KHÁI QUÁT VỀ ĐỊA Y
Định nghĩa và phân loại
Địa y là một dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, hình thành từ sự cộng sinh giữa nấm (mycobiont) và một thành phần quang hợp, thường là tảo (green alga) hoặc vi khuẩn lam (cyanobacterium).
Khoảng 17 000 loài địa y đã được biết Địa y thường được chia làm ba dạng: dạng khảm (crustose), dạng phiến (foliose) và dạng sợi (frucose) [30]
Hình 1.1 Ba dạng chính của địa y
Địa y là sự kết hợp giữa tảo và nấm, trong đó tảo sản sinh carbohydrate qua quá trình quang hợp, còn nấm tạo ra các hợp chất tự nhiên để chống lại tia UV, sâu bọ và động vật ăn cỏ, đồng thời cung cấp nước và khoáng chất Sự cộng sinh này cho phép địa y phát triển và tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng vĩ độ cao và nhiệt đới, có mặt ở nhiều nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại và thủy tinh Để hiểu rõ về bản chất và nguồn gốc của địa y, các nhà thực vật học đã cố gắng tổng hợp chúng từ tảo và nấm, tuy nhiên, việc tái tổ hợp thành phần địa y vẫn gặp nhiều thách thức.
Hoạt tính các hợp chất trong địa y
Địa y sản sinh ra nhiều hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học, nhưng việc nghiên cứu hóa học trên địa y gặp khó khăn do nguồn cung hạn chế và tốc độ phát triển chậm Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng việc nuôi cấy địa y trong phòng thí nghiệm rất khó khăn, với tỷ lệ thành công chỉ khoảng 10%, và các hợp chất hữu cơ thu được từ địa y nuôi cấy khác biệt so với các hợp chất trong địa y tự nhiên.
Đến nay, gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập và nghiên cứu về hoạt tính sinh học cũng như khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên này đã được tổng hợp đầy đủ bởi Huneck (1999), Muller (2001) và Boustie (2007) Các nghiên cứu này chỉ ra rằng các hợp chất địa y có tiềm năng kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm và kháng enzyme.
1.1.2.1 Hoạt tính đối với động vật [30]
Caperatic acid và các cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis và
Xanthoparmelia cumberlanda kìm hãm sự tăng trưởng của loài ốc Pallifera varia
Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng của loài giun Toxocara canis
Atranorin, pulvinic acid dilactone, calycin, parietin, evernic acid, psoromic acid, physodic acid, 3-hydroxyphysodic acid, fumarprotocetraric acid, stictic acid, norstictic acid, salazinic acid, vulpinic acid, rhizocarpic acid, and usnic acid effectively inhibit the growth of the polyphagous larvae Spodoptera littoralis, while not affecting their survival.
1.1.2.2 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao [30]
Bảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao Địa y hoặc các hợp chất của địa y Hoạt tính
Acid barbatic, acid 4-O-demethylbarbatic, acid diffractaic, acid evernic, acid lecanoric, acid β-orcinolcarboxylic, acid orsellinic Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp
Ergochrome AA (acid secalonic A) Gây độc cho thực vật
Acid evernic Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau bina
Acid lecanoric Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây Allium cepa
Các hợp chất phenol đơn vòng Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật
Các quinone từ Pyxine spp Ức chế sự nguyên phân của rễ cây
Usnic acid Ức chế sự nảy mầm và phát triển của
1.1.2.3 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus
Anthraquinone như emodin và các chất tương tự có hoạt tính kháng virus, trong khi hypericin cho thấy hoạt tính đáng kể chống lại sự sao chép ngược của virus HIV Các hợp chất 7,7’-dichlorohypericin và 5,7-dichloroemodin có hoạt tính mạnh đối với virus HSV-1, với hoạt tính tăng theo số lượng nguyên tử Cl trong cấu trúc Depside và depsidone có khả năng ức chế sự sao chép của virus HIV thông qua enzyme intergrase, với depsidone có cấu trúc vòng 11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-11-one được cho là nguồn gốc của hoạt tính này Mặc dù depside có hoạt tính yếu, nhưng các β-depsidone như virensic acid, granulatine, stictic acid và chloroparellic acid cho thấy khả năng tương đương với giá trị IC50 khoảng 3 µM Các β-depsidone khác như physodic acid, norlobaric acid, salarinic acid và parellic acid cũng có hoạt tính với giá trị IC50 trong khoảng vài µM.
