Nghiên cứu khoa học " PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN HỆ GEN NHÂN CỦA LOÀI MỠ HẢI NAM (MANAGLIETIA HAINANENSIS DANDY) BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ cpSSR " pdf

Nghiên cứu khoa học PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN HỆ GEN NHÂN CỦA LOÀI MỠ HẢI NAM (MANAGLIETIA HAINANENSIS DANDY) BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ cpSSR . Page 1 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN HỆ GEN NHÂN CỦA LOÀI MỠ HẢI NAM (MANAGLIETIA HAINANENSIS DANDY) BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ cpSSR. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Thanh Trăng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Văn Phượng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ Sinh học TÓM TẮT Năm mươi (50) mẫu lá loài Mỡ Hải Nam thu thập từ rừng trồng khảo nghiệm xuất xứ có nguồn gốc địa lý khác nhau (Trung Quốc 2 vùng và Việt Nam 1 vùng) đã được phân tích đánh giá mức độ đa dạng di truyền của loài và xuất xứ bằng việc sử dụng các chỉ thị phân tử RAPD và chỉ thị lục lạp cpSSR nhằm đưa ra giải pháp hợp lý cho việc bảo tồn nguồn gen của loài Mỡ Hải Nam trong tương lai. Có 3 trong số 5 mồi RAPD được sử dụng là OPB18, RA46 và RA159 cho tính đa hình với các đoạn ADN của loài, còn lại 2 mồi OPB10 và RA142 không cho tính đa hình. Trong số 50 mẫu Mỡ Hải Nam, có 1 mẫu (II-6, Tianlake Jiangfeng) tách biệt hẳn về mặt di truyền so với các mẫu còn lại, với mức độ tương đồng là 58,3%. Các mẫu còn lại có độ tương đồng khá cao, từ 82 đến 100%. Mặc dầu vậy sự đa dạng di truyền cũng thể hiện ngay trong cùng một vùng địa lý thu thập mẫu: các mẫu thuộc cây mẹ III-1 và III-2 (Ba Vì) lập thành một nhóm khác biệt với các nhóm khác tới 16,5%, các mẫu thuộc các cây mẹ II-1, II- 7, II-5, II-8, II-21 và II-19 (Tianlake Jiangfeng) lập thành nhóm khác biệt với các nhóm khác khoảng 11%, trong khi đó, 3 mẫu thuộc xuất xứ Southern Jiangfeng (I) có hai mẫu I-9 và I-20 có độ tương đồng cao xấp xỉ 100% và có sự khác biệt lớn so với mẫu I1. Một số mẫu trong số đó lại có mức độ sai khác di truyền thấp, bởi vì chúng được thu hái từ cùng cây mẹ hoặc các cây mẹ có quan hệ di truyền gần gũi nhau (như các mẫu ký hiệu III thu từ Ba Vì). Cặp mồi đặc hiệu cpSSR dùng trong phân tích ADN lục lạp của 10 mẫu Mỡ đại diện không chỉ ra tính đa hình, điều này khẳng định sự bảo thủ di truyền rất cao trong hệ gen lục lạp của loài Mỡ Hải Nam. Từ khóa: Mỡ Hải Nam, Đa dạng di truyền, Mồi lục lạp cpSSR, Mồi RAPD. ĐẶT VẤN ĐỀ Rừng tự nhiên trước đây đã bị khai thác khá mạnh vì nguồn lợi từ thị trường nguyên liệu gỗ lớn, dẫn đến nguồn gen của nhiều loài cây bản địa như loài Mỡ Hải Nam (Manglietia hainanensis Dandy) bị giảm đi một cách nhanh chóng. Trong khuôn khổ hợp tác nghiên cứu với Trung Quốc, 2 xuất xứ Mỡ Hải Nam có nguồn gốc Trung Quốc (Tianlake Jianfeng và Southern Jianfeng) đã được đưa vào khảo nghiệm ở Việt Nam với 1 xuất xứ bản địa là Ba Vì (Hà Nội). Mỡ Hải Nam (Manglietia hainanensis Dandy) là cây thường xanh, cao tới 25-30m, đường kính ngang ngực 25-35cm. Gỗ Mỡ Hải Nam được dùng làm đồ mộc gia dụng, cột nhà, là loài cây có giá trị kinh tế. Mỡ Hải Nam là cây bản địa của miền Bắc Việt Nam, phân bố ở các tỉnh Yên Bái, Hà Giang, Tuyên Quang, Phú