Rosmarinic acid (RA) là một este của acid caffeic và acid 3,4dihydroxyphenyl lactic, tồn tại tự nhiên trong dạng các hợp chất phenolic. Bắt nguồn từ cây húng quế Rosmarinus officinalis L., năm 1958 hai nhà khoa học người Italian là Scarpati và Oriente lần đầu tiên đã phân lập và được đặt tên theo tên của loài dược liệu này. Sau đó, RA đã liên tục được phát hiện trong hơn 160 loài thực vật thuộc họ Lamiaceae, Boraginaceae, Apiaceae, và nhiều loài khác. Các nhà khoa học chủ yếu nghiên cứu về các tác dụng dược lý bao gồm: hoạt tính chống oxi hóa, chống viêm, chống u và khả năng bảo vệ hệ thần kinh… trong nhiều thử nghiệm in vitro và cả in vivo. Trong tài liệu trình bày đầy đủ các thông tin về Hóa thực vật như CTHH, các đặc tính hóa lý và quá trình sinh tổng hợp của RA trong tự nhiên đến cơ chế của các tác dụng dược lý của RA
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ Khoa Hóa học Tên HP: Một số chương chọn lọc Hóa học hợp chất thiên nhiên Mã HP: CHE Lớp: CHE22A,B -1 hữu Học viên: Nguyễn Ngọc Anh - Nhóm (Nghiên cứu sinh học bổ sung) Tiểu luận tổng quan Rosmarinic acid Từ hóa thực vật đến tác dụng dược lý qua công bố khoa học Nội dung: Giới thiệu .1 Cơng thức hóa học Tính chất hóa lý .2 Các nguồn thực vật có chứa rosmarinic acid (RA) .2 Quá trình sinh tổng hợp rosmarinic acid (RA) Phương pháp chiết xuất, phân lập tinh chế 6.1 Phương pháp chiết thông thường 6.2 Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn 10 6.3 Một số phương pháp chiết xuất đại 10 Hoạt tính sinh học 11 7.1 Tiềm chống khối u 11 7.2 Chống viêm 13 7.3 Chống oxy hóa 14 7.4 Chống tiểu đường 15 7.5 Bảo vệ hệ tim mạch 15 7.6 Hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ gan (Hepatoprotective Activity) 16 7.7 Tiềm chống trầm cảm 17 Kết luận .17 Tài liệu tham khảo .18 Giới thiệu Rosmarinic acid (RA) este acid caffeic acid 3,4-dihydroxyphenyl lactic, tồn tự nhiên dạng hợp chất phenolic Bắt nguồn từ húng quế Rosmarinus officinalis L., năm 1958 hai nhà khoa học người Italian Scarpati Oriente lần phân lập đặt tên theo tên lồi dược liệu [1] Sau đó, RA liên tục phát 160 loài thực vật thuộc họ Lamiaceae, Boraginaceae, Apiaceae, nhiều loài khác Các nhà khoa học chủ yếu nghiên cứu tác dụng dược lý bao gồm: hoạt tính chống oxi hóa, chống viêm, chống u khả bảo vệ hệ thần kinh… nhiều thử nghiệm in vitro in vivo RA số hợp chất khác tách từ dịch chiết húng quế acid carnosic, acid ursolic carnosol, chứng minh có khả giảm nguy phát triển u nhiều quan thể, chẳng hạn dày, ruột, gan, vú tế bào bạch cầu [2], [3] Do hoạt tính quý báu mà RA mang lại thu hút nhiều nhà khoa học nghiên cứu chuyên sâu nhằm ứng dụng lĩnh vực thiết yếu dược phẩm thực phẩm Cơng thức hóa học Cơng thức phân tử: C18H16O8 Cơng thức cấu tạo: Hình Cấu trúc hóa học Rosmarinic acid Tên IUPAC: (2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-[(E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl) prop-2enoyl] oxypropanoic acid Tên thông thường: Rosmarinic acid, (R)-rosmarinic acid, Labiatic acid… Tính chất hóa lý Thuộc tính tính tốn: Trọng lượng phân tử: 360.03 g/mol Tính chất thử nghiệm: • • • • • Trạng thái vật lý: Chất rắn Dạng tồn tại: Dạng bột tinh thể Màu sắc: Bột màu trắng tinh thể khơng màu Điểm nóng chảy: 171-175°C Độ hòa tan: Hòa tan dung môi hữu ethanol, DMSO dimethyl formamide mức độ định (khoảng 25 mg/mL) Các nguồn thực vật có chứa rosmarinic acid (RA) RA tìm thấy phân lập dạng thành phần đơn phân từ tổng số 162 loài thực vật liệt kê Bảng Họ Lamiaceae họ có số lượng loài nghiên cứu nhiều nhất, chiểm 104 loài thực vật số đó, Salvia chi thuộc họ Lamiaceae với 20 loài chiết tách thu RA bao gồm S absconditiflora Greuter & Burdet., S Deserta Schang., S grandifolia, S miltiorrhiza Bunge., S plebeia S przewalskii Maxim v.v Về phân loại hóa học, tồn RA cung cấp số sở phân loại cấp độ phân họ Theo sở liệu Tổ chức Bảo vệ Thực vật Châu Âu Địa Trung Hải, số 104 loài thực vật thuộc họ Lamiaceae, có 93 lồi đến từ họ Nepetoideae 10 loài đến từ họ Lamioideae [4] Rõ ràng RA sản phẩm tự nhiên đặc trưng giúp phân biệt Nepetoideae phân họ khác họ Hoa môi (Lamiaceae) Tuy nhiên, để thực nghiên cứu phân loại họ Lamiaceae cách xác khơng thể dựa vào RA mà terpenoid đặc trưng đóng vai trị quan trọng tương tự Bảng Các lồi thực vật có chứa rosmarinic acid STT Tên loài Họ Bộ phận Adenium obesum Apocynaceae Vỏ thân Alkanna sfikasiana Tan., Vold and Strid Boraginaceae Rễ Anchusa azurea Miller var azurea Boraginaceae Rễ Anchusa italica Retz Boraginaceae Anchusa strigosa Banks et Sol Boraginaceae Rễ Anthoceros punctatus Anthocerotaceae Apeiba tibourbou Aubl Tiliaceae Lá Arctopus monacanthus Apiaceae Rễ Arnebia purpurea S Erik & H Sumbul Boraginaceae Rễ 10 Baccharis chilco Kunth Asteraceae Trên mặt đất 11 Barbarea integrifolia Brassicaceae Trên mặt đất STT 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Tên loài Bellis sylvestris Blechnum brasiliense Canna edulis Ker Celastrus hindsii Benth Centella asiatica Họ Asteraceae Blechnaceae Cannceae Celastraceae Apiaceae Chloranthus fortune (A Gray) Solms-Laub