TỔNG QUAN
Sơ lược về enzyme lipase
Enzym lipase, do tuyến tụy sản xuất, có vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa mỡ và triglycerid thành glycerol và acid béo Thông thường, tuyến tụy chỉ tạo ra một lượng lipase đủ để tiêu hóa thức ăn, do đó nồng độ lipase trong máu thường ở mức thấp.
Lipase (EC 3.1.1.3), được biết đến như là triacylglycerol acylhydrolase, thuộc họ hydrolase và có khả năng thủy phân các liên kết este carboxylic Enzyme này thực hiện quá trình thủy phân triglyceride thành diglyceride, monoglyceride, axit béo và glycerol Ngoài lipase, các liên kết este cacboxylic cũng có thể bị thủy phân bởi các este và lipase khác.
Hình 1 2: Phản úng thủy phân triacylgycerol thành glycerol và các acid béo
Lipase là một loại enzyme hydrolase serine, trong đó Ser xúc tác được xác định bởi trình tự liên ứng (Gly-X1-Ser-X2-Gly) có thể có các biến thể khác nhau Nguồn gốc sinh học của enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định phân loại của nó Chất xúc tác Ser cùng với His và Asp (hoặc Glam) tạo thành bộ ba axit amin, được gọi là bộ ba xúc tác Trong cấu trúc sơ cấp, Ser thường nằm gần đầu N, trong khi His thường ở gần đầu C.
Trình tự liên ứng và bộ ba xúc tác trong nếp gấp α/β hydrolase bao gồm một tấm beta trung tâm với tám chuỗi beta song song (1 đến 8) kết nối bởi tối đa sáu chuỗi xoắn alpha (A–F) Ser nằm ở đầu C của chuỗi β5, trong pentapeptide đồng thuận, tạo thành mô típ beta-turn-alpha (αC) gọi là “khuỷu tay nucleophilic” Gần khuỷu tay này, Asp (hoặc Glam) giữa αE và β8 thuộc vòng lặp dài độc lập, trong khi His thường nằm giữa αF và β8 như một phần của vòng lặp dài Trong quá trình kích hoạt, cấu trúc “nắp” sẽ di dời, mở ra các “túi ràng buộc” và làm cho vị trí hoạt động dễ tiếp cận với cơ chất.
Hình 1 3:Cấu trúc phân tử 1.1.3 Tính chất enzyme lipase
Lipase có trọng lượng phân tử từ 19–60 kDa và được xác định là protein đơn phân Vị trí axit béo trên khung glycerol, độ dài chuỗi và mức độ không bão hòa của axit béo ảnh hưởng đến giá trị cảm quan và dinh dưỡng của các chất béo trung tính Ngoài ra, một số loại lipase còn xúc tác các phản ứng như este hóa nhờ vào hoạt tính của chúng trong môi trường dung môi hữu cơ.
Lipase hoạt động phụ thuộc vào độ pH, với sự ổn định ở pH trung tính 7,0 và pH từ 4,0 đến 8,0 Một số vi khuẩn như Chromobacter viscosum, A niger và Rhizophus sp sản xuất lipase ngoại bào hoạt động ở pH axit, trong khi P nitroaeducens tạo ra lipase kiềm hoạt động ở pH 11,0 Dưới các điều kiện thí nghiệm nhất định, lipase có khả năng đảo ngược các phản ứng, dẫn đến quá trình este hóa và este hóa khi không có nước Canxi là cation hóa trị hai cần thiết để kích thích hoạt động lipase, trong khi Co, Ni 2+, Hg 2+ và Sn 2+ ức chế mạnh hoạt động này Zn 2+, Mg 2+, EDTA và SDS chỉ ức chế nhẹ Lipase được chia thành hai nhóm dựa trên đặc tính vùng với chất nền acyl glycerol; nhóm đầu tiên thải ra axit béo từ cả ba vị trí của glycerol, trong khi nhóm thứ hai chỉ thải ra axit béo từ vị trí 1 và 3 Cuối cùng, triacylglycerol bị thủy phân bởi lipase tạo thành 2-monoacylglycerol và axit béo tự do 1, 2-(2, 3)-diacylglycerol.
Hình 1 4: Cơ chế xúc tác của lipase (Jaeger et al.,1999)
Các cơ chế xúc tác của lipase vi sinh vật tương tự như các cơ chế trong hydrolase serine, bao gồm bốn bước chính Đầu tiên, histidine loại bỏ hydro từ nhóm hydroxyl serine, tạo ra oxy tích điện âm tương tác với cacbonyl cacbon tích điện dương, hình thành liên kết cộng hóa trị Tiếp theo, vùng ái điện tử lipase được hình thành, dẫn đến trạng thái chuyển tiếp tứ diện enzyme-cơ chất ổn định Sau đó, liên kết este bị phá vỡ, giải phóng rượu axit béo và hình thành phức chất trung gian cộng hóa trị acyl Cuối cùng, các liên kết tạm thời giữa serine và cơ chất bị phá vỡ, giải phóng cơ chất acyl.
1.1.5 Nguồn thu nhận enzyme lipase
Lipase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn như động vật, thực vật và vi sinh vật
+ Động vật: lipase từ tuyến tụy của gia súc, bò lợn… tụy lợn chứa trypsin, tạo ra amino axit vị đắng và chứa nhiều virusđộng vật, hoocmon…
Lipase là enzym quan trọng được tìm thấy trong mô dự trữ của các hạt có dầu như hạt đậu nành, đậu phộng, hạt hướng dương, hạt cây cải dầu, dừa và hạnh nhân Enzym này được hình thành trong quá trình nảy hạt, đóng vai trò thiết yếu trong việc phân giải chất béo và cung cấp năng lượng cho sự phát triển của cây.
