ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Rễ cốt khí củ được thu mua từ đường Hải Thượng Lãn Ông, Quận 5, Tp Hồ Chí Minh, với nguyên liệu được xác định thông qua hình ảnh và tài liệu tham khảo để đảm bảo chính xác Sau khi sơ chế, nguyên liệu được xay nhuyễn thành bột thô và được bảo quản trong bao nylon kín để giữ chất lượng.
2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm
Vi sinh vật thử nghiệm do Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, khoa Dược, Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh lưu trữ và cung cấp
Bảng 2.1 Các vi si sinh vật thử nghiệm
Stt Tên vi sinh vật Mã số
2 Meticilline - resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300
3 Meticilline - susceptible Staphylococcus aureus ATCC 29213
2.1.3 Môi trường nuôi cấy và thử hoạt tính kháng vi sinh vật
Môi trường 1: Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
Môi trường 2: Tryptic Soy Agar (TSA)
Môi trường 3: Mueller hinton agar (MHA)
Bảng 2.2 Hóa chất, dung môi
Stt Hóa chất Xuất xứ
Pha dung môi ethanol (TT):
Để xác định độ cồn cần pha loãng, hãy cho lượng cồn cần pha vào ống đong 250 ml Sau đó, nhẹ nhàng thả cồn kế vào ống và để yên trong 2 phút Cuối cùng, đọc và ghi lại các kết quả.
18 nhiệt độ trên nhiệt kế, độ cồn biểu kiến trên cồn kế Độ cồn biểu kiến ≥ 56 %, tra bảng Gay – Lussac
Tính lượng cồn cao độ cần dùng X = p x b-c a-c x: Thể tích cồn cao độ cần lấy (ml) p: Thể tích cồn cần pha (ml) a > b > c: Độ cồn thực (%)
Pha dung môi DMSO 10 % (TT):
Dung môi DMSO 10 % (TT) được pha từ dung dịch DMSO 100 % (TT) với dung môi pha loãng là nước cất
Pha 5 ml DMSO 10 % (TT): Dùng micropipet hút 4,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm có nắp Tiếp theo hút 0,5 ml DMSO 100 % (TT) cho vào ống nghiệm Lắc ống nghiệm cho DMSO 100 % (TT) phân bố đều
2.1.5 Dụng cụ, trang thiết bị
Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng
Stt Thiết bị Model Nguồn gốc
1 Bếp cách thủy HH – S6 Trung Quốc
2 Đèn UV254, UV365 CM - 10 Mỹ
3 Cân phân tích Sartorius Đức
4 Tủ hood BS - 122 Việt Nam
5 Lò hấp tiệt trùng Hirayama Nhật
6 Tủ vô trùng Esco AVC – 4A1 Mỹ
Các dụng cụ sử dụng: Bình lắng gạn, pipet, phễu, bình sắc ký, bản mỏng silicagel
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát sơ bộ thực vật học rễ cốt khí củ
2.2.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái rễ: Mô tả đặc điểm thực vật học dựa trên quan sát mẫu dược liệu đã chọn
2.2.1.2 Khảo sát cấu tạo vi học bột dược liệu: Nhận xét cảm quan và quan sát dưới kính hiển vi và so sánh với tài liệu
Dược liệu được cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ khoảng 60 độ C và nghiền thành bột mịn bằng máy xay Sau đó, bột được rây qua rây số 32; phần còn lại trên rây sẽ được tán và xay lại cho đến khi đạt độ mịn mong muốn Trước khi soi kính hiển vi, cần quan sát bột bằng cảm quan để đánh giá màu sắc, mùi vị và các đặc điểm khác.