Chloranthus multistachys Pei Clerodendranthus spicatus (Thunb.) C.Y Wu Clinopodium chinense var parviflorum Clinopodium tomentosum (Kunth) Govaerts Clinopodium urticifolium Coleus aromaticus Benth Coleus forskohlii (Willd) Briq Coleus parvifolius Benth Colocasia esculenta (L.) Schott Cordia alliodora Cordia bicolor Cordia boissieri A DC Cordia dentata Cordia latifolia Roxb Cordia megalantha Cordia morelosana Standley Cordia sinensis Cordia verbenacea Cynoglossum columnae Ten Dracocephalum fruticulosum Steph Ex Willd Dracocephalum heterophyllum Dracocephalum nutans L Dracocephalum palmatum Stephan Dracocephalum tanguticum Maxim Ehretia asperula Ehretia obtusifolia Ehretia philippinensis Ehretia thyrsiflora Elsholtiza bodinieri Vaniot Elsholtzia rugulosa Hemsl Elsholtzia splendens Nakai Farfugium japonicum (L.) Kitam Var giganteum (Siebold et Zucc.) Kitam Chloranthaceae Chloranthaceae Lamiaceae Bộ phận Lá Lá Thân rễ Lá Trên mặt đất Toàn Trên mặt đất Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Araceae Boraginaceae Boraginaceae Boraginaceae Boraginaceae Boraginaceae Boraginaceae Boraginaceae Boraginaceae Boraginaceae Boraginaceae Lamiaceae Trên mặt đất Trên mặt đất Toàn Lá Toàn Trên mặt đất Lá Vỏ rễ Lá Lá Lá Quả Lá Trên mặt đất Toàn Lá Rễ Trên mặt đất Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Boraginaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Asteraceae Toàn Trên mặt đất Trên mặt đất Toàn Lá Toàn Vỏ Lá Toàn Trên mặt đất Hoa Hoa STT 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 Tên loài Họ Foeniculum vulgare Mill Forsythia koreana Nakai Gastrocotyle hispida Glechoma longituba Hamelia patens Jacq Hedera helix L Helicteres angustifolia Linn Helicteres hirsuta Lour Helicteres isora L Hypenia salzmannii (Benth.) Harley Hyptis atrorubens Poit Hyptis capitata Jacq Hyptis pectinata (L.) Poit Hyptis suaveolens (L.) Poit Hyptis verticillata Jacq Hyssopus cuspidatus Ipomoea turpethum (L.) R.Br Isodon eriocalyx (Dunn) Hara var laxiflora C Y Wu et H W Li Isodon flexicaulis C Y Wu et H W Li Isodon lophanthoides var graciliflorus Isodon oresbius (W W Smith) Kudo Isodon rubescens (Hemsl.) Hara Isodon rugosus (Wall Ex Benth.) Codd Isodon sculponeata (Vaniot) Hara Keiskea japonica Miq Lallemantia iberica (Bieb.) Fisch & C.A Mey Lavandula angustifolia Mill Lepechinia graveolens (Reg.) Epling Lepechinia meyenii (Walp.) Epling Lepechinia speciosa (St Hill) Epling Lycopus europaeus L Lycopus lucidus Turcz Marrubium vulgare L Meehania urticifolia (Miq.) Makino Melissa officinalis L Mentha dumetorum Mentha haplocalyx Briq Mentha longifolia (L.) Hudson subsp Longifolia Apiaceae Oleaceae Boraginaceae Lamiaceae Rubiaceae Araliaceae Sterculiaceae Sterculiaceae Sterculiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Convolvulaceae Lamiaceae Bộ phận Trên mặt đất Quả Trên mặt đất Toàn Trên mặt đất Rễ Thân Quả Lá Lá thân Trên mặt đất Lá Trên mặt đất Trên mặt đất Toàn Toàn Lá Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Lá Trên mặt đất Trên mặt đất Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Toàn Trên mặt đất Lá Toàn Trên mặt đất Trên mặt đất STT 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 Tên loài Họ Mentha piperita L Mentha spicata L Mesona chinensis Benth Micromeria myrtifolia Boiss & Hohen Microsorum fortunei (T Moore) Ching Momordica balsamina Nepeta asterotricha Rech F Nepeta cadmea Boiss Nepeta curviflora Boiss Ocimum campechianum Mill Ocimum sanctum Linn Origanum dictamnus L Origanum glandulosum Desf Origanum majorana L Origanum minutiflorum Origanum rotundifolium Boiss Origanum vulgare L ssp Hirtum Paris veriticillata Bieb Perilla frutescens (L.) Britton var acuta Kudo Perilla frutescens var acuta Perovskia atriplicifolia Benth Plectranthus forsteri ‘Marginatus’ Plectranthus hadiensis var tomentosus Plectranthus madagascariensis (Pers.) Benth Plectranthus scutellarioides (L.) R Br Polygomun aviculane Prunella vulgaris L Prunella vulgaris var lilacina Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Polypodiaceae Cucurbitaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Liliaceae Lamiaceae Bộ phận Trên mặt đất Toàn Toàn Trên mặt đất Lá thân Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Lá Lá thân Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Rễ, Hạt Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Quả Rễ Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Lamiaceae Polygonaceae Lamiaceae Lamiaceae Quercus serrata Murray Rosmarinus officinalis L Salvia absconditiflora Greuter & Burdet Salvia castanea Diels f tomentosa Stib Salvia cavaleriei Levi Salvia cerino-pruinosa Rech F var cerinopruinosa Salvia chinensis Benth Salvia deserta Schang Salvia flava Forrest Fagaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Trên mặt đất Trên mặt đất Gai Gai, phận mặt đất Lá Lá Trên mặt đất Thân rễ Toàn Trên mặt đất Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Toàn Rễ, hoa Toàn STT 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 Tên loài Họ Salvia grandifolia