3 h có hoạt tính kháng virus như protolichesterinic ức chế sự nhân bản DNA của virus HIV với giỏ trị IC50 khoảng 24 àM (Bảng 1.2) [23]
Bảng 1.2 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus Hợp chất Virus và enzyme của virus
Depsidone: virensic acid và dẫn xuất tương tự
Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV
Butyrolactone acid: protolichesterinic acid Nhân bản của HIV
(+)-Usnic acid và 4 depside khác Virus Epstein-Barr (EBV)
Emodin, 7-cloroemodin, 7-chloro-1-O- methylemodin, 5,7-dichloroemodin, hypericin
HIV, cytomegalovirus và các virus khác
1.1.2.4 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm [30]
Các hợp chất từ địa y, như acid protolichesterinic, đã được chứng minh có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả, đặc biệt là với Helicobacter pylori, một loại vi khuẩn liên quan đến đau dạ dày Nhiều hợp chất địa y khác như alectosarmentin, pannarin, chloropannarin, emodin, physcion, evernic acid, leprapinic acid và các dẫn xuất của chúng cũng có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm Khả năng kháng nấm của các hợp chất này được đánh giá thông qua giá trị MIC, với parietin, fallacinal và emodin là những ví dụ tiêu biểu Đặc biệt, usnic acid và các dẫn xuất của nó thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh trên nhiều dòng vi khuẩn khác nhau.
Bảng 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm [30]
Usnic acid và các dẫn xuất Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp.,
Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Mycobacterium aurum
Methyl orsellinate, ethyl orsellinate, methyl β-orsellinate, methyl haematommate
Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, M gypseum,
Trichophyton rubrum, T mentagrophytes, Verticillium achliae, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Cvàida albicans
Pulvinic acid và dẫn xuất Drechslera rostrata, Alternaria alternata
Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí Leprapinic acid và dẫn xuất Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)
1.1.2.5 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến
Usnic acid, một hợp chất từ địa y, có khả năng gây độc tế bào mạnh mẽ Khả năng kháng u của usnic acid đã được phát hiện cách đây 30 năm, và lần đầu tiên được thử nghiệm trên hệ thống ung thư phổi Lewis bởi Kupchan.
Kopperman [23] Những nghiên cứu về mối liên hệ hoạt tính cấu trúc cũng được khảo
Nghiên cứu cho thấy tính thân dầu (lipophilicity) đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây độc tế bào Cấu trúc của acid usnic với hai liên kết hydrogen nội phân tử đã làm tăng đáng kể tính thân dầu tự nhiên của nó.
Depside và depsidone cho thấy độc tính tế bào tương đối, với depsidone lobaric acid và depside baeomyceic acid có khả năng ức chế sự phát triển của 14 loại tế bào ung thư, giá trị IC50 dao động từ 12-65 µg/ml Bên cạnh đó, depsidone pannarin và depside sphaerophin cũng có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU-145 và tế bào ung thư da M14, với IC50 trong khoảng 25-30 µg/ml.
Bảng 1.4 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến [23] [30]
Hợp chất Hoạt tính trên loại tế bào
(-)-Usnic acid Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại tế bào sừng hóa HaCaT
Protolichesterinic acid Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu K-562 và khối u rắn Ehrlich
Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào
Naphthazarin Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa
Scabrosin ester và dẫn xuất, euplectin Gây độc chống lại tế bào murine P815 mastocytoma và các dòng tế bào khác
Hydrocarpone, salazinic acid, stitic acid Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan chuột
Axit psoromic, chrysophanol và emodin cùng các dẫn xuất của chúng có khả năng chống lại tế bào ung thư bạch cầu Bên cạnh đó, một số hợp chất cũng cho thấy hoạt tính ức chế enzyme, được trình bày trong bảng 1.5.