Thọ và ở miền Trung như Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Quảng Bình. Cây Mỡ Hải Nam không còn được phát hiện nhiều ở các rừng tự nhiên, vì vậy việc bảo tồn nguồn gen cho Mỡ Hải Nam là điều cần thiết. Để phục vụ cho công tác bảo tồn nguồn gen loài cây này, các nguồn giống từ Trung Quốc đã được nhập nội và gây trồng ở nước ta do vậy cần phải có sự đánh giá về mức độ đa dạng di truyền của các xuất xứ thu thập từ các địa phương khác nhau, nhất là các nguồn gen được thu từ Trung Quốc. Phân tích đánh giá mức độ đa dạng di truyền của các loài cây lâm nghiệp đã được tiến hành nhiều ở Việt Nam bằng việc sử dụng các chỉ thị phân tử, như nghiên cứu đa dạng di truyền các xuất xứ cây Lim xanh (Erythrophloeum fordii Oliv.) (Quách Thị Liên và cs. 2004; Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs., 2005), nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) (Nguyễn Đức Thành và cs., 2005) và của 12 loài thuộc chi Dầu (Dipterocarpus) (Nguyễn Thuý Hạnh và cs., 2005), phân tích đa dạng di truyền loài Sao hình lá tim (Hopea cordata Vidal) (Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs. 2006) và loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.) (Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs., 2007). Nghiên cứu này đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 50 mẫu lá Mỡ Hải Nam thu thập từ các địa phương khác nhau của Trung Quốc và Việt Nam dựa vào các chỉ thị RAPD và chỉ thị lục lạp cpSSR. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu nghiên cứu Năm mươi mẫu lá cây Mỡ Hải Nam (Bảng 1) thu ở 3 vùng địa lý khác nhau của Trung Quốc và Việt Nam, bảo quản trong tủ lạnh sâu -85°C được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu. ADN của 50 mẫu lá Mỡ được tách chiết và phân tích bằng chỉ thị RAPD. Sau khi phân tích bằng chỉ thị RAPD, ADN của 10 mẫu lá Mỡ Hải Nam (Bảng 1) đại diện trong 3 nhóm được phân tích bằng chỉ thị cpSSR. Page 2 Bảng 1. Ký hiệu tên mẫu Mỡ được sử dụng trong nghiên cứu Danh sách mẫu phân tích RAPD Danh sách mẫu phân tích cpSSR STT Ký hiệu mẫu* STT Ký hiệu mẫu* STT Ký hiệu mẫu* STT Ký hiệu mẫu* 1 II 1 18 II 18 35 III 4-3 1 I 1 2 II 2 19 II 19 36 III 5-1 2 I 9 3 II 3 20 II 20 37 III 5-2 3 I 20 4 II 4 21 II 21 38 III 5-3 4 II 1 5 II 5 22 I 1 39 III 7-1 5 II 5 6 II 6 23 I 9 40 III 8-1 6 II 10 7 II 7 24 I 20 41 III 9-1 7 II 15 8 II 8 25 III 1-1 42 III 9-2 8 III 1-2 9 II 9 26 III 1-2 43 III 10-1 9 III 5-2 10 II 10 27 III 1-3 44 III 10-2 10 III 10-3 11 II 11 28 III 2-1 45 III 10-3 12 II 12 29 III 2-2 46 III 11-1 13 II 13 30 III 3-1 47 III 11-2 14 II 14 31 III 3-2 48 III 11-3 15 II 15 32 III 3-3 49 III 12-1 16 II 16 33 III 4-1 50 III 12-3 17 II 17 34 III 4-2 (*Ký hiệu I: mẫu Mỡ Hải Nam thu từ Southern Jiangfeng Mountain – Trung Quốc, II: mẫu thu từ Tianlake Jiangfeng Mountain – Trung Quốc, III: mẫu thu từ Ba Vì – Việt Nam) Các mồi và enzyme sử dụng trong nghiên cứu Bao gồm 5 mồi RAPD, một cặp mồi đặc hiệu đối với hệ gen lục lạp trnD – trnT (của hãng Fermentas), năm enzyme hạn chế: BamHI, HaeIII, HinfI, PstI và TaqI được dùng để phân tích đa dạng di truyền của các mẫu lá Mỡ trong nghiên cứu này. Trình tự nucleotide của các mồi RAPD và cặp mồi cpSSR với kích thước lý thuyết của phân đoạn ADN trình bày trong Bảng 