+ Vi sinh vật: Lipase có thể được thu nhận từ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và xạ khuẩn.
Một số loài nấm mốc có khả năng sinh enzyme lipase như: Rhizopus sp.,
Aspergillus, Penicillium, Mucor, and Fusarium are notable genera of fungi, while Candida, Yarrowia, and Saccharomyces represent key yeast species Additionally, bacteria capable of synthesizing lipase include Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, and Pseudomonas Furthermore, the actinobacteria genus Streptomyces is also recognized for its significance in this context.
1.1.6 Ứng dụng của enzyme lipase
Trong quy trình sản xuất phô mai, chất béo sữa được chuyển hóa thành axit béo tự do nhờ vào hoạt động của enzyme lipase Quá trình này đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra hương vị đặc trưng cho nhiều sản phẩm từ sữa, đặc biệt là các loại phô mai mềm.
Trong sản xuất bánh mì, lipase có vai trò quan trọng trong việc kéo dài thời hạn sử dụng, kiểm soát quá trình hóa nâu không do enzyme, tăng thể tích và cải thiện cấu trúc của bánh.
Trong ngành dầu mỡ, lipase có khả năng thay đổi tính chất của lipid bằng cách điều chỉnh vị trí hoặc thay thế axit béo Quá trình transester hóa xúc tác của lipase trong dung dịch hữu cơ có nhiều ứng dụng quan trọng, bao gồm mô phỏng chất béo sữa mẹ trong sữa bột cho trẻ sơ sinh, sản xuất axit béo không bão hòa đa, lipid với hàm lượng calo thấp, và chế biến dầu diesel sinh học từ dầu thực vật Ngoài ra, lipase cũng được sử dụng trong sản xuất các loại dầu như dầu ngô, dầu hướng dương, dầu đậu phộng, dầu ôliu và dầu đậu nành.
Trong ngành công nghiệp sản xuất giấy, nhựa thông và các thành phần kỵ nước từ gỗ, như triglyceride và sáp, gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng Để khắc phục, cần bổ sung các phương pháp loại bỏ nhựa thông khỏi nguyên liệu hoặc kiểm soát chúng ở mức tối thiểu Đồng thời, việc xúc tác thủy phân triglyceride từ gỗ có thể đạt hiệu suất lên đến 90%.
Enzyme hydrolase trong nuôi trồng thủy sản có vai trò quan trọng trong việc thủy phân các liên kết este, tạo ra axit béo và glycerol Nhờ enzyme này, vật nuôi thủy sản có khả năng hấp thu dễ dàng các chất béo từ môi trường nuôi và thức ăn.
Enzym lipase trong y học có vai trò quan trọng trong việc chuyển đổi mỡ và triglycerid thành acid béo và glycerol Thận lọc enzym này, và các ống lượn gần tái hấp thu hoàn toàn lipase Enzym lipase được vận chuyển qua các ống tụy vào tá tràng, nơi thực hiện chức năng chuyển đổi chất béo trung tính thành acid béo.
Giới thiệu về Bacillus subtilis
Bacillus subtilis, lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1835 bởi Christion Erenberg với tên gọi “Vibrio subtili”, đã trải qua sự đổi tên gần 30 năm sau đó khi Casimir Davaine đặt tên là “Bacteridium”.
Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là
Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn mới được xác định Bacteriocin thô của loài Bacillus subtilis này có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn khác.
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus và Salmonella
Vào năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của Đức và ban đầu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức tại Bắc Phi Từ năm 1949 đến 1957, Henry và cộng sự đã tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis Gần đây, vi khuẩn này đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới, dẫn đến sự ra đời của thuật ngữ “Subtilis therapy” Bacillus subtilis ngày càng trở nên phổ biến và được coi là một sinh vật hiệu quả trong việc phòng và điều trị các bệnh liên quan đến rối loạn tiêu hóa, viêm ruột, viêm đại tràng và tiêu chảy.
Bộ gen của Bacillus subtilis
Năm 1997, nghiên cứu về trình tự gen của Bacillus subtilis đã được hoàn tất và công bố lần đầu tiên, với bộ gen chứa 4,2 mega-base và khoảng 4.110 gen Trong số này, có 192 gen không thể thiếu và 79 gen được dự đoán là thiết yếu, chủ yếu liên quan đến quá trình trao đổi chất của tế bào.
Bảng 1 1: Phân loại theo Bergey
Giới (Kingdom) Bacteria Ngành (Phylum) Bacillota
Họ (Family) Bacillaceae Giống (Genus) Bacillus Loài (Species) Subtilis
Vi khuẩn Bacillus subtilis là loại vi sinh vật hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, phân bố rộng rãi trong môi trường tự nhiên, chủ yếu cư trú trong đất, rơm rạ và cỏ khô, nên còn được gọi là “trực khuẩn cỏ khô” Trong đất trồng trọt, mật độ của chúng thường dao động từ 106 đến 107 CFU/g, trong khi ở những vùng đất nghèo dinh dưỡng như sa mạc, chúng rất hiếm gặp Ngoài ra, Bacillus subtilis cũng có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì, bột gạo và trong nhiều loại thực phẩm như mắm, tương và chao.