Bảng 1.5 Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y [23]
Hợp chất của địa y Enzyme bịức chế
Bis-(2,4-dihydroxy-6-n- propylphenyl)methane, divarinol, cao chiết từ
Cetraria juniperina, Hypogymnia physodes và
Confluentic acid, 2β-O-methylperlatolic acid Monoaminoxidase B
(+)-Protolichesterinic acid 5-Lipoxygenase (Sao chép ngược
NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI ĐỊA Y THUỘC CHI PARMOTREMA
(+)-Praesorediosic acid (1), (+)-protopraesorediosic acid (2), atranorin (11) và chloroatranorin (12) được cô lập bởi David F và cộng sự [6]
Lecanoric acid (14) và stictic acid (18) được cô lập từ Parmelia praesorediosa
(Nyl.) bởi Ramesh P và cộng sự [26]
Huỳnh B L Chi và cộng sự đã cô lập được prasoether A (42), zeorin (46), và 1β,3β-diacetoxyhopan-29-oic acid (57) [16][17]
Atranorin (11), lecanoric acid (14) và α-collatolic acid (25) được cô lập bởi Neeraj V và cộng sự [24]
Hà Xuân Phong successfully isolated ten compounds from the lichen species Parmotrema sancti-angelii, including 8-(2,4-Dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-hydroxy-3-pentyl-1H-isochromen-1-one, gyrophoric acid, lecanoric acid, orsellinic acid, methyl orsellinate, methyl β-orsellinate, methyl haematomate, and three novel bicyclic compounds designated as Sancti A-C.
Protocetraric acid (21), malonprotocetraric acid (23) và (+)-(12R)-usnic acid
(40) được cô lập bởi Keogh M F [19]
Depside atranorin (11), các depsidone salazinic acid (16), norstictic acid (19), hypostictic acid (20) và protocetraric acid (21) được cô lập từ Parmotrema dilatum bởi Honda N K và cộng sự [12]
Depside atranorin (11), depsidone salazinic acid (16) và xanthone lichexanthone (40) được cô lập từ cao chloroform của loài địa y Pamotrema lichexanthonicum bởi Ana C M và cộng sự [1]
Methyl orsellinate (5), ethyl orsellinate (6), n-butyl orsellinate (7), methyl β- orsellinate (8), methyl haematommate (9), ethyl chlorohaematommate (10), atranorin
(11), chloroatranorin (12), α-alectoronic acid (24), α-collatolic acid (25), 2′′′-O- methyl-α-alectoronic acid (26), 2′′′-O-ethyl-α-alectoronic acid (27), dehydroalectoronic acid (28), dehydrocollatolic acid (29), parmosidone A (30),
8 h parmosidone B (31), parmosidone C (32), isocoumarin A (33), isocoumarin B (34), β- alectoronic acid (36), 2′′′-O-methyl-β-alectoronic acid (37), 2′′′-O-ethyl-β-alectoronic acid (38), (+)-(12R)-usnic acid (39) và skyrin (41) được cô lập từ loài địa y
Parmotrema mellissii thu hái ở thành phố Đà Lạt bởi Lê Hoàng Duy [22]
Parmotrema nilgherrense α-Alectoronic acid (24), α-collatolic acid (25) và dehydrocollatolic acid (29) được cô lập bởi Kharel M K và cộng sự [20]
Depside atranorin (11) được cô lập bởi Neeraj V và cộng sự [24]
Năm 2011, Dương T Huy và cộng sự [7] đã cô lập được 7 hợp chất gồm có methyl β-orsellinate (8), methyl orsellinate (5), orsellinic acid (4), methyl haematommate (9), atranorin (11), lecanoric acid (14), (+)-(12R)-usnic acid (39)
Năm 2012, orcinol (3), gyrophoric acid (13), protocetraric acid (21), 9’-O- methylprotocetraric acid (22), 2-[3-(2,6-dihydroxy-4-methylbenzyl)-2,4-dihydroxy-6- methylphenoxy]-3-formyl-4-hydroxy-6-methylbenzoate (35), được cô lập bởi Dương
Atranorin (11), chloroatranorin (12), salazinic acid (16) và consalazinic acid
(17) được cô lập từ cao acetone bởi Fazio A T và cộng sự [10]
