợp chất thiên nhiên, 5% hợp chất tổng hợp có mang nguyên liệu đầu bắt nguồn từ hợp chất thiên nhiên 23% chất tổng hợp thiết kế sở cấu trúc phân tử thu từ hợp chất thiên nhiên (các chất mô hợp chất thiên nhiên) Trong số lĩnh vực trị liệu có đến 78% hoạt chất dùng làm thuốc kháng sinh 74% hoạt chất dùng làm thuốc chữa ung thư hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên [*]

Việt nam nằm khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa vùng có tính đa dạng sinh học cao Riêng thực vật, Việt Nam có khoảng 12000 lồi, có 2300 lồi thực vật sử dụng làm lương thực, thuốc chữa bệnh… Khoảng 25% loại thuốc sử dụng thơng thường xuất phát từ lồi thực vật dùng y học dân gian

Cây Long nha thảo có tên khoa học: Agrimonia pilosa Ledeb

thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) loại thảo sống lâu năm có nguồn gốc vùng Hymalaya, bao gồm Trung quốc Ấn độ Việt Nam Trong y học dân gian Long nha thảo sử dụng làm thuốc cầm

máu, chữa thổ huyết, khái huyết (ho máu), nục huyết (đổ máu cam), lỵ phân lẫn máu, sốt rét mụn nhọt lở loét da [1] Các nghiên cứu gần cho thấy, Long nha thảo vị thuốc có phổ tác dụng tương đối rộng, từ chống viêm nhiễm, tăng cường khả miễn dịch thể, có tác dụng ức chế khối u đến khả kháng HIV… quan tâm nghiên cứu nhiều nhà khoa học giới, Việt Nam sử dụng theo kinh nghiệm dân gian chưa nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Ngồi ra, Long nha thảo mười thành phần vị thuốc nhóm lương y thuộc phịng nghiên cứu thuốc, thuốc dân tộc thuộc Trung Tâm Cơng nghệ Hóa dược hóa sinh hữu - Viện KH & CNVN sử dụng từ năm 2004 điều trị thành công số bệnh nhân nhiễm HIV chuyển sang AIDS Trên sở thuốc nam chúng tơi chọn Long nha thảo làm đối tượng nghiên cứu luận văn với mục đích tìm hiểu thành phần hóa học tác dụng dược lý với nội dung là:

2 Nghiên cứu phân lập hợp chất có Long nha thảo

(Agrimonia pilosa Ledeb.) họ hoa hồng (Rosaceae), thu hái

Sapa-Lào Cai

3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập

4 Khảo sát hoạt tính sinh học phân đoạn dịch chiết chất phân lập

[*] David J Newman, Gordon M Cragg, and Kenneth M Snader (2003), “Natural products as sources of new drugs over the periode 1981-2002” J Nat prod 66, pp1022-1037

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Vài nét thực vật chi Long nha thảo (Agrimonia)

Chi Long nha thảo (danh pháp khoa học: Agrimonia) chi

chứa khoảng 12-15 loài Chi Long nha thảo thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) có nguồn gốc vùng Hymalaya, bao gồm Trung Quốc, Ấn Độ ngồi cịn có khu vực ơn đới Bắc bán cầu, châu Âu châu Phi

Theo thống kê loài thuộc chi Agrimonia phân bố giới:

- Agrimonia eupatoria (1 loài phân bố Châu Âu, Châu Á, Châu Phi) - A coreana, A nipponica (1 loài phân bố Đơng Á)

- Agrimonia pilosa (1 lồi phân bố Đơng Âu, Châu Á) - Agrimonia procera (1 lồi phân bố Châu Âu)

- Agrimonia repens (1 loài phân bố Nam Á)

- A rostellata, A striata, A gryposepala, A incisa, A microcarpa, A parviflora, A pubescens (7 loài phân bố Bắc Mỹ)

