Ôn tập sinh học tuan 13 adn tái tổ hợp và các phương pháp phân tích gen may 2021 (1)

5/27/2021 TUẦN 13: CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH GEN Cơng nghệ ADN tái tổ hợp =>cách mạng cơng nghệ sinh học • N/C chức gen/hệ gen SV = tìm thiết kế phân tử SV CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP Công nghệ ADN tái tổ hợp tập hợp kỹ thuật phát triển để khuếch đại, trì cải biến trình tự ADN mức độ in vitro in vivo (bên ống nghiệm, tế bào, thể) • Cải biến gen theo ý muốn • Chuyển gen vào lồi CƠNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP ENZYME GIỚI HẠN VÀ ỨNG DỤNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH GEN Enzyme giới hạn Điện di gel agarose Vector Tách dòng gen Kỹ thuật PCR ứng dụng Tạo thư viện DNA hệ gen Tạo thư viện cDNA Giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger Các phương pháp lai phân tử (lai Southern blot, Northern blot, Western blot), FISH phân tích gen 10 Cơng nghệ chỉnh sửa gen Cần kéo phân tử https://biologydictionary.net/restriction-enzymes/#foobox-1/0/molecularscissors.jpg ENZYME GIỚI HẠN VÀ ỨNG DỤNG ENZYME GIỚI HẠN VÀ ỨNG DỤNG Lịch sử phát minh kéo phân tử (enzyme giới hạn) Nobel in Physiology or Medicine in 1978 (Endo-nuclease) (Restriction enzyme) Enzyme giới hạn = kéo phân tử = giúp cắt DNA thành đoạn mong muốn Enzyme giới hạn − Nhận biết trình tự ADN đặc trưng − Cắt trình tự ADN đích Restriction genome E.coli K12 (CH3) 5/27/2021 ENZYME GIỚI HẠN VÀ ỨNG DỤNG − Có > 3500 loại RE = nhận biết cắt trình tự khác ENZYME GIỚI HẠN VÀ ỨNG DỤNG − Một số dạng RE sử dụng sinh học phân tử: o Nhận biết cặp Nu=>256 bp (average) o Nhận biết cặp Nu => 4096 bp (average) − Trình tự nhận biết trình tự đối xứng (palindrome) => Đọc xuôi ngược giống o Nhận biết cặp Nu => 65.500 bp (average) − Tên enzyme giới hạn: Ví dụ : Vị trí cắt RE NST11 EcoRI Ký tự 5= số la mã số enzyme RE Chữ 1= Chữ đầu tên giống Escherichia Chứ thứ 4= chủng vi khuẩn RY13 Hai chữ = hai chữ tên loài coli ENZYME GIỚI HẠN VÀ ỨNG DỤNG ENZYME GIỚI HẠN VÀ ỨNG DỤNG  Enzyme giới hạn cắt đầu đầu dính a Cắt đầu  Enzyme giới hạn thủy phân liên kết phosphodiester b Cắt đầu dích 5’ c Cắt đầu dích 3’ Ứng dụng RE: Lập bàn đồ giới hạn ─ Xác định vị trí cắt enzyme giới hạn ADN Cắt enzyme giới hạn với EcoRI BamHI: Đoạn ADN 13 (13-kb) Ứng dụng RE: tạo ADN tái tổ hợp Restriction site 5 3 DNA tái tổ hợp: phân tử ADN tạo việc nối hai nhiều phân tử ADN khác 5 3 3 5 Sticky 3 3 5 Restriction enzyme cuts sugar-phosphate backbones 5 o Đầu dính bổ sung => bắt cặp với 3 GAATTC CTTAAG DNA end DNA fragment added from another molecule cut by same enzyme Base pairing occurs 5 5 3 3 o Mạch khung nối lại enzyme DNA ligase => tạo DNA tái tổ hợp 5 3 DNA ligase seals strands 3 5 G AATT C C TTAA G 53 3 5 G AATT C C TTAA G 5 3 One possible combination 5 3 5 3 5 3 DNA tái tổ hợp 5 5/27/2021 ĐIỆN DI TÊN GEL AGAROSE     Phân tách đoạn DNA Xác định kích thước đoạn DNA Xác định có mặt đoạn DNA hàm lượng Phân tích cắt enzyme giới hạn ĐIỆN DI TÊN GEL AGAROSE  Dòng điện chiều  DNA tích điện – => +  Các yếu tố ảnh hưởng đến điện di: o Điện trường (cường độ) o Kích thước đoạn