(Luận văn thạc sĩ) giải trình tự và nghiên cứu đặc điểm hệ gen lục lạp của cây xà căn ba vì (ophiorrhiza baviensis) bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới pacbio smrt

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM PHẠMMAI HƯƠNG HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Phạm Mai Hương SINHHỌC THỰCNGHIỆM GIẢI TRÌNH TỰ VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HỆ GEN LỤC LẠP CỦA CÂY XÀ CĂN BA VÌ (Ophiorrhiza baviensis) BẰNG CƠNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI PACBIO SMRT LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC 2023 Hà Nội - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Phạm Mai Hương GIẢI TRÌNH TỰ VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HỆ GEN LỤC LẠP CỦA CÂY XÀ CĂN BA VÌ (Ophiorrhiza baviensis) BẰNG CƠNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI PACBIO SMRT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : GS.TS CHU HOÀNG HÀ Hà Nội – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu luận văn cơng trình nghiên cứu dựa tài liệu, số liệu tơi tự tìm hiểu nghiên cứu Chính vậy, kết nghiên cứu đảm bảo trung thực khách quan Đồng thời, kết chưa xuất nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực sai tơi hồn chịu trách nhiệm trước phát luật Tác giả Phạm Mai Hương LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin chân thành cảm ơn thầy hướng dẫn, GS.TS Chu Hồng Hà, tận tình hướng dẫn, bảo ln có phản hồi tỉ mỉ thời gian nhanh suốt thời gian qua, nhằm giúp tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn lãnh đạo nhân viên Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Gen Trung tâm Giám định ADN, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, giúp đỡ tơi có thêm nhiều kiến thức kinh nghiệm bước tiến hành luận văn Tôi xin cảm ơn Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thành viên đề tài “Giải trình tự nghiên cứu đặc điểm hệ gen lục lạp dược liệu thuộc lồi Xà ba (Ophiorrhiza baviensis) cơng nghệ giải trình tự hệ Pacbio SMRT sequencing, nhằm phân loại bảo tồn nguồn gen”, với mã số đề tài: CSCL08.02/22-22, giúp đỡ đạt kết luận văn Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn đến ban Lãnh đạo, phòng Đào tạo, phòng chức Học viện Khoa học Cơng nghệ để luận văn hồn thành Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ tơi, tới gia đình bạn bè người ủng hộ, giúp đỡ động viên tơi suốt q trình học tập qua MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm chung phân bố lồi Xà ba 1.2 Tình hình nghiên cứu Xà ba giới 1.3 Tình hình nghiên cứu Xà ba nước 1.4 Định danh Xà ba thị phân tử 1.5 Giải trình tự hệ ứng dụng nghiên cứu bảo tồn nguồn gen phân loại thực vật 11 1.5.1.Giải trình tự hệ 11 1.5.2 Ứng dụng NGS nghiên cứu bảo tồn nguồn gen phân loại thực vật 14 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1.Tách chiết DNA tổng số mẫu thực vật 18 2.2.2.Tạo thư viện giải trình tự 19 2.2.3.Lắp ráp hệ gen lục lạp 19 2.2.4.Chú giải hệ gen lục lạp 20 2.2.5.So sánh hệ gen lục lạp xây dựng phát sinh chủng loại 20 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Kết tách chiết lưu trữ DNA tổng số mẫu thực vật 22 3.2 Kết giải trình tự hệ gen lục lạp cơng nghệ giải trình tự Pacbio 23 3.3 Kết lắp ráp hệ gen 25 3.4 Kết giải hệ gen lục lạp 26 3.5 Kết so sánh hệ gen lục lạp xây dựng phát sinh chủng loại 33 3.5.1.Kết so sánh hệ gen lục lạp 33 3.5.2.Kết phân tích phát sinh lồi 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 Kết luận 41 Kiến nghị 41 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 42 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 47 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT STT Tên viết tắt Tên đầy đủ bp Basepair CCS Circular consensus sequencing CLR Continuous long read CNS Conserved noncoding sequences CPT Camptothecin DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate dsDNA Double-stranded DNA ETS External transcribed spacer 