Ở Việt Nam có nhiều Lào Cai, Lai Châu, Hà Giang, Cao

Bằng, Lạng Sơn, Hịa Bình, Tam Đảo chủ yếu loài A pilosa [1]

1.2 Một số kết nghiên cứu hóa thực vật chi Agrimonia

Thành phần hóa học chi Agrimonia nghiên cứu giới nhiên Việt Nam chưa có nghiên cứu chi Loài A

pilosa Ledeb sử dụng thuốc dân gian, chưa

nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Đã có số cơng trình nghiên cứu nhà khoa học Hàn quốc, Trung quốc

một số loài thực vật thuộc chi Agrimonia Các nghiên cứu thành phần hóa học từ lồi Agrimonia pilosa có mặt hợp chất

flavonoid, tritecpen, saponin tanin [2,3,4] có số nghiên cứu cơng bố hoạt tính sinh học từ phần dịch chiết từ thân loài này; đáng ý hoạt tính sinh học kháng khuẩn,

chống oxy hóa, hoạt tính ức chế acetylcholinesterase, chống ung thư

hoạt tính kháng HIV [5,6 ,7]

Thành phần hóa học lồi thuộc chi Agrimonia

tecpenoit, flavonoit số hợp chất khác

1.2.1 Các hợp chất flavonoit

Flavonoit nhóm hợp chất thường gặp thực vật, có nửa loại rau dùng hàng ngày Flavonoit nhóm hoạt chất lớn dược liệu Phần lớn flavonoit có màu vàng, ngồi cịn có chất màu xanh, tím, đỏ khơng màu Flavonoit có mặt tất phận loài thực vật bậc cao, đặc biệt hoa, tạo cho hoa sắc màu rực rỡ để quyến rũ loại côn trùng giúp cho thụ phấn Trong cây, flavonoit giữ vai trò chất bảo vệ, chống oxy hóa, bảo tồn axít ascorbic tế bào, ngăn cản số tác nhân gây hại cho (vi khuẩn, virus, côn trùng, ) số cịn có tác dụng điều hịa sinh trưởng cối

Flavonoit nhóm hợp chất có nhiều tác dụng sinh học Trước hết, dẫn chất flavonoit chất chống xy hóa, có khả bắt gốc tự OH, ROO (là yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung thư, tăng nhanh lão hóa, ) Đồng thời, flavonoit tạo phức với ion kim loại nên ngăn cản phản ứng oxy hóa mà ion enzym xúc tác Do đó, chất flavonoit có tác dụng bảo vệ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạnh, tai biến mạnh, lão hóa, thối hóa gan, tổn thương xạ Các flavonoit cịn có tác dụng làm bền thành mạch, dùng trường hợp rối loạn chức tĩnh mạnh, trĩ, rối loạn tuần hồn võng mạc, Các chất flavonoit cịn có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức gan Nhiều hợp chất flavonoit thuộc nhóm flavon, flavanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt có diếp cá, râu mèo, Trên hệ tim mạch, nhiều hợp chất flavonoit quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp catechin trà có tác dụng làm

tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích phút tim, Ngày nay, dược liệu hoa có hàm lượng flavonoit cao khai thác chiết xuất, nghiên cứu, sản xuất thành sản phẩm: thuốc viên, thuốc nước, tiện ích sử dụng

Một số nghiên cứu thành phần hóa học số loài thực vật

thuộc chi Agrimonia giới:

Khi nghiên cứu thành phần hóa học loài A pilosa Ledeb, nhà

nghiên cứu Trung Quốc Nhật Bản phân lập xác định cấu trúc

được hợp chất như: Aromadendrin (1), aromadendrin 3-O-β-d-glucopyranosit (2), astragalin (3), afzelin (4), tilirosit (5), luteolin (6), quercetin (7) , isoquercetrin (8), quercitrin (9), takanechromone C (10), dihydroxy-2-propylchromone 7-O-β-d-glucopyranosit (11), 5,7-dihydroxy-2-propylchromone (12), demethylagrimonolit