Lên tiêu bản dược liệu:
Cho một giọt nước vào giữa phiến kính và dùng que sạch để trộn đều bột Lấy một ít bột cho vào giữa giọt nước, sau đó khuấy nhẹ bằng góc của lá kính để phân tán bột Dùng ngón tay trỏ di chuyển nhẹ trên lamelle để tách rời và phân tán đều các phân tử bột, đồng thời loại bỏ bọt khí Cuối cùng, dùng khăn giấy để loại bỏ phần bột và nước thừa bên ngoài lamelle, rồi lau sạch mặt lamelle và phiến kính trước khi quan sát dưới kính hiển vi.
2.2.1.3 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của bột dược liệu: Dùng phản ứng hóa học dựa theo phương pháp Ciuley để xác định nhóm hợp chất có trong dịch chiết [13] h
Bốc hơi đến cắn, hòa trong nước acid Phản ứng với thuốc thử chung alkaloid
Phản ứng với thuốc thử Fehling
Hiện tượng: Tủa đỏ gạch
Bốc hơi đến cắn Cho tác dụng với kiềm, soi UV365
Hiện tượng: Tăng cường độ phát quang
Hiện tượng: Có màu đỏ
Phản ứng với dung dịch FeCl3 và dung dịch gelatin muối
Hiện tượng: Xanh rêu/ xanh đen với FeCl3 Tủa bông với gelatin
Bốc hơi đến cắn Hòa trong nước, lắc mạnh
Hiện tượng: Bọt bền trên 15 phút
Thêm một ít tinh thể Na2CO3
Hiện tượng: Có bọt khí
Hình 2.1 Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn h
2.2.2 Lựa chọn dung môi chiết xuất rễ cốt khí củ
Khảo sát với 3 dung môi: Ethanol 50 % (TT), ethanol 80 % (TT) và ethanol 96 % (TT) và tiến hành chiết xuất theo quy trình sau:
Làm ẩm 5 g bột dược liệu với 20 ml mỗi dung môi trong 30 phút Bổ sung thêm
30 ml dung môi đã chọn và ngâm lạnh trong 24h Lọc, dịch chiết được cô trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 80 o C đến khi còn khoảng 20 ml
Dịch chiết trên được dùng để khảo sát hệ dung môi pha động và chọn độ cồn thích hợp cho chiết xuất
Mẫu thử: Dùng pipet khắc vạch 10 ml hút 5 ml dịch chiết của từng mẫu, cô cách thủy ở 80 o C tởi cắn bằng chén sứ Hòa tan cắn với 2 ml CHCl3
Chấm khoảng 5 μl dịch chiết lên bản mỏng silica gel 60 F254 và triển khai với các hệ dung môi có tỉ lệ khác nhau Sau khi khai triển, để bản mỏng khô tự nhiên hoặc sấy nhẹ để loại bỏ dung môi Cuối cùng, phát hiện các chất bằng cách soi dưới ánh sáng UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm.
Pha động: Toluen – EtOAc (93:7), CHCl3 – EtOAc (11:1) và MeOH – EtOAc –
Phát hiện bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm
2.2.3 Khảo sát việc chiết tách cao toàn phần và tách phân đoạn với dung môi có độ phân cực khác nhau từ rễ cốt khí củ
2.2.3.1 Chiết xuất cao toàn phần: Phương pháp ngâm lạnh
Để chiết xuất dược liệu, đầu tiên làm ẩm 1 kg bột dược liệu bằng 500 ml ethanol 80% trong 30 phút Tiếp theo, thêm 4,5 lít ethanol 80% và ngâm lạnh trong 72 giờ Sau khi lọc và thu dịch chiết, tiếp tục chiết lạnh bã dược liệu còn lại với 5 lít ethanol 80% trong 72 giờ Cuối cùng, gộp các dịch chiết và cô thu hồi dung môi để thu được cao toàn phần.