DNA o Thuốc nhuồm huỳnh quang VECTOR ĐIỆN DI TÊN GEL AGAROSE  Phân tách đoạn DNA  Xác định kích thước đoạn DNA  Xác định có mặt đoạn DNA hàm lượng  Phân tích cắt enzyme giới hạn/PCR…  “Vector" hệ thống/ nhân tố mang đoạn ADN bên tế bào vật chủ Ví dụ: Plasmid =>vector VECTOR Cloning vector: tạo đoạn ADN tế bào vật chủ  Có hai loại vector chính:  Vector nhân dòng: Vector dùng để tạo đoạn ADN "cloning vector“ Vùng khởi đầu tài bản(ori) Origin of replication  Vector biểu hiện: dùng để biểu đoạn gen "expression vector" Gen kháng kháng sinh (Antibiotic resistance gene) Vị trí đa điểm cắt (MCS) (Multi-cloning site) 5/27/2021 5/27/2021 Expression vector: Vector thoi (Shuttle vector) Vector chép hai vật chủ khác Vùng khởi đầu tài bản(ori) Gen kháng kháng sinh Vị trí đa điểm cắt (MCS) => chứa cấu trúc biểu gen o Promoter o Ribosome binding site o Terminator/ (polyA site) Các loại vector thước đoạn chèn Shuttle vector for E coli and Saccharomyces cerevisiae 5/27/2021 NHÂN DỊNG ĐOẠN DNA ─ Nhân dịng đoạn DNA gì?  Tách đoạn DNA khỏi hệ gen  Tạo số lượng lớn đoạn DNA Bacterium Gene inserted into plasmid Bacterial Plasmid chromosome Recombinant DNA (plasmid) Gene of interest Plasmid put into bacterial cell Cell containing gene of interest DNA of chromosome (“foreign” DNA) Recombinant bacterium NHÂN DÒNG ĐOẠN DNA NHÂN DÒNG ĐOẠN DNA ─ Vector cho nhân dòng DNA  Điểm khởi đầu chép (Ori)  Gen thị (Kháng kháng sinh)  Vị trí đa điểm cắt (MCS) ─ Enzyme giới hạn đầu dính  Các đầu dính bổ sung với bắt cặp với  Các đầu dính (của enzyme giới hạn) => bắt cặp với ─ DNA ligase  Nối mạch khung phosphodiester ampr Ori ampr Ori 5/27/2021 Chọn lọc xanh-trắng Các bước ADN tải tổ hợp: • Tinh Vector ADN chứa gen đích + Gen mã hóa enzyme xúc tác X-gal thành màu xanh • Cắt vector với gen đích RE + Gen chèn vào LacZ gene tạo khuẩn lạc trắng • Nối vector gen đích DNA ligase + Vector không chứa DNA ngoại lai chèn vào LacZ gene tạo khuẩn lạc xanh Kết cắt nối ADN tải tổ hợp: khuẩn lạc xanh Biến nạp • Tạo plasmid có gen mong muốn khuẩn lạc trắng • Tạo vector khơng có gen Biến nạp • Phải chọn vector mang gen 5/27/2021 5/27/2021 FigureTECHNIQUE 20.4 Bacterial plasmid ampR gene Khơng có khuẩn lạc NHÂN DÒNG ĐOẠN ADN Hummingbird cell Foreign genome lacZ gene Restriction site Sticky ends Nhân dòng chọn lọc vector mang gen mong muốn Gene of interest Hummingbird DNA fragments Cut with restriction enzymes into either small large or Bacterial artificial fragments fragments chromosome (BAC) Large insert with many genes Recombinant plasmids Nonrecombinant plasmid Bacteria carrying plasmids Recombinant plasmids (b) BAC clone RESULTS Colony carrying nonrecombinant plasmid with intact lacZ gene Plasmid clone Colony carrying recombinant plasmid with disrupted lacZ gene One of many bacterial clones (a) Plasmid library (c) Storing genome libraries NHÂN DÒNG ĐOẠN DNA Nhân dòng vào vector biểu Ứng dụng nhân dòng DNA Đưa gen vào vector biểu phải theo chiều  Cắt vector RE  Cắt gen RE  Nối chiều vị trí cắt 5/27/2021 Host cell grown in culture to form a clone of cells containing the “cloned” gene of interest Protein expressed