6-O-β-d-glucopyranosit (13), agrimonolit 6-O-glucosit (14), demethylagrimonolit

Một hợp chất flavonol glycosit kaempferit 3-rhamnosit (18)

được nhà nghiên cứu Ý phân lập từ loài Agrimonia

Cũng từ loài A eupatoria nhà nghiên cứu Anh phân lập

được flavonol glycosit isoquercetrin (8) kaempferol 3-O-β-D- glucopyranosit (19) [11]

Các nhà nghiên cứu Hàn Quốc phân lập từ loài Agrimonia

pilosa Ledeb số hợp chất flavonoit tilirosit (5), 3- methoxy

quercetin (21), quercetin (7), quercitrin (9) Các hợp chất thử hoạt tính cho thấy kết hợp chất tilirosit (5) quercetin (7) có khả

năng ức chế hoạt tính enzyme acetylcholinesterase (AChe) với

Các nhà nghiên cứu Nhật Bản phân lập xác định cấu trúc

được chất pilosanol N (21) từ loài A pilosa Ledeb, nhận thấy

lồi có hàm lượng cao polyphenol; số chất flavonoit, coumarins, glycosit phenolic với đặc tính dược lý, hoạt tính chống ung thư,

kháng viêm, kháng khuẩn, hoạt tính ức chế acetylcholine esterase hoạt

tính ức chế nitric oxít (NO) NO nguyên nhân phá hủy tế bào, theo nghiên cứu hợp chất phenolic có hoạt tính ức chế NO Với kết thử hoạt tính chất phân lập được, chất

pilosanol N (21) ức chế NO nguyên nhân gây kích thích đại

thực bào Thông qua trình ức chế NO làm giảm sản xuất NO

Cũng nhóm nhà khoa học Nhật phân lập xác định

cấu trúc hợp chất như: quercitrin (9), agrimonolit 6-O-glucosit

(14), loliolit (22), dihydrokaempferol-3-O-glucosit (23), aromadendrin

(24) từ loài A pilosa Ledeb

Các nhà nghiên cứu thử hoạt tính ức chế nitric oxít

nhận thấy hợp chất quercitrin (9), dihydrokaempferol-3-O-glucosit (23), aromadendrin (24) phân lập có hoạt tính ức chế nitric oxít cao

hơn hợp chất phenolic khác

Một nhóm nhà khoa học Brrazil phân lập hợp chất

catechin dẫn suất chúng từ loài A pilosa đồng thời nhận thấy

chúng có hoạt tính kháng khuẩn [16] Catechin cịn có hoạt tính bảo vệ thần kinh chống lại glutamat, chúng cịn có khả bắt gốc tự DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) Các kết cho thấy catechin chất bảo vệ thần kinh hoạt tính bắt gốc tự [17, 18]

Catechin chứng minh có khả tác động đến trình ức chế tạo thành sợi alpha S (protein alpha-synuclein) làm tính bền sợi tạo từ trước Sự kết tụ alpha S tạo thành sợi não gia đoạn chủ chốt trình phát triển bệnh thần kinh thể Lewy teo đa hệ thống [15]

1.2.2 Các hợp chất tecpenoit

Các nhà Khoa học Hàn Quốc Trung Quốc phân lập xác

định cấu trúc tritecpenoit usrolic axít (25), polmolic axít

(26), tormentic axít (27), corosolic axít (28) từ lồi Agrimonia pilosa

Ledeb Các hợp chất có hoạt tính sinh học hoạt tính kháng

Các loài thực vật thuộc chi Agrimonia có chứa chất hypericin,

agrimophol, agrimol A-G, caffeic axit, gallic axit, dầu bay hơi, tannin, axit hữu cơ, vitamin C, K [1]

2 Một số kết nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Agrimonia 2.1 Công dụng số loài thực vật chi Agrimonia đƣợc sử dụng

trong y học dân tộc Việt Nam:

Long nha thảo A pilosa Ledeb var nepalensis, có vị đắng,

chát, tính bình, có tác dụng thu liễm huyết, triệt ngược, lỵ, giải độc Thường dùng trị khái huyết, thổ huyết, băng huyết, đại tiện máu, sốt rét, lỵ , tràng nhạc, lao lực, ung thũng [1]

Long nha thảo A pilosa Ledeb, có tác dụng thu liễm huyết,

cầm lỵ, sát trùng Điều trị chứng xuất huyết khái huyết, thổ huyết, nục huyết, niệu huyết, tiện huyết, băng lậu, phúc tả, kiết lỵ, sốt rét, viêm âm đạo trùng roi [1] Long nha thảo thường sử dụng chữa bệnh ban xuất huyết giảm tiểu cầu, ban xuất huyết dị ứng, bệnh ưa chảy máu (hemophilia), xuất huyết đường tiêu hóa, xuất huyết đường tiết niệu, xuất huyết tử cung

Đặt biệt, kết nghiên cứu dược lý gần phát Long nha thảo có tác dụng tăng cường khả miễn dịch thể, chất quercetin, ursolic acid, Long nha thảo có tác dụng ức chế khả tái sinh virut HIV [19] Hiện Long nha thảo bắt đầu sử dụng lâm sàng cho bệnh nhân HIV/AIDS Đã có số nghiên

cứu nước từ nguồn tổng hợp nguồn gốc tự nhiên để làm thuốc điều trị bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS Theo đó, Long nha thảo sử dụng 10 vị thuốc mà nhóm lương y thuộc phòng nghiên cứu thuốc, thuốc dân tộc thuộc Trung tâm Cơng nghệ Hóa dược hóa sinh hữu - Viện KH & CNVN từ năm 2004 điều trị thành công bệnh nhân nhiễm HIV chuyển sang AIDS (theo xét nghiệm bệnh viện Quân y 103 với biểu người bị lở loét, nhiễm trùng phổi nặng, suy kiệt thể chất Sau tháng điều trị thuốc nam, bệnh nhân khỏi bệnh, tăng cân, thân thể lành lặn người bình thường Trên sở thuốc nam đó, đến năm 2011 lương y Trung Tâm hoàn thiện thuốc tiến hành chữa khỏi cho nhiều bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS Những bệnh nhân khỏi bệnh, làm việc bình thường khơng phải dùng thuốc

2.2 Những nghiên cứu nước hoạt tính sinh học thực vật chi Agrimonia :

Đã có số cơng trình nghiên cứu nhà khoa học Hàn

quốc, Trung quốc số loài thực vật thuộc chi Agrimonia Các

nghiên cứu hoạt tính sinh học từ phần dịch chiết từ thân loài hoạt tính sinh học kháng khuẩn, chống oxy hóa,

hoạt tính ức chế acetylcholinesterase, chống ung thư hoạt tính kháng

thuốc có phổ tác dụng tương đối rộng Chất agrimol Long nha thảo có tác dụng trừ sán; tannins Long nha thảo có tác dụng chống virut gây bệnh mụn rộp Cao thuốc chế từ Long nha thảo có tác dụng làm co mạch ngoại biên, tăng tốc độ đơng máu, có tác dụng ức chế mạnh tụ cầu khuẩn vàng, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn coli, trực khuẩn lỵ, trực khuẩn thương hàn trực khuẩn lao Kết nghiên cứu Trung Quốc cho thấy Long nha thảo có tác dụng ức chế mạnh tế bào ung thư mô liên kết S180, ung thư ruột, ung thư gan số loại ung thư

hiện thêm Long nha thảo có tác dụng tăng cường khả miễn dịch thể; chất quercetin, ursolic axít, Long nha thảo có tác dụng ức chế khả tái sinh virut HIV Hiện Long nha thảo bắt đầu