W W Smith Salvia kiaometiensis Lévl Salvia limbata C.A Meyer Salvia miltiorrhiza Bunge Salvia officinalis Salvia palaestina Bentham Salvia plebeia R Br Salvia przewalskii Maxim Salvia sonchifolia C.Y Wu Salvia splendens Sellow ex Roem & Schult Salvia trichoclada Bentham Salvia viridis L cvar Blue Jeans Salvia yunaansis Sanicula europaea L Sanicula lamelligera Hance Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai Satureja biflora Schizonepeta tenuifolia Briquet Sideritis albiflora Sideritis leptoclada Solanum betaceum Cav Solenostemon monostachys Briq Symphytum officinale L Thunbergia laurifolia Lindl Thymus alternans Klokov Thymus atlanticus (Ball) Roussine Thymus praecox subsp grossheimii (Ronniger) Jalas Thymus praecox subsp grossheimii (Ronniger) Jalas var grossheimii Thymus quinquecostatus var japonica Thymus serpyllum Thymus sibthorpii Bentham Thymus sipyleus subsp Sipyleus var sipyleus Thymus vulgaris L Tournefortia sarmentosa Lam Veronica sibirica L Pennell Ziziphora clinopodioides Lam Zostera marina Zostera noltii Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Apiaceae Apiaceae Chloranthaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Solanaceae Lamiacea Boraginaceae Acanthaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Bộ phận Rễ Rễ Trên mặt đất Lá, rễ Trên mặt đất Trên mặt đất Toàn Rễ thân Rễ Lá Toàn Trên mặt đất Rễ Trên mặt đất Toàn Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Trên mặt đất Quả Trên mặt đất Rễ Lá Trên mặt đất Lá Trên mặt đất Lamiaceae Trên mặt đất Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Boraginaceae Scrophulariaceae Lamiaceae Potamogetonaceae Potamogetonaceae Trên mặt đất Toàn Trên mặt đất Trên mặt đất Lá Thân Thân rễ Trên mặt đất Lá Lá 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 -: Không đề cập đến Nhiều loài số 154 loài nêu sử dụng làm nguồn dược liệu cổ truyền Trung Quốc từ lâu đời như: Perilla frutescens (L.) Britt, Prunella vulgaris L., Salvia miltiorrhiza Bunge, Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai., Schizonepeta tenuifolia Briquet … Một số lồi khác cịn dùng làm thuốc dân gain nhiều quốc gia khu vực Cordia bicolor, Cordia dentate, Cordia megalantha, Hyptis atrorubens Poit., Hyptis verticillata Jacq Trung Mỹ Caribe.; Micromeria myrtifolia Boiss & Hohen., Salvia palaestina Bentham Sanicula europaea L Thổ Nhĩ Kỳ; Baccharis chilco, Hyptis capitata Jacq., Lepechinia meyenii (Walp.) Epling Nam Mỹ; Ipomoea turpethum (L.) R.Br., Thunbergia laurifolia Lindl., Thymus serpyllum Nam Á, nhiều vùng miền khác Dưới hàm lượng rosmarinic acid (RA) acid caffeic (CA) phân lập từ số thuộc họ Lamiaceae xác định phương pháp TLC-densitometric thể qua Bảng Bảng Hàm lượng RA CA số thuộc họ Lamiaceae Tên loài Salvia aethiopis L S officinalis L S argentea L Thymus serpyllum L Melissa o cinalis L Origanum heracleoticum L Satureja montana L Dracocephalum peregrinum L Hyssopus o cinalis L Hàm lượng RA (mg/g) Hàm lượng CA (mg/g) 1.80 2.00 1.20 1.10 1.20 2.00 2.60 0.59 0.42 0.07 0.12 0.09 0.20 0.14 0.22 0.10 0.03 0.09 Quá trình sinh tổng hợp rosmarinic acid (RA) Rosmarinic acid phân lập Scarpati Oriente (1958) Rosmarinic acid có cơng thức hóa học C18H16O6, ester acid caffeic acid (3,4dihydroxycinnamic acid) 3,4-dihydroxyphenyllactic acid tìm thấy nhiều họ Lamiaceae Quá trình sinh tổng hợp RA đường phức tạp, phi tuyến tính phân kỳ hội tụ Tiền chất cuối để tổng hợp RA đến từ hai đường song song, hai bắt nguồn từ đường sinh tổng hợp tyrosine [5] Bắt nguồn từ tham gia amino acid L-phenylalanine L-tyrosine, với có mặt phenylalanine liên kết 14C, RA tạo chứa nửa caffeic acid liên kết 14C Tương tự có mặt tyrosine liên kết 14C, RA tổng hợp có chứa 3,4dihydroxyphenyl-lactic liên kết 14C Chi tiết trình đưa sau [6]: (Hình 2) Hình Quá trình sinh tổng hợp RA Chú thích: PAL: phenylalanine ammonia-lyase C4H: cinnamic acid 4-hydroxylase 4CL: 4-coumaric acid CoA-ligase TAT: tyrosine aminotransferase HPPR: hydroxyphenylpyruvate reductase RAS = “rosmarinic acid synthase” HPPD: Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Hydroxycinnamoyl-CoA: Hydroxyphenyllactate hydroxycinnamoyl transferase 3-H, 3’-H = hydroxycinnamoyl-hydroxyphenyllactate 3- and 3’- hydroxylases Nhìn chung tổng hợp RA bắt đầu xảy với amino acid L-phenylalanine Ltyrosine chuyển đổi chuyên biệt thành tiền chất trung gian 4-coumaroyl-CoA 4-hydroxyphenyllactic acid Sự biến đổi phenylalanine xúc tác enzyme thông qua đường phenylpropanoid phenylalanine ammonia-lyase (PAL), cinnamic acid 4-hydroxylase (C4H), 4-Coumaric acid CoA-ligase (4CL) Cịn tyrosine chuyển hóa nhờ vào tyrosine aminotransferase (TAT) thành 4-hydroxyphenylpyruvic acid sau chuyển thành 4-hydroxyphenyllactic acid nhờ vào hydroxyphenylpyruvate reductase (HPPR) Hai tiền chất trung gian kết hợp với hình thành este 4-coumaroyl4’-hydroxyphenyllactic acid hình thành thơng qua đường rosmarinic acid synthase (RAS) Cuối nhờ vào nhóm 3’-hydroxyl hình thành rosmarinic acid Ngồi đường phenylpropanoid để sinh tổng hợp rosmarinic acid cịn có