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0,5 –
0,8àm x 1,5 – 3àm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn cú khả năng di động, cú 8 –
Bào tử Bacillus subtilis có hình bầu dục nhỏ, kích thước từ 0,8 – 1,8 µm, nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào Chúng phát triển bằng cách nảy mầm qua sự nứt của bào tử và có khả năng chịu đựng nhiều điều kiện khắc nghiệt như acid, nhiệt độ cao (100oC trong 180 phút), độ ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất và chất sát trùng Bào tử này có thể tồn tại từ vài năm đến hàng chục năm, với chứng cứ cho thấy sức sống của chúng có thể kéo dài từ 200 đến 300 năm.
– Lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose và arabinose.
– Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+).
Hình 1 5: Vi khuẩn Bacillus subtilis
Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, nhưng vẫn có thể sinh trưởng trong môi trường thiếu oxy Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này là 37oC, trong khi pH thích hợp nằm trong khoảng từ 7,0 đến 7,4.
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản:
Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA), khuẩn lạc xuất hiện dưới dạng tròn với rìa răng cưa không đều, có màu vàng xám và đường kính từ 3 đến 5 mm Sau khoảng 1 đến 4 ngày, bề mặt khuẩn lạc trở nên nhăn nheo và có màu hơi nâu.
Trong môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB), vi khuẩn phát triển gây đục môi trường, hình thành màng nhăn và lắng cặn Các cặn này kết lại như vẩn mây ở đáy và khó tan khi lắc đều.
+ Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4cm sau 72 giờ nuôi cấy.
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn chủ yếu bao gồm các nguyên tố như carbon, hydro, oxy, nitơ và một số nguyên tố vi lượng khác Để phát triển tốt, vi khuẩn cần một môi trường cung cấp đầy đủ carbon, chẳng hạn như glucose, và nitơ, như peptone.
LỰA CHỌN, PHÂN TÍCH, QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ
Lựa chọn công nghệ
Máy lọc ép khung bản hoạt động dựa trên nguyên tắc nén áp suất, bao gồm hai phần chính: bộ phận lọc và bộ phận bơm Bộ phận bơm có nhiệm vụ hút và nén dung dịch lọc qua vật liệu lọc, giúp quá trình lọc diễn ra hiệu quả.
Thiết bị lọc bao gồm khung và tấm lọc được ép lại với nhau bằng một đĩa quay tay, cho phép sử dụng từ 50 đến 100 tấm lọc Tấm vải lọc khung bản, được làm từ polypropylene (PP), nổi bật với độ bền cao và khả năng chịu đựng tốt trong môi trường hóa chất.
Phần thứ hai của hệ thống bao gồm bộ phận hút và nén dung dịch lọc, được trang bị bơm nén áp suất cao và hai thùng chứa bằng thép không gỉ, mỗi thùng có dung tích 200 lít và có chỉ thị mức dung dịch Một thùng chứa dung dịch đục (hỗn hợp lọc) và thùng còn lại chứa dịch lọc (Filtrat) Bên cạnh đó, còn có một thùng thứ ba kết nối với máy để chứa hỗn hợp nước và diatomit, giúp tạo lớp màng trên màng lọc, cho phép chất lỏng dễ dàng đi qua.
Nguyên lý hoạt động của thiết bị lọc áp lực gián đoạn cho phép nhập liệu liên tục, trong khi nước lọc được tháo ra một cách liên tục và bã được loại bỏ theo chu kỳ.
Khung và bản là hai thành phần chính của thiết bị lọc, trong đó khung chứa bã lọc và nhập huyền phù, còn bản tạo bề mặt lọc với các rãnh dẫn nước Cả hai thường có hình vuông và cần đảm bảo kín khi ghép lại Chúng được xếp liên tiếp trên giá đỡ, với vách ngăn lọc nằm giữa Quá trình ép chặt diễn ra nhờ cơ cấu đai vít xoắn Lỗ dẫn huyền phù nối liền tạo thành ống dẫn kết nối với hệ thống cấp liệu Nước lọc chảy ra qua đường ống, trong khi bã được giữ lại trên vách ngăn và chứa trong khung Khi khung đầy bã, quá trình lọc dừng lại để rửa và tháo bã Chất rắn trong huyền phù được giữ lại bởi lớp vật liệu lọc, thường là vải lọc bùn khung bản.
Màng lọc hoạt động dựa trên nguyên lý chuyển động của các phần tử nước nhờ lực nén từ máy bơm, tạo ra dòng chảy mạnh Các phần tử cần lọc có kích thước trung bình khoảng 0.001 mm sẽ bị giữ lại bởi mạng lọc, trong khi đó các thành phần như sinh khối và kim loại sẽ không thể vượt qua được.
Máy lọc màng hoạt động ở áp suất dư có cấu trúc hình trụ, bên trong chứa các tấm hình chữ nhật được gắn chặt vào nắp Nắp và các tấm này có khả năng di động nhờ hai con lăn chạy trên các đường ray bên trong Mỗi tấm được trang bị ống tháo và van để xả nước lọc, cùng với cửa huyền phù vào và cửa đẩy không khí.
Thiết bị lọc màng hoạt động ở áp suất chân không được sử dụng để lọc huyền phù có độ pha rắn nhỏ Cấu trúc của thiết bị bao gồm nhiều tấm lọc được lắp đặt trên một khung, cùng với bể chứa huyền phù, bể rửa và bể tháo bã có vít tải để xử lý bã thải Toàn bộ khung lọc được treo trên một con chạy, giúp quá trình lọc diễn ra hiệu quả hơn.
