Miễn dịch học

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! Chương ĐẠI CƯƠNG VỀ MIỄN DỊCH HỌC Tên gọi tiếng Anh “immunity” (tính miễn dịch) có nguồn gốc từ tiếng Latinh “immunitas” có nghĩa miễn trừ cáo buộc pháp luật dành cho nghị sĩ quốc hội thời gian âæång chức Trong lịch sử, miễn dịch dùng để không mắc bệnh, mà cụ thể bệnh nhiễm trùng Trong thể, tất tế bào phân tử hoá học chịu trách nhiệm tính miễn dịch hợp thành hệ thống miễn dịch, toàn đáp ứng chúng tạo chất lạ xâm nhập vào thể gọi đáp ứng miễn dịch Chức sinh lý hệ thống miễn dịch bảo vệ thể chống lại vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào thể Tuy nhiên, chất lạ không gây bệnh xâm nhập vào thể gây đáp ứng miễn dịch Hơn nữa, chế bảo vệ bình thường cịn có gây số thương tổn cho thể Do đó, người ta đưa định nghĩa bao hàm tính miễn dịch phản ứng chất lạ, bao gồm vi khuẩn đại phân tử protein, polysaccharide, không kể phản ứng sinh lý hay bệnh lý Miễn dịch học mơn học nghiên cứu tính miễn dịch với nghĩa rộng hoạt động phân tử tế bào xảy sau vi sinh vật đại phân tử xâm nhập vào thể Các nhà sử học kể rằng: Thucydides, người Hy Lạp Athens, người vào kỷ thứ V trước Cơng ngun đề cập đến tính miễn dịch chống lại bệnh nhiễm trùng mà lúc gọi “bệnh dịch” Khái niệm “tính miễn dịch” có lẽ tồn lâu trước Trung Quốc người dân có tập tục cho người dân hít chất bột làm từ da người bị đậu mùa khỏi để phòng ngừa bệnh Cịn miễn dịch học, với tư cách mơn học đại, lại ngành khoa học thực nghiệm, tượng miễn dịch giải thích dựa quan sát thực nghiệm Miễn dịch học, với tư cách môn học thực nghiệm, tiến hoá theo lực người hiểu biết kiểm soát chức hệ thống miễn dịch Bằng chứng lịch sử lực thành công Edward Jenner việc chủng ngừa phòng bệnh đậu mùa Jenner thầy thuốc người Anh, ông quan sát thấy người vắt sữa bị bệnh đậu bò sau hồi phục khơng mắc bệnh đậu mùa Dựa vào nhận định này, ông lấy dịch từ vết thương người bị đậu bò tiêm cho đứa trẻ tuổi Đứa trẻ sau cho tiếp xúc trực tiếp với người bệnh đậu mùa khơng mắc bệnh ơng gọi cách bảo vệ "vaccination” (chủng ngừa) (chữ vaccination bắt nguồn từ tiếng Latinh “vacca” nghĩa bò cái) cho xuất sách “Vaccination” vào năm 1798 Từ biện pháp phịng bệnh nhiễm trùng phát triển rộng rãi phương pháp phịng ngừa hiệu bệnh nhiễm trùng (Bảng 1.1) Một văn có ý nghĩa quan trọng ngành Miễn dịch học công bố Tổ chức Y tế Thế giới năm 1980 bệnh đậu mùa bệnh giới bị loại trừ nhờ vào công tác chủng ngừa Từ năm 1960, có chuyển biến hiểu biết hệ thống miễn dịch chức Các tiến kỹ thuật ni cấy tế bào (kể kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dịng), hố miễn dịch, phương pháp DNA tái tổ hợp, động vật biến đổi gen, chuyển miễn dịch học từ chỗ chủ yếu hoạt động mô tả thành ngành khoa học mà tượng miễn dịch giải thích thuật