đường shikimate để sinh tổng hợp nên dẫn xuất rosmarinic acid Dẫn xuất rosmarinic acid thường chứa hai phân tử rosmarinic acid kết hợp với thành phần chất thơm khác từ loài thực vật bậc cao Ví dụ liên kết rosmarinic acid với caffeic acid, rosmarinic acid lithospermic acid B Phương pháp chiết xuất, phân lập tinh chế 6.1 Phương pháp chiết thông thường RA acid polyphenolic tự nhiên, thường chiết tách từ cỏ phương pháp chiết xuất khác xuất phát từ phương pháp chiết thường quy đến phương pháp chiết đại ứng dụng ngày Trong phương pháp chiết thường quy, dung môi yếu tố quan trọng định đến hàm lượng RA chiết tách trình thực nghiệm Một nghiên cứu chiết tách RA phương pháp chiết Soxhlet sử dụng sắc ký lỏng hiệu cao, nghiên cứu sử dụng phận mặt đất Dracocephalum moldavica L Bằng việc khảo sát loại dung mơi có độ phân cực khác EtOAC, n-BuOH, ACN, CH2Cl2, petrol, H2O, MeOH nghiên cứu n-butanol dung môi tốt sử dụng chiết xuất RA Kết xác định thành phần cho thấy hàm lượng RA thu dao động từ 9.46 mg/g (chiết H2O) đến 114.54 mg/g (chiết n-BuOH) không xác định hàm lượng RA dịch chiết Petrol CH2Cl2 So sánh theo thứ tự sau Petrol CH2Cl2 < H2O < EtOAC < ACN < MeOH < n-BuOH (Bảng 3) [7] Bảng Hàm lượng RA thu tương ứng với loại dung môi Dung môi RA (mg/g) Petrol - CH2Cl2 - ACN 23.87 ± 0.5 EtOAC 10.26 ± 1.29 Dung môi MeOH n-BuOH H2 O 6.2 RA (mg/g) 89.83 ± 1.38 114.54 ± 24.70 9.46 ± 0.07 Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn Theo nghiên cứu Zibetti CS [8] tách chiết rosmarinic acid từ Rosmarinus officinalis phương pháp siêu tới hạn (điều kiện áp suất 80 150 atm) đồng thời sử dụng ethanol (nồng độ 30 – 99%) để hỗ trợ tách chiết Kết cho thấy điều kiện áp suất 80 atm, nồng độ ethanol 30% thu hàm lượng rosmarinic acid cao (8.50 ± 0.52 mg/g) Tuy nhiên có hỗ trợ sóng siêu âm (25 KHz) hàm lượng rosmarinic acid tăng 10.39 ± 0.21 mg/g 6.3 Một số phương pháp chiết xuất đại Một vài thập kỷ qua, cách thức vận hành đơn giản, thời gian hàm lượng cao hơn, nhà khoa học nghiên cứu thực số phương pháp để chiết xuất RA như: Chiết có sử dụng hỗ trợ sóng siêu âm, chiết xuất vi sóng hay chiết xuất có hỗ trợ enzyme… Bên cạnh đó, nhà khoa học sử dụng đồng thời phương pháp đáp ứng bề mặt RSM (Response surface methodology) trình chiết xuất để khảo sát mối quan hệ nhiều điều kiện thí nghiệm để tìm điều kiện tối ưu cho hàm lượng rosmarinic acid thu tốt Phương pháp mô tả Box Wilson vào năm 1951 với ý tưởng sử dụng chuỗi thí nghiệm thiết kế dựa nguyên tắc: Sự ngẫu nhiên, lặp lại chia nhóm nhằm tối ưu thơng số đầu vào cho kết tốt kết thúc trình Một nghiên cứu so sánh phương pháp chiết xuất thực loài thực vật khác nhau, để đạt hàm lượng RA cao nhất, tham số tối ưu cho phương pháp khác sau: - MACs: 120 phút 25°C cho chiết ngâm khuấy HRE: 15 phút nhiệt độ sôi MAE: phút 50°C cho chiết xuất vi sóng Dung mơi sử dụng hỗn hợp (CH3CH2OH : H2O :HCl, 70:29:1, v/v/v) chứng tốt cho phương pháp Xét hàm lượng RA thu nhận được, phương pháp MACs cho kết hàm lượng RA cao loài Melissa officinalis L (30.0 ± 0.2 mg/g), Mentha piperita (16.2 ± 0.6 mg/g), Rosmarinus officinalis L (9.2 ± 0.2 mg/g), Salvia officinalis L (19.6 ± 0.3 mg/g) phương pháp HRE cho hàm lượng RA tốt thực hai loài: Thymus vulgaris L (15.3 ± 1.2 mg/g) Origanum vulgare L (40.1 ± 1.0 mg/g) [9] 10 Trong nghiên cứu khác, nhà khoa học thực chiết xuất RA từ Rosmarinus officinalis với hỗ trợ sóng siêu âm, 1-octyl-3-methulimidazolium bromide ([C8mim]Br) dùng làm dung môi chiết Sau tối ưu hóa điều kiện chiết xuất bao gồm thời gian ngâm dược liệu, công suất thời gian siêu âm, tỷ lệ dược liệu dung môi cho kết phân tích thơng số tối ưu hàm lượng RA đạt sau [10]: Thời gian ngâm: Thời gian siêu âm: 30 phút Công suất máy siêu âm: 220W Tỷ lệ NL/DM 1:20 Hàm lượng RA dự đoán: 98.91% Một nghiên cứu khác sử dụng vi sóng để chiết xuất RA từ Rosmarinus officinalis, 1-octyl-3-methulimidazolium bromide ([C8mim]Br) sử dụng dung môi chiết, với công suất chiếu sáng 700W, thời gian chiếu sáng 15 phút tỷ lệ NL/DM 1/12 cho kết chiết xuất đáng kể với hàm lượng RA thu 3.97mg/g [11] Như vậy, thấy hiệu xuất hàm lượng RA thu từ trình chiết xuất không ổn định phụ thuộc nhiều yếu tố phương pháp thực nghiệm Tùy thuộc vào loài thực vật sở vật chất, hay chí nhà khoa học tiến hành thí nghiệm nhằm khảo sát lựa chọn phương pháp tối ưu cho mục tiêu nội dung nghiên cứu khác đối tượng Hoạt tính sinh học RA sản phẩm tự nhiên tìm thấy từ nhiều lồi thực vật, nghiên cứu RA có nhiều tác dụng dược lý tiềm việc ứng dựng điều trị số bệnh lý thông qua kết thử nghiệm số hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa, chống tiểu đường, khối u, kháng virus, bảo vệ hệ thân kinh, gan nhiều tác dụng khác thử nghiệm phương pháp in vivo in vitro 7.1 Tiềm chống khối u Rosmarinic acid nghiên cứu có tác dụng ức chế phát triển số loại tế bào ung thư người ung thư đại tràng, gan, dày, vú tế bào ung thư bạch cầu Một số chế đề xuất cho hoạt tính chống ung thư RA (Hình 3) 11 Rosmarinic acid Ức chế DNA methyltransferase Điều chỉnh RANKL/RANK/OPG Ức chế tế bào ung thư Hình Cơ chế chống ưng thư Rosmarinic acid Đánh giá hoạt tính RA với tế bào ung thư ruột kết chuột, RA sử dụng nồng độ 5mg/kg tính trọng lượng thể chuột có hiệu việc làm suy giảm hình thành phát triển tế bào ung thư, giảm sản phẩm phụ tình peroxid hóa lipid biểu protein tiền apoptotic, enzyme xenobiotic tổng hợp tăng protein apoptotic biểu [12] Trong nghiên cứu thực tế bào ung thư gan HepG2 người, HepG2 tái tổ hợp gen cách truyền plasmid chứa gen ARE-luciferin RA chủ yếu tăng cường hoạt động ARE-luciferin kích thích protein vận chuyện đào thải trọng bào thông qua kích hoạt đường tín hiệu NRF2 điều khiển tế bào HepG2 Điều vai trị RA việc kích thích đáp ứng chống oxi hóa quản lý stress tế bào thơng qua đường tín hiệu NRF2-mediation, làm tăng bảo vệ tế bào chống lại tác động yếu tố có hại hỗ trợ q trình đào thải [13] Một nghiên cứu khác thực Wu CS RA có khả ức chế tế bào CCRF-CEM CEM/ADR5000 phụ thuộc vào liều lượng gây độc tế bào tế bào lympho bình thường RA đồng thời gây hoại tử tế bào theo chu trình apoptosis kích thích rối loạn chức MMP kích hoạt phân cắt PARP apoptosis độc lập caspase RA ngăn chặn chuyển vị p65 từ bào tương vào nhân [14] Hơn nữa, ức chế biểu yếu tố phiên mã hay yếu tố cảm ứng (HIF-1α), ảnh hưởng đến đường glycolytic Trong đó, RA ngăn chặn việc tiêu thụ glucose sản xuất lactate tế bào đại trực tràng [15] RA ức chế microRNA cytokine gây viêm ngăn chặn thay đổi triệt để trình trao đổi chất tế bào ung thư (Warburg Efect) thông qua đường viêm liên quan đến chất kích hoạt phiên mã-3 (STAT3) chuyển đổi tín hiệu interleukin (IL)-6 [16] Hơn nữa, RA ức chế phát triển tế bào ung thư bạch cầu tiền tủy bào HL-60 phát triển mang lại hiệu ứng thu dọn gốc tự mạnh mẽ, làm xáo trộn cân lượng hạt nhân nồng độ deoxyribonucleotide triphosphate 12 (dNTP) mà không ảnh hưởng đến nồng độ protein RR (R1, R2, p53R2) tiểu đơn vị, cuối dẫn đến cảm ứng apoptosis [17] [18] Một nghiên cứu khác thực chuột bị kích thích trình gây ung thư ruột kết cách sử dụng 1,2-dimethyldrazin liên tục 30 tuần Đồng thời, RA sử dụng với liều lượng 20mg/kg trọng lượng thể chuột thời gian ngăn chặn đáng kể hình thành tăng sinh khối u [19] Các tế bào giống tế bào gốc ung thư vú đóng vai trò quan trọng việc khởi đầu, phát triển di tế bào ung thư vú Sự đồng ấp RA với tế bào ung thư vú (270 µM, 810 µM) làm giảm khả tồn chúng, ức chế di thúc đẩy chu trình apoptosis chúng Phân tích RT-PCR immunoblot cho thấy hai nồng độ RA dùng để điều trị làm giảm đáng kế mức độ mRNA protein phosphoryl hóa gen gây ung thư làm mịn liên quan đến Glioma tương đồng Hơn nữa, việc sử dựng RA để điều trị dẫn đến điều hóa giảm biểu ung thu hạch tế bào B (Bcl-2) điều chỉnh tăng biểu Bax Vì vây, tác dụng chống khối u RA cho liên quan đến việc tác động đến đường dẫn truyền tín hiệu Bcl-2 [20] 7.2 Chống viêm Viêm phản ứng sinh học toàn thể chống lại yếu tố kích thích tác nhân vật lý, hóa học hay sinh học gây nhiễm trùng chấn thương đến từ tác nhân bên hoại tử thiếu máu hay bệnh tự miễn Nó đặc trung cân chất trung gian tế bào gây viêm Viêm cịn có tác động khơng nhỏ đến sức khỏe người liên quan đến nhiều bệnh khác Các hợp chất chống viêm có nguồn gốc từ thực vật thu hút quan tâm ngày lớn việc ứng dụng điều trị Trong bệnh viêm xương khớp, giảm phá cấu trúc ma trận ngoại bào sụn gây thiếu hụt collagen type II aggrecan, hai thành phần sụn Ngồi ra, disintegrin MPs (Metalloproteinase) với ADAMTS-4 (Thrombospondin motifs-4) ADAMTS-5 tham gia vào trình giảm phá Trong nghiên cứu in vitro chondrocyte kích thích IL-1β, việc ức chế biểu gen collagen type II aggrecan giảm phá ma trận ngoại bào xảy Sự ước tính RA nồng độ 100 µM quan sát để loại bỏ ức chế thể tác động ức chế đến sản xuất IL-6, biểu gen protein ADAMTS-4 ADAMTS-5, chí đến việc giảm phá ma trận ngoại bào Kết nghiên cứu RA hợp chất đầy hứa hẹn việc tạo loại thuốc điều trị triệu chứng bệnh thối hóa khớp [21] Trong nghiên cứu khác liên quan đến bệnh viêm khớp chuột gây thiếu hụt collagen, nhà khoa học tiến hành tiêm bắp với liều lượng 50 mg/kg RA cho chuột, kết cho thấy RA cải thiện đáng kể bệnh viêm khớp giảm số chân bị ảnh hưởng chuột So với nhóm chuột khơng tiêm RA, gia tăng tế bào bạch cầu trở nên nghiêm trọng, phá vỡ cấu trúc mơ niêm mạc tình trạng cơ, xương biến nghiêm trọng so với nhóm chuột tiêm RA [22] 13 Các tế bào T tham gia vào phát triển bệnh viêm da dị ứng, giai đoạn cấp tính, đoạn da bị tổn thương bệnh da dị ứng bị xâm nhập tế bào CD4+, có khả tiết cytokine IL-4, IL-5 IL-13, giai đoạn mãn tính, tế bào Th1 tiết cytokine IFN-γ, cytokine gây viêm Một số nghiên cứu báo cáo RA (5 µM) ức chế đáng kể sản xuất IL-4 IFN-γ thông qua tế bào CD4+ kích thích Ngồi ra, nhóm nghiên cứu thấy sau đưa vào 2,4-dinitrofluorobenzen, triệu chứng viêm da dị ứng, dấu hiệu da bị tổn thương tìm thấy chuột NC/Nga ngứa, tổn thương da sưng tai Trong trạng thái bệnh lý này, nồng độ IgE huyết kiểm tra cao bất thường xâm nhập biểu tế bào viêm nhiễm gồm có T CD4+, T CD8+ tế bào bạch cầu vào vết tổn thương da tai quan sát tăng đáng kể Tiêm bắp bội trùng trùng 50 mg/kg RA