Từ dịch chiết ethanol lồi Agrimonia pilosa (APE) nhóm

nhà nghiên cứu Hàn Quốc thử tác dụng gây chết ức chế dòng tế bào ung thư gan người Hep G-2 Kết cho thấy với liều lượng APE 50–400 μg/ml tiến hành thử nghiệm 24giờ 48 dòng tế

và 87.0 μg/ml 48 h, có ngăn cản, gây chết ức chế dòng tế bào ung thư gan Hep G-2 [12,19]

Từ dịch chiết loài Agrimonia pilosa (APE) nhóm nhà

khoa học Nhật Bản nghiên cứu tác dụng chống viêm chống dị ứng dòng tế bào ống nghiệm thể chuột Mơ hình thử nghiệm chứng viêm chế phân tử liên quan nghiên

cứu tác động dịch chiết methanol loài A pilosa lên đại thực bào

chuột RAW 264,7 Lipopolysaccharit (LPS) sinh chất trung gian gây viêm nhiễm đo Sử dụng IgEDNP kiểm chứng thoái biến dòng tế bào chuột RBL-2H3 [13]

Các nhà khoa học Nhật Bản thử hoạt tính ức chế trình sinh nitrit oxit lipopolysaccharit (LPS) RAW264.7 (đại thực bào

chuột) dịch chiết etanol loài A pilosa Ledeb Với ảnh hưởng

của nồng độ khác (0,025%, 0,50%, 0,10% 0,25%) dịch chiết

EtOH Agrimonia pilosa Ledeb để đánh giá ức chế trình sinh

nitrit oxit Các giá trị ức chế ức chế (%) tế bào mẫu cho LPS điều trị Đánh giá khả tồn tế bào với mẫu xử lý nồng độ thử nghiệm kiểm tra khảo nghiệm MTT, khả tồn tế bào thể giá trị % tế bào kiểm sốt mà khơng có mẫu Với kết thu thấy

dịch chiết A pilosa Ledeb có hoạt tính ức chế điều chỉnh sản

sinh nitrit oxit mức, nguyên nhân gây độc phá hủy tế bào [14] Từ nghiên cứu tác dụng chống hen suyễn dịch chiết AP thể viêm đường hô hấp ovalbumin (OVA), với việc sử dụng mơ hình chuột, kết cho thấy dịch chiết AP làm suy yếu kích hoạt đại thực bào basophils ức chế viêm đường hô hấp gây OVA Các chế phân tử cho thấy dịch chiết AP có tác dụng kháng viêm chống dị ứng mạnh Từ cho thấy AP có giá trị trị liệu điều trị khác bệnh viêm bao gồm hen suyễn [20]

Khi nghiên cứu số loài thực vật địa, nhóm nhà khoa học Anh xác định lồi có hoạt tính kháng khuẩn có liên quan đến điều trị nhiễm trùng vi khuẩn vết thương, có

lồi Agrimonia eupatoria Chế phẩm loài A eupatoria sàng

lọc hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram dương Gram âm thử hoạt tính chống viêm Bằng cách sử dụng phương pháp pha loãng nồng độ 96 giếng, với nồng độ 200, 40 mg/ml Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) xác định cho chất chiết xuất giá

trị từ đến 0,004 mg/ml Chế phẩm loài Agrimonia eupatoria có tác

dụng làm se vết thương sử dụng để điều trị tiêu chảy trẻ em, viêm niệu đạo, viêm đại tràng, viêm bàng quang viêm họng [21]

