Xác định đột biến gen col1a1, col1a2 gây bệnh tạo xương bất toàn (osteogenesis imperfecta)

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đột biến gen xác định nguyên nhân gây nên nhiều bệnh, đặc biệt bệnh lý di truyền rối loạn chuyển hóa Những tổn thương gen thường xảy sớm Các tổn thương thông qua chế điều hòa gen mối tương tác gen với gen với phân tử nội bào mối tương tác tế bào - tế bào mà biểu thành thể bệnh nặng, nhẹ khác Các nhà khoa học giới sâu tìm hiểu chế gây đột biến kết cho thấy: chế gây đột biến gen phức tạp, họ c kiểu/dạng đột biến đa dạng phong phú tùy thuộc vào thể bệnh, mức độ nhẹ có khơng đặc hiệu với chủng tộc Trong giai đoạn Y chưa thể sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để can thiệp n sĩ nhằm ngăn ngừa phát sinh đột biến với bệnh lý cụ thể tiế nhà khoa học hồn tồn xác định xác đột biến cách án sớm để đưa giải pháp can thiệp kịp thời hay lời khuyên di truyền nhằm nâng cao hiệu điều trị phòng bệnh Lu ận Bệnh tạo xương bất tồn (osteogenesis imperfecta) cịn gọi bệnh xương thủy tinh hay bệnh giòn xương Hơn 90% bệnh tạo xương bất toàn di truyền trội nhiễm sắc thể thường Bệnh bao gồm nhiều thể lâm sàng có đặc điểm di truyền khác với tần suất mắc bệnh 1/15.000÷1/25.000 [1],[2],[3] Nguyên nhân bệnh đột biến gen tổng hợp collagen týp I dẫn đến thiếu hụt bất thường cấu trúc phân tử collagen týp I gây nên giòn xương, giảm khối lượng xương bất thường mô liên kết Collagen týp I loại protein chiếm ưu chất khoảng gian bào hầu hết mơ, tìm thấy xương, màng bọc quan, giác mạc, củng mạc mắt, cân dây chằng, mạch máu, da, màng não, thành phần ngà chiếm 30% trọng lượng thể Vì vậy, bị khiếm khuyết chất ngoại bào, bệnh không biểu bất thường xương mà bất thường tổ chức khác củng mạc mắt màu xanh, tạo bất tồn, giảm thính lực… [4],[5] Bệnh tạo xương bất toàn gây đau đớn, tàn phế suốt đời cho trẻ mặt thể chất lẫn tâm thần với thể bệnh nhẹ Cịn với thể bệnh nặng gây tỷ lệ tử vong cao Cho đến nay, chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu bệnh tạo xương bất toàn Chủ yếu điều trị triệu chứng, giảm đau, giảm gãy xương tái phát với mục đích giảm đến mức tối đa tỷ lệ tàn tật suy giảm chức năng, giúp cải thiện chất lượng sống cho bệnh nhân [6],[7] Các nhà khoa học phát rằng, khoảng 90% trường hợp bệnh tạo xương bất c toàn gây nên đột biến gen COL1A1 COL1A2 [8] Từ đến nay, họ khoảng 300 dạng đột biến khác COL1A1 COL1A2 phát Y hiện, đột biến phổ biến mô tả Dalgleish cộng sĩ năm 1997 thay đổi acid amin glycin thành acid amin khác Các tiế n đột biến không tập trung vùng trọng điểm (hotspot) mà rải rác khắp chiều dài gen q trình phân tích gen tìm đột biến tương đối khó án khăn [9],[10],[11],[12] Bằng kỹ thuật phân tích gen kết phân tích gen Lu ận tiền đề quan trọng giúp chẩn đoán trước sinh đối tượng có nguy cao sinh bị bệnh tạo xương bất toàn để đưa tư vấn di truyền giúp ngăn ngừa làm giảm tỉ lệ mắc bệnh [13],[14] Các nghiên cứu bệnh tạo xương bất tồn Việt Nam cịn ít, chủ yếu nghiên cứu mặt lâm sàng bệnh viện Nhi Trung ương nên số lượng nghiên cứu bệnh tạo xương bất tồn chưa nhiều, thơng tin cịn hạn chế Xuất phát từ thực tiễn đó, nghiên cứu tiến hành nhằm mục