thể tác động cải thiện ức chế đáng kể tượng bệnh lý [23] Bệnh viêm đường tiêu hóa bệnh viêm nhiễm đường tiêu hóa mạn tính tái phát, loét dạng loét loại tiêu biểu Ở chuột mắc bệnh viêm đại tràng natri dextran sulfate gây ra, việc uống RA (60 mg/kg) giảm đáng kể mức độ bệnh viêm đại tràng, thể qua điểm số hoạt động bệnh, tổn thương đại tràng chiều dài đại tràng Ngoài ra, điều trị RA dẫn đến giảm số cytokine gây viêm IL-6, IL-1β IL-22, mức protein COX-2 (Cyclooxygenase-2) iNOS (Inducible nitric oxide synthase) đại tràng Các tác động bảo vệ chứng minh liên quan đến ức chế hoạt động NF-κB tác nhân kích hoạt dẫn truyền (STAT3) [24] Trong nghiên cứu khác, RA cho bảo vệ khỏi viêm loét dạng loét cách điều tiết đa dạng hóa tế bào nhiễm sắc thể dựa vào HMOX1 (Heme oxydase-1) [25] Ngoài nghiên cứu đề cập trên, RA nghiên cứu in vitro in vivo để thể tính chất bảo vệ làm dịu viêm nhiễm lipopolysaccharide (LPS) gây [26], viêm tuyến mật cấp tính kích thích sodium taurocholate [27], viêm phổi cấp tính LPS gây [28], viêm não cấp tính LPS gây [29], viêm lợi sưng nứt mảng bám [30], tổn thương gan cấp tính kích thích concanavalin A [31], viêm mũi dị ứng kích thích ovalbumin [32], nhiều tình trạng khác 7.3 Chống oxy hóa Sự oxi hóa nguyên nhân dẫn đến số bệnh ung thư, tim mạch, tiểu đường bệnh thần kinh So với loại thuốc nhân tạo, hợp chất tự nhiên gây tác dụng phụ việc điều trị bệnh Do việc tìm hợp chất có khả chống oxi hóa, mang lại lợi ích tốt cho sức khỏe điều thiết yếu Trong năm vừa qua, rosmarinic acid chứng minh có khả chống oxi hóa hữu hiệu Theo nghiên cứu Horvathova cộng (2015) tiến hành làm phong phú nước uống chuột với rosmarinic acid, kết cho thấy tế bào gan chuột sản sinh sức đề kháng chống oxi hóa Nó bảo vệ tế bào gan chống lại tổn thương lên DNA dimethoxyl naphthoquinone hydrogen peroxide gây thông qua việc nâng cao hoạt động glutathione peroxidase [33] Gao cộng (2005) nghiên cứu tác dụng chống 14 apoptotic chống oxi hóa rosmarinic acid gây H2O2 tế bào astrocytes, kết cho thấy rosmarinic acid làm giảm nồng độ oxi hóa giảm tổn thương tế bào H2O2 gây [34] Ngoài ra, so với caffeic acid dẫn xuất có chất rosmarinic acid có hoạt tính chống oxi hóa cao, mạnh so với vitamin E 7.4 Chống tiểu đường Một số nghiên Một số nghiên cứu in vitro hoạt động chống tiểu đường RA Acid polyphenolic có tác dụng ức chế α-glucosidase với giá trị IC50 33.0 µM, thấp nhiều so với acarbose (131.2 µM), loại thuốc ức chế α-glucosidase bán thị trường [35] RA chứng minh có tác động điều chỉnh đến ổn định glucose Đã phát RA (5.0 µM) kích hoạt enzyme cảm biến lượng AMPK (AMP-activated protein kinase) tăng hấp thụ glucose tế bào chuột L6, tương tự insulin (0.1 µM) metformin (2.0 mM) [36] Theo cách phụ thuộc vào liều lượng, việc điều trị RA (120–200 mg/kg, ngày) cho thấy tác dụng hạ đường huyết đặc biệt ấn tượng chuột mắt gây tiểu đường giống loại streptozotocin cải thiện đáng kể hấp thụ glucose độ nhạy insulin chuột mắt gây tiểu đường giống loại chế độ dinh dưỡng giàu chất béo Hiệu tích cực tiểu đường cho liên quan đến giảm biểu enzyme PEPCK (Phosphoenolpyruvate carboxykinase) gan tăng biểu glucose transporter4 bắp [37] Trong nghiên cứu khác, điều trị RA (100 mg/kg, 30 ngày) chuột mắt gây tiểu đường phát có tác dụng khôi phục mức đường máu điều chỉnh mức adiponectin leptin Ngoài ra, biến đổi bệnh lý tiểu đường cấu trúc tế bào gan giảm nhẹ sử dụng RA, theo quan sát từ hình ảnh cấu trúc siêu vi [38] Cao CS sử dụng RA dày (150, 300 mg/kg) 10 ngày để điều trị cho chuột mang tế bào ung thư H22 Kết cho thấy RA có khả ức chế phát triển khối u hiệu cách điều hòa tiết cytokine gây viêm hình thành mạch khối u (IL-1β, IL-6 TNF-α), yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu tăng trưởng biến đổi yếu tố-β) ngăn chặn biểu NF-κB p65 môi trường vi mô [39] 7.5 Bảo vệ hệ tim mạch RA nồng độ 25, 50, 10 mg/L có khả trì mức ATP tế bào ức chế giảm khả sống sót tế bào H/R gây ra, rò rỉ lactate dehydrogenase (LDH) ROS mức RA ức chế chu trình Apoptosis tế bào tim H/R gây biểu caspase phân cắt p-AKt điều chỉnh xuống [40] Thụ thể protein C nội mơ (EPCR) có vai trị bật q trình viêm đơng máu, hoạt động bị thay đổi đáng kể phân tách giải phóng ectodomain dạng protein hòa tan (sEPCR) RA chứng minh chất chống viêm mạnh Theo dõi hiệu ứng RA TNF-α, PMA (phorbol-12-myristate 13acetate), IL-1β trình loại bỏ EPCR qua trung gian thắt đâm thủng phân 15 (CLP) chế bản, người ta nhận thấy điều trị RA dẫn đến ức chế mạnh mẽ PMA, TNF-α, bong tróc EPCR IL gây thông qua việc ngăn chặn biểu TACE Hơn nữa, RA làm giảm 1/2 kinase điều hịa ngoại bào (ERK), p38 kích thích PMA q trình JNK (phosphoryl hóa c-Jun N-terminal kinase) Những kết hỗ trợ việc sử dụng RA tới làm chất chống sEPCR thuốc thử loại bỏ chất chống lại loại bỏ EPCR qua trung gian IL-1β, TNF-α, PMA CLP [41], [42] Sử dụng RA chuột cho ăn đường fructose (FFR) tăng cường đáng kể độ nhạy insulin, giảm nồng độ lipid, tổn thương oxy hóa tiểu đơn vị protein P22phox NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) làm giảm xuất loại enzyme