2. Bảng 2. Trình tự nucleotide của 5 mồi RAPD và cặp mồi cpSSR sử dụng trong nghiên cứu Mồi RAPD TT Mồi Trình tự nucleotide TT Mồi Trình tự nucleotide 1 OPB10 5’CTGCTGGGAC3’ 4 RA159 5’GTCCACACGG3’ 2 OPB18 5’CCACAGCAGT3’ 5 RA46 5’CCAGACCCTG3’ 3 RA142 5’CAATCGCCGT3’ Mồi cpSSR Tên mồi Trình tự các nucleotide Kích thước lý thuyết trnD 5’ACCAATTGAACTACAATCCC3’ 1600bp trnT 5’CTACCACTGAGTTAAAAGGG3’ 1600bp Phương pháp nghiên cứu Tách chiết và chuẩn độ ADN ADN của 50 mẫu lá Mỡ Hải Nam được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp của Doyle và Doyle (1990) có cải tiến. ADN sau khi tách chiết được kiểm tra trên gel Agarose 0,8%, xác định hàm lượng trên máy đo quang phổ và pha loãng về nồng độ sử dụng 10ng/µl. Phản ứng PCR – RAPD: Một phản ứng PCR có thể tích 25 l bao gồm: 1X dịch đệm PCR; 2,5 mM MgCl 2 ; 2 mM dNTPs; 200 nM đoạn mồi RAPD; 0,125 đơn vị Tag polymeraza và 10 ng ADN khuẩn. Phản ứng PCR- RAPD thực hiện trong máy PCR- Thermal Cycler PTC 100 theo chu kỳ nhiệt: Bước 1: 94 0 C–3 phút; Bước 2: 92 0 C–1 phút; Bước 3: 35 0 C–1 phút; Bước 4: 72 0 C–1 phút; Bước 2 đến bước 4 được lặp lại 45 chu kỳ; Bước 5: 72 0 C–10 phút; Bước 6: giữ ở 4 0 C (Ravinsanka và cs. 2000; Trương Quang Vinh và cs. 2008). Phản ứng PCR - SSR: Một phản ứng PCR-SSR có tổng thể tích là 25 µl chứa: 1X dung dịch đệm PCR, 50 mM MgCl 2 , 2 mM dNTPs, 10 ng mồi lục lạp, 0,5 đơn vị Taq polymerase và 50 ng DNA genome. Chu trình nhiệt của của phản ứng bao gồm các bước: bước 1: 94 0 C–2 phút; bước 2: 94 0 C–1 phút, bước 3: 54 0 C-1 phút; bước 4: 72 0 C–1 phút; Bước 2 đến bước 4 được lặp lại 34 chu kỳ; bước 5: 72 0 C–10 phút; bước 6: giữ sản phẩm ở 4 0 C (Heinze 2007). Page 3 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 M 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 M 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 M 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 M 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 OPB10 RA46 Phản ứng cắt enzyme hạn chế: Sản phẩm PCR-cpSSR được cắt bằng các enzyme hạn chế với thành phần như sau: 10 µl sản phẩm PCR, 2 µl 10X buffer, 2 µl enzyme và 6 µl ddH 2 O. Phản ứng cắt được thực hiện ở 37 0 C trong thời gian 16 giờ. Phân tích số liệu Phân tích số liệu theo quy ước: 1= phân đoạn ADN xuất hiện và 0 = phân đoạn ADN không xuất hiện, khi điện di sản phẩm RAPD với các mồi ngẫu nhiên. Xác định hệ số tương đồng di truyền theo phương pháp của Nei và Li (1979). Trong đó Sij: hệ số giống nhau giữa hai cá thể i và j a: Số phân đoạn ADN xuất hiện ở cả cá thể i và j b: Số phân đoạn ADN xuất hiện ở i và không xuất hiện ở j c: Số phân đoạn ADN xuất hiện ở j và không xuất hiện ở i Lập biểu đồ hình cây trong chương trình NTSYSpc 2.0 (James 1998). Hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content = PIC) (Marilyn and Jose 2002) của mỗi mồi xác định theo công thức PIC = 1- Pi 2 , trong đó Pi là tần số của allen thứ i của kiểu gen được kiểm tra. Phạm vi giá trị PIC từ 0 (không đa hình) tới 1 (đa hình hoàn toàn). Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Phân tích tính đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD Sản phẩm PCR-RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1,8% để phân tích tính đa hình ADN của 50 mẫu lá Mỡ Hải Nam. Trong số 5 mồi ngẫu nhiên được sử dụng để phân tích, ba mồi cho tính đa hình về các phân đoạn ADN được nhân bản gồm mồi RA46, RA159 và OPB18. Số lượng các phân đoạn ADN nhân bản với mỗi mồi dao động từ 4-11 phân đoạn (Hình 1). Kích thước các phân đoạn ADN được nhân bản trong khoảng từ 250 bp - 2000 bp. Số phân đoạn ADN nhân bản được của 50 mẫu Mỡ với 5 mồi RAPD là 1200, tương ứng với 110 băng vạch, trong đó số băng vạch đa hình là 27 chiếm 24,5%. Mồi cho tính đa hình cao nhất là OPB18 (1,0%) tiếp đến là mồi RA159 (0,8%) và mồi RA46 (0,55%), hai mồi OPB10 và RA142 không cho tính đa hình về các phân đoạn ADN được nhân bản (0%). Kết quả này cũng phù hợp khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình thể hiện ở giá trị PIC (Polymorphism Information Content) (Bảng 3), giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình càng cao và ngược lại. Cụ thể, giá trị PIC của mồi RA142 và OPB10 là 0 (không đa hình) và giá trị PIC của mồi OPB18 là 0,54 (đa hình cao nhất). Bảng 3. Mức độ đa hình của các mồi nghiên cứu STT Tên mồi Số phân đoạn nhận được Số phân đoạn đa hình Tỉ lệ % đa hình PIC 1 OPB10 150 0 0,0 0,00 2 OPB18 400 4 1,00 0,54 3 RA142 200 0 0,0 0,00 4 RA159 250 2 0,80 0,15 5 RA46 550 3 0,55 0,34 Hình 1: Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel Agarose 1,8% của hai mồi c b a a Sij   2 2 Page 4 OPB10 và RA46 (M: Thang chuẩn ADN kích thước 1kb; 1-50: tên của các mẫu Mỡ như trong bảng 1) Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu Mỡ dựa trên phân tích kết quả RAPD Kết quả phân tích với 3 mồi ngẫu nhiên ở 50 mẫu Mỡ Hải Nam cho thấy hệ số tương đồng di truyền của từng cặp dao động trong khoảng từ 0,823 đến xấp xỉ 1,00. Mức độ khác nhau đựơc biểu hiện bằng hệ số sai khác di truyền khi so sánh giữa các mẫu cây Mỡ. Để có bức tranh tổng quát về quan hệ giữa các mẫu nghiên cứu ở mức độ phân tử, sự đa dạng di truyền được thể hiện trên sơ đồ hình cây (Hình 2). Sơ đồ hình cây được chia làm hai nhánh chính, nhánh một chỉ chứa mẫu II-6 với mức sai khác di truyền với các mẫu còn lại là 41,7%. Nhánh hai bao gồm 49 mẫu còn lại và được chia làm hai nhóm phụ và các phân nhóm tiếp theo. Sự sai khác di truyền giữa các mẫu trong nhánh hai dao động từ xấp xỉ 0% đến 17%. Điều này gây nên sự ngạc nhiên lớn và đáng được quan tâm vì các xuất xứ được thu thập từ hai vùng địa lý cách khá xa nhau là đảo Hải Nam (Trung Quốc) và Vườn quốc gia Ba Vì (Việt Nam) Thông qua sơ đồ hình cây có thể thấy, các mẫu có xuất xứ Ba Vì (ký hiệu III) tập trung chủ yếu ở phân nhóm C và D (Hình 2) và có mức độ tương đồng di truyền rất cao. Mức độ sai khác di truyền thấp này là do chúng được thu hái từ cùng cây mẹ hoặc các cây mẹ có quan hệ di truyền gần gũi nhau. Mặc dầu vậy sự đa dạng di truyền cũng thể hiện ngay trong cùng một vùng địa lý thu thập mẫu: các mẫu thuộc cây mẹ III-1 và III-2 (Ba Vì) lập thành một nhóm khác biệt với các nhóm khác tới 16,5%, các mẫu thuộc các cây mẹ II-1, II-7, II-5, II-8, II-21 và II-19 (Tianlake Jiangfeng) lập thành nhóm khác biệt với các nhóm khác khoảng 11%. Trong khi đó, 3 mẫu thuộc xuất xứ Southern Jiangfeng (I) có hai mẫu I-9 và I-20 có độ tương đồng cao xấp xỉ 100% và có sự khác biệt lớn so với mẫu I1. Như vậy chỉ với 5 mồi RAPD đã cho thấy được sự đa dạng di