tiêu: Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 bệnh nhân mắc bệnh tạo xương bất toàn Xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 bố mẹ bệnh nhân phát đột biến gen COL1A1 COL1A2 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tạo xƣơng bất toàn 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn giới Theo nghiên cứu Lowenstein E.J Ai Cập bệnh tạo xương bất tồn xuất từ 1.000 năm trước cơng ngun (hình 1.1), [15] Tuy nhiên đến năm 1788, mô tả khoa học bệnh tạo xương bất toàn Olaus Jakob Ekman đưa Năm 1833, Lobstein mô tả trường hợp bệnh c đầu tiên, bệnh nhân nữ 35 tuổi đến bệnh viện New Sussex biến họ dạng cột sống từ 10 tuổi, phát củng mạc mắt xanh dần Y 8÷10 năm, đau lưng trước vài tháng, điếc tai phải năm sau sĩ điếc tai trái Bệnh nhân bị gãy xương cánh tay trái lúc 12 tuổi bị ngã tiế n trường sau thời gian ngắn lại bị gãy xương trụ trái hai lần liên tiếp án ngã Khi đến khám, bệnh nhân cao 1,5 m; yếu ớt, điếc, gãy nhiều trên, cửa hàm nhỏ mảnh, men xấu, biến dạng cột sống, biến Lu ận dạng xương dài hộp sọ, ngón tay vận động mức Bệnh nhân chẩn đốn bệnh “osteopsathyrosis”, bệnh tạo xương bất tồn hay bệnh Lobstein [16] Sau Lobstein mô tả trường hợp bệnh này, nhiều trường hợp có biểu bệnh tương tự báo cáo Năm 1849, bệnh Vrolik mô tả gọi hội chứng Vrolik hay bệnh xương thủy tinh Trong kỷ XX, nhiều nghiên cứu báo cáo biến đổi lâm sàng mức độ nặng nhẹ khác bệnh tạo xương bất toàn Looser tiến hành phân loại bệnh lần vào năm 1906 Năm 1963 có 120 trường hợp bệnh báo cáo y văn, sau Silence đề xuất phân loại bệnh thành bốn týp vào năm 1979 [17] Tuy chỉnh sửa nhiều lần cách phân loại áp dụng Tên gọi bệnh tạo xương bất toàn xác định từ năm 1985 sử dụng đến ngày [18] Hình 1.1 Phần cịn lại xƣơng trẻ bị tạo xƣơng bất tồn với hình ảnh xƣơng sọ Tam O’Shanter, tạo bất toàn, xƣơng mỏng biến dạng [15] họ c 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo q trình chuyển hóa xương sĩ Y 1.1.2.1 Cấu tạo xương tiế n Bộ xương người có khoảng 80% xương đặc (cortical bone) 20% xương xốp (trabecular bone) Tuy nhiên, bề mặt xương đặc chiếm khoảng 1/5 án bề mặt xương xốp Do đó, phương diện chuyển hóa, xương xốp hoạt Lu ận hóa (active) xương đặc Tỷ lệ chuyển hóa xương (remodeling) xương xốp khoảng 20% đến 30% tỷ lệ cho xương đặc từ 3% đến 10% Cấu tạo xương gồm có thành phần hữu vô Thành phần hữu chiếm 35% bao gồm chất tạo keo, glucoprotein, phosphoprotein, mucopolysacarid glycosaminoglycan (GAG) lipid Thành phần vô chiếm 65% gồm chủ yếu tinh thể hydroxyapatit (Ca.10(PO4).6(OH)2) có tính chất vật lý gốm sứ thành tố quan trọng calci Tại vị trí xương, quy trình chu chuyển xương (xương bị đào thải thay xương mới) xảy khoảng ba năm lần Khối xương (bone mass) tích lũy nhanh độ tuổi dậy đạt mức độ tối đa vào khoảng tuổi 20 đến 30 Độ khác biệt khối xương cá nhân dao động khoảng 10% đến 20% Phần lớn độ khác biệt khối xương cao (peak bone mass) yếu tố di truyền định Việc giảm chất xương ảnh hưởng đến xương xốp xương đặc Điều thay đổi hoàn toàn cấu trúc xương Tuy nhiên, thành phần cấu tạo hóa học xương khơng thay đổi [19],[20],[21],[22],[23] 1.1.2.2 Q trình chuyển hóa xương c Xương khơng phải