Atranorin (11) và chloroatranorin (12) được cô lập từ cao hexane của loài địa y
Parmotrema saccatilobum bởi Bugni T S và cộng sự [5]
Orsellinic acid (4), methyl orsellinate (5), atranorin (11) và lecanoric acid (14) được cô lập bởi Javaprakasha G K và cộng sự [18]
Depside atranorin (11) và hai depsidone salazinic acid (16) và consalazinic acid
(17) được cô lập từ cao acetone bởi O’Donovan D G và cộng sự [25]
Isolecanoric acid (15) được cô lập bởi Sakurai A và cộng sự [27]
Ethyl orsellinate (6) được cô lập bởi Santos L C và cộng sự [28]
Atranorin (11) và lecanoric acid (14) được cô lập bởi Honda N K và cộng sự [12]
Hợp chất phenolic đơn vòng
Orsellinic acid ( 4 ) Methyl orsellinate ( 5 ) Ethyl orsellinate ( 6 ) n-Butyl orsellinate ( 7 )
Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema
Parmosidone A (30) R= a− C 2 H 5 [H-5''' (d H 5.28 (d, 5.0 Hz)] Parmosidone B (31) R= β -C 2 H 5 [H-5''' (d H 5.29 (dd, 5.5, 3.5 Hz)] Parmosidone C (32) R=C 4 H 9
R 1 R 2 R 3 Salazinic acid (16) H CHO CH 2 OH Consalazinic acid (17) H CH 2 OH CH 2 OH Stictic acid (18) CH 3 CHO CH 3
Norstictic acid (19) H CHO CH 3 Hypostictic acid (20) CH 3 CH 3 CH 3
Protocetraric acid (21) H 9'-O- Methylprotocetraric acid (17) CH 3 Malonprotocetraric acid (23) COCH 2 COOH
Methyl 2-[3-(2,6-dihydroxy-4- methylbenzyl)-2,4-dihydroxy-6- methylphenoxy]-3-formyl-4-hydroxy- 6-methylbenzoate ( 35 )
R 1 R 2 β-Alectoronic acid ( 36 ) H H 2'''-O-Methyl-β-alectoronic acid ( 37 ) H CH 3 2'''-O-Ethyl-β-alectoronic acid ( 38 ) H C 2 H 5
Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema (tiếp)
HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ
Hóa chất
• Silica gel 0.04 – 0.06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí
• Sắc kí bảng mỏng loại Kieselgel 60F254 (20×20), Merck
• Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol và nước cất
• Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng vanillin/H 2 SO 4
Thiết bị, dụng cụ
• Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu
• Máy cô quay chân không Buchi-111, bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath
• Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm
• Các thiết bị ghi phổ: phổ 1 H-NMR tần số 500 MHz và phổ 13 C - NMR ở tần số
125 MHz tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh
NGUYÊN LIỆU
Hình 2.1 Tản địa y Parmotrema sancti-angelii
Loài địa y Parmotrema sancti-angelii (Lynge) Hale thu hái trên thân cây trà
Camellia sinensis (L.) O Ktze được tìm thấy tại thành phố Bảo Lộc, tỉnh Lâm Đồng Tên khoa học của loài này được xác định bởi tiến sĩ Harrie J M Sipman từ Vườn và bảo tàng thực vật, Đại học Freie, Berlin, Đức Mẫu ký hiệu số US-B025 hiện đang được lưu giữ tại bộ sưu tập thực vật của bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên.
QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
Bột địa y khô (350 g) được ngâm trong acetone ở nhiệt độ phòng, sau đó cô quay để thu hồi dung môi, thu được 145.1 g cao acetone thô Trong quá trình bay hơi dung môi, tủa xuất hiện và được lọc riêng, thu được 30.0 g tủa P.
Dịch chiết đem cô quay thu được cao acetone (110.4 g) Sắc kí cột trên cao acetone với hệ dung môi hexane–ethyl acetate (9:1) thu được cao H0 (6.1 g) Tiếp theo, giải ly với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần (8:2, 7:3, 6:4, 4:6, 3:7) thu được các phân đoạn H1 (2.1 g), C (15.4 g), EA1 (4.5 g), EA2 (5.1 g), và EA3 (9.8 g).