oxydase ngăn ngừa chứng phì đại tim RA làm hạ huyết áp fructose gây thông qua việc giảm hoạt động enzyme chuyển đổi angiotensin endthelin-1 tăng mức độ oxit nitric (NO) [43] RA làm giảm huyết lúc đói mức độ phân tử bám dính tế bào mạch máu (VCAM-1), phân tử bám dính tế bào (ICAM-1), plasminogen-activator-inhibitor-1 (PAI-1), tăng mức GPX SOD [44] 7.6 Hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ gan (Hepatoprotective Activity) Nhiễm trùng huyết, sốc hẹp động mạch thận vấn đề lâm sàng suy thận cấp, thường liên quan đến tỷ lệ tử vong cao Chấn thương tái tưới máu thiếu máu cục (I-R) gây tổn thương tế bào, chết tế bào, hoại tử mô, rối loạn chức đa quan tăng tính thấm mạch máu Những loại trình sinh lý bệnh bao gồm RNS, ROS, bạch cầu trung tính, cytokine, tiểu cầu, hệ thống đơng máu, nội mơ kích hoạt hệ thống enzyme xanthine oxidoreductase Trong chấn thương IR, tế bào chết xảy apoptosis hoại tử [45] RA điều chỉnh q trình peroxid hóa lipid, sản xuất ROS, hình thành peroxynitrite, yếu tố bổ sung chất trung gian gây viêm, chẳng hạn cytokine chemokine Các q trình có liên quan đến bệnh gan Mặt khác, RA liều 150 mg/kg điều trị chuột I-R, làm giảm mức độ peroxid hóa lipid nitro tyrosine, tăng hàm lượng GSH giảm thâm nhiễm bạch cầu trung tính, tổn thương tế bào gan tất dấu hiệu stress oxy hóa nitrat hóa Nó có tác dụng chống viêm tác dụng chống oxy hóa gan thiếu máu cục bộ, bảo vệ tế bào gan khỏi tổn thương thiếu máu cục [46] Hơn nữa, RA mang lại bảo vệ rõ rệt chống lại stress oxy hóa thơng qua việc tăng CAT hàm lượng GPx, ngăn ngừa gan nhiễm mỡ Các dẫn xuất RA khác báo cáo có tác dụng chống tiết chống lt mơ biểu mơ, có khả chữa lành vết loét dày RA làm giảm đáng kể độc tính gan, bao gồm alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), peroxid hóa lipid nồng độ glutathione bị oxy hóa cải thiện tác dụng chống oxy hóa enzyme GPx, CAT SOD Sự cải thiện rõ rệt dấu ấn huyết gan mô học giảm trình viêm ghi nhận sau dùng RA với liều 10, 25 50 mg/kg qua ống thông lần ngày hai ngày liên tiếp để chống lại hoại tử gan CCl4 gây Hơn nữa, RA ngăn chặn biểu Actin trơn (α-SMA) biến đổi yếu tố tăng trưởng β1 (TGF-β1), cho thấy 16 ức chế phản ứng chức [47] Thụ thể kích hoạt peroxisome γ (PPARγ) yếu tố quan trọng để phân biệt HSC ức chế biểu sinh dẫn đến kích hoạt HSC RA ức chế tín hiệu biểu HSC đường truyền tín hiệu WNT ngăn chặn tiến triển kích hoạt xơ hóa gan [48] 7.7 Tiềm chống trầm cảm Tác dụng RA liều 0, 3, 10 30 mg/kg nghiên cứu chuột C57BL/6 60 phút trước tiêm pilocarpine (300 mg/kg) pentylenetetrazol (PTZ, 60 mg/kg) Thời gian co giật toàn thể độ trễ co giật toàn thể giật cơ phân tích điện não đồ (EEG) phương pháp hành vi Tác dụng liều RA cấp tính chuột đánh giá qua hành vi trường mở, rotarod, nhận dạng đối tượng thử nghiệm bơi bắt buộc Trong mô hình PTZ, RA tăng phụ thuộc vào liều lượng động kinh toàn thể độ trễ giật cải thiện độ trễ giật pilocarpine gây Ngoài ra, RA (30 mg/kg) cải thiện thời gian sân trống, số lần băng qua thời gian bất động kiểm tra bơi cưỡng [49] Rối loạn tâm trạng toàn giới dạng bệnh tâm thần phổ biến trường hợp bệnh tật Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), trầm cảm nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn giới Trầm cảm rối loạn tâm trạng mãn tính, có khả đe dọa tính mạng tái phát, ước tính ảnh hưởng đến khoảng 21% dân số giới Sử dụng RA (10 mg/kg, hàng ngày) bị căng thẳng mãn tính Chuột Sprague Dawley thay đổi hành vi trầm cảm chuột tiếp xúc với phương thức căng thẳng bốc đồng phục hồi yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não vùng đồi thị (BDNF) biểu protein pERK1/2 Do đó, RA hình thành phân tử tuyệt vời điều trị trầm cảm kích hoạt thay đổi mức BDNF tín hiệu ERK11/2 khoa học dược lý [50] rong tế bào PC 12, RA cho thấy tác dụng gây suy nhược thần kinh đáng kể cải thiện chức cholinergic tương quan với đường truyền tín hiệu ERK1/2 MAPK RA gây điều chỉnh tăng rộng rãi pyruvate carboxylase (PC) tyrosine hydroxylase (TH), liên quan đến điều hòa đường serotonergic, GABAergic dopaminergic, chống lại độc tính corticosterone gây ra, cung cấp bảo vệ tế bào thần kinh [51] Kết luận Với tác dụng sinh học quý báu tiềm ứng dụng điều trị số bệnh lý RA mà nghiên cứu khoa học gọi quà mẹ thiên nhiên mang lại Đây mảnh đất đầy hứa hẹn dành cho khoa học ứng dụng mà nhà khoa học đặt móng Trên tóm tắt từ số lượng nhỏ kết nghiên cứu RA, chưa đầy đủ đưa góc nhìn tương đối tồn diện mà nhà khoa học đóng góp cho nghiên cứu 17 Tài liệu tham khảo [1] Scarpati, M.L.; Oriente, G., "Isolamento e costituzione dell’acido rosmarinico (dal rosmarinus off.)," Rice Science, vol 28, p 2329–2333, 1958 [2] Baliga, M.S.; Jimmy, R.; Thilakchand, K.R.; Sunitha, V.; Bhat, N.R.; Saldanha, E.; Rao, S.; Rao, P.; Arora, R.;, "Ocimum sanctum L (Holy Basil or Tulsi) and its phytochemicals in the prevention and treatment of cancer," Nutr Cancer, vol 65, no 1, pp 26-35, 2013 [3] Ngo, S.N.; Williams, D.B.; Head, R.J., "Rosemary and cancer prevention: preclinical perspectives," it Rev Food Sci Nutr, vol 51, no 10, pp 