vật chất "chết" mà trái lại có hoạt động chuyển hóa họ tích cực gồm hai q trình tạo xương hủy xương với tham gia tế bào sĩ Y tạo xương gọi tạo cốt bào tế bào hủy xương gọi hủy cốt bào Hai n trình diễn song song suốt đời Ở trẻ em, trình tạo tiế xương hoạt động mạnh trình hủy xương Khi trưởng thành, án điều kiện bình thường, hai trình tạo xương hủy xương hoạt động nhịp Lu ận nhàng bổ sung cho Khối lượng xương đào thải luôn với khối lượng xương tạo Để đạt quân bình này, hệ thống sinh học gồm hormon yếu tố trung gian phải tương tác với môi trường điều khiển hàng trăm gen Các hormon bao gồm hormon cận giáp, vitamin D hormon thuộc steroid Các yếu tố trung gian tham gia vào việc kiểm sốt q trình tạo xương hủy xương bao gồm cytokin yếu tố tăng trưởng (hình 1.2), [19],[20],[23],[24],[25] họ c Y Hình 1.2 Chu kỳ tái tạo xƣơng (nguồn: Roche, 1998) sĩ Q trình chuyển hóa bình thường xương giúp trì ổn định cấu tạo tiế n xương bao gồm khoáng chất, khung hữu cơ, tế bào án nước Thành phần khống chất chiếm khoảng 2/3 tổng trọng lượng khơ, chủ yếu apatit calci Khung hữu chiếm khoảng 35% trọng lượng Lu ận xương, collagen týp I chiếm khoảng 90% Phần lớn dấu ấn sinh học trình hủy xương sản phẩm thối hóa collagen týp I Cấu trúc collagen týp I gồm ba chuỗi polypeptid xoắn ốc (hai chuỗi α1 chuỗi α2) Các phân tử collagen nối liên kết chéo pyridinium Prolin hydroxyl hóa phần thành hydroxyprolin Cuối cùng, chuỗi phụ chứa nitơ prolin lysin tác dụng lysyl oxidase hình thành vịng pyridinium Nhờ mà hình thành mạng lưới chặt chẽ phân tử collagen týp I (hình 1.3) Những biến đổi thành phần cấu trúc chức collagen týp I làm rối loạn cấu tạo q trình chuyển hố xương gây nên bệnh lý xương Đó bệnh lý phát sinh đời sống bệnh di lý truyền qua hệ gây nên đột biến gen Trong đột biến gen COL1A1 COL1A2 gây thiếu hụt bất thường cấu trúc phân tử collagen týp I gây nên bệnh tạo xương bất toàn với đặc điểm giòn xương, giảm khối lượng xương bất thường tiế n sĩ Y họ c mô liên kết, [26] án Hình 1.3 Cấu trúc collagen trƣởng thành týp I (nguồn: Roche, 1998) Cho đến nay, nhiều cơng trình nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn Lu ận thực nhiều quốc gia giới Cơ chế phân tử, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng dần sáng tỏ Các phương pháp điều trị, chăm sóc nhằm hạn chế tiến triển bệnh nâng cao chất lượng sống người bệnh hướng dẫn phổ biến cách rộng rãi 1.1.3 Lâm sàng phân loại bệnh tạo xương bất toàn Biểu lâm sàng phụ thuộc vào týp bệnh tạo xương bất toàn Tùy theo người, bệnh tạo xương bất toàn biểu nhẹ nghiêm trọng Xương bị giòn, dễ gãy đặc điểm người mắc bệnh tạo xương bất toàn Một số biểu người mắc bệnh tạo xương bất toàn xương tạo bất thường, người thấp, bé Khớp lỏng lẻo Củng mạc mắt có màu xanh da trời màu xám Khn mặt có hình tam giác Lồng ngực hình thùng Cong vẹo cột sống Răng bị giòn, dễ gãy (tạo bất tồn) Giảm thính lực Bất thường kết cấu da (da nhẵn mịn mỏng) Những dấu hiệu đặc trưng khác phổ biến nhiều týp bệnh chảy máu tạng (dễ gây nên vết thâm tím) suy hơ hấp Sillence cộng (1979) chia bệnh tạo xương bất toàn thành bốn týp [17]: 1.1.3.1 Týp I: thể nhẹ hay gặp Người bệnh có tầm vóc bình thường tương