2.2.3.2 Chiết xuất cao phân đoạn
Từ cao toàn phần, lắc với: n – hexan, chloroform, ethyl acetat để phân tách thành h
22 các phân đoạn có độ phân cực khác nhau Cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn
Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn
Cao ethyl acetat Dịch nước
2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cốt khí củ
2.2.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Nguyên tắc phương pháp là bơm dung dịch thử vào các giếng đã được đục lỗ Khi chất thử có khả năng ức chế vi khuẩn, sẽ xuất hiện vòng ức chế xung quanh đĩa Dựa vào đường kính của vùng ức chế, ta có thể xác định khả năng kháng khuẩn của mẫu thử.
Chuẩn bị môi trường thử nghiệm bằng cách pha và hấp khử trùng, sau đó cho vào mỗi đĩa petri có đáy phẳng Đặt đĩa lên mặt phẳng để đảm bảo thạch có bề dày đồng nhất, khoảng 4 mm Thể tích môi trường cần thiết là khoảng 20 – 25 ml cho mỗi đĩa có đường kính phù hợp.
90 mm) Để nguội ở nhiệt độ phòng thí nghiệm
Chuẩn bị vi sinh vật:
Sau khi cấy vi khuẩn trên đĩa thạch TSA và ủ ở 37 °C trong 24 giờ, vi khuẩn được pha loãng trong dung dịch nước muối sinh lý 0,85 % và khuấy đều bằng máy vortex Huyền dịch vi khuẩn được điều chỉnh đến giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bước sóng 625 nm, hoặc pha loãng để đạt nồng độ đục tương đương với thang McFarland 0,5, tương ứng với khoảng 1 – 2 x 10^8 CFU/ml.
Nấm men Candida albicans được hoạt hóa trong môi trường SDA ở nhiệt độ 37 ℃ trong 48 giờ Sau đó, nấm men được phân tán trong dung dịch nước muối sinh lý 0,85 % và khuấy đều bằng máy vortex Huyền dịch vi nấm được điều chỉnh đến giá trị OD từ 0,08 đến 0,12 tại bước sóng 530 nm hoặc pha loãng với canh thang để đạt nồng độ tương đương với thang McFarland 0,5, tương ứng khoảng 1 – 5 x 10^6 CFU/ml Vi khuẩn và vi nấm sau khi pha chế cần được sử dụng trong vòng 30 phút.
Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 100 mg cao toàn phần và cao phân đoạn hòa tan vào trong 1 ml DMSO 10 % (TT)
Tiến hành khảo sát bằng cách trải đều huyền dịch vi khuẩn trên mặt thạch bằng que bông vô trùng, lặp lại 3 lần với mỗi lần xoay hộp 60° Ở lần cuối, xoay tròn que bông quanh thành đĩa để vi khuẩn được phân bố đồng đều Sử dụng ống thép không rỉ để đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch và cho vào mỗi lỗ 100 μl dung dịch chất kháng khuẩn.
Để thực hiện thí nghiệm, để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào môi trường, sau đó ủ đĩa thạch ở 37 °C Kết quả được đọc sau 16 – 18 giờ cho vi khuẩn và 20 – 24 giờ cho vi nấm Chất thử có tác động kháng khuẩn sẽ tạo ra vòng ức chế xung quanh lỗ Đo đường kính vòng ức chế bằng thước kẹp có độ chia nhỏ nhất 0,01 mm và ghi nhận kết quả Khả năng kháng được đánh giá sơ bộ dựa trên giá trị đường kính vòng ức chế theo bảng 2.4.
Bảng 2.4 Bảng đối chiếu đường kính vòng kháng vi sinh vật [29] Đường kính vòng kháng vi sinh vật
(mm) Mức độ kháng vi sinh vật
2.2.4.2 Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật MIC
Các mẫu cao có tác động ức chế sẽ được kiểm tra để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thông qua phương pháp pha loãng trong môi trường rắn MIC là nồng độ tối thiểu cần thiết để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, được quan sát bằng mắt thường.