from gene of interest Gene of interest Protein harvested Copies of gene Basic research on gene Basic research and various applications Basic research on protein Gene for pest Gene used to alter Protein dissolves Human growth resistance inserted bacteria for cleaning blood clots in heart hormone treats into plants up toxic waste attack therapy stunted growth 5/27/2021 KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG • Thành phần phản ứng PCR: • Dr Kary Mullis phát minh PCR năm 1983 • PCR tạo cách mạng sinh học phân tử – – – – ADN khuôn dNTP (ATP, GTP, CTP, TTP) cặp mồi (xi, ngược) ADN polymerase (có khả đọc sửa, bền nhiệt) – Buffer cho ADN polymerase – Mg2+ (cofactor) Kary Mullis polymerase chain reaction Invented PCR 1983 • Kỹ thuật PCR (…………………………………… … ) phản ứng chuỗi trùng hợp: hàng tỷ copy – tạo nhiều copy (….…… ……………… ) đoạn DNA đích ~2-3h – thơi gian ngắn (……………………) Thermal cycler © 2011 Pearson Education, Inc Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR  Cặp mồi (primer)  DNA khuôn  Trong tế bào (in vivo), mồi cho chép ADN đoạn ARN sợi ngắn điềm khởi đầu cho sap chép ADN  Trong phản ứng PCR (in vitro), mồi (primers) sợi AND ngắn tổng hợp hóa học có trình tự bổ sung với phần đầu phần cuối đoạn AND đích cần nhân lên  Là trình tự đoạn ADN cần chép Được gọi ADN đích  Kích thước đoạn PCR: ~50 đến ~4000 cặp Nu (có thể tùy vào enzyme điều kiện pư)  DNA khuôn cần tinh trước PCR 5’ Reverse Primer 3’ 5’ Genomic DNA 3’ 5’ Genomic DNA 5’ 3’ Forward Primer 3’ Thành phần phản ứng PCR DNA polymerase • Chỉ tổng hợp sợi theo chiều từ 5’ đến 3’ • Sợi tổng hợp bổ sung với sợi khuôn 3’ 5’ 3’ Forward Primer 5’ Target DNA length ~50 -4000 bp Reverse Primer 3’ 5’ 3’ 5’ Target DNA length~50 -4000 bp Taq Polymerase • DNA polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus có khả bền nhiệt • Taq polymerase khơng có khả đọc sửa, tổng hợp sai (tạo đột biến) – Các enzyme bền nhiệt có khả đọc sửa (Pfu or KOD…) ưu tiên sử dụng • Taq khơng có khả tổng hợp đoạn DNA dài DNA polymerase – Để tổng hợp đoạn DNA dài (lên tới 35 kb) dung Tfl polymerase © John Wiley & Sons, Inc 5/27/2021 Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR  dNTPs  dNTPs (deoxynucleosides) nguyên liệu để tổng hợp sợi DNA G T A C A T G G C A C PCR Buffer  Duy trì mơi trường pH tốt co enzyme Taq, cung cấp Mg++  Nồng đô Mg++ cần tối ưu cho phản ứng với cặp mồi sợi khn  Ít Mg++ khơng có sản phẩm PCR, cịn nhiều Mg++ giảm tính đặc hiệu tạo băng phụ PCR Mỗi chu kỳ gồm giai đoạn: biến tính gắn mồi kéo dài chuỗi Mỗi chu kỳ gồm giai đoạn: biến tính gắn mồi kéo dài chuỗi Ứng dụng PCR Nhược điểm PCR • Tạo DNA tái tổ hợp • Phát tác nhân gây bệnh(SARS-CoV2, pathogenic microorganisms…) • Phát bệnh di truyền(e.g., chuẩn đoán trước sinh, bệnh di truyền, bệnh ung thư) • Hồ sơ ADN (DNA profiling/fingerprinting) • Phải biết trình tự hai vùng biên => mồi (primer) • Vấn đề nhiễm mẫu ADN • Không khuếch đại đoạn dài Agriculture Archaeology Medicine Forensics Molecular biology Botany Cell biology © John Wiley & Sons, Inc © John Wiley & Sons, Inc 5/27/2021 Tạo đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis) Cách