ngữ sinh hoá cấu trúc Trong chương chúng tơi trình bày đặc điểm chung đáp ứng miễn dịch giới thiệu khái niệm tạo nên bước ngoặc ngành miễn dịch học đại Bảng 1.1 Hiệu vắc-xin số bệnh nhiễm trùng thường gặp Hoa Kỳ Bệnh Số bệnh nhân năm 2000 Số bệnh nhân năm 2000 Tỷ lệ phần trăm Bạch hầu 206.939 (1921) -99,99 Sởi 894.134 (1941) 63 -99,99 Quai bị 152.209 (1968) 315 -99,99 Ho gà 265.269 (1934) 6.755 -97,73 Bại liệt 21.269 (1952) -100,00 Rubella 57.686 (1969) 152 -99,84 Uốn ván 1.560 (1923) 26 -98,44 ~20.000 (1984) 1.212 -93,14 26.611 (1985) 6.646 -75,03 H Znfluenza typ B Viêm gan B 1.1 Tính miễn dịch bẩm sinh thu Sự đề kháng chống lại vi sinh vật thể ban đầu phản ứng hệ thống miễn dịch bẩm sinh sau miễn dịch thu (Hình 1.1, Bảng 1.2) Hệ miễn dịch bẩm sinh (còn gọi miễn dịch tự nhiên) bao gồm chế đề kháng tồn thể chưa có nhiễm trùng sẵn sàng đáp ứng nhanh vi sinh vật xâm nhập Các chế chủ yếu phản ứng chống lại vi sinh vật không phản ứng với vật lạ vi sinh vật; đồng thời chúng phản ứng theo chế giống hệt vi sinh vật xâm nhập tái tái lại Các thành phần miễn dịch bẩm sinh bao gồm: (1) hàng rào vật lý hoá học da, niêm mạc, chất kháng khuẩn tiết bề mặt này; (2) tế bào thực bào (tế bào trung tính, đại thực bào) tế bào NK (tế bào giết tự nhiên); (3) protein máu, bao gồm thành phần hệ thống bổ thể chất trung gian khác phản ứng viêm; (4) protein gọi cytokin có vai trị điều hoà phối hợp hoạt động tế bào hệ miễn dịch bẩm sinh Cơ chế hoạt động hệ miễn dịch bẩm sinh đặc hiệu cho cấu trúc chung nhóm vi sinh vật không đặc hiệu cho khác biệt tinh tế nhóm Hệ miễn dịch bẩm sinh tạo phản ứng chống lại xâm nhập vi sinh vật Ngược với hệ miễn dịch bẩm sinh, có đáp ứng miễn dịch khác kích thích tiếp xúc với vi sinh vật tạo cường độ tăng dần tiếp xúc lặp lặp lại Bởi dạng đáp ứng xuất sau vi sinh vật xâm nhập thể nên gọi miễn dịch thu Tính chất đặc biệt đáp ứng miễn dịch thu tính đặc hiệu phân tử khả “nhớ” phân tử xâm nhập trở lại thể để tạo đáp ứng mạnh nhiều so với lần xâm nhập Hệ miễn dịch thu có khả nhận diện phản ứng lại với nhiều vật lạ có chất nhiễm trùng khơng nhiễm trùng Ngồi ra, cịn có khả tuyệt vời viãûc phân biệt khác nhỏ vật lạ mà gọi miễn dịch đặc hiệu Các thành phần miễn dịch thu tế bào lymphô sản phẩm chúng Những chất lạ tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chịu tác động hệ miễn dịch gọi kháng nguyên Theo thói quen, thuật ngữ “đáp ứng miễn dịch” “hệ thống miễn dịch” thường dùng cho đáp ứng miễn dịch thu được, trừ có nhấn mạnh riêng khác đến miễn dịch bẩm sinh Hình 1.1 Miễn dịch bẩm sinh thu Các chế miễn dịch tự nhiên cung cấp sức đề kháng ban đầu nhiễm trùng Đáp ứng miễn dịch thu đến muộn với hoạt hoá tế bào lymphô Mức độ mạnh hay yếu đáp ứng miễn dịch bẩm sinh thu phụ thuộc loại nhiễm trùng Bảng 