Nguyên tắc xác định MIC (Minimum Inhibitory Concentration) dựa trên phương pháp pha loãng trong môi trường rắn Mẫu thử được pha loãng liên tục trong môi trường thích hợp, sau đó thêm một lượng vi khuẩn xác định Sau thời gian ấp, nồng độ thấp nhất ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn được xác định bằng quan sát bằng mắt thường.
Phương pháp: Pha loãng trong môi trường rắn
Để chuẩn bị dung dịch, hòa tan chính xác lượng cao toàn phần và các cao phân đoạn trong DMSO 10% (TT) để tạo thành dung dịch mẹ Từ dung dịch mẹ, pha loãng với môi trường MHA thành 10 nồng độ chất thử giảm dần với độ pha loãng là 2 Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm theo mô tả ở mục 2.2.4.1, sử dụng pha loãng tiếp với dung môi DMSO 10% (TT) 10 lần để đạt mật độ khoảng 10^7 CFU/ml.
Tiến hành khảo sát bằng cách chấm một ống dịch vi khuẩn lên đĩa thạch để đạt mật độ vi khuẩn 10^4 CFU/ml, sau đó ủ ở nhiệt độ 35 – 37 °C và đọc kết quả sau 16 – 18 giờ Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo khóm, nồng độ này được xác định là MIC của chất thử đối với vi khuẩn Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp hơn, mẫu cấy có thể bị nhiễm và cần thực hiện lại thử nghiệm Kết quả cuối cùng cho biết nồng độ MIC là nồng độ thấp nhất ức chế vi sinh vật trên đĩa thạch, và quy trình này cần được lặp lại ba lần để đảm bảo độ chính xác.
2.2.4.3 Kỹ thuật hiện hình sinh học
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả
3.1.1 Khảo sát thực vật học rễ cây cốt khí củ
Rễ cốt khí có hình dạng củ hình trụ cong queo, vỏ bên ngoài sần sùi và nhăn nheo, màu nâu xám với các đốt lồi lên chia củ thành từng gióng Những củ to được cắt thành lát mỏng khoảng 1 – 2 cm và phơi khô Khi nhìn vào mặt cắt ngang, có thể thấy phần vỏ mỏng và phần gỗ dày bên trong Rễ có thể chất rắn, mùi nhẹ và vị hơi se đắng.
3.1.1.2 Đặc điểm bột dược liệu
Bột rễ cây cốt khí củ có màu vàng sẫm, mùi thơm và vị hơi đắng Thành phần chính trong bột này bao gồm mảnh mạch vạch, mạch mạng, mảnh bần, hạt tinh bột và sợi mô cứng.
Hình 3.1 Rễ cốt khí củ
(A): Mẫu bột cốt khí củ
(D): Sợi mô cứng (E): Hạt tinh bột (F): Mảnh bần
3.1.1.3 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của bột dược liệu
Rễ cốt khí củ chứa các thành phần hóa học quan trọng như anthranoid, flavonoid, coumarin và tanin Những nhóm chất này đóng góp vào giá trị dinh dưỡng và tác dụng dược lý của rễ cốt khí củ.
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát thành phần hóa học rễ cốt khí củ
STT Thành phần Nhận biết Kết luận
1 Alkaloid Thuốc thử chung alkaloid -
2 Anthranoid Phản ứng màu hơ amoniac +
6 Saponin Phản ứng tạo bọt bền trong môi trường nước -
Hình 3.2 Soi bột rễ cốt khí củ
7 Chất khử Thuốc thử Fehling -
8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 có sủi bọt -
Ghi chú: (-) không có (+) có
Hình 3.3 Phản ứng hóa học định tính alkaloid, coumarin và tanin
(A): Alkaloid với các thuốc thử dragendorff, mayer, bertran, bouchardat
(C): Tanin với thuốc thử gelatin muối và FeCl3 5 %
Hình 3.4 Phản ứng hóa học định tính anthranoid, saponin, chất khử và acid hữu cơ Ghi chú:
(A): Anthranoid quan sát mắt thường
(B): Anthranoid quan sát sau hơ amoniac
(C): Saponin tạo bọt không bền
(D): Phản ứng định tính chất khử
(E): Phản ứng định tính acid hữu cơ
3.1.2 Lựa chọn dung môi chiết xuất
Tiến hành chiết xuất theo quy trình đã đề cập ở mục 2.2.2, dịch chiết thu được được sử dụng để khảo sát lựa chọn dung môi chiết xuất Kết quả sắc ký của các hệ dung môi được trình bày trong hình 3.3, 3.4 và 3.5.
