TỔNG QUAN
Giới thiệu chung về cá Tra
Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một loài cá da trơn thuộc họ Pangasiidae, phân bố chủ yếu ở lưu vực sông Mê Kông, bao gồm Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan Loài cá này được nuôi trồng phổ biến nhất tại Việt Nam, đặc biệt ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long.
Thành phần hóa học của thịt cá bao gồm nước, protein, lipid, glucid, khoáng chất, vitamin và enzyme, và những thành phần này thay đổi đáng kể tùy thuộc vào giới tính, mùa vụ và điều kiện sinh sống Ngoài ra, thức ăn, môi trường sống, kích cỡ và đặc tính di truyền cũng ảnh hưởng đến thành phần hóa học Giá trị dinh dưỡng của thịt cá không chỉ phụ thuộc vào hàm lượng protein mà còn thể hiện qua hàm lượng và tỷ lệ các amino acid không thay thế như isoleucine, leucine, lysine, methionine, tryptophan, tyrosine, phenylalanine và valine.
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của cá tra phi lê (TRINH & NGUYEN, 2019)
Thành phần Protein Chất béo Tro Độ ẩm
Tổng quan về các phương pháp trích ly
2.2.1 Phương pháp ngâm trong isopropanol
Mặc dù có nhiều phương pháp thu nhận protein khác nhau, tất cả đều trải qua giai đoạn loại bỏ các phần phi protein như nước, da, xương và chất béo bằng dung môi như alcohol, propanol và ethylene dichlorine Sau đó, protein được kết tủa bằng điểm đẳng điện pHi từ 5,2 đến 5,5 Theo FAO, alcohol và propanol thường được ưu tiên, nhưng hiện nay, do chính sách miễn thuế tiêu thụ đặc biệt, isopropanol đang được sử dụng phổ biến hơn.
Việc ứng dụng enzyme thương mại để thủy phân fillet cá Tra đang được coi là một phương pháp hiệu quả nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế và đa dạng hóa sản phẩm Các enzyme phổ biến trong nghiên cứu thủy phân bao gồm Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, Protamex và Kojizyme Alcalase, một enzyme endopeptidase, có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus licheniformis, đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
Enzyme endopeptidase của alcalase chủ yếu thủy phân liên kết peptide tại các nhóm –COOH kỵ nước bên trong phân tử protein (Liaset và cộng sự, 2002; Chiang và cộng sự, 2019) Flavourzyme có cả hoạt tính endopeptidase và exopeptidase, nhưng chủ yếu là exopeptidase và có nguồn gốc từ
Aspergillus oryzae được nghiên cứu bởi Kamnerdpetch và cộng sự (2007), cho thấy rằng hoạt tính exopeptidase của enzyme flavourzyme có khả năng thủy phân từ đầu-C hoặc đầu-N của các amino acid kỵ nước cuối cùng trong phân tử protein Quá trình này dẫn đến việc giảm vị đắng của dịch đạm thu được, như đã chỉ ra bởi Chiang và cộng sự (2019).
Các quá trình chuyển hoá của protein concentrate từ cá Tra
2.3.1 Quá trình chuyển hoá protein liên quan đến lipid và cholesterol
Cholesterol là thành phần lipid quan trọng trong cấu trúc và tính thấm của màng tế bào, đồng thời là tiền chất cho hormone steroid, acid mật và vitamin D Tuy nhiên, nồng độ cholesterol cao trong huyết tương có thể dẫn đến các bệnh tim mạch và suy giảm hệ thần kinh Để giảm lipid máu, cần thực hiện lối sống lành mạnh và sử dụng các chất hạ lipid Protein động vật và thực vật có cấu trúc amino acid khác nhau, trong đó protein cá Tra chứa hàm lượng amino acid chuỗi nhánh cao hơn so với protein đậu nành Leucine, một amino acid ketogen bắt buộc, có vai trò quan trọng trong tổng hợp cholesterol và đã được chứng minh là tiền chất cholesterol ở người Nghiên cứu cho thấy leucine có ảnh hưởng đến tổng hợp cholesterol trong mô mỡ và cơ vận động, đồng thời kích thích bài tiết insulin, từ đó tăng cường hoạt động của HMG-CoA reductase, giúp điều chỉnh tốc độ tổng hợp cholesterol.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ cholesterol tổng trong huyết tương bị ảnh hưởng bởi các loại protein với tỷ lệ L/A khác nhau (Kritchevsky và cộng sự, 1982) Cụ thể, khi chuột được cho ăn các nguồn protein có tỷ lệ L/A cao hơn, nồng độ cholesterol trong huyết tương và gan có xu hướng gia tăng, trong khi lượng sterol bài tiết qua phân lại giảm (Sugano và cộng sự, 1982).
2.3.2 Quá trình chuyển hóa protein thành urea
Khoảng 90% protein tiêu thụ được chuyển hóa thành urea và bài tiết qua nước tiểu Amoniac xuất phát từ nhiều nguồn protein khác nhau Một phần của chu trình urea diễn ra tại ty thể, nơi glutamate được chuyển đổi thành carbamoyl phosphate nhờ enzyme carbamoyl phosphate synthetase và chất kích hoạt N-acetylglutamate Carbamoyl phosphate sau đó kết hợp với ornithine để tạo thành citrulline thông qua enzyme ornithine transcarbamylase Citrulline thoát khỏi ty thể và kết hợp với aspartate, tạo ra argininosuccinate Hợp chất này sau đó được phân cắt thành arginine và fumarate nhờ argininosuccinate lyase Arginine tiếp tục bị thủy phân bởi arginase, giải phóng urea và tái tạo ornithine Ornithine được đưa trở lại ty thể thông qua phương tiện vận chuyển riêng Trong chu trình urea, ornithine là hợp chất được bảo tồn, không được tạo ra hay mất đi, với một nguyên tử nitrogen từ amoniac và một từ aspartate kết hợp để tạo thành một phân tử urea.
Hình 2.1 Chu trình Ure (Fearing & Shih, 2004)
2.3.3 Quá trình chuyển hóa protein thành creatin
The synthesis of creatine involves two straightforward reactions In the first reaction, catalyzed by glycine amidinotransferase (EC 2.1.4.1), L-arginine donates an amidino group to glycine, resulting in the formation of guanidinoacetate and ornithine The second reaction, catalyzed by guanidinoacetate N-methyltransferase (EC 2.1.1.2), involves the methylation of guanidinoacetate by S-adenosylmethionine, producing S-adenosylhomocysteine and creatine.
Creatine được phóng thích từ gan và hấp thụ bởi các mô, đặc biệt là cơ vận động, thông qua một chất vận chuyển cụ thể Hầu hết creatine trong cơ thể tập trung ở cơ xương, nơi creatine phosphate đóng vai trò là nguồn dự trữ năng lượng Khi nhu cầu năng lượng tăng cao, creatine phosphokinase kết hợp với ADP để chuyển đổi creatine phosphate thành creatine và ATP.
Hình 2.2 Con đường tổng hợp creatine liên cơ quan được đề xuất (Brosnan & Brosnan, 2004)
Chú thích: GAA, guanidinoacetate; SAM, S-adenosylmethionine; SAH, S-adenosylhomocysteine
2.3.4 Quá trình chuyển hoá protein thành uric acid
Purin là thành phần thiết yếu của nucleotide, cần thiết cho việc xây dựng DNA và RNA trong tế bào động vật có vú Nucleotide purine như guanosine-5′-triphosphate và adenosine triphosphate (ATP) đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh quá trình chuyển hóa năng lượng và chức năng nội bào Rối loạn chuyển hóa purine có thể dẫn đến sự thay đổi nồng độ uric acid huyết thanh, vì uric acid là sản phẩm cuối cùng của quá trình dị hóa purine ở người Chế độ ăn giàu đạm động vật, bao gồm thịt gia cầm, thịt, cá và trứng, có thể làm tăng nguy cơ tái phát sỏi thận, gây tăng tính acid trong nước tiểu và ảnh hưởng đến sự cân bằng khoáng chất Hàm lượng protein động vật cao, không phân biệt thịt đỏ hay thịt trắng, có thể dẫn đến lượng purine cao và tăng uric acid, từ đó làm tăng nguy cơ sỏi thận.
Gần 2/3 lượng purine trong cơ thể là nội sinh, trong khi phần còn lại, gọi là purine ngoại sinh, xâm nhập qua thực phẩm Purine trong chế độ ăn uống đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng chuyển hóa purine ở tế bào động vật có vú thông qua các quá trình sinh tổng hợp de novo, trục vớt và thoái hóa Các purine ngoại sinh có thể bị khử phospho hóa thành nucleoside trong quá trình tiêu hóa, dẫn đến sự giải phóng các base tự do Cuối cùng, các base bị thoái hóa này có thể được tái chế thành nucleotide trong các mô.
Quá trình thu hồi và phân hủy purine chủ yếu diễn ra trong gan và ruột non, với adenosine monophosphate (AMP) và guanine monophosphate (GMP) là các dạng purine nucleoside chính từ thực phẩm Enzyme deaminase và GMP reductase chuyển đổi AMP và GMP thành inosine monophosphate (IMP), trong khi nucleosidase xúc tác quá trình khử phospho để tạo ra adenosine và guanosine IMP và adenosine sau đó chuyển hóa thành inosine, tiếp theo là hypoxanthine thông qua purine nucleoside phosphorylase, và cuối cùng hypoxanthine được chuyển đổi thành uric acid nhờ xanthine oxidase Guanosine cũng có thể chuyển hóa thành uric acid qua guanine deaminase Khi cơ thể không thể quản lý purine, uric acid tích tụ dẫn đến tăng uric acid máu và bệnh gút, một bệnh chuyển hóa liên quan đến purin Thực phẩm giàu purine như thịt và hải sản có thể gây ra tình trạng này Ngoài ra, đồ uống như rượu có thể làm tăng nhanh nồng độ uric acid do tiêu thụ ATP để sản xuất AMP trong gan.
2.3.5 Quá trình chuyển hoá protein ảnh hưởng đến sự hình thành, phát triển cơ và hình dạng cơ
Sau bữa ăn chứa protein, nồng độ các tiền chất EAA trong huyết tương tăng, cung cấp nguyên liệu cần thiết cho việc tổng hợp protein cơ bắp mới Các amino acid trong máu di chuyển đến cơ bắp, thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp và phát triển mô cơ Trong tổng số 20 loại amino acid, có chín loại amino acid thiết yếu (EAA) và mười một loại không thiết yếu (NEAA) cần thiết cho việc tổng hợp protein cơ Ba loại amino acid chuỗi nhánh (BCAAs) là leucine, isoleucine và valine, trong đó leucine không chỉ là tiền chất cho tổng hợp protein mà còn giúp giảm phân hủy protein và tăng cường tổng hợp protein trong cơ, đồng thời điều chỉnh các con đường tín hiệu nội bào liên quan đến quá trình này.
9 hợp protein Từ đây, BCAAs có thể có một khả năng đặc biệt kích thích tổng hợp protein cơ bắp (K D Tipton, 1999)
2.3.6 Quá trình chuyển hoá protein ảnh hưởng đến nitrogen phân
Amino acid được vận chuyển từ ruột vào máu thông qua các tế bào ruột nhờ protein vận chuyển đặc biệt và ATP Sau khi vào máu, chúng được đưa đến gan, nơi kiểm soát phân phối và phân hủy amino acid Quá trình dị hóa amino acid giải phóng nitrogen dưới dạng amoni (NH4 +) và α-keto acid Do amoniac là chất độc, gan chuyển hóa nó thành urea, được bài tiết qua thận và nước tiểu Chu trình urea tại gan tổng hợp urea từ amoni, CO2, aspartate và bicarbonate, đồng thời tạo ra các sản phẩm trung gian cho chu trình Krebs Urea, chứa hai nitrogen và hòa tan trong nước, khuếch tán vào máu và thải ra qua nước tiểu Tại thận, NH4 + kết hợp với acid để tạo muối amoni, giúp điều hòa cân bằng acid-base Nitrogen cũng được bài tiết qua phân Hầu hết protein được hấp thụ dưới dạng tripeptide, dipeptide hoặc amino acid tại tá tràng Protein dị hóa trong tiêu hóa chiếm 10% tổng lượng protein chuyển hóa của cơ thể, với hệ vi sinh vật đường ruột đóng góp lớn vào nitrogen trong phân Amoniac trong đại tràng, được sản xuất từ thủy phân urea bởi vi khuẩn, là nguồn nitrogen phi protein chính và có thể tái tuần hoàn để gan chuyển hóa thành urea Tăng protein trong chế độ ăn không làm tăng nitrogen trong phân, nhưng tăng chất xơ có thể làm tăng sử dụng nitrogen của vi khuẩn, dẫn đến tăng bài tiết nitrogen trong phân.
Nội tạng
Mỗi quả thận gồm hai phần chính: vỏ thận và tủy thận Khoang Bowman là một phần của nephron, có chức năng bao quanh cầu thận và tham gia vào quá trình lọc máu từ các mao mạch cầu thận Dịch lọc vào không gian của Bowman được tạo ra khi máu đi qua các mao mạch, màng đáy cầu thận và các tế bào podocytes, với quá trình lọc dựa trên kích thước và điện tích Thành phần của dịch lọc rất giống với máu trong mao mạch cầu thận, ngoại trừ protein và các thành phần tế bào, được ngăn chặn khi quá trình lọc cầu thận hoạt động bình thường (Reidy & Rosenblum, 2009).
Gan được chia thành bốn thùy chính: giữa, trái (lớn nhất), phải (phân đôi) và đuôi, với các tiểu thùy gan hình lục giác, mỗi điểm nối có tĩnh mạch cửa kết nối với tiểu thùy lân cận Gan đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra, trao đổi và phân hủy các phân tử sinh học thiết yếu như amoni, acid béo, amino acid và glucose, đồng thời chuyển đổi và loại bỏ các hợp chất xenobiotic và độc tố khác nhau (Hildebrandt và cộng sự., 2021).
Tế bào mỡ gồm hai loại: mỡ nâu và mỡ trắng, trong đó mỡ trắng là nguyên nhân chính gây béo phì do tăng số lượng và kích thước Tế bào mỡ trắng hoạt động như một hormone, sản xuất leptin để thông báo cho não về trạng thái dinh dưỡng, từ đó giúp kiểm soát năng lượng nạp vào và phân phối cho các mô Khối lượng tế bào mỡ trắng chủ yếu là tế bào mỡ trưởng thành, được hình thành từ sự tăng sinh và biệt hóa của tiền tế bào mỡ, chứa các giọt lipid cung cấp năng lượng khi cơ thể cần Tuy nhiên, khi năng lượng nạp vào vượt quá nhu cầu, năng lượng dư thừa sẽ được lưu trữ dưới dạng giọt mỡ, làm tăng kích thước tế bào và có thể dẫn đến mất vách ngăn giữa các tế bào khi năng lượng dư thừa quá lớn.
Cơ gastrocnemius (GA) là một đơn vị cơ vận động quan trọng của chuột, trong khi cơ soleus chỉ hỗ trợ cho các hoạt động vận động GA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu y sinh nhờ vai trò quan trọng trong vận động và khối lượng lớn ở chân Vị trí bề ngoài của cơ này cũng tạo điều kiện thuận lợi cho các can thiệp và giải phẫu.
Cơ GA bên phải và trái có sự tương đồng (Santocildes và cộng sự, 2022), trong khi cơ soleus không cho thấy sự khác biệt giữa các động vật vận động thường xuyên và không vận động (Reggte Edgerton, n.d.) Cơ GA chủ yếu bao gồm sợi co giật nhanh (Fast oxidative - FO), trong khi cơ soleus chủ yếu là sợi co giật chậm (Slow oxidative - SO) (Tasić và cộng sự, 2003).
Hình 2.3 Vị trí cơ GA và soleus
2.5 Mô hình kết hợp chế độ ăn giàu béo và sử dụng protein concentrate
2.5.1 Chế độ ăn bổ sung protein
Khối lượng cơ vận động, hay còn gọi là cơ vân, được điều chỉnh bởi sự cân bằng giữa tốc độ tổng hợp và phân hủy protein, cả hai đều chịu ảnh hưởng từ lượng protein trong chế độ ăn uống Các nguồn protein khác nhau có tác động khác nhau đến khối lượng cơ vận động, vì vậy việc bổ sung protein cho vận động viên là một phương pháp hiệu quả để cải thiện khối lượng cơ Protein cá Tra chứa nhiều leucine hơn protein đậu nành, cho thấy sự khác biệt trong khả năng hỗ trợ phát triển cơ bắp Chế độ ăn giàu protein không chỉ giúp duy trì cảm giác no mà còn thúc đẩy quá trình giảm cân Nghiên cứu cho thấy protein từ động vật thường hiệu quả hơn trong việc tổng hợp khối lượng cơ so với protein từ thực vật, đặc biệt là đối với người trung niên.
12 người lớn tuổi (> 50 tuổi) không làm gia tăng khối lượng cơ vận động (Ten Haaf và cộng sự.,
2.5.2 Chế độ ăn giàu béo có bổ sung protein
Các mô hình động vật đã được áp dụng phổ biến trong các nghiên cứu về béo phì do chế độ ăn uống, như được chỉ ra trong các nghiên cứu của Reuter (2007), Speakman và cộng sự (2007), James (2008), cùng với Young & Kirkland.
2007) Theo đó, thông thường chế độ ăn nhiều chất béo, với lượng chất béo chiếm khoảng 30-
78% tổng lượng năng lượng được tiêu thụ từ việc thêm chất béo vào chế độ ăn của động vật hoặc sử dụng thực phẩm giàu chất béo và đường (Buettner và cộng sự, 2007) Nghiên cứu cho thấy chế độ ăn nhiều carbohydrate và ít chất béo không hiệu quả bằng chế độ ăn giàu chất béo và ít carbohydrate trong việc gây béo phì (Ghibaudi và cộng sự, 2002; Harrold và cộng sự, 2000; Ellis và cộng sự, 2002).
Nghiên cứu gần đây cho thấy chế độ ăn giàu béo kết hợp với protein có thể ngăn chặn sự phát triển béo phì ở chuột, tạo cảm giác no và đầy bụng Chế độ ăn này không chỉ giảm năng lượng tiêu thụ mà còn làm tăng cholecystokinin và giảm ghrelin trong huyết tương Hơn nữa, chế độ ăn giàu protein giảm hoạt động enzyme synthase acid béo trong gan, từ đó giảm hình thành mỡ trong gan Sau bữa ăn giàu protein, nồng độ amino acid trong huyết tương tăng, kéo dài cảm giác no nhờ tác dụng kích thích của hormone tiêu hóa Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy việc tăng protein không làm giảm béo phì ở chuột ăn nhiều chất béo Ngoài ra, khẩu phần ăn quá nhiều chất béo và protein có thể gây stress cho động vật thí nghiệm, ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu Do đó, nghiên cứu này sử dụng khẩu phần ăn có hàm lượng béo cao (70% năng lượng) và protein ở mức trung bình (3,5% và 13% năng lượng).
2.6 Thử nghiệm in vivo trên động vật thí nghiệm
Trước khi thuốc mới được sử dụng cho người, thử nghiệm an toàn tiền lâm sàng là giai đoạn quan trọng trong phát triển dược phẩm, bao gồm quy trình tuần tự các thí nghiệm in silico, in vitro và in vivo Thử nghiệm in vivo là thành phần thiết yếu để đánh giá an toàn và là điều kiện pháp lý cho việc tiến hành thử nghiệm lâm sàng Với kiến thức khoa học hiện tại, thử nghiệm trên động vật đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả, chất lượng và an toàn của thuốc và liệu pháp mới Nghiên cứu in vivo kết nối thử nghiệm in vitro với sự an toàn của thuốc, từ đó mở đường cho các thử nghiệm lâm sàng trên con người.