đối bình thường, có biểu yếu cơ, cột sống bị cong, củng mạc mắt có màu xanh hay màu tím, gãy xương thường xảy trước tuổi dậy 1.1.3.2 Týp II: thể nặng Bệnh nhân thường chết sau sinh c sống thời gian ngắn rối loạn chức hô hấp (thiểu họ sản phổi, gãy xương sườn), người bệnh có vóc dáng nhỏ, gãy nhiều xương Y 1.1.3.3 Týp III: thể tương đối nặng, trẻ thường sinh có gãy xương sĩ Củng mạc mắt thường trắng có màu xám, màu xanh, giảm chức n hơ hấp, giảm thính lực bất thường án mức nhẹ đến trung bình tiế 1.1.3.4 Týp IV: thể trung gian týp I III Các biến dạng xương Lu ận Xếp theo thứ tự từ nhẹ đến nặng týp I, týp IV, týp III, týp II Một số nghiên cứu phân loại bệnh tạo xương bất toàn làm 11 týp [7], [27],[28],[29],[30],[31] Thể bệnh tạo xương bất toàn phân loại tùy theo mức độ nghiêm trọng bệnh Đột biến gặp 60% dạng bệnh nhẹ (chiếm nửa ca bệnh tạo xương bất toàn) bao gồm: bệnh tạo xương bất toàn loại cổ điển- không biến dạng (classic – non deforming) với củng mạc mắt màu xanh Hoặc bệnh tạo xương bất toàn thuộc loại biến thể phổ biến (common variable) với củng mạc mắt bình thường Hầu hết (100%) bệnh tạo xương bất toàn chết chu sinh (perinatally lethal osteogenesis imperfecta) Gần 100% loại bệnh tạo xương bất toàn tiến triển dạng tăng dần (progressively deforming osteogenesis imperfecta) đột biến Hình 1.4 Hình ảnh bất thƣờng xƣơng bệnh nhân tạo xƣơng bất tồn c Hình ảnh đột biến gen tổng hợp collagen týp I ảnh hưởng lên cấu trúc xương Lu ận án tiế n sĩ Y họ gây giịn xương làm xương dễ gãy Hình 1.5 Hình ảnh củng mạc mắt màu xanh bệnh nhân tạo xƣơng bất tồn Hình ảnh đột biến gen tổng hợp collagen týp I ảnh hưởng lên củng mạc mắt biểu củng mạc mắt màu xanh Hình 1.6 Hình ảnh tạo bất tồn bệnh nhân tạo xƣơng bất tồn Hình ảnh đột biến gen tổng hợp collagen týp I ảnh hưởng lên trình tạo 10 Bảng 1.1 Đặc điểm bệnh tạo xƣơng bất toàn [17] Týp I II-A II-B Trội Trội Trội/lặn NST NST NST thường thường thường Tử vong Nghiêm trước sinh trọng III IV Đặc điểm Di truyền Mức độ Nhẹ NST thường Trội/lặn NST thường Nhẹ vừa Vừa Thường xuyên Hiếm gặp Nặng vừa Nhẹ vừa c nghiêm trọng Trội/lặn Có Có Hiếm gặp Rất nặng Xanh Đen Nặng Bình Đặc biệt Đen Đặc biệt Xanh/ xám/ trắng Rất nhỏ thường nhỏ nhỏ Lu ận án Tầm vóc tiế Củng mạc mắt n sĩ Biến dạng xương Không Y bẩm sinh họ Gãy xương Có Có Có Chưa rõ Chưa rõ Phổ biến Sự dịch chuyển khớp Có 60% Mất chức nghe trường hợp Bình thường Nhỏ có thay đổi Có thể 42% trường hợp Tạo bất tồn Có thể Chưa rõ Chưa rõ Có Có thể Biến chứng hơ hấp Khơng Có Có Có Khơng Khơng Chưa rõ Chưa rõ Có Khơng Biến chứng thần kinh Bảng 1.1 trình bày khác số đặc điểm di truyền, mức độ nghiêm trọng bệnh mức độ biểu khác số triệu chứng bệnh tạo xương bất toàn týp khác PHỤ LỤC Bảng Trình tự mồi khuếch đại gen COL1A1 STT Exon 5’UTR Exon 10 11 5’UTP2_P2 GAGTCTCCGGATCATCCACGT CGAGGTTGGGGTTGAACG E1_P2 CCGGGTCTAAGAGGCACACT Exon E2-5_P1 CAGGTGGGCATGGCTCTC 2-5 E2-5_P2 TCCTGTAGGATTCTTGCAACT Exon E6-9_P1 CACACCAGGAAGTGCATG 6-9 E6-9_P2 CTGAGTATCGTTCCCAAATGT Exon E10-14_P1 CTGACCTGCAACAATCC 10-14 E10-14_P2 CCCGTTAAGTCCACTGAGCAC Exon E15-18_P1 GATCCCTGAGCTCTGGAAGGG 15-18 E15-18_P2 CTCCTCTTCCTTTCCGGATTTC E19-23_P1 TAAGTATCCTGCCAGGCTTCA (bp) 320 1227 283 họ Y 968 sĩ n 19-23 E19-23_P2 TAGGGAGGCAGAGAGGTATGA Exon E24-25_P1 GTCTGGGATGAGGCGTTCTGG 24-25 E24-25_P2 TAGGGAGGCTGAGGTCCAGAA Exon E26-29_P1 AGGGCCCAGCAAGAAGCACCT 26-29 E26-29_P2 TGGCTGTCTGATTAGCTAGGA Exon E30-32_P1 CAGACCCCAGGAGGAAGGACC E30-32 E30-32_P2 GATTCAAAGCAGGCAAGAATG Exon E33-38_P1 CCTCTCAGGAAACCCAGACAC 33-38 E33-38_P2 GACATAGGAACAGTCAGAGG Exon Kích thƣớc c E1_P1 tiế 5’UTP2_P1 GACGGGAGTTTCTCCTCGGGG án Trình tự mồi Lu ận Tên mồi 1124 1326 1248 491 818 794 1268 CCTGCCTGGGTGAAGTCCGAC Exon E42-45_P1 GCGGAGCCAAGGAGAACAGAT 42-45 E42-45_P2 TCGCCCTGTTCGCCTCTTCTCA Exon E46_P1 GTCCTGTCGGCCCTGTT 46 E46_P2 CAGAGAGGGAAGAGAGTGGG Exon E47-49_P1 GCTGGGGTTGCGGGCT 47-49 E47-49_P2 CATGTCCCTTCTGAGCACTGG Exon E50-51_P1 GGACCCTGGACAGGGAGGCC 50-51 E50-51_P2 CAGTTTGGGTTGCTTGTCTGT Y họ c E39-41_P2 sĩ 16 39-41 n 15 GAGTATCACCCGCCTCTCTGT tiế 14 E39-41_P1 án 13 Exon Lu ận 12 1421 1174 1203 927 679 Bảng Trình tự mồi khuếch đại gen COL1A2 Kích STT Exon Tên mồi Trình tự mồi thƣớc (bp) E4_P2 GCTTCTTCTGCAGTGCATTACCT E5_P1 TCCACCCTACTTGCACATAGAAAGG E5_P2 GACAGGGCTCACAAAGAGAATGCG E6_P1 GGGAAGTTCTCCATTTCAAAGAGGTGT E6_P2 GCTAAATAAATGGCGTGGTAAAATGTGA Exon E7-9_P1 GTCTGACCCCAGCCAACACCAT 7-9 E7-9_P2 11 1088 294 họ Y 385 sĩ n tiế Exon 491 c CATTGTAGTTACATCAGTCTTACC 10 ATGGGTGCCATACTTTTGACCTGC E4_P1 Exon CTGAGAGTCTGCCCTCCAAGTGTA CAAGTCTTTTTTTTTCCTTTTGTATGTA E1_P2 E2-3_P2 Exon CCCCCATTCGCTCCCTCCT Exon 2- E2-3_P1 E1_P1 án Exon CCACGGATTTGAAAGTCAGTATATGT Lu ận Exon E10-12_P1 CAGCAAGCATACCATAAGCAAC 10-12 E10-12_P2 GAGGTCATGCGGAATTTCAATCA Exon E13-16_P1 GAATCTAAGGGAGAAATTGGGGAGGA 13-16 E13-16_P2 AACACAGTTCCAATCTTTCACATCACA Exon E17-19_P1 TGCAGATAAAGAGATAATTACGAAACA 17-19 E17-19_P2 TGTTGAAACTCTCTTGCAGACAA Exon E20-23_P1 CTTGAGCTTCTCTTTACCTTGAC 20-23 E20-23_P2 TAAAGAAGGAAGTAATGCCAGGTGTGA Exon E24-26_P1 AAAAAGTCGGGGGAAAAGGTGCCTT 24-26 E24-26_P2 AGTGTGGTTCTTAGATGAATGCTATGTGA 374 1346 833 1316 1304 1073 1229 14 15 E27-29_P2 TGGCTCATTCTCTCCATCAGCAC Exon E30-31_P1 TGCACTCATGTAGATACTGCCAGGT 30-31 E30-31_P2 GGTCCACTGGAATCGGATTGCTGTT Exon E32-33_P1 TCTCCCTCCTTTCAATAGCCCAGCC 32-33 E32-33_P2 TTGACACTAGGAAGTTAGAAAATTCGGAT Exon E34-37_P1 FFAFTACCCTCCTTCTGAGAGTGGC 34-37 E34-37_P2 ACCACCCTTATGAGGTTATCAG Exon E38-39_P1 TGCGGGAATGATCCACTTGAAGAAA 38-39 E38-39_P2 GAAAAGCTGACTTCAGACCAGGAG Exon E40_P1 CATAAAGGAAGACAGGAGTTGC 40 E40_P2 CATCAACAAATAGATGCCACTTG 815 1557 1221 1475 1167 sĩ Y 16 27-29 c 13 E27-29_P1 CTTTGAGACATCTTAAACTACCTGCTT họ 12 Exon 19 20 21 22 448 tiế E41-42_P1 CTCACAATCTTCAAGCCAACCTGTG 41-42 E41-42_P2 AAAGCCCATTCTTTGGCCTAAGCAA Exon E43-45_P1 AGGGTTCGTTACTGAGCATG 43-45 E43-45_P2 TGAAAATCCTTCTGAGCTGAAGGCC Exon E46-48_P1 GCAGATTACCAGCAGAGGTGAGAGC 46-48 E46-48_P2 TGGGGCTAACTTTAATGGGGTTGTC Exon E49-50_P1 GAACATGCTTCCGTGTGAAGCTC 49-50 E49-50_P2 GTCCAATCAATCCATCTTCTAATGTG Exon E51-52_P1 CCCTTTTCCTAAGCTTGGATCTGAG 51-52 E51-52_P2 TTGCCCACAATTTAAGCAAGTAG án Exon Lu ận 18 n 17 1142 1098 1121 1472 782 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ HỒNG CHU ỏn ti n s Y h c XáC ĐịNH Đột biến gen col1a1, col1a2 gây bệnh tạo x-ơng bất toµn (osteogenesis imperfecta) Lu ận Chun ngành: Hóa sinh Mã số: 