Kết quả khảo sát sắc ký lớp mỏng các dịch chiết từ ethanol 50 % (TT), ethanol 80
Trong nghiên cứu, khi sử dụng hệ dung môi CHCl3 – EtOAc (11:1), sắc ký đồ của dịch chiết từ ethanol 80 % (TT) cho thấy hai vết tách rõ ràng và đậm màu hơn so với dịch chiết từ ethanol 50 % (TT) và ethanol 96 % (TT) Điều này cho thấy ethanol 80 % (TT) có hiệu quả chiết xuất tốt hơn trong điều kiện thí nghiệm này.
80 % (TT) được chọn làm dung môi chiết xuất cao toàn phần để khảo sát hoạt tính sinh học Ghi chú:
(1): Ethanol 96 % (TT) (2): Ethanol 80 % (TT) (3): Ethanol 50 % (TT) (A): Quan sát bằng mắt thường
(B): Quan sát dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm
(C): Quan sát dưới đèn UV ở bước sóng 365 nm
Hình 3.5 Sắc ký đồ hệ dung môi Toluen - EtOAc (93:7)
Hình 3.6 Sắc ký đồ hệ dung môi CHCl3 - EtOAc (11:1)
Hình 3.7 Sắc ký đồ hệ dung môi MeOH - EtOAc - H2O (13,5:100:10)
3.1.3 Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn
3.1.3.1 Chiết xuất cao toàn phần
Từ 1 kg bột rễ cốt khí củ chiết bằng phương pháp ngâm lạnh với ethanol 80 %
(TT), lọc và cô trên bếp cách thủy thu được 127,69 g cao toàn phần, hiệu suất quá trình chiết 12,77 %
3.1.3.2 Chiết xuất cao phân đoạn
Xử lý sơ bộ cao toàn phần theo quy trình sau: Cân 20 g cao toàn phần, hòa tan với
Trong quá trình tách chiết, 100 ml nước cất được lắc phân bố với dung môi n-hexan, tạo ra hai phần: dịch n-hexan màu vàng và dịch nước Phân đoạn n-hexan sau đó được cô quay dưới áp suất giảm, thu được cao phân đoạn 1 với khối lượng 0,75 g Tiếp theo, dịch nước (1) được lắc phân bố với chloroform, tạo ra dịch chloroform màu vàng và phần dịch nước (2) Cuối cùng, phân đoạn chloroform cũng được cô quay dưới áp suất giảm để thu được cao phân đoạn 2.
Dịch nước (2) được lắc với ethyl acetat, tạo ra dịch ethyl acetat màu cam và dịch nước (3) Phân đoạn ethyl acetat sau đó được cô quay dưới áp suất giảm, thu được cao phân đoạn 3 với khối lượng 3,56 g Dịch nước (3) được cô trên bếp cách thủy, thu được cao nước với khối lượng 5,06 g Khối lượng cao phân đoạn được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Khối lượng cao toàn phần và cao phân đoạn
Phân đoạn Cao toàn phần n-hexan Chloroform Ethyl acetat Cao nước
3.1.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật
3.1.4.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
Trộn đều lần lượt 100 mg cao toàn phần và cao phân đoạn trong 1 ml DMSO 10
Để đạt được các dung dịch thử với nồng độ 100 mg/ml, cho vào mỗi giếng 100 μl dung dịch chất kháng khuẩn Hoạt tính kháng vi sinh vật được xác định bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch.
Cao toàn phần và cao phân đoạn được khảo sát tác động kháng vi sinh vật trên 4 h
Nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm với 32 vi khuẩn và 1 vi nấm bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, cho thấy cao toàn phần và các cao phân đoạn n-hexan, chloroform có khả năng kháng khuẩn mạnh đối với 2 chủng vi khuẩn MSSA, MRSA và nấm men C albicans Cụ thể, phân đoạn n-hexan thể hiện khả năng kháng tốt nhất trên chủng MSSA với đường kính 22,93 mm và C albicans với 27,32 mm, trong khi phân đoạn chloroform lại cho kết quả tốt hơn trên chủng MRSA với 18,93 mm.
Cao ethyl acetat cho thấy khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ trên hai chủng vi khuẩn MSSA (19,75 mm) và MRSA (19,28 mm), trong khi đó, đối với C albicans, nó chỉ có vòng kháng khuẩn vừa (13,41 mm) Cao nước thể hiện mức độ kháng vừa với MSSA (14,95 mm) và kháng mạnh với MRSA (15,62 mm).
Cao toàn phần và các cao phân đoạn đều không cho khả năng kháng khuẩn đối với
2 chủng vi khuẩn Gram âm Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa
Chứng âm là DMSO 10 % (TT) không cho vòng kháng khuẩn
Hình 3.8 Kết quả vòng kháng khuẩn MSSA h
Hình 3.9 Kết quả vòng kháng khuẩn MRSA
Hình 3.10 Kết quả vòng kháng khuẩn C albicans h
Bảng 3.3 Đường kính vòng ức chế vi sinh vật của cao toàn phần và cao phân đoạn (mm)
MSSA MRSA Ec Pa Ca
(TP): Cao toàn phần (n – hex): Cao phân đoạn n – hexan (CHCl3): Cao phân đoạn chloroform (CN): Cao nước
3.1.4.2 Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật Để đánh giá chính xác về hoạt tính kháng vi sinh vật của cao toàn phần và các cao phân đoạn rễ cốt khí củ, chúng tôi tiến hành xác định giá trị MIC trên chủng vi khuẩn MSSA và MRSA
Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao n-hexan và cao chloroform đối với chủng vi khuẩn MSSA và MRSA là bằng nhau, đều là 0,45 mg/ml Trong khi đó, khả năng kháng vi khuẩn của cao ethyl acetat với MIC là 0,91 mg/ml thấp hơn so với cao n-hexan và cao chloroform Cao toàn phần có MIC là 1,14 mg/ml, trong khi cao nước có MIC cao hơn, đạt 4,55 mg/ml.
Bảng 3.4 Kết quả MIC của cao toàn phần và các cao phân đoạn trên vi khuẩn
MSSA và MRSA (mg/ml)
(n – hex): Cao phân đoạn n – hexan
(CHCl3): Cao phân đoạn chloroform (CN): Cao nước
3.1.4.3 Xác định chất có hoạt tính kháng vi sinh vật bằng kỹ thuật tự sinh đồ
Cao phân đoạn n – hexan, chloroform và ethyl acetat được hòa tan trong dung môi chloroform, đưa lên bản mỏng silicagel 60 F254, khai triển bằng hệ dung môi CHCl3
Chúng tôi đã sử dụng dung môi EtOAc với tỉ lệ 11:1 và tiến hành phát hiện bằng phương pháp soi UV ở bước sóng 254 nm Qua kỹ thuật hiện hình sinh học trên mẫu MSSA, chúng tôi đã xác định được các vết có hoạt tính kháng vi sinh vật, như thể hiện trong các hình 3.11, 3.12 và 3.13.
Khi sử dụng ánh sáng UV ở bước sóng 254 nm để phát hiện các vết trên bản sắc ký đồ, đã xác định được tổng cộng 4 vết được đánh số từ 1 đến 4, như minh họa trong hình 3.14 Giá trị Rf của các vết này được trình bày chi tiết trong bảng 3.5.
Với phân đoạn n – hexan: Kết quả tự sinh đồ cho thấy vết số 4 (Rf = 0,80) cho vòng kháng khuẩn
Với phân đoạn ethyl acetat: Kết quả tự sinh đồ cho thấy vết số 4 (Rf = 0,80) cho vòng kháng khuẩn
Dựa trên kết quả tự sinh đồ của các loại cao phân đoạn n-hexan, chloroform và ethyl acetat, chỉ có cao phân đoạn n-hexan và cao ethyl acetat thể hiện khả năng kháng MSSA.
Khi so với sắc ký đồ cả 3 cao đều cho 2 vết số 1 (Rf = 0,28) và vết số 3 (Rf = 0,78) h
Bàn luận
Khi so sánh kết quả thử vi sinh vật của dịch chiết cao ethanol 80% (TT) với các tài liệu tham khảo, chúng tôi nhận thấy rằng đường kính vòng kháng khuẩn của cao toàn phần đối với chủng MSSA là 19,86 mm, nhỏ hơn so với nghiên cứu của Bin Shan (20,2 mm) về dịch chiết cao methanol (TT) và dịch chiết ethanol 96% (TT) của Pai We Soo, có đường kính vòng kháng khuẩn từ 20 đến 21 mm.
Cao phân đoạn n-hexan (22,93 mm) lớn hơn so với kết quả của Pai We Soo (17 – 20 mm), trong khi cao phân đoạn chloroform (18,45 mm) lại nhỏ hơn so với mức của Pai We Soo Đối với cao phân đoạn ethyl acetat (19,75 mm), kết quả cũng thấp hơn so với Pai We Soo.
Chúng tôi đã nghiên cứu các chủng vi khuẩn gram âm E coli và P aeruginosa trong dịch chiết cao ethanol 80% Kết quả cho thấy cả hai chủng vi khuẩn đều cho kết quả âm tính Đặc biệt, phân đoạn cao nước của chúng tôi có kích thước 14,95 mm, cao hơn so với Pai We Soo với kích thước chỉ 12 – 14 mm.
E coli ( 6,40 mm) và Pai We Soo trên chủng P aeruginosa ( 11,50 mm)
Dịch chiết cao toàn phần ethanol 80% (TT) có giá trị MIC là 1,14 mg/ml, cao hơn so với dịch chiết cao methanol (TT) của Bin Shan với MIC là 0,31 mg/ml và dịch chiết cao ethanol 96% (TT) của Pai We Soo có MIC là 0,38 mg/ml.
Dựa trên kết quả đường kính vòng kháng khuẩn cho thấy cao n – hexan có khả năng kháng khuẩn tốt trên vi khuẩn MSSA (22,93 mm) và nấm mem C albicans
Cao n-hexan có giá trị MIC thấp nhất (0,45 mg/ml) đối với MSSA, cho thấy tiềm năng cao trong việc phân lập các chất tinh khiết với hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm từ rễ cây cốt khí củ.
Kết quả từ việc tự sinh đồ của cao n-hexan, cao chloroform và cao ethyl acetat cho thấy rằng khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của rễ cây cốt khí củ không chỉ phụ thuộc vào một hợp chất duy nhất.
Cao phân đoạn n-hexan có khả năng kháng vi sinh vật tốt, nhờ vào sự hỗ trợ của nhiều nhóm chất kém phân cực dạng aglycon trong rễ cây cốt khí củ Các nhóm chất này bao gồm anthranoid, stilbenoids, flavonoid và coumarin, chúng tương tác với nhau để tạo ra hiệu quả ức chế các vi khuẩn MSSA, MRSA và vi nấm C albicans.