946-54, 2011 [4] "European and Mediterranean Plant Protection Organization," [Online] Available: http://gd.eppo.int [Accessed 10 11 2023] [5] Zhenghong Li, Xiaonan Wang, Haoran Zhang, "Balancing the non-linear rosmarinic acid biosynthetic pathway by modular co-culture engineering," Metabolic Engineering, vol 54, pp 1-11, 2019 [6] Eszter Trócsányi, Zsuzsanna Grgy, Éva Zámboriné-Németh, "New insights into rosmarinic acid biosynthesis based on molecular studies," Current Plant Biology, vol 23, p 100162, 2020 [7] Keyvan Dastmalchi, H.J Damien Dorman, Into Laakso, Raimo Hiltunen, "Chemical composition and antioxidative activity of Moldavian balm (Dracocephalum moldavica L.) extracts," LWT - Food Science and Technology, vol 40, no 9, pp 1655-1663, 2007 [8] André Wüst Zibetti, Abdelkarim Aydi, Mayra Arauco Livia, Ariovaldo Bolzan, Danielle Barth, "Solvent extraction and purification of rosmarinic acid from supercritical fluid extraction fractionation waste: Economic evaluation and scale-up," The Journal of Supercritical Fluids, vol 83, pp 133-145, 2013 [9] Beatrix Sik, Erika Lakatos Hanczné, Viktória Kapcsándi, Zsolt Ajtony, "Conventional and nonconventional extraction techniques for optimal extraction processes of rosmarinic acid from six Lamiaceae plants as determined by HPLC-DAD measurement," J Pharm Biomed Anal, vol 184, p 113173, 2020 [10] Ge Zu, Rongrui Zhang, Lei Yang, Chunhui Ma, Yuangang Zu, Wenjie Wang and Chunjian Zhao, "Ultrasound-Assisted Extraction of Carnosic Acid and Rosmarinic Acid Using Ionic Liquid Solution from Rosmarinus officinalis," International Journal of Molecular Sciences, vol 13, no 9, pp 11027-11043, 2012 [11] Tingting Liu, Xiaoyu Sui, Rongrui Zhang, Lei Yang, Yuangang Zu, Lin Zhang, Ying Zhang, Zhonghua Zhang, "Application of ionic liquids based microwave-assisted simultaneous extraction of carnosic acid, rosmarinic acid and essential oil from Rosmarinus officinalis," Journal of Chromatography A, vol 1218, no 47, pp 8480-8489, 2011 18 [12] Karthikkumar Venkatachalam, Sivagami Gunasekaran, Nalini Namasivayam, "Biochemical and molecular mechanisms underlying the chemopreventive efficacy of rosmarinic acid in a rat colon cancer," Eur J Pharmacol, vol 791, pp 37-50, 2016 [13] Jinjun Wu, Yuanfeng Zhu, Fangyuan Li, Guiyu Zhang, Jian Shi, Rilan Ou, Yunli Tong, Yuting Liu, Liang Liu, Linlin Lu, Zhongqiu Liu, "Spica prunellae and its marker compound rosmarinic acid induced the expression of efflux transporters through activation of Nrf2mediated signaling pathway in HepG2 cells," J Ethnopharmacol, vol 193, pp 1-11, 2016 [14] ching-fen Wu, Chunlan Hong, Sabine M Klauck, Yun-Lian Lin, "Molecular mechanisms of rosmarinic acid from Salvia miltiorrhiza in acute lymphoblastic leukemia cells," Journal of Ethnopharmacology, vol 176, pp 55-68, 2015 [15] Yichun Xu, Shuai Han, Kesheng Lei, Xinnan Chang, Ke Wang, Zhou Li, Jianwen Liu, "AntiWarburg effect of rosmarinic acid via miR-155 in colorectal carcinoma cells," Eur J Cancer Prev, vol 25, no 6, pp 481-489, 2016 [16] Shuai Han, Shaohua Yang, Zhai Cai, Dongyue Pan, Zhou Li, Zonghai Huang, Pusheng Zhang, Huijuan Zhu, Lijun Lei, and Weiwei Wang, "Anti-Warburg effect of rosmarinic acid via miR-155 in gastric cancer cells," Drug Design, Development and Therapy, vol 9, pp 2696-2703, 2015 [17] Philipp Saiko, Marie-Thérèse Steinmann, Heike Schuster, Geraldine Graser, Sabine Bressler, Benedikt Giessrigl, Andreas Lackner, Michael Grusch, Georg Krupitza, Zsuzsanna BagoHorvath, Walter Jaeger, Monika Fritzer-Szekeres, Thomas Szekeres, "Epigallocatechin gallate, ellagic acid, and rosmarinic acid perturb dNTP pools and inhibit de novo DNA synthesis and proliferation of human HL-60 promyelocytic leukemia cells: Synergism with arabinofuranosylcytosine," Phytomedicine, vol 22, no 1, pp 213-222, 2015 [18] Sook-Kyoung Heo, Eui-Kyu Noh, Dong-Joon Yoon, Jae-Cheol Jo, SuJin Koh, Jin Ho Baek, Jae-Hoo Park, Young Joo Min, Hawk Kim, "Rosmarinic acid potentiates ATRA-induced macrophage differentiation in acute promyelocytic leukemia NB4 cells," Eur J Pharmacol, vol 15, pp 36-44, 2015 [19] Venkatachalam Karthikkumar, Gunasekaran Sivagami, Periyasamy Viswanathan, Namasivayam Nalini, "Rosmarinic acid inhibits DMH-induced cell cell proliferation in experimental rats," J Basic Clin Physiol Pharmacol, vol 26, no 2, pp 185-200, 2015 [20] Hong Li, Yuefeng Zhang, Hsiao-Huei Chen, En Huang, Hailin Zhuang, Dan Li, and Feng Ni, "Rosmarinic acid inhibits stem-like breast cancer through hedgehog and Bcl-2/Bax signaling pathways," Pharmacognosy Magazine, vol 15, no 65, pp 600-606, 2019 [21] Zhong-Nan Hu, Li-Juan Huang, Wei-Ping Chen, "The inhibitory effects of rosmarinic acid on catabolism induced by IL-1β in rat chondrocyte," Acta Biochim Pol., vol 65, no 4, pp 535-538, 2018 [22] Jeehee Youn, Kyung-Hee Lee, Jonghwa Won, Sung-Jin Huh, Hye-Sun Yun, Won-Gil Cho, Doo-Jin Paik, "Beneficial effects of rosmarinic acid on suppression of collagen induced arthritis," J Rheumatol., vol 30, no 6, pp 1203-1207, 2003 19