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Ng-êi h-íng dÉn khoa häc: GS.TS Tạ Thành Văn HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời cho phép xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới GS.TS Tạ Thành Văn, Phó Hiệu Trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, Trưởng Bộ mơn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen- Protein Trường Đại học Y Hà Nội người hướng dẫn khoa học, người thầy tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu để hồn thành luận án họ c Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Vân Khánh, Phó Y Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen- Protein Trường Đại học Y Hà Nội, sĩ người thầy định hướng, giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học án luận án ngày hôm tiế n tập, tạo thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài hồn thành Lu ận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Hà, người thầy giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: PGS.TS Phạm Thiện Ngọc, ngun Trưởng Bộ mơn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ q trình học tập hồn thành luận án Các CBVC Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để thực kỹ thuật nghiên cứu hoàn thành đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Bộ mơn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội - Ban Giám hiệu, Phòng ban chức năng, CBVC Bộ mơn Hóa sinh, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu - Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bệnh nhân tạo xương bất tồn giúp đỡ tơi có số liệu luận án họ c - Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ, động viên nhiều Y trình học tập sĩ Cuối cùng, tơi xin ghi nhớ cơng ơn sinh thành, ni dưỡng tình u n thương cha mẹ tôi, cha mẹ chồng ủng hộ, giúp đỡ, động viên tiế chồng, hai anh chị em gia đình, người bên Lu ận án tôi, chỗ dựa vững để yên tâm học tập hoàn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2015 NCS Bùi Thị Hồng Châu LỜI CAM ĐOAN Tôi Bùi Thị Hồng Châu, nghiên cứu sinh khóa 30 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn GS.TS Tạ Thành Văn Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam họ c Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sĩ Y sở nơi nghiên cứu Lu ận án tiế n Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Người viết cam đoan Bùi Thị Hồng Châu DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Osteogenesis imperfecta (tạo xương bất toàn) COL1A1 Collagen týp I alpha COL1A2 Collagen týp I alpha DNA Deoxyribonucleic acid cDNA Complementary deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid mRNA Messenger ribonucleic acid (RNA thông tin) NST Nhiễm sắc thể Kb Kilo base bp Base pair dNTP deoxyribonucleotide triphosphate ddNTP dideoxyribonucleotide triphosphate PCR Polymerase chain reaction Lu ận SDS họ Y sĩ n tiế án Reverse transcription PCR (PCR mã ngược) RT-PCR EDTA c OI Ethylendiamin tetraacetic acid Sodium dodecyl sulfate TE Tris - EDTA TBE Tris borate EDTA Ala: alanin Gly: glycin Pro: prolin Arg: arginin His: histidin Ser: serin Asn: asparagin Ile: isoleucin Stop: mã kết thúc Asp:aspartic Leu: leucin Thr: threonin Cys: cystein Lys: lysin Trp: tryptophan Gln: glutamin Met: methionin Tyr: tyrorin Glu: acid glutamic Phe: phenylalanin Val: valin MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tạo xương bất toàn 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh tạo xương bất toàn giới 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo trình chuyển hóa xương 1.1.3 Lâm sàng phân loại bệnh tạo xương bất toàn 1.1.4 Cận lâm sàng 11 1.1.5 Tần suất mắc bệnh tạo xương bất toàn 14 họ c 1.1.6 Di truyền học bệnh tạo xương bất toàn 14 Y 1.1.7 Chẩn đoán 16 sĩ 1.1.8 Điều trị bệnh tạo xương bất toàn 17 n 1.2 Cơ chế phân tử bệnh tạo xương bất toàn 20 tiế 1.2.1 Cấu trúc, chức protein collagen týp I 20 án 1.2.2 Vị trí, cấu trúc, chức gen COL1A1, COL1A2 23 1.3 Phương pháp phát đột biến gen COL1A1, COL1A2 30 Lu ận 1.3.1 Phương pháp PCR 30 1.3.2 Phương pháp giải trình tự gen 31 1.3.3 Kỹ thuật SSCP 33 1.4 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 33 1.4.1 Trên giới 33 1.4.2 Ở Việt Nam 34 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tượng nghiên cứu 35 2.1.1 Nhóm bệnh 35 2.1.2 Nhóm chứng 36 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ hóa chất 36 2.2.1 Trang thiết bị nghiên cứu 36 2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu 37 2.2.3 Hóa chất nghiên cứu 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu 40 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 40 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 41 2.3.3 Địa điểm nghiên cứu 41 2.3.4 Quy trình kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 41 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 49 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 3.1 Kết tách chiết DNA 50 3.2 Kết xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 nhóm bệnh nhân họ c tạo xương bất toàn 52 3.2.1 Kết xác định đột biến gen COL1A1 52 Y 3.2.2 Kết xác định đột biến gen COL1A2 61 sĩ 3.2.3 Kết đột biến gen COL1A1, COL1A2 63 tiế n 3.2.4 Kết điểm đột biến vùng exon, intron gen COL1A1, COL1A2 64 án 3.3 Kết xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 bố mẹ bệnh nhân Lu ận tạo xương bất toàn phát đột biến gen COL1A1 COL1A2 67 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 80 Kết tách chiết DNA 80 Kết xác định đột biến gen COL1A1, COL1A2 nhóm bệnh nhân tạo xương bất tồn 81 Kết xác định đột biến bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn phát đột biến gen COL1A1 COL1A2 96 KẾT LUẬN 108 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƢỢC CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm bệnh tạo xương bất toàn 10 Bảng 1.2 Đột biến gen COL1A1, COL1A2 bệnh nhân tạo xương bất toàn 29 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ độ tinh mẫu DNA tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân 51 Đột biến gen COL1A1 gen COL1A2 63 Bảng 3.3 Tỷ lệ đột biến exon intron gen COL1A1, COL1A2 64 Bảng 3.4 Các điểm đột biến vùng exon gen COL1A1, COL1A2 65 Bảng 3.5 Vùng intron xảy đột biến vị trí nối gen COL1A1, COL1A2 66 Bảng 3.6 Kết xác định vị trí đột biến gen COL1A1, COL1A2 67 Bảng 3.7 Đột biến gen COL1A1, COL1A2 bố mẹ bệnh nhân tạo xương n sĩ Y họ c Bảng 3.2 Lu ận án tiế bất toàn 79 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1.1 Tỉ lệ đột biến gen COL1A1 gây bệnh tạo xương bất toàn 26 Biểu đồ 3.1 Phân bố đột biến gen COL1A1 gen COL1A2 64 Biểu đồ 3.2 Phân bố điểm đột biến vùng exon gen COL1A1 Lu ận án tiế n sĩ Y họ c COL1A2 65 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Phần cịn lại xương trẻ bị tạo xương bất tồn với hình ảnh xương sọ Tam O’Shanter, tạo bất toàn, xương mỏng biến dạng Chu kỳ tái tạo xương Hình 1.3 Cấu trúc collagen trưởng thành týp I Hình 1.4 Hình ảnh bất thường xương bệnh nhân tạo xương bất tồn Hình 1.5 Hình ảnh củng mạc mắt màu xanh bệnh nhân tạo xương bất tồn Hình 1.6 Hình ảnh tạo bất toàn bệnh nhân tạo xương bất toàn Hình 1.7 Hình ảnh mơ bệnh học tạo xương bất tồn 12 Hình 1.8 Sự phân chia bè xương quan sát ánh sáng phân cực 13 Hình 1.9 Sự di truyền trội bệnh tạo xương bất toàn 15 n sĩ Y họ c Hình 1.2 tiế Hình 1.10 Hình ảnh siêu âm thai 20 tuần 17 án Hình 1.11 Cấu trúc phân tử collagen bình thường bất thường 21 Lu ận Hình 1.12 Vị trí gen COL1A1 cánh dài nhiễm sắc thể 17 23 Hình 1.13 Vị trí gen COL1A2 cánh dài nhiễm sắc thể 24 Hình 1.14 Cấu trúc gen COL1A1 24 Hình 1.15 Tỷ lệ đột biến gen gây bệnh tạo xương bất toàn 25 Hình 1.16 Vai trị protein hnRNPs SR q trình hồn thiện mRNA 28 Hình 1.17 Hình ảnh đột biến gen COL1A1 30 Hình 1.18 Các bước phản ứng PCR 31 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu Error! Bookmark not defined Hình 3.1 Kết xác định nồng độ độ tinh DNA bệnh nhân tạo xương bất toàn mã số OI32 máy Nano-Drop 50 Hình 3.2 Hình ảnh sản phẩm PCR đoạn gen từ exon 39 đến exon 41 gen COL1A1 52 Hình 3.3 Hình ảnh đột biến thay nucleotid G thành nucleotid T 54 Hình 3.4 Hình ảnh đột biến thay nucleotid G thành nucleotid A 55 Hình 3.5 Hình ảnh đột biến tạo mã kết thúc sớm 57 Hình 3.6 Hình ảnh đột biến nucleotid 58 Hình 3.7 Hình ảnh đột biến vị trí nối bệnh nhân mã số OI20 59 Hình 3.8 Hình ảnh đột biến vị trí nối bệnh nhân mã số OI43 60 Hình 3.9 Hình ảnh đột biến vị trí nối bệnh nhân mã số OI46 60 Hình 3.10 Hình ảnh sản phẩm PCR đoạn gen từ exon 46 đến exon 48 gen COL1A2 61 họ c Hình 3.11 Hình ảnh đột biến thay nucleotid C thành nucleotid T 62 Hình 3.12 Sơ đồ gia đình bệnh nhân mã số OI04, OI08 (trước phân tích gen) 68 sĩ Y Hình 3.13 Hình ảnh giải trình tự gen COL1A1 bố mẹ gia đình bệnh nhân n mã số OI04, OI08 69 tiế Hình 3.14 Sơ đồ gia đình bệnh nhân mã số OI04, OI08 (sau phân tích gen) 70 án Hình 3.15 Sơ đồ gia đình mã số OI20 (trước phân tích gen) 71 Lu ận Hình 3.16 Hình ảnh giải trình tự gen COL1A1 bố mẹ bệnh nhân mã số OI20 72 Hình 3.17 Sơ đồ gia đình mã số OI20 (sau phân tích gen) 73 Hình 3.18 Sơ đồ gia đình mã số OI43 (trước phân tích gen) 74 Hình 3.19 Hình ảnh giải trình tự gen COL1A1 bố mẹ bệnh nhân mã số OI43 75 Hình 3.20 Sơ đồ gia đình mã số OI43 (sau phân tích gen) 76 Hình 3.21 Sơ đồ gia đình mã số OI03 (trước phân tích gen) 77 Hình 3.22 Hình ảnh giải trình tự gen COL1A1 bố mẹ bệnh nhân mã số OI03 78 Hình 3.23 Sơ đồ gia đình mã số OI03 (sau phân tích gen) 79 4,6,7,9,12,13,15,17,21,23-26,28,30,31,40,50,52-62,64,65,68-79 1-3,5,8,10,11,14,16,18-20,22,27,29,32-39,41-49,51,63,66,67,80138 - 43