truyền cũng như mức độ tương đồng giữa các mẫu cây Mỡ Hải Nam nghiên cứu, tuy nhiên để có những đánh giá chi tiết và chính xác hơn cần sử dụng thêm nhiều mồi ngẫu nhiên hơn nữa. Page 5 Coefficient 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 II-1 II-7 II-5 II-8 II-21 II-19 II-2 II-10 II-11 II-12 II-13 II-3 II-17 I-9 III12-1 III11-2 III10-3 III12-3 III11-3 III5-2 III5-1 III11-1 III3-1 I-20 III4-3 III8-1 III5-3 II-15 II-16 II-18 II-14 III3-2 III9-2 III4-2 III4-1 III3-3 III7-1 III10-2 III10-1 III9-1 II-20 I-1 III2-2 II-4 II-9 III1-1 III1-2 III1-3 III2-1 II-6 Hình 2: Biểu đồ cây phân loại của 50 mẫu Mỡ khi phân tích với 3 mồi RAPD Tối ưu hoá nhiệt độ bắt mồi của các cặp mồi lục lạp Cùng với việc đánh giá đa dạng genome nhân bằng các chỉ thị RAPD, trong nghiên cứu này, cặp mồi lục lạp cpSSR (Chorotoplast Simple Sequence Repeat) cũng được sử dụng để đánh giá sự đa dạng di truyền. Thường các hệ gen lục lạp của từng loài có tính bảo thủ cao và tần số đột biến thấp hơn so với ADN nhân (Heinze 2007; Mohanty và cs. 2001; Navascues và cs. 2005). Để có thể tìm hiểu một cách tương đối toàn diện tính đa dạng ADN của các mẫu Mỡ thu thập ở các vùng khác nhau, trong nghiên cứu này chúng tôi cũng sử dụng mồi cpSSR (trnD – trnT) để đánh giá tính đa hình ADN lục lạp của 10 mẫu Mỡ đặc trưng cho 3 vùng thu thập . Cặp mồi trnD-trnT đã được chọn để phân tích sự đa dạng di truyền của 10 mẫu Mỡ ở mức độ hệ gene lục lạp. Trong quá trình chạy PCR, một số ngưỡng nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi này đã được khảo sát và lựa chọn được nhiệt độ tối ưu là 54 0 C (Hình 3). Trong điều kiện phản ứng này, sản phẩm nhận được với kích thước như mong đợi và rõ nét. Như vậy, phản ứng nhân gen lục lạp của 10 mẫu Mỡ nghiên cứu với cặp mồi đặc hiệu trnD-trnT đã được tối ưu hoá. A B C D 2 1 Page 6 Hình 3: Sản phẩm của cặp mồi trnD-trnT ở nhiệt độ bắt mồi 52 o C (hàng trên) và 54 0 C (hàng dưới). M – thang ADN 1 kb, các chữ số tương ứng là tên các mẫu được ký hiệu trong bảng 1 Sản phẩm PCR của cặp mồi trnD-trnT với độ dài khoảng 1600 bp. Kết quả này tương tự như các kết quả đã được công bố bởi Pardo và cs. (2004) và Nicolosi và cs. (2000) khi họ dùng các cặp mồi này để nghiên cứu nguồn gốc và phát sinh loài ở các loài thuộc họ cam quýt và cũng tương tự như kết quả được các tác giả đã công bố trước đây khi dùng các cặp mồi này để khảo sát trên một số loài cây họ Dầu (Nguyyễn Thúy Hạnh, 2005). Sản phẩm của cặp mồi này có độ dài tương tự nhau ở tất cả 10 mẫu nghiên cứu. Như vậy, về kích thước sản phẩm PCR của mồi lục lạp không cho thấy sự đa hình giữa các mẫu (Hình 4). Để khẳng định một lần nữa tính đa dạng của các sản phẩn cpSSR, một số enzyme hạn chế BamHI, HaeIII, HinfI, PstI và TaqI đã được dùng để cắt các sản phẩm nhận được sau khi nhân bản. Nếu ở các mẫu có sự khác nhau về trình tự nucleotide thì sẽ dẫn đến thay đổi vị trí cắt của các enzyme. Bằng cách này có thể nhận được sự đa hình trong cpDNA ở các mẫu nghiên cứu. Đây là một trong những phương pháp đóng vai trò tích cực trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền và phát sinh loài dựa vào hệ gen lục lạp (Mason-Gamer và cs. 1995; Nicolosi và cs. 2000; Mohanty và cs. 2001, Devos và cs. 2003, McMillan và Sun 2004). Hình 4: Sản phẩm