Các nhà khoa học Hàn Quốc nghiên cứu khả bảo vệ gan

của nước chiết từ loài A eupatoria (AE) để chống lại chấn thương mãn

tính gan ethanol Thử nghiệm chuột cho ăn chế độ ăn uống với chất lỏng Lieber-DeCarli tuần sau động vật điều trị miệng với nước chiết AE với liều lượng 10, 30, 100, 300 mg/kg/ngày Kết sau chấn thương mãn tính gan ethanol gây ra, hoạt động dẫn truyền huyết aminotransferase viêm cytokine tăng đáng kể, song gia tăng suy yếu sau điều trị

bằng nước chiết AE Hoạt độ cytochrome P450 2E1 peroxy lipid tăng

lên sau tiêu thụ ethanol mãn tính, giảm nồng độ glutathione, thay đổi suy giảm tác động AE Kết cho thấy AE làm giảm chấn thương mãn tính gan gây ethanol, bảo vệ khả chống oxy hóa truyền tín hiệu qua trung gian TLR viêm [22]

Các nhà nghiên cứu Anh tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn

và chống oxy hóa dịch chiết từ lồi A eupatoria nhận thấy có dịch chiết n-hexane có tác dụng ức chế khuẩn Bacillus cereus Bacillus subtilis Còn dịch chiết MeOH cho thấy hoạt tính bật

chống oxy hóa dựa khảo nghiệm DPPH

Định lượng mật độ hấp phụ DPPH, xác định nồng độ chất

Theo nghiên cứu nhà khoa học hợp chất phenolic

có lồi Agrimonia asiarica, thử hoạt tính độc tế bào, chống u

bướu chất chuột thử nghiệm, kết cho thấy hợp chất có hoạt tính khả quan giảm khoảng 60% khối u thử nghiệm 10 ngày [16, 26]

Các loài thực vật thuộc chi Agrimonia chứa lớp chất có

hoạt tính tốt đa dạng, đặc biệt lớp chất flavonoit, phenolic tritecpen Trên giới có nhiều nhóm nghiên cứu chi này,

nhiên Việt Nam chi Agrimonia chưa nghiên cứu sâu thành

phần hóa học hoạt tính sinh học mà sử dụng thuốc dân tộc để điều trị chữa bệnh cho người Vì chúng

tơi chọn lồi thực vật Agrimonia pilosa Ledeb thuộc chi Agrimonia có

Việt Nam để tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh

học chúng góp phần hiểu biết sâu loài thực vật chi Agrimonia

với mục đích tìm chất, nguồn dược liệu để điều trị chữa bệnh hiệu cho người

CHƯƠNG ĐỒI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, nhiệm vụ nghiên cứu:

Đối tượng thuốc dân gian Long nha thảo (Agrimonia pilosa

Ledeb.), thu hái để nghiên cứu Ở Việt Nam có nhiều Lào cai, Lai châu, Hà giang, Cao bằng, Lạng sơn, Hịa bình, Tam đảo[1]

Các nhiệm vụ luận văn là:

- Chiết tách mẫu với loại dung mơi khác - Khảo sát hoạt tính sinh học cặn dịch chiết - Phân lập tinh chế hợp chất

- Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất:

Các phương pháp phân lập tinh chế hợp chất bao gồm phương pháp sắc ký như:

- Sắc kí lớp mỏng thực mỏng silica gel tráng

- Sắc ký cột gel (sephadex LH-20 ) nhựa trao đổi ion Diaion HP-20; Sắc ký ngược pha RP-18 sắc ký mỏng điều chế kết

tinh

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất:

Cấu trúc hóa học chất xác định kết hợp phương pháp vật lý phương pháp phổ đại như: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (EI-MS, ESI-MS), phổ cộng hưởng từ

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học:

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định thử chủng vi khuẩn nấm theo phương pháp pha loãng nồng độ Hadacek F Greger H Hoạt tính gây độc tế bào thử theo phương pháp Scudiero D A cộng dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), ung thư vú (MCF7) đối chiếu với chất chuẩn Hoạt tính kháng oxi hóa thử theo phương pháp DPPH Shela G cộng

CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đặc điểm thực vật Long nha thảo (Agrimonia pilosa

Ledeb.)