TẠO THƯ VIỆN DNA HỆ GEN Cách 5/27/2021 5/27/2021 TẠO THƯ VIỆN cDNA TẠO THƯ VIỆN cDNA DNA in nucleus A complementary DNA (cDNA) – tạo phản ứng phiên mã ngược (RT-PCR) cDNA library => transcriptome Thư viện cDNA cho biết gen biểu mô, quan, giai đoạn phát triển thể mRNAs in cytoplasm © 2011 Pearson Education, Inc Tạo thư viện cDNA Tạo thư viện cDNA DNA in nucleus DNA in nucleus mRNAs in cytoplasm 5 mRNA Reverse transcriptase Poly-A tail A A A A A A 3 3 T T T T T 5 DNA Primer strand mRNAs in cytoplasm 5 5 3 mRNA Reverse transcriptase Poly-A tail A A A A A A 3 3 T T T T T 5 DNA Primer strand A A A A A A 3 T T T T T 5 5/27/2021 Tạo thư viện cDNA DNA in nucleus Tạo thư viện cDNA DNA in nucleus mRNAs in cytoplasm mRNAs in cytoplasm 5 mRNA 5 Reverse transcriptase Poly-A tail A A A A A A 3 3 T T T T T 5 DNA Primer strand mRNA Reverse transcriptase Poly-A tail A A A A A A 3 3 T T T T T 5 DNA Primer strand A A A A A A 3 T T T T T 5 5 3 A A A A A A 3 T T T T T 5 5 3 5 3 DNA polymerase 5 3 DNA polymerase 3 3 5 5 5 3 GIẢI TRÌNH TỰ ADN THEO PHƯƠNG PHÁP CỦA SANGER GIẢI TRÌNH TỰ ADN THEO PHƯƠNG PHÁP CỦA SANGER • • • • 3 5 cDNA Primer Deoxyribonucleotides Dideoxyribonucleotides T 3 (fluorescently tagged) DNA (template strand) 5 C Dựa tảng PCR Chỉ dùng mạch khuôn Chỉ dùng mồi (primer) Có thêm ddNTP 3 5 3 T G A C T T C G A C A A G T T dATP 5 ddCTP dTTP ddTTP dGTP ddGTP P P P P P P G OH DNA (template C strand) T G A C T T C G A C A A ddATP dCTP DNA polymerase ddC T G T T ddG C T G T T ddA G C T G T T Shortest Direction of movement of strands ddA A G C T G T T ddT G A A G C T G T T ddG A A G C T G T T G H Labeled strands ddC T G A A G C T G T T ddA C T G A A G C T G T T ddG A C T G A A G C T G T T 3 5 Longest Longest labeled strand Detector Laser Frederick Sanger Shortest labeled strand RESULTS Invented DNA sequencing (1975) Last nucleotide of longest labeled strand Last nucleotide of shortest labeled strand G A C T G A A G C Kết thúc tổng hợp chuỗi ngẫu nhiên © 2011 Pearson Education, Inc Figure 20.12a Figure 20.12b TECHNIQUE (continued) 5 TECHNIQUE DNA (template strand) 5 3 C T G A C T T C G A C A A Primer Deoxyribonucleotides Dideoxyribonucleotides T 3 (fluorescently tagged) G T T 5 DNA polymerase dATP ddATP dCTP ddCTP dTTP ddTTP dGTP ddGTP P P P G OH 3 P P P G H DNA (template C strand) T G A C T T C ddG G C ddC A T T C G G A T T A T T Shortest Direction of movement of strands Labeled strands ddA G C T G T T ddA A G C T G T T ddG A A G C T G T T ddT G A A G C T G T T ddC T G A A G C T G T T ddA C T G A A G C T G T T ddG A C T G A A G C T G T T 3 5 Longest Longest labeled strand Detector Laser Shortest labeled strand 5/27/2021 Figure 20.12c Direction of movement of strands CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH GEN Longest labeled strand Detector Laser Shortest labeled strand  Lai Southern blot  Lai Northern blot  Lai Western blot RESULTS Last nucleotide of longest labeled strand Last nucleotide of shortest labeled strand G A C T G A A G C © 2011 Pearson Education, Inc Lai ADN-ADN= Southern blot CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH GEN Nguyên lý:  Các DNA có trình tự bổ sung với =>bắt cặp với (lai với nhau) – Lai Southern blot: lai ADN-ADN – Lai Northern blot : lai AND với ARN – Lai Western blot: lai protein – protein (kháng thể )  Mẫu dò (probe): o Đoạn DNA ngắn có trình tự bổ sung với sợi gen đích (vùng bảo thủ) => liên kết đặc hiệu gen đích o Mẫu dị gắn tín hiệu phóng xạ/huỳnh quang => phát quang => nhận biết Tín hiệu huỳnh quang đâu => gen đích Lai ADN-ADN= Southern blot Các bước tiến hành: Ứng dụng Southern blot ADN hệ gen Phát trình tự DNA đặc trưng mẫu DNA Điện di Tách DNA hệ gen Cắt enzyme giới hạn Màng lai Phân tích đa hình đoạn cắt giới hạn (RFLP) Chuyển ADN lên màng lai Ủ màng lai với mẫu dò ADN Chụp ảnh x-ray/huỳnh quang 10 5/27/2021 Figure 20.11 TECHNIQUE Ví dụ: Lai Southern blot Normal -globin allele 175 bp DdeI DdeI DdeI DdeI Large fragment DdeI I II III DdeI (a) DdeI restriction sites in normal and sickle-cell alleles of the -globin gene 201 bp 175 bp Heavy weight Nitrocellulose membrane (blot) Gel Sponge I Normal II Sickle-cell III Heterozygote -globin allele allele Preparation of restriction fragments Large fragment Sickle-cell mutant -globin allele 376 bp Restriction fragments Normal Sickle-cell allele allele Large fragment 201 bp DdeI Ví dụ: Lai Southern blot DNA  restriction enzyme Alkaline solution Gel electrophoresis Paper towels DNA transfer (blotting) 376 bp I (b) Electrophoresis of restriction fragments from normal and sickle-cell alleles II III Probe base-pairs with fragments Fragment from sickle-cell -globin allele Radioactively labeled probe for -globin gene Nitrocellulose blot Fragment from normal - globin allele Hybridization with labeled probe I II III Film over blot Probe detection Northern blot CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH GEN Lai ADN với ARN – Lai Southern blot: lai ADN-ADN – Lai Northern blot : lai ADN với ARN – Lai Western blot: lai protein – protein (kháng thể ) Ngun lý:  Các DNA có trình tự bổ sung RNA=>bắt cặp với (lai với nhau)  Mẫu dị DNA => bổ sung mRNA (gen đích)  Mẫu dị ( gắn tín hiệu phát huỳnh quang) => phát mRNA gen đích Northern blot  Mẫu dị DNA => có trình tự bổ sung với gen đích  Mẫu dị có đánh dấu huỳnh quang => phát có mặt gen đích Ứng dụng Northern blot • Nghiên cứu khả biểu gen ở: – Các mô – Cơ quan – Các giai đoạn phát triện thể – Phát gen biểu mạnh, gen biểu yếu, gen gây bệnh, chống chịu sâu bệnh v.v… 11 5/27/2021 Microarray Western blot Lai protein- protein (Kháng nguyên - kháng thể) 5/27/2021 Ứng dụng Western blot FISH Fluorescent in situ hybridization • Biểu gen mức độ dịch mã=> khả biểu gen=> tìm gen tốt, có đặc tính biểu tốt • Phân tích bệnh Bệnh bị điên, lở mồm long móng, HIV, viêm gan B v.v… Để xác định gen (DNA/RNA) có tế bào/mơ thể SV sử dụng mẫu dò (probe) bắt cặp bổ sung 5/27/2021 FISH Fluorescent in situ hybridization 5/27/2021 5/27/2021 12 5/27/2021 10 Công nghệ chỉnh sửa gen sử dụng CRISPR-Cas Khoa Sinh học Đại học KHTN-ĐHQGHN Company Logo 10 Công nghệ chỉnh sửa gen sử dụng CRISPR-Cas Khoa Sinh học Đại học KHTN-ĐHQGHN Company Logo 10 Công nghệ CRISPR-Cas giúp phá hủy provirus HIV 5/27/2021 13