của phản ứng cắt enzyme sản phẩm PCR của cặp mồi lục lạp trnD -trnT được cắt bởi các enzyme hạn chế BamH I (A) và TaqI (C), M - thang ADN: 1kb Kết quả cho thấy, sản phẩm PCR của cặp mồi nghiên cứu được cắt bởi các enzyme hạn chế ở trên không cho đa hình ở tất cả các mẫu. Như vậy khi sử dụng một cặp mồi trnD-trnT chưa cho thấy tính đa dạng di truyền ở mức độ hệ gen lục lạp của loài. Do đó để đánh giá sâu hơn về sự đa dạng di truyền của các mẫu này cần phải khảo sát với nhiều cặp mồi lục lạp hơn và số lượng enzyme hạn chế cũng cần được tăng lên. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Page 7 Tuy nhiên với kết quả này có thể kết luận sơ bộ là các mẫu của loài nghiên cứu là rất bảo thủ ở locus trnD – trnT. Nói khác đi là ở locus này giữa các mẫu của loài có độ tương đồng về mặt di truyền ở hệ gen lục lạp là rất cao. Hơn nữa, về bản chất thì hệ gen lục lạp là hệ gen rất ít có những biến động giữa các cá thể cùng loài. KẾT LUẬN Trong phân tích đa dạng di truyền các mẫu cây Mỡ Hải Nam bằng chỉ thị RAPD, 5 mồi ngẫu nhiên được sử dụng trong đó có 3 mồi cho tính đa hình về các phân đoạn ADN được nhân bản. Số phân đoạn nhân lên tương ứng với 110 băng vạch và có 27 băng vạch cho tích đa hình về phân đoạn ADN nhân bản chiếm 24,5%. Mồi cho tính đa hình cao nhất là OPB18, hai mồi RA142 và OPB10 không cho tính đa hình về phân đoạn ADN nhân bản. Trong 50 mẫu Mỡ Hải Nam nghiên cứu, mẫu II-6 tách biệt so với 49 còn lại và có độ tương đồng là 58,3%. Các mẫu còn lại có độ tương đồng dao động từ 83-100% và phân bố trong các phân nhóm nhỏ. Mặc dầu vậy sự đa dạng di truyền cũng thể hiện ngay trong cùng một vùng địa lý thu thập mẫu: các mẫu thuộc cây mẹ III-1 và III-2 (xuất xứ Ba Vì) lập thành một nhóm khác biệt với các nhóm khác tới 16,5%, các mẫu thuộc các cây mẹ II-1, II-7, II- 5, II-8, II-21 và II-19 (xuất xứ Tianlake Jiangfeng) lập thành nhóm khác biệt với các nhóm khác khoảng 11%. Trong khi đó, 3 mẫu thuộc xuất xứ Southern Jiangfeng (I) có hai mẫu I-9 và I-20 có độ tương đồng cao xấp xỉ 100% và có sự khác biệt lớn so với mẫu I1. Một số mẫu có mức độ sai khác di truyền thấp bởi vì chúng được thu hái từ cùng cây mẹ hoặc các cây mẹ có quan hệ di truyền gần gũi nhau (như các mẫu thu từ Ba Vì). Trong 3 vùng nghiên cứu, các mẫu thuộc xuất xứ Ba Vì (trừ 2 cây mẹ III-1 và III-2 lập thành phân nhóm riêng) tập trung trong các phân nhóm C và D với mức độ tương đồng cao, các mẫu nhóm thuộc xuất xứ Tianlake Jiangfeng tập trung ở hai phân nhóm 1 và 2. Sự đa dạng di truyền thể hiện ngay trong cùng một vùng địa lí thu thập mẫu. Cặp mồi đặc hiệu cpSSR dùng trong phân tích ADN lục lạp của 10 mẫu Mỡ Hải Nam đã không chỉ ra tính đa hình cả khi phân tích bằng các enzyme hạn chế. Kết quả nhận được cho phép khẳng định thêm sự bảo thủ di truyền rất cao trong hệ gen lục lạp ở loài cây này. TÀI LIỆU THAM KHẢO Devos N, Tyteca D, Raspe O, Wesselingh R.A., and Jacquemart A.L. (2003) Patterns of chloroplast diversity among western European Dactylorhiza species (Orchidaceae). Plant Syst Evol 243: 85-97. Doyle J.J. and Doyle J.L. (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13-15 Heinze B. (2007) A database of PCR primers for the chloroplast genomes of higher plants. Plants Methods 2007: 3- 4. James