Cây Long nha thảo loại thảo sống lâu năm cao khoảng 60-120cm, tồn thân rậm lơng nhung dài màu trắng Lá 5-9 chét to phụ nhỏ, hình bầu dục hay trái xoan ngược, mép có có lơng nhung len hai mặt, có tuyến, bắc xoan to, có Chùm hoa thưa cao 10-30cm, cuống hoa ngắn, đài có thuỳ nhọn; cánh hoa màu vàng, nhị 5-15, nhụy hai nỗn rời Ðài có gai móc đứng, rãnh 10, bế 2, hoa tháng 4-7, tháng 8-10

Hình Cây Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb.)

3.2 Chiết xuất phân lập hợp chất 3.2.1 Thu hái xử lý mẫu thực vật:

Chúng chọn thời điểm phát triển chúng có hoa để thu hái Mẫu thực vật thu hái vào tháng Sapa - Lào cai - Việt nam Tên nhà thực vật học Nguyễn Kim Đào (Viện sinh thái tài nguyên sinh vật) thẩm định, tiêu lưu giữ phịng Cơng nghệ chất có hoạt tính sinh học, Viện Hóa học, Viên Khoa học Cơng nghệ Việt Nam

3.2.2 Sơ đồ phân lập chiết tách mẫu thực vật Sơ đồ1: Chiết tách mẫu thực vật

Bột mẫu thực vật (1,1kg)

Cặn dịch chiết (A7)

1 Chiết siêu âm với EtOH (%)

2 Cất loại dung môi áp suất giảm

Chiết phân đoạn với dung môi

Sơ đồ 2: Phân lập hợp chất cặn dịch chiết CH2Cl2

Sơ đồ 3: Phân lập hợp chất cặn dịch chiết EtOAc

Sơ đồ (tiếp theo): Phân lập hợp chất từ phân đoạn cặn

3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất:

*) Chất (ß-sitosterol): phân lập từ phân đoạn F3 cặn dịch

*) Chất (β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit) phân lập từ

δH 0,77; 0,81; 0,82; 0,83; 0,90 0,96 ppm có cặp tín hiệu

dublet δ 0,82 (H-26) δ 0,81 (H-27) có số tương tác J

=7,0 Hz tương tác germinal nhóm metyl vị trí C-26 C-27 gắn

vào nhóm metin vị trí 25 Tín hiệu dublet δ 5,33 (J =5,0 Hz)

nối đôi vị trí C5 - C6 với multiplet δ 3,46 (1H, m, H-3)

cho thấy dẫn xuất sitosterol Tín hiệu proton anomer δ

4,22 (J=7,0 Hz) với vùng tín hiệu proton δ 4,39-4,85 ppm cho

thấy có mặt phân tử đường glucose phân tử hợp chất Trên

các phân tích với phổ khối lượng EI-MS cho pic ion m/z 575

tài liệu công bố [9, 28] cho phép nhận dạng chất

β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit hay daucosterol

Hợp chất AP thu dạng tinh thể hình kim, màu vàng, điểm

thơm vòng A, với xuất nhóm tín hiệu singlet từ δ

sự tách vạch đặc trưng hệ thống spin ABX [30] với số tương

tác J =2Hz J =8Hz cho thấy vị trí 3’, 4’ vịng B hợp chất

các tín hiệu cacbon chuyển vùng trường thấp nối với oxi Cụm

tín hiệu vùng từ δ 55,9 - 62,2 ppm cacbon nhóm metoxy; tín hiệu nhóm C=O (vị trí 4) δ 173,8 ppm.Việc gắn số liệu phổ

chiều Từ liệu thu được, so sánh với tài liệu [29, 31, 32] xác định

hợp chất AP 3,5,6,7,8,3',4'-heptamethoxyflavone Hợp chất

3,5,6,7,8,3’,4’-heptamethoxyflavone tìm thấy số lồi

Citrus lần tách từ Long nha thảo Hoạt

tính ức chế khối u, chống oxy hóa tốt hợp chất flavon nhóm nghiên cứu Nhật cơng bố [33]