Tiến hành sắc kí cột trên phân đoạn H1 (2.1 g) với hệ dung môi hexane–ethyl acetate–acetic acid (9:1:0.5) đã thu được năm phân đoạn: H1.1 (1.1 g), H1.2–H1.4 (0.5 g) và H1.5 (197.3 mg) Tiếp theo, thực hiện sắc kí lớp mỏng trên phân đoạn H1.5 (197.3 mg) sử dụng hệ dung môi H:A:M (7:3:0.4), kết quả thu được hai hợp chất H3.79 (4.9 mg) và P2 (3 mg).
Sơ đồ 2.1 Qúa trình ly trích và cô lập trên địa y Parmotrema sancti-angelii
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT H3.79
Hợp chất H3.79 (4.9 mg) thu được từ phân đoạn H1.5 của địa y Parmotrema sancti-angelii với các đặc điểm sau:
• Là chất bột vô định hình màu trắng
• Phổ 1 H-NMR (500 MHz, Acetone-d6): Phụ lục 1
• Phổ 13 C-NMR (125 MHz, Acetone-d6): Phụ lục 2
Bi ện luận cấu trúc hợp chất H3.79:
Phổ 1 H-NMR cho thấy 8 nhóm methyl mũi đơn ở δ 1.19 (3H, s, H-23), 1.02 (3H, s, H-24), 0.91 (3H, s, H-25), 1.09 (3H, s, H-26), 1.07 (3H, s, H-27), 0.81 (3H, s, H-28),
1.26 (3H, s, H-29), 1.13 (3H, s, H-30), hai nhóm oxymethine tại δ 3.93 (1H, m, H-6) và 4.06 (1H, ddd, J.5, 9.5, 4.5 Hz, H-16) Phổ 13 C-NMR cho thấy sự hiện diện của
Hợp chất có 30 carbon, bao gồm 2 nhóm oxymethine tại δC 65.8 (C-16) và 67.1 (C-6), 5 carbon tứ cấp, 5 nhóm methine, 9 nhóm methylene và 8 nhóm methyl Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của H3.79 cho thấy sự tương đồng với dữ liệu của zeorin ở các vòng A và B.
So sánh dữ liệu phổ NMR giữa H3.79 và zeorin cho thấy sự khác biệt chính là sự xuất hiện của nhóm oxymethine (δH 4.06, ddd, J 5, 9.5, 4.5 Hz) thay thế cho nhóm methylene tại C-16 trong hợp chất zeorin Đồng thời, nhóm methine H-5 (δH 0.87, d, J 10.5 Hz) tương tác spin-spin 1 H-1 H nhị trục với nhóm methine tại (δH 3.93, m, H-).
Việc tái khẳng định vị trí 6α của nhóm hydroxyl là rất quan trọng Phân tích hằng số ghép của H-16 cho thấy proton này ghép cặp với hai proton khác ở vị trí trục, mang lại những giá trị cụ thể.
Tần số J aa là 11.5 Hz và 9.5 Hz, xác nhận định hướng β của nhóm 16-OH Dựa trên kết quả phân tích và tài liệu tham khảo, H3.79 đã được xác định là leucotylin (Hình 3.1).
Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của zeorin và H3.79
Hình 3.2 Cấu dạng của hợp chất H3.79
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất zeorin và H3.79
KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT P2
Hợp chất P2 (3 mg) thu được từ phân đoạn H1.5 của địa y Paemotrema sancti-angelii với các đặc điểm sau:
• Chất bột vô định hình màu trắng
• Phổ 1H-NMR (500 MHz, Acetone): Phụ lục 3 : 2.23 (3H, s),
Bi ện luận cấu trúc hợp chất P2:
Phổ 1 H-NMR cho thấy sự hiện diện của hai proton vòng thơm tại δ 6.26 (2H, s), cho thấy proton chịu ảnh hưởng của các nhóm –OR đẩy electron, đồng thời xác nhận P2 là hợp chất đối xứng với hai proton ở vị trí meta Ngoài ra, phổ 1 H-NMR còn chỉ ra một nhóm methyl thơm tại δ 2.23 (3H, s) và một nhóm aldehyde tại δ 10.26 (1H, s) Dựa trên dữ liệu phổ này và tài liệu tham khảo [14], hợp chất P2 được xác định là atranol (Hình 3.2).
Hình 3.3 Công thức hợp chất P2
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Atranol và P2