R. F. (1998) NTSYSpc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 2.0. Exeter software Setauket, New York: 11733-2870. Marilyn W. and Jose C. (2002) “data analysis in the CIMMYT Applied Biotechnology Center for fingerprinting and Genetic”. Mason-Gamer R.J., Holsinger K.E., and Jansen R.K. (1995) Chloroplast DNA haplotype variation within and among populations of Coreopsis grandiflora (Asteraceae). Mol Biol Evol 12(3): 371-381. McMillan E., and Sun G. (2004) Genetic relationships of tetraploid Elymus speciess and their genomic donor speciess inferred from polymerase chain reaction – restriction length polymorphism analysis of chloroplast gene regions. Theor Appl Gent 108: 535-542. Mohanty A, Martin JP, Aguinagalde I (2001) Chloroplast DNA study in wild populations and some cultivars of Prunu avium L. Theor Appl Genet 103: 112-117. Navascues M, and Emerson B.C. (2005). Chloroplast microsatellites: measure of genetic diversity and the effect of homoplasy. Mol Ecol 14: 1333-1341. Nei M, WH Li, (1979) Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction end nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76. 5269-5273 Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005) Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam dựa trên đa hình ADN genome và lục lạp. Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2005. 1379-1382. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Nguyễn Đức Thành, Trần Thùy Linh (2007) Kết quả phân tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz)) bằng chỉ thị phân tử RAPD. Tạp chí Nông nghiệp &PTNT, 14/2007, 44-48. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Quốc Trọng, Nguyễn Đức Thành (2005) Kết quả bước đầu đánh giá đa dạng di truyền của ba xuất xứ Lim xanh bằng chỉ thị phân tử RAPD và ADN lục lạp. Tạp chí Nông nghiệp &PTNT, 15/2005, 80- 81. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Văn Tiến, Nguyễn Thúy Hạnh, Nguyễn Đức Thành (2006) Kết quả phân tích đa dạng di truyền loài Sao hình lá tim (Hopea cordata Vidal) thuộc họ dầu (Dipterocarpaceae) bằng chỉ thị phân tử. Thông tin khoa học kỹ thuật Lâm nghiệp, 1:1-6. Nguyễn Thuý Hạnh (2005) Nghiên cứu mối quan hệ di truyền một số chi và loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam bằng chỉ thị RAPD và DNA lục lạp. Luận án cao học Page 8 Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005) Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus (họ Dipterocarpaceae) dựa trên các chỉ thị phân tử. Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc “Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản”, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội, 2005. 89-92. Nicolosi E, Deng ZN, Gentle A., Mafa SL, Continella G, Tribulato E (2000) Citrus phylogeny and genetic origin of important species as investigated by molecular marker. Theor Appl Genet 100: 1155-1166. Pardo C, Cubas P, and Tahiri H (2004) Molecular phylogeny and systematics of Genista (Leguminose) and related genera based on nucleotide sequences of nrDNA (ITS region) and cpDNA (trnL-trnF intergenic spacer). Plant Syst Evol 244: 93-119. Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa (2004) Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim Xanh Erythrophleum fordii Oliv. Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc 2004: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật: 464-468. Ravinsanka KV., Lahitha A., Dinesh MR (2000) Assement of genetic relatedness among mango cultivals of India using RAPD marker. Hort Sci Biot: 87 – 89. Trương Quang Vinh, Nguyễn Thị Tâm, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Thanh Danh (2008) Đánh giá sự đa hình ADN một số giống khoai tây (solanum tuberosum L.) bằng kỹ thuật RAPD. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông Thôn, số 1: 20-25. GENETIC DIVESITY ANALYSIS OF MANAGLIETIA HAINANENSIS DANDY BY RAPD AND CPSSR MARKERS Nguyen Hoang Nghia, Tran Thanh Trang Forest Science Institute of Vietnam Do Tien Phat, Nguyen Van Phuong, Le Van Son, Chu Hoang Ha Biotechnology Institute Summary Fifty leaf samples collected from a Manglietia hainanensis Dandy provenance trial established with different provenances (two from China and one from Vietnam) were genetically analyzed by molecular markers (RAPD and cpSSR markers) in order to suggest suitable measures for genetic conservation of the species in the future. Among five RAPD markers used, three of them (OPD18, RA46 and RA159) gave polymorphic DNA bands while the other two (OPB10 and RA142) did not. Among 50 samples, one sample (II-6, Tianlake Jiangfeng) is genetically separated far from others with a similarity of 58.3%. The rest of the samples have quite high similarities, from 82% to 100%. This fact is surprising and a cause for concern as the provenances were collected from two different geographic areas: Hainan Island (China); and Bavi National Park (Vietnam). However, genetic diversity is present in samples collected in the same area: samples of the mother tree III-1 and III-2 (Bavi provenance) formed a different group far from other groups of up to 16,5%, other samples of the mother trees II-1, II-7, II-5, II-8, II-21 and II-19 (Tianlake Jiangfeng) formed a different group far from others of 11%, while the samples belonging to Southern Jiangfeng provenance namely I-9 and I-20 gave high similarity, nearly 100% and differ from I-1. The fact is that some samples have low genetic difference as they were collected from the same mother tree or those mother trees are close relatives (e.g. samples III collected from Bavi). The cpSSR makers used in the molecular analysis of ten representative samples did not give polymorphic DNA bands, meaning that the genetic content in chloroplast DNA of Manglietia hainanensis is highly conservative. Key words: Manglietia hainanensis Dandy, Genetic diversity, CpSSR, RAPD. . Nghiên cứu khoa học PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN HỆ GEN NHÂN CỦA LOÀI MỠ HẢI NAM (MANAGLIETIA HAINANENSIS DANDY) BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ cpSSR . Page 1 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG. nghiên cứu. ADN của 50 mẫu lá Mỡ được tách chiết và phân tích bằng chỉ thị RAPD. Sau khi phân tích bằng chỉ thị RAPD, ADN của 10 mẫu lá Mỡ Hải Nam (Bảng 1) đại di n trong 3 nhóm được phân tích. mức độ đa dạng di truyền của loài và xuất xứ bằng việc sử dụng các chỉ thị phân tử RAPD và chỉ thị lục lạp cpSSR nhằm đưa ra giải pháp hợp lý cho việc bảo tồn nguồn gen của loài Mỡ Hải Nam trong