Hình 2: Phổ 1H-NMR hợp chất AP

*) Hợp chất AP2 (5, 7, 3’- trihydroxy- 6, 4’,5’- trimetoxy flavon)

AP2 5,7, 3'-trihydroxy-6,,4',5' trimetoxyflavon

Hợp chất AP2 thu chất bột màu vàng, điểm nóng chảy

H-NMR hợp chất AP2 xuất tín hiệu cộng hưởng vịng A δ

hết tín hiệu C dịch phía trường thấp với nhóm carbonyl δ

được, so sánh với tài liệu [34, 35, 36] xác định hợp chất AP2 5,7,3’-

trihydroxy - 6, 4’,5’- trimetoxy flavon

Hợp chất 5,7,3’- trihydroxy - 6,4’,5’- trimetoxy flavon (irigenin) tìm thấy số lồi thuộc họ Iridaceae nghiên cứu công bố hoạt tính ức chế ung thư kháng viêm tốt [34], song lần hợp chất irigenin phân lập từ Long nha thảo

Chất AP3 phân lập từ phân đoạn F4.2 phần dịch chiết

(1H, t, 3,5 Hz, H-12) nhóm metyl với độ chuyển dịch hóa học

liệu phổ so sánh với tài liệu cho phép kết luận hợp chất AP3 ursolic

Chất AP4 phân lập từ phân đoạn F4.3 phần dịch chiết

H-8); δ 6,20 ppm (d, J = 2Hz, H-6) chứng tỏ hợp chất thơm có proton vị trí meta với Kiểu tín hiệu xuất vùng δ 6,90 7,75 ppm với số tương tác J = 8Hz J = 2Hz chứng tỏ vịng B có hai nhóm

ppm, vị trí C-5, C-7, C-3’ C-4’ có dịch chuyển phía trường yếu chứng tỏ có nhóm OH Các kết gán phổ cộng hưởng từ hạt nhân trình bầy mục 4.5, tr 45 phần thực nghiệm

Kết hợp phân tích kiện phổ so sánh với tài liệu [39, 40]

cùng với thông tin từ phổ khối lượng (ESI-MS) với pic ion m/z 301

2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-on hay gọi

quercetin

Hình phổ 1H-NMR AP4

Quercetin có hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase (AchE)

là 19,8 µM [6], Hoạt tính Quercetin cịn cao hoạt tính

Chất AP5 phân lập từ phân đoạn F5 phần dịch chiết

proton thơm δ 5,84 ppm (d, J = 1,5Hz, H-8) δ 5,81 ppm (d, J =

Từ phân tích liệu thu được, so sánh với tài liệu [41,42] xác định

hợp chất AP5 flavanol có tên gọi 2R,

3S-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2H-chromene-3,5,7-triol catechin

Catechin dẫn suất chúng thành phần chè (chè catechin) có hoạt tính ngăn ngừa chống ung thư, ngồi chúng cịn có hoạt tính kháng virut herpes với tỷ số chọn lọc từ 1,5 đến 13 phụ thuộc vào chủng virut thử nghiệm [42] Catechin cịn thể tính bảo vệ thần kinh chống lại glutamat, chất gây độc thần kinh tế bào hippocampal HT 22 chuột hiệu Chúng cịn có khả bắt gốc tự

kết cho thấy catechin chất bảo vệ thần kinh hoạt tính bắt gốc tự [43]

Catechin chứng minh có khả tác động đến trình ức chế tạo thành sợi alpha S (protein alpha-synuclein) làm tính bền sợi tạo từ trước Sự kết tụ alpha S tạo thành sợi não gia đoạn chủ chốt trình phát triển bệnh thần kinh thể Lewy teo đa hệ thống [44] Vì catechin kết hợp với số hợp chất tự nhiên khác tạo thuốc phịng ngừa điều trị hai bệnh bệnh Alzheimer [45]