10 HGAP Hierarchical Genome Assembly Process 11 HR-ESI-MS High-resolution electrospray ionisation mass spectra 12 IGS Intergenic spacer 13 IR Inverted repeat 14 ITS Internal transcribed spacer 15 LPS Lipopolysaccharide 16 LSC Large single copy 17 NBCI National Center for Biotechnology Information 18 NGS Next generation sequencing 19 NMR Nuclear magnetic resonance 20 NO Nitric oxide 21 O Ophiorrhiza 22 PacBio Pacific BioSciences 23 Pi Nucleotide diversity 24 RNA Ribonucleic Acid 25 RSCU Relative synonymous codon usage 26 SGS Sanger Sequencing 27 SMRT Single-molecule real-time sequencing 28 sp Species 29 SSC Small single copy 30 ssDNA Single-stranded DNA 31 SSR Microsatellite, simple sequence repeats 32 33 XCBV ZMW Xà ba Zero-mode waveguide DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học hợp chất khai thác từ Xà ba Bảng 3.1 Nồng độ DNA tổng số đo nanodrop 23 Bảng 3 Tóm tắt thông tin lắp ráp giải hệ gen lục lạp Xà ba .27 Bảng 3.4 Thành phần gen hệ gen lục lạp Xà ba 28 Bảng 3.4 Tần suất sử dụng codon cho gen mã hóa protein hệ gen lục lạp Xà ba 33 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cây Xà ba (Ophiorrhiza baviensis) Hình 1.2 Cơng thức hóa học hợp chất từ Xà ba Hình 2.1 (A) Mơi trường sống Xà ba vì; (B) Chùm Xà ba 18 Hình 3.1 Ảnh điện di gel agarose 0.8% 22 Hình 3.2 Phân bố độ dài (A) chất lượng (B) đoạn đọc 25 Hình 3.3 Bản đồ hệ gen lục lạp lồi Xà ba Việt Nam .26 Hình 3.4 Phân tích lần lặp lại trình tự đơn hệ gen lục lạp Xà ba 31 Hình 3.5 Phân tích trình tự lặp lại dài quy mơ gen lục lạp lồi Xà ba 32 Hình 3.6 Biểu đồ nhận dạng so sánh gen lục lạp ba lồi Xà .36 Hình 3.7 Phân tích so sánh giá trị đa dạng nucleotide ba trình tự gen lục lạp lồi Xà 36 Hình 3.8 So sánh vị trí tiếp giáp vùng cấu trúc ba gen lục lạp 38 Hình 3.9 Cây phát sinh lồi Maximum Likelihood dựa các trình tự gen rps16 vùng nối gen trnL-trnF .39 MỞ ĐẦU Lục lạp bào quan thiết yếu tế bào thực vật vi sinh vật quang hợp, nơi sản sinh lượng nuôi sống tế bào qua hoạt động quang hợp Mỗi lục lạp có chứa ribosome riêng hệ gen tách biệt với hệ gen nhân tế bào với kích thước khoảng 20 - 120kb Bởi kích thước hệ gen lục lạp nhỏ, đơn giản so với hệ gen nhân, nên lục lạp thường đích giải trình tự Trong đó, trình tự hệ gen lục lạp sử dụng rộng rãi phân tích tiến hóa, barcoding meta-barcoding, lại chứa khoảng 100-120 gene mã hóa protein Cho đến thời điểm tại, sở liệu Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia NCBI Genbank có khoảng 1000 hệ gen lục lạp loài thực vật Tuy nhiên, số nhỏ so với đa dạng thực vật có hành tinh, từ đặt tiềm cần thiết phải thu thập lưu trữ trình tự lồi Đối với lồi dược liệu Xà ba vì, tiềm khai thác cần thiết phải phân loại cách có hệ thống lại cần thiết Thông tin đặc điểm sinh thái hệ gen lồi vơ hạn chế, có trình tự Xà ba bao gồm gen rps16 (#MH626923.1), vùng nối gen trnL-trnF (#MH626989.1), ETS (#MH626743.1) ITS (#MH626804.1) sở liệu genbank Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (Hoa Kỳ) (NCBI) Mỗi trình tự có kích thước 1000 bp, thuộc hệ gen lục lạp Như vậy, thấy cần thiết phải có nghiên cứu toàn hệ gen lục lạp lồi Xà ba cho cơng tác phân loại, đánh giá đa dạng nghiên cứu đặc điểm hệ gen lục lạp, làm sở cho công tác bảo tồn nghiên cứu mở rộng sau Với kích thước ước tính hệ gen lục lạp loài Xà khoảng 154 kb, tiềm khai thác thông tin genome hệ gen lục lạp lớn, hứa hẹn cung cấp nhiều thông tin khoa học quan trọng Hiện nay, cơng nghệ giải trình tự PacBio ứng dụng để giải trình tự hệ gen lục lạp, có nghiên cứu chứng minh cho khả vượt trội PacBio lắp ráp de novo với độ xác 99%, tăng độ lặp lại độ xác lên đến 99,9% Cho đến có nhiều cơng trình sử dụng cơng nghệ PacBio để giải trình tự hệ gen lục lạp, đặc biệt lồi có tính ứng dụng cao lồi dược liệu Trong lĩnh vực nghiên cứu hệ gen, nước ta chưa có cơng bố liên quan đến khảo sát hệ gen nhân hệ gen lục lạp loài thuộc chi Xà Xuất phát từ tình hình thực tiễn cần thiết nghiên cứu,