1.2 Đặc điểm miễn dịch bẩm sinh miễn dịch thu Đặc điểm Tính đặc hiệu Tính đa dạng Tính nhớ Tính khơng đáp ứng với thân Hàng rào lý hoá Các protein máu Tế bào Bẩm sinh Đối với cấu tạo chung nhóm vi sinh vật Ít Khơng Có Thu Đối với kháng ngun có khơng nhiễm trùng Rất nhiều Có Có Các thành phần tham gia Da, niêm mạc, hoá chất kháng khuẩn Bổ thể Thực bào, tế bào NK Tế bào lymphô niêm mạc; kháng thể niêm mạc Kháng thể Tế bào lymphô Các thành phần đáp ứng miễn dịch bẩm sinh thu thường xen lẫn với chế đề kháng chung thể thông qua nhiều loại tế bào phân tử Riêng miễn dịch bẩm sinh giúp thể khỏi cơng số vi sinh vật, nhiều vi sinh vật gây bệnh có khả vượt qua hàng rào miễn dịch nên loại trừ chúng cần đến chế đề kháng mạnh nhiều, miễn dịch thu Có hai mối liên kết quan trọng miễn dịch bẩm sinh thu Thứ nhất, miễn dịch bẩm sinh có khả kích thích đáp ứng miễn dịch thu ảnh hưởng đến chất miễn dịch thu Đáp ứng miễn dịch thu có sử dụng nhiều chế hiệu miễn dịch bẩm sinh để loại trừ vi sinh vật có khả tăng cường hoạt động kháng khuẩn miễn dịch thu Miễn dịch bẩm sinh mặt di truyền thuộc hệ thống đề kháng cổ thể chủ, miễn dịch thu có nhờ tiến hố sau Ở động vật có xương sống, sức đề kháng thể chủ chống lại vi sinh thể chủ yếu đảm trách miễn dịch bẩm sinh, bao gồm thực bào, phân tử protein lưu động máu Miễn dịch thu bao gồm tế bào lymphô kháng thể, xuất lồi xương sống có hàm biệt hố lồi tiến hố sau Các kiểu đáp ứng miễn dịch thu Có hai kiểu đáp ứng miễn dịch thu được, đáp ứng thể dịch đáp ứng qua trung gian tế bào Cả hai kiểu có tham gia nhiều thành phần hệ thống miễn dịch với mục đích loại trừ nhiều loại vi sinh vật khác khỏi thể (Hình 1.2) Miễn dịch dịch thể thực qua trung gian phân tử diện máu dịch niêm mạc có tên kháng thể, sản xuất tế bào lymphơ B (cịn gọi tế bào B) Kháng thể có khả nhận diện kháng nguyên vi sinh vật, trung hồ tính gây bệnh tác động lên vi sinh vật để loại trừ qua nhiều chế hiệu khác Miễn dịch dịch thể chế đề kháng chủ yếu chống lại vi sinh vật ngoại bào độc tố chúng theo chế kháng thể liên kết với vi sinh vật độc tố để xúc tiến việc loại trừ Bản thân kháng thể phân tử chun mơn hố, kháng thể khác tạo nhiều chế loại bỏ kháng nguyên khác Một số tuýp kháng thể có khả xúc tiến hoạt động thực bào, số khác lại kích thích tế bào bạch cầu sản xuất chất trung gian phản ứng viêm Miễn dịch qua trung gian tế bào (còn gọi miễn dịch tế bào) kiểu đáp ứng thực qua trung gian tế bào lymphơ T (cịn gọi tế bào T) Các vi sinh vật nội bào virus số vi khuẩn có khả sống nhân lên đại thực bào số tế bào chủ khác, chúng khơng chịu tác động trực tiếp kháng thể lưu động máu Sự đề kháng chống lại vi sinh vật kiểu chức miễn dịch tế bào Ngăn chặn nhiễm trùng loại bỏ vi sinh vật ngoại bào Hình 1.2 Các kiểu miễn dịch thu Trong miễn