Máy lọc tấm làm việc ở áp suất dư:
Huyền phù được hay nhờ không khí nén đưa vào thiết bị qua ống, không khí trong thùng bị đẩy qua cửa qua van tự động.
Khi thùng chứa đầy huyền phù, van tự động đóng lại do áp suất dư Dưới tác động của áp suất, chất lỏng chảy qua vách lọc và thoát ra ngoài qua ống Khi lớp bã đạt chiều dài yêu cầu, người ta sử dụng không khí nén để đẩy huyền phù dư ra ngoài, sau đó dùng nước hoặc không khí để tách bã.
Máy lọc tấm làm việc ở áp suất chân không:
Khi nhúng khung vào bể huyền phù hút chân không, nước sẽ được lọc qua vải và dẫn vào bộ phận chứa, trong khi bã sẽ bám lại trên vải, đạt bề dày từ 5 đến 33mm Sau đó, khung sẽ được chuyển sang bể rửa nhưng vẫn duy trì quá trình hút chân không Cuối cùng, sau khi rửa xong, khung sẽ được chuyển đến bể để tháo bã bằng không khí hoặc chất lỏng.
Từ các đặc điểm của các máy lọc sử dụng máy lọc khung bản có bột trợ lọc là tốt nhất.
Lọc khung bản bằng màng có nhiều ưu điểm, bao gồm khả năng sản xuất bề mặt lọc lớn trên một đơn vị diện tích Ngoài ra, động lực quá trình lọc, được tạo ra từ hiệu số áp suất lớn, cũng góp phần nâng cao hiệu quả của phương pháp này.
Có thể kiểm tra quy trình làm việc được.
Có thể ngừng không cho một vài bản làm việc (khi thấy nước lọc chảy ra qua van của bản nào bị đục thì ta đóng van đó lại).
Tốn ít nước rửa Vải lọc ít bị hao mòn Năng suất cao
Thao tác bằng tay nhiều Rửa bã chưa thật tốt Vải lọc nhanh bị rách
Giá thành thiết bị caoKhó kiểm tra bề dày bãKhó thay vải lọc.
Ly tâm là phương pháp hiệu quả để tách biệt các phân tử có khối lượng riêng khác nhau, thường được sử dụng để tách pha rắn khỏi pha lỏng trong các hỗn hợp không đồng nhất Trong ngành công nghiệp, phương pháp này chủ yếu áp dụng cho hỗn hợp rắn-lỏng hoặc lỏng-lỏng với khối lượng riêng khác nhau Để quá trình ly tâm diễn ra hiệu quả, vật liệu cần có khả năng phân ly tốt, với tính keo và độ nhớt của dung dịch không quá lớn, đồng thời pha rắn phải ở dạng to và chắc Kết quả cuối cùng là sản phẩm rắn có độ tinh khiết cao, nhưng vẫn còn ẩm, trong khi các chất lỏng được tách biệt dựa trên sự khác biệt về khối lượng riêng.
Sau quá trình ly tâm, hỗn hợp được tách biệt chủ yếu thông qua thay đổi trạng thái mà không có biến đổi hóa học hay hóa lý đáng kể Tuy nhiên, chất lượng sản phẩm được cải thiện nhờ việc loại bỏ các tạp chất hòa tan không phải dạng tinh thể, đặc biệt là các chất màu Do đó, sau khi ly tâm, sản phẩm trở nên sạch hơn và chất lượng được nâng cao.
Trong ngành công nghiệp, phương pháp ly tâm liên tục được sử dụng phổ biến nhờ vào những lợi ích như thu nhận sản phẩm nhanh chóng và liên tục, đồng thời không làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Phương pháp này hiệu quả trong việc thu nhận dung dịch chứa enzyme ngoại bào, trong khi để thu được enzyme nội bào, cần thực hiện thêm bước phá vỡ tế bào sinh vật.
Thiết bị ly tâm dạng đĩa bao gồm thùng quay và hình nón cụt bên trong Chất lỏng được đưa vào qua đường ống và chảy xuống đáy thùng, sau đó phân tán thành lớp mỏng qua các lỗ trên đĩa Nhờ lực ly tâm, chất rắn (protein tủa) lắng xuống đáy đĩa và được thu gom để xử lý tiếp, trong khi phần chất lỏng phía trên được xả ra ngoài qua ống dẫn.
Lựa chọn nguồn nuôi cấy Bacillus subtilis
Nguồn carbon đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, vừa là nguồn dinh dưỡng vừa là nguồn năng lượng Nghiên cứu của Mohammed Al Mohaini và cộng sự (25/2/2022) cho thấy rằng việc nuôi cấy chủng Bacillus.sp với các nguồn carbon và chất hoạt động bề mặt khác nhau mang lại kết quả khác nhau Cụ thể, dầu ô liu được xác định là nguồn cung cấp carbon có hoạt tính lipase cao nhất so với dầu hướng dương và dầu ăn thải.
Có nhiều nguồn carbon cho sản xuất, nhưng do yếu tố kinh tế và giá thành nguyên liệu, phụ phẩm nông nghiệp trở thành lựa chọn tối ưu cho quy mô công nghiệp Mật rỉ đường, một nguồn nguyên liệu dồi dào và sẵn có, giúp giảm chi phí đáng kể, trở thành nguyên liệu lý tưởng Mật rỉ đường, hay còn gọi là rỉ đường, là phụ phẩm trong quá trình sản xuất đường hoặc củ cải đường, là chất lỏng đặc sánh còn lại sau khi đã rút đường qua phương pháp cô đặc và kết tinh.
Không những thế, mật rỉ đường còn chứa một số vitamin như:
Nguồn nitơ là yếu tố thiết yếu trong quá trình chuyển hóa năng lượng và cấu tạo vật chất tế bào như acid nucleic, protein và enzyme Nguồn nitơ tồn tại dưới dạng vô cơ và hữu cơ, trong đó nitơ hữu cơ thường ở dạng phức tạp, cần được chuyển đổi thành dạng đơn giản để vi sinh vật dễ hấp thụ và sử dụng hiệu quả Vi sinh vật thường sử dụng các nguồn nitơ như muối nitrat, protein, ure và pepton, đồng thời cũng có thể tận dụng phụ phẩm nông nghiệp như bã mía, bã dừa và bã đậu nành Theo nghiên cứu của Cihangir & Sarikaya (2004), muối, ure và protein có khoảng 1% trong môi trường bổ sung với 1% dầu oliu.
(2007) cho rằng tryptone là nguồn nitơ kích thích sinh tổng hợp amylase của chủng
2.2.3 Nguồn khoáng và các yếu tố khác
Khoáng là yếu tố quan trọng trong sự phát triển của vi sinh vật, chiếm khoảng 2-5% khối lượng khô của tế bào Chúng thường được cung cấp dưới dạng muối như sunphat, cacbonat, và clorua, và tồn tại trong tế bào vi sinh vật dưới dạng ion như Na+.
Mg 2+ , K + , Ca 2+ hoặc Cl - , HCO 3- , (HPO4) 2-
Hàm lượng khoáng chất trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật thay đổi theo từng giai đoạn phát triển Việc bổ sung khoáng chất, đặc biệt là phospho, có vai trò quan trọng trong việc cải thiện sự phát triển của vi sinh vật, đồng thời giúp tạo ra môi trường ổn định hơn cho chúng.
Các chất khoáng có mặt trong các chế phẩm như bã mía, bã dừa, bã đậu nành và mật rỉ đường Việc sử dụng những cơ chất này giúp giảm đáng kể lượng khoáng cần bổ sung vào môi trường.
B subtilis có nguồn carbon và nito đa dạng nên sẽ có rất nhiều môi trường nuôi cấy có thể sử dụng như PGA, PDA, Czapek Dox, mật rỉ đường, bã mía Để lựa chọn môi trường cấy B subtilis ở quy mô công nghiệp cần đảm bảo giá thành rẻ, dễ tìm, hiệu suất thu hồi cao,
Lựa chọn phương pháp nuôi cấy
Hiện nay, có ba phương pháp chính để nuôi cấy vi sinh vật: phương pháp nuôi cấy gián đoạn, phương pháp nuôi cấy liên tục với việc bổ sung cơ chất, và phương pháp nuôi cấy liên tục.
Trong 3 phương pháp này đều có ưu và nhược điểm riêng, nhưng phương pháp nuôi cấy liên tục có những ưu điểm như hiệu suất sinh khối cao nhất, rút ngắn được thời gian lên men, giảm bớt được thể tích của toàn bộ thiết bị, thao tác đơn giản và thực hiện quá trình tự động hóa, giảm bớt thời gian làm vệ sinh thiết bị khử khuẩn và làm nguội, mật độ tế bào được tạo ra cao do khả năng phục hồi và tái sử dụng tế bào Ngoài ra, phương pháp lên men liên tục có những hạn chế như cần điều kiện vô trùng tuyệt đối vì trong quá trình nuôi liên tục đã tạo ra môi trường tối ưu cho chủng nuôi cấy nhưng các vi khuẩn khác có điều kiện tương tự sẽ nhiễm vào, dễ bị nhiễm khuẩn và khó xử lí, cần nhân viên chuyên nghiệp có tay nghề cao để vận hành thiết bị, cần nhiều nguồn năng lượng cho quá trình vận hành và chi phí thiết bị cao cho tự động hóa
Phương pháp nuôi cấy gián đoạn bổ sung cơ chất có hiệu suất thu hồi sinh khối thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy liên tục, nhưng lại đơn giản và dễ vận hành với chi phí thiết bị thấp Tuy nhiên, phương pháp này có nguy cơ ngoại nhiễm cao trong giai đoạn bổ sung cơ chất, đòi hỏi đội ngũ nhân viên có tay nghề cao và điều kiện vô trùng tiệt đối Mặc dù vi sinh vật không bị ức chế bởi nồng độ môi trường cao, phương pháp này vẫn cần chi phí cao cho trang thiết bị và vận hành (Lê Văn Hoàng, 2004)
Khi lựa chọn phương pháp nuôi cấy ở quy mô công nghiệp, cần chú trọng đến chi phí đầu tư thiết bị thấp, yêu cầu trình độ nhân viên không cao, thiết bị đơn giản và dễ vận hành, cũng như khả năng khắc phục sự cố nhanh chóng Do đó, phương pháp nuôi cấy B subtilis phù hợp cho quy mô công nghiệp là nuôi cấy gián đoạn Để đáp ứng nhu cầu của ngành công nghiệp, chi phí sản xuất thấp là ưu tiên hàng đầu trong việc sản xuất enzyme như lipase Cả hai hình thức lên men trạng thái rắn (SSF) và lên men chìm (SMF) đều có thể áp dụng, nhưng cần xác định hình thức nuôi cấy nào là phù hợp nhất cho quy mô công nghiệp.
Theo Nguyễn Hoàng Lộc (2007), trong phương pháp nuôi bề mặt, vi sinh vật được cấy trực tiếp trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng Đối với môi trường rắn, cần làm ẩm trước khi nuôi cấy Vi sinh vật sử dụng chất dinh dưỡng và oxy từ không khí để hô hấp, sinh trưởng và phát triển Để đảm bảo vi sinh vật phân tán đều và sử dụng hiệu quả các chất dinh dưỡng, lớp môi trường rắn nên mỏng (khoảng 2-5 cm) để tiếp xúc trực tiếp với không khí, từ đó cung cấp đủ oxy cho sự phát triển.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường rắn được áp dụng để sản xuất enzyme cho một số loại nấm mốc và vi khuẩn, trong khi môi trường lỏng có thể được sử dụng trong một số trường hợp Quá trình nuôi cấy diễn ra trên các khay phẳng, được xếp chồng và ủ trong buồng chứa vô trùng kín, với vi sinh vật được cấy bằng cách thổi bào tử vào buồng Môi trường rắn thường được làm từ nguyên liệu tự nhiên như cám, gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường, khoai tây và lõi ngô, hoặc hỗn hợp của chúng Trong khi đó, môi trường lỏng thường là rỉ đường, dịch thủy phân từ thóc mầm, nước bã rượu, và có thể bổ sung thêm muối khoáng.
Để đảm bảo đầy đủ chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy, cần bổ sung các nguồn N, P, K và chất sinh trưởng như nước khoai tây Độ ẩm tối ưu cho nuôi cấy bề mặt nấm mốc là 58-60%, nhưng độ ẩm 60% có thể tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, gây tạp nhiễm và khó thông khí Nếu độ ẩm giảm xuống 45-50%, môi trường sẽ khô nhanh, dẫn đến sinh bào tử yếu và giảm hoạt tính enzyme Do đó, nên duy trì độ ẩm môi trường ở mức 50-60% và độ ẩm không khí trong phòng nuôi cấy từ 90-100% Mặc dù nuôi cấy bề mặt không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối, nhưng môi trường nhân giống cần được vô trùng để giống phát triển bình thường, đặc biệt trong giai đoạn đầu.
Trong sản xuất môi trường rắn, việc vô trùng cần thực hiện ở áp suất 1-1,5 atm trong 45-60 phút Nếu môi trường được trộn với axit clohydric hoặc axit sulfuric đến pH phù hợp, hoặc thêm một ít formalin, có thể vô trùng ở 0,2-0,3 atm Việc điều chỉnh pH nhằm tăng cường sự sản xuất enzyme Sau khi dàn mỏng môi trường dày khoảng 2-2,5 cm và để nguội xuống 30°C, tiến hành cấy giống Giống được nhân bằng phương pháp bề mặt hoặc tách bào tử và được lưu trữ trong các bình nút kín hoặc túi.
Phương pháp thu nhận enzyme lipase
Dịch enzyme thô sau khi lên men chứa nước, protein không hoạt tính, tạp chất từ môi trường nuôi cấy và enzyme ngoại bào Để thu được sản phẩm có nồng độ enzyme cao, cần loại bỏ các thành phần không cần thiết Lipase từ vi sinh vật chủ yếu là enzyme ngoại bào, thường được sử dụng trong chất tẩy rửa Phương pháp kết tủa là chính để sản xuất chế phẩm enzyme, nhưng trong ngành dược phẩm, thực phẩm và da, cần thêm các biện pháp tinh sạch như sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion và sắc ký ái lực.
Kết tủa là phương pháp phổ biến trong nghiên cứu enzyme và sản xuất enzyme quy mô công nghiệp, với 80% công nghệ tinh sạch enzyme sử dụng phương pháp này Trong đó, kết tủa bằng muối ammonium sulphate chiếm 60%, trong khi kết tủa bằng ethanol, acetone hoặc axit (thường là HCl) chiếm 35% (RK Saxena, 2003).
Phương pháp kết tủa muối dựa trên nguyên tắc rằng khi bổ sung muối vào dung dịch enzyme, muối sẽ kéo nước vào giữa các phân tử protein, làm thay đổi điện tích và giảm độ hòa tan của enzyme, dẫn đến kết tủa protein enzyme Mỗi enzyme có một nồng độ muối tối ưu khác nhau để hoàn toàn kết tủa, vì vậy muối có thể được sử dụng để tách riêng các protein trong hỗn hợp.
Ammonium sulphate là một loại muối phổ biến và giá thành thấp, có trọng lượng phân tử nhỏ và độ hòa tan cao, giúp duy trì hoạt tính của protein enzyme Tuy nhiên, cần lưu ý rằng các thiết bị có thể bị ăn mòn do tác động của muối Thông thường, muối được sử dụng ở dạng rắn và được hòa tan từ từ vào dung dịch cho đến khi đạt nồng độ từ 30% đến 70%, quá trình này nên được thực hiện ở nhiệt độ lạnh khoảng 4 độ C.
Phương pháp kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ như ethanol và acetone là một kỹ thuật hiệu quả Khi dung môi được thêm vào dung dịch enzyme, nó làm giảm hằng số điện môi, từ đó tăng cường lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein, dẫn đến sự kết hợp và hình thành tủa Đặc biệt, enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ trong dung môi hữu cơ, và nồng độ dung môi cần thiết để tủa protein phụ thuộc vào tính chất của từng loại enzyme.
Nghiên cứu của Kumar et al , 2012 tinh sạch lipase bằng muối Ammonium sulphate (30 – 70%) từ canh trường nuôi cấy Bacillus sp DVL43 Và nghiện cứu của
Ameri et al , 2015 tinh sạch lipase bằng muối (0-80%) từ canh trường nuôi cấy Bacillus atrophaeus FSHM.
Bảng 2 1: So sánh dung môi dùng để kết tủa enzyme
Hoạt tính trong dung dịch enzyme thô chưa kết tủa
Hiệu suất thu hồi enzyme
Hiệu quả tinh sạch (lần) 11,5 7,12
Amonium sulfate (NH4)2SO4: 1kg: 4 000 VNĐ
Về hiệu suất thu hồi enzyme, dung dịch enzyme thô từ hai nghiên cứu có hoạt tính tương đương Sau khi tinh sạch bằng phương pháp kết tủa phân đoạn với hai hóa chất khác nhau, hiệu suất thu hồi và hoạt tính enzyme sau kết tủa khi sử dụng Ammonium sulphate cao hơn so với ethanol Tuy nhiên, quá trình kết tủa bằng Ammonium sulphate tốn nhiều thời gian hơn và số mẻ thực hiện được cũng ít hơn.
Xét về chi phí hóa chất: giá thành của ethanol cao hơn Ammonium sulphate, từ đó giá thành sản phẩm cũng cao hơn.
Từ những so sánh trên chúng tôi lựa chọn phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sulphate để sản xuất lipase
Quy trình công nghệ
Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu đầu vào cho sản xuất là mật rỉ đường, một phụ phẩm từ ngành công nghiệp đường, cần đảm bảo nguồn cung ổn định và giá cả hợp lý, đồng thời phải uy tín về chất lượng Việc chuẩn bị môi trường cũng rất quan trọng để đảm bảo quá trình sản xuất diễn ra hiệu quả.
Mục đích: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho chủng Bacillus subtilis sinh trưởng và phát triển để thu được nhiều enzyme lipase nhất.
Các thành phần môi trường được trộn đều và sau đó được đưa vào thiết bị thanh trùng ở nhiệt độ 121 oC trong 15 phút Sau quá trình thanh trùng, môi trường được làm nguội trực tiếp xuống 30 oC trong bể lên men.
Bảng 2 2: Thành phần môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis
Giống sử dụng: chủng Bacillus subtilis tự nhiên mua từ giống công nghiệp.
Mục đích nuôi cấy: Sinh nhiều enzyme lipase trong quá trình lên men.
Lượng giống cấy cần được điều chỉnh phù hợp với môi trường để tối ưu hóa quá trình tạo sinh khối Nếu lượng giống cấy ban đầu quá ít, thời gian tạo sinh khối sẽ kéo dài, ảnh hưởng đến hiệu suất sản xuất Ngược lại, nếu lượng giống cấy quá nhiều, chi phí cho quá trình nhân giống sẽ tăng lên.
Mục tiêu của nghiên cứu là tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho Bacillus subtilis nhằm tăng cường khả năng sinh tổng hợp enzyme lipase Để đạt được điều này, môi trường nuôi cấy sử dụng mật rỉ đường kết hợp với phương pháp nuôi cấy chìm và nuôi cấy gián đoạn theo mẻ đã được phân tích.
Môi trường nuôi cấy và vi khuẩn sau khi đạt đủ số lượng sẽ được chuyển vào bể lên men chính, nơi có hệ thống cánh khuấy, cung cấp oxy, và điều chỉnh pH, nhiệt độ để duy trì điều kiện tối ưu cho Bacillus subtilis phát triển Việc kiểm soát nồng độ oxy là rất quan trọng đối với Bacillus subtilis, một sinh vật hiếu khí, nhằm đảm bảo sự phân bố đồng đều của vi sinh vật trong bể, từ đó tăng cường diện tích tiếp xúc giữa cơ chất và vi sinh vật, giúp tối ưu hóa quá trình lên men và hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn.
Mục đích: loại bỏ sinh khối khỏi canh trường, sử dụng dịch lọc (có chứa enzyme) vào các khâu sau.
Thiết bị sử dụng: lọc khung bản
Máy lọc ép khung bản hoạt động dựa trên nguyên tắc nén áp suất, bao gồm hai bộ phận chính: bộ phận lọc và bộ phận bơm Bộ phận bơm có nhiệm vụ hút và nén dung dịch lọc qua vật liệu lọc, giúp quá trình lọc diễn ra hiệu quả.
Phần đầu tiên của thiết bị lọc bao gồm các khung và tấm lọc được ép chặt với nhau bằng một đĩa quay bằng tay Thiết bị có thể sử dụng tối đa từ 50 đến 100 tấm lọc Tấm vải lọc khung bản, hay còn gọi là vải lọc khung bản, được sản xuất từ vật liệu polypropylene (PP) với độ bền cao và khả năng chịu đựng tốt trong môi trường hóa chất.
Phần thứ hai của hệ thống bao gồm bộ phận hút và nén dung dịch lọc, được trang bị bơm nén áp suất cao cùng hai thùng chứa bằng thép không rỉ Mỗi thùng có dung tích 200 lít và được trang bị chỉ thị mức dung dịch Trong đó, một thùng chứa dung dịch đục (hỗn hợp lọc) và thùng còn lại chứa dịch lọc (Filtrat).
Ngoài ra, còn có một thùng thứ ba được kết nối với máy, dùng để chứa hỗn hợp nước và diatomit Chất này giúp phủ lên màng lọc một lớp màng, tạo điều kiện cho chất lỏng đi qua dễ dàng hơn.
Nguyên lý hoạt động của thiết bị lọc áp lực là quá trình làm việc gián đoạn, trong đó nước được nhập liệu và lọc liên tục, trong khi bã thải được xả ra theo chu kỳ.
Khung và bản là hai thành phần chính trong hệ thống lọc, với khung giữ bã lọc và nhập huyền phù, trong khi bản tạo ra bề mặt lọc với các rãnh dẫn nước Cả hai thường có hình vuông và cần được bịt kín tốt khi ghép lại Chúng được xếp liên tiếp trên giá đỡ, với vách ngăn lọc nằm giữa Quá trình ép chặt diễn ra nhờ cơ cấu đai vít xoắn và tay quay Lỗ dẫn huyền phù được nối liền thành ống dẫn cho hệ thống cấp liệu, trong khi nước lọc chảy ra qua đường ống ra ngoài Bã được giữ lại trên bề mặt vách ngăn và chứa trong khung, và khi khung đầy bã, quá trình lọc sẽ dừng lại để rửa và tháo bã Trong quá trình này, chất rắn trong huyền phù được giữ lại nhờ lớp vật liệu lọc.
Màng lọc hoạt động dựa trên cơ chế chuyển động của các phần tử nước, nhờ vào lực nén từ máy bơm tạo ra dòng chảy mạnh Các phần tử cần lọc sẽ bị giữ lại bởi mạng lọc với kích cỡ trung bình 0.001µm, đảm bảo rằng các thành phần như sinh khối và kim loại không thể vượt qua.
Mục đích: Thu nhận enzyme có hoạt tính cao hơn.
Để tiến hành quá trình kết tủa enzyme, cần bổ sung muối ammonium sulphate từ từ vào dung dịch enzyme trong khi khuấy trộn Quá trình này nên được thực hiện ở nhiệt độ thấp (4 °C) để bảo toàn hoạt tính của enzyme, cho đến khi đạt nồng độ muối bão hòa 70% Sau đó, giữ ở nhiệt độ này trong vòng 5 giờ Thiết bị sử dụng trong quá trình này phải được làm từ thép không rỉ để tránh sự ăn mòn do muối.
Mục đích: ly tâm tách riêng tủa protein với nước, loại bỏ nước và thu nhận tủa có chứa enzyme nồng độ cao
Enzyme amylase rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, vì vậy quá trình ly tâm có thể tạo ra nhiệt, dẫn đến biến tính enzyme Để duy trì hoạt tính của amylase, cần thực hiện ly tâm ở nhiệt độ thấp, dưới 5 độ C.
Mục đích: giảm độ ẩm của chế phẩm enzyme, thường độ ẩm sau khi sấy phải dưới 10% (Lê Văn Hoàng, 2004)
Sau khi hoàn tất quá trình ly tâm, hòa trộn cặn lắng với 12% maltodextrin, 6% gum arabic và 1% CaCl2 Hỗn hợp này sau đó được chuyển vào thiết bị sấy phun liên tục, nơi thực hiện quá trình sấy ở nhiệt độ đầu vào 160°C.
CÂN BẰNG VẬT CHẤT
Quá trình lọc loại bỏ sinh khối
1.Gopinath, S C., et al., Strategies to characterize fungal lipases for applications in medicine and dairy industry BioMed research international, 2013 2013: p.
2.Mehta, A., et al., Fungal lipases: a review Journal of Biotech Research, 2017 8: p.
3.Alsberg, E., et al., Cell-interactive alginate hydrogels for bone tissue engineering.
4.Carpen A, Bonomi F, Iametti S, Marengo M Effects of starch addition on the activity and specificity of food-grade lipases Biotechnol Appl Biochem 2019;66(4):607–16.
5.Tong X, Busk PK, Lange L Characterization of a new sn-1, 3-regioselective triacylglycerol lipase from Malbranchea cinnamomea Biotechnol Appl Biochem. 2016;63(4):471–8.
6.Ekinci AP, Dinỗer B, Baltaş N, Adıgỹzel A Partial purification, and characterization of lipase from Geobacillus stearothermophilus AH22 J Enzym Inhibit Med Chem. 2016;31(2):325–31.
7 Gaschler MM, Stockwell BR Peroxid hóa lipid trong tế bào chết Biochem Biophys
8.Wentao Yao, Kaiquan Liu, Hongling Liu, Yi Jiang, Ruiming Wang, Wei Wangand Tengfei Wang A Valuable Product of Microbial CellFactories: Microbial Lipase 2021
9 Vakhlu, J., Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning Electronic Journal of Biotechnology, 2006 9(1): p 0-0.
10 Barros, M., et al., Seed lipases: sources, applications and properties-a review.
Brazilian Journal of Chemical Engineering, 2010 27(1): p 15-29.
11 Sharma, R., et al., Production, purification, characterization, and applications of lipases Biotechnology advances, 2001 19(8): p 627-662.
12 Aravindan, R., et al., Lipase applications in food industry 2007 p.