Mô hình thử nghiệm in vivo sử dụng động vật sống như chuột, chó, mèo, thỏ, lợn và cá, được nhân giống đặc biệt để nghiên cứu Chuột là mô hình phổ biến nhất do cấu trúc gen tương tự con người Những nghiên cứu này chủ yếu nhằm thử nghiệm thuốc và đánh giá độc tính cho các phương pháp điều trị bệnh truyền nhiễm và không truyền nhiễm, đồng thời đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển thuốc và vaccine.
2.6.1 Nguồn gốc và phân loại chuột
Chuột là một mô hình nghiên cứu quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học như ung thư, miễn dịch học, độc học, và nghiên cứu về bệnh tiểu đường, béo phì, lão hóa và tim mạch Chúng được ưa chuộng nhờ kích thước nhỏ, thời gian sinh sản ngắn và dễ dàng nuôi dưỡng trong phòng thí nghiệm, cùng với sự tương đồng về giải phẫu và sinh lý học với con người, giúp cung cấp dữ liệu cho các thí nghiệm in vivo (Medicine & Bryda, 2013) Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chuột rất phù hợp để nghiên cứu các bệnh như béo phì, ung thư, nhiễm trùng huyết, bệnh đường ruột và cấy ghép nội tạng (Fernandes & Pedroso, 2017) Trong tương lai, các nghiên cứu này sẽ tiếp tục phát triển, bao gồm việc tạo ra các loài gặm nhấm mang gen hoặc mô của con người để cải thiện các phương pháp điều trị cho bệnh nhân (Medicine & Bryda, 2013).
2.6.2 Lợi ích và hạn chế khi sử dụng động vật thí nghiệm a Lợi ích
Chuột là lựa chọn hàng đầu cho nghiên cứu khoa học nhờ vào tính sẵn có, kích thước nhỏ, chi phí thấp, dễ xử lý và tốc độ sinh sản nhanh (Willis-Owen & Flint, 2006) Chúng phát triển nhanh về giới tính và có khả năng mang thai nhanh, cho phép các phòng thí nghiệm tạo ra một thế hệ mới chỉ sau ba tuần Tuổi thọ của chuột tương đối ngắn, khoảng hai năm, nhưng chúng được xem là mô hình chính cho các nghiên cứu về bệnh di truyền ở người, với 99% gen tương đồng với con người.
Hàng triệu động vật, chủ yếu là chuột (chiếm 95% trong nghiên cứu), bị nhân giống và sử dụng trong các thử nghiệm độc tính liên quan đến thuốc, thiết bị y tế, hóa chất và mỹ phẩm, thường phải chịu đựng những căn bệnh không tự nhiên và các biện pháp tra tấn như bỏng, nhiễm độc, và co giật trước khi chết Quá trình phân hủy xác động vật tạo ra nhiều vi trùng, virus và ký sinh trùng, và nếu không được xử lý đúng cách, chúng có thể thải ra môi trường các hợp chất độc hại, gây ảnh hưởng lâu dài đến con người Do đó, đã có nhiều nỗ lực trong nhiều thập kỷ nhằm hạn chế việc sử dụng hóa chất trên động vật để giảm thiểu thiệt hại môi trường.
2.6.3 Điều kiện nuôi chuột thí nghiệm
Môi trường nuôi động vật thí nghiệm đóng vai trò quan trọng trong tâm sinh lý của động vật gặm nhấm và ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả nghiên cứu Nếu không đảm bảo tiêu chuẩn, môi trường nuôi có thể gây hại đến thể chất và tâm lý của chuột thí nghiệm, dẫn đến suy giảm sự phát triển não bộ và hành vi bất thường (Balcombe, 2006) Theo Hướng dẫn chăm sóc và sử dụng động vật trong phòng thí nghiệm, các điều kiện nuôi chuột như chuồng nuôi, nhiệt độ, ánh sáng và âm thanh cần được kiểm soát để đảm bảo kết quả thí nghiệm đáng tin cậy (Albus, 2012) Kích thước chuồng nuôi phải đủ rộng để động vật có không gian sinh hoạt thoải mái, có hệ thống thông gió hợp lý và được thiết kế phù hợp.