dịch dịch thể, tế bào B tiết kháng thể để ngăn chặn nhiễm trùng loại bỏ vi khuẩn ngoại bào Trong miễn dịch qua trung gian tế bào, tế bào T hoạt hóa đại thực bào để tiêu diệt vi khuẩn bị ăn vào bên tế bào tế bào T gây độc trực tiếp tiêu diệt tế bào bị nhiễm khuẩn Miễn dịch bảo vệ chống lại vi sinh vật tạo nhờ kích thích vi sinh vật nhờ truyền kháng thể tế bào lymphơ đặc hiệu từ bên ngồi vào (Hình 1.3) Cách thức tạo kháng thể qua kích thích trực tiếp với vật lạ gọi miễn dịch chủ động cá thể tiếp xúc với vật lạ đóng vai trị chủ động việc đáp ứng với kháng nguyên Những cá thể tế bào lymphô chưa tiếp xúc với kháng nguyên gọi “nguyên vẹn” hay “nguyên” (naive) Còn cá thể tiếp xúc với kháng nguyên vi sinh vật sau bảo vệ chống lại lần tiếp xúc khác gọi miễn nhiễm (immune) Hình 1.3 Miễn dịch chủ động thụ động Miễn dịch chủ động tạo thể chủ tiếp xúc với vi sinh vật kháng nguyên vi sinh vật, miễn dịch thụ động vay mượn nhờ truyền kháng thể hay tế bào lymphô T đặc hiệu Cả hai loại tạo sức đề kháng vi sinh vật chè có miễn dịch chủ động có tính nhớ miễn dịch Người ta mang tính miễn dịch đến cho cá thể cách truyền huyết tế bào lymphô từ cá thể khác gây miễn dịch Cách làm gọi truyền miễn dịch thụ động, thường hay thực động vật thí nghiệm Cơ thể nhận sau có tính miễn dịch chống lại kháng nguyên tương ứng chưa lần tiếp xúc với kháng nguyên Do kiểu miễn dịch gọi miễn dịch thụ động Gây miễn dịch thụ động phương pháp hữu ích để cung cấp sức đề kháng nhanh, chờ miễn dịch chủ động xuất Một ví dụ miễn dịch thụ động truyền kháng thể từ mẹ sang thời kỳ bào thai giúp cho đưa trẻ chống lại nhiễm trùng thời kỳ chờ đợi miễn dịch chủ động trẻ hình thành Người ta dùng phương pháp miễn dịch thụ động để chống lại độc tố vi khuẩn gây chết người (ví dụ độc tố uốn ván) cách truyền kháng thể từ vật gây miễn dịch vi sinh vật Kỹ thuật truyền miễn dịch thụ động (hay gọi tạo miễn dịch vay mượn) thực với tế bào phân tử khác miễn chúng có lực miễn dịch đặc hiệu Thật ra, thuật ngữ “miễn dịch dịch thể” (humoral immunity) ban đầu định nghĩa kiểu miễn dịch truyền sang cho vật chưa nhiễm chất dịch máu có chứa kháng thể khơng có tế bào (tức huyết huyết tương mà từ cổ gọi thể dịch - humor) Cũng vậy, miễn dịch qua trung gian tế bào (cell-mediated immunity) định nghĩa dạng miễn dịch truyền sang cho cá thể chưa nhiễm dạng tế bào (lymphô T) dịch thể Năm 1890, Emil von Behring Shibasaburo Kitasato trình diễn thí nghiệm miễn dịch dịch thể Họ cho thấy rằng, huyết vật khỏi bệnh bạch hầu truyền cho vật chưa nhiễm vật có khả đề kháng đặc hiệu bệnh bạch hầu Thành phần hiệu lực huyết lúc gọi kháng độc tố trung hồ tác dụng bệnh lý độc tố bạch hầu Đầu năm 1890, Karl Landsteiner nhà nghiên cứu khác chứng minh có độc tố mà chất khơng có nguồn gốc vi sinh vật khác tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể Từ thí nghiệm đó, người ta đưa thuật ngữ “kháng thể” (antibody) để thành phần protein huyết tạo tính miễn dịch dịch thể Những chất liên kết với kháng thể tạo sản xuất kháng thể gọi “kháng nguyên” (antigen) Năm 1900, Paul Ehrlich đưa lý thuyết tính đặc hiệu phản ứng kháng nguyên – kháng thể, mà chứng thực nghiệm cho lý thuyết đưa suốt 50 năm kể từ có phát Lansteiner Lý thuyết Ehrlich khớp mặt lý hố kháng ngun kháng thể có giá trị vào thời kỳ đầu miễn dịch học Sự nhấn mạnh kháng thể lý thuyết dẫn đến thừa nhận chung tầm quan trọng miễn dịch dịch thể, miễn dịch trung gian chất diện dịch thể Lý thuyết tế bào miễn dịch Metchnikoff đưa Trình diễn ơng thực bào xảy xung quanh gai hồng đâm vào thể suốt ấu trùng biển xuất năm 1893 Đây có lẽ chứng thực nghiệm vai trò đáp ứng tế bào vật lạ xâm nhập vào thể Các quan sát Sir Almroth Wright vào đầu năm 1900 cho thấy rằng, huyết miễn dịch có yếu tố thúc đẩy thực bào vi khuẩn cách bọc xung quanh vi khuẩn, điều làm người ta tin kháng thể chuẩn bị vi khuẩn để thực bào dễ bắt giữ hơn, trình gọi opsonin hoá Những người theo trường phái tế bào khơng chứng minh tính đặc hiệu miễn dịch vi sinh vật thể qua miễn dịch tế bào Lý thuyết tế bào miễn dịch khẳng định vào năm 1950, George Mackaness chứng tỏ rằng, đề kháng loài vi sinh vật nội bào, Listeria monocytogenes, vay mượn cách truyền tế bào truyền huyết Chúng ta biết tính đặc hiệu miễn dịch tế bào lymphơ, tế bào có chức làm nhạc trưởng để điều khiển tế bào khác đại thực bào nhằm loại bỏ vi sinh vật Trên lâm sàng, tính miễn dịch vi sinh vật bị nhiễm trước đo cách gián tiếp cách định lượng sản phẩm miễn dịch diện thể (ví dụ kháng thể đặc hiệu huyết thanh) chiết xuất chất từ thể vi sinh vật đánh giá phản ứng thể chất Một phản ứng cá thể kháng nguyên vi sinh vật xảy trước cá thể tiếp xúc với kháng nguyên rồi; cá thể gọi “mẫn cảm” kháng nguyên Người ta cho cá thể mẫn cảm có khả tạo đáp ứng miễn dịch bảo vệ vi sinh vật 1.3 Các đặc điểm đáp ứng miễn dịch thu Tất đáp ứng dịch thể tế bào vật lạ có nhiều tính chất phản ánh tính chất tế bào lymphơ làm trung gian cho phản ứng (Bảng 1.3) Bảng 1.3 Các đặc điểm đáp ứng miễn dịch thu Đặc điểm Đặc hiệu Đa dạng Nhớ Ý nghĩa chức Đảm bảo kháng nguyên khác tạo đáp ứng đặc hiệu riêng cho chúng Cho phép hệ thống miễn dịch đáp ứng nhiều loại kháng nguyên Dẫn đến đáp ứng mạnh kháng nguyên Chuyên mơn hố Tự giới hạn Khơng phản ứng với thân tiếp xúc Tạo đáp ứng tối ưu chống lại nhiều loại vi sinh vật khác Cho phép hệ thống miễn dịch đáp ứng với kháng nguyên xâm nhập Ngăn ngừa tổn thương thể chủ suốt trình phản ứng với kháng nguyên lạ 1.3.1 Tính đặc hiệu đa dạng Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cho kháng nguyên khác cho thành phần cấu trúc kháng nguyên protein, polysaccharide đại phân tử (Hình 1.4) Những thành phần kháng nguyên gọi định kháng nguyên hay epitop Tính đặc hiệu có nhờ màng tế bào lymphơ riêng lẻ có thụ thể riêng để nhận diện cấu trúc kháng nguyên khác Trong thể gây miễn dịch có nhiều clơn tế bào lymphơ với tính đặc hiệu khác tồn tại, chúng nhận diện đáp ứng lại tất kháng nguyên ngoại lai Khái niệm tảng lý thuyết chọn clôn mà đề cập đến sau Hình 1.4 Tính đặc hiệu, nhớ, tự giới hạn đáp ứng miễn dịch Hình 12.12 Điện di miễn dịch ngược dòng Điện di miễn dịch ngược dòng thường dùng tốt để sàng lọc huyết Sau đó, tính đặc hiệu kháng ngun huyết dương tính xác định kỹ thuật Ouchterlony (xem Hình 12.10) Chất chiết xuất kháng nguyên đặt lỗ giữa, xung quanh huyết thử thấy dương tính huyết chứng biết tính đặc hiệu Huyết chứng huyết thử đặt cạnh nhau: đường tủa tương tự chứng tỏ huyết có tính đặc hiệu kháng ngun tương tự 12.4.2 Trong bệnh phẩm sinh thiết Khảo sát phương pháp hóa mơ miễn dịch (immunohistochemical) mẫu sinh thiết lấy từ mơ bình thường bệnh lý cho thấy có lắng đọng immunoglobulin, bổ thể, đơi có kháng ngun Immunoglobulin thấy kháng thể đến phản ứng với kháng nguyên đặc hiệu mô hay đặc hiệu quan, phức hợp miễn dịch hình thành từ trước đến lắng đọng mơ, số phức hợp có chứa kháng nguyên ngoại sinh Các mẫu sinh thiết để dùng cho xét nghiệm kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang không cố định, phải chuyển cho phịng thí nghiệm nhiệt độ lạnh Sau đó, chúng làm đơng lạnh đột ngột cắt mỏng; lát cắt rửa nước muối để giảm độ nhuộm bẩn trước cho ủ với kháng huyết có cộng hợp (conjugate) thích hợp Một mẫu song song nhuộm với hematoxylin eosin để xem hình ảnh hình thái học Kỹ thuật thường dùng cho mẫu sinh thiết thận, da tủy xương tỏ có ích cho chẩn đốn Chỉ định sử dụng kỹ thuật đề cập chương lâm sàng 12.5 Khảo sát bổ thể Các phương pháp dùng để khảo sát bổ thể huyết chia làm hai; kỹ thuật đo hoạt tính chức gây tan máu, kỹ thuật nhận diện chất kháng nguyên thành phần bổ thể 12.5.1 Đánh giá chức Kỹ thuật gây tan máu kỹ thuật dùng phổ biến phòng thí nghiệm thường quy Chỉ số thường đánh giá CH50 (bổ thể gây tan máu toàn phần) Kỹ thuật tính lượng huyết cần thiết (tức lượng bổ thể cần thiết) để gây ly giải 50% số lượng hồng cầu mẫn cảm Huyết bệnh nhân định hiệu giá dựa theo huyết chuẩn Giả sử mẫu huyết đưa đến phịng thí nghiệm lập tức, kỹ thuật cho kết nhạy đáng tin cậy Đây xét nghiệm cần thiết nghi ngờ bệnh nhân bị thiếu hụt di truyền thành phần bổ thể đó, tức bệnh nhân thường bị nhiễm trùng lặp lặp lại bệnh nhân thành viên gia đình bị SLE hay hội chứng giống SLE (SLE – like) 12.5.2 Xét nghiệm thành phần bổ thể Định lượng C3 C4 phương pháp hóa miễn dịch xét nghiệm có ích Trên giới sẵn có huyết chứng quốc tế Định lượng thành phần bổ thể khác thực cần đến, có trường hợp nghi ngờ bị thiếu thành phần di truyền thể qua trị số CH50 giảm sút Chúng ta cần phải định lượng chất ức chế C1q (C1qINH) nghi ngờ bệnh nhân bị phù mạch (angioedema) Tuy nhiên, có điều cần nhớ tất trị số đo nói số mang tính thời điểm, thành phần lại tác động protein pha cấp tổng hợp chúng gia tăng đáng kể viêm; hậu tăng tổng hợp làm cho không thấy khả tiêu thụ bổ thể lại cho lượng bổ thể bình thường Điều gợi ý với lúc cần phải định lượng thêm protein pha cấp khác để xác định phản ứng pha cấp diễn vào thời điểm định lượng bổ thể Để hiểu vai trị biến đổi lượng bổ thể trình bệnh lý, xem xét thành phần bổ thể theo nhóm: (1) thành phần sớm đường cổ điển (C1, C4 C2 ); (2) thành phần sớm đường không cổ điển (Yếu tố B, D P); (3) thành phần muộn chung cho hai đường (C3 đến C9 ) Trong thực hành (Bảng 18.9), lượng C3 C4 thấp yếu tố B bình thường hoạt hóa xảy theo đường cổ điển; C3, C4 yếu tố B thấp có lẽ đường khơng cổ điển hoạt hóa theo lối vịng cung phản hồi (feedback loop) (xem lại chương 1) hoạt hóa đồng thời Nếu lượng C4 bình thường cịn C3 yếu tố B thấp có nghĩa có hoạt hóa đường khơng cổ điển Như vậy, thấy việc đo C3 C4 nhiều lần giúp ích cho việc theo dõi bệnh nhân bị mắc số dạng bệnh viêm cầu thận, SLE viêm mạch Nếu chúng thấp mắc bệnh, trở lại bình thường hồi phục, đó, C3 C4 giúp ích cho việc theo dõi điều trị Xét nghiệm bổ thể thường quy giá trị đa số bệnh viêm cấp mạn tính (Bảng 12.3) Bảng 12.3 Phân tích biến đổi bổ thể bệnh lý LƯỢNG BỔ THỂ CH50 C4 C3 Y/tố B CON ĐƯỜNG HOẠT HĨA VÍ DỤ ↓ ↓ ↓ Bt Cổ điển SLE; viêm mạch ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Cả hai đường Giảm tổng hợp thành phần Một số ca SLE Nhiễm khuẩn máu gram âm Hoại tử gan cấp ↓ ↓ Bt ↓ ↓ Bt ↓ Bt Không cổ điển Cổ điển C4 C2 ↑ ↑ ↑ ↑ Tăng tổng hợp thành phần Tự kháng thể C3NeF Phù mạch di truyền (thiếu hụt C1IHN) Cryoglobulin máu Viêm cấp mạn (Bt= Bình thường) 12.5.3 Phát sản phẩm phân cắt C3 Xét nghiệm có ích trường hợp bệnh nhân bị sốc nội độc tố, tức thể có khả hoạt hóa C3 theo đường khơng cổ điển Độ di chuyển điện di C3 sản phẩm phân cắt (ví dụ C3dg) khác Đối với mẫu huyết tương lấy từ bệnh nhân có phân cắt C3 in vivo sản phẩm phân cắt phát huyết tương chống đông EDTA, trong mẫu huyết tương bình thường phát C3 nguyên vẹn Sự diện EDTA ngăn chặn phân cắt xảy in vitro sau lấy máu tĩnh mạch 12.5.4 Yếu tố viêm thận C3 (C3NeF) Yếu tố viêm thận C3 tự kháng thể chống C3 hoạt hóa Tự kháng thể làm bền vững enzym C3 convertase đường không cổ điển cho phép phân cắt C3 tiếp tục xảy Người ta nghi ngờ có C3 NeF bệnh nhân có mức C3 thấp khơng giải thích được; thường người mắc bệnh thận nhiễm trùng tái tái lại Yếu tố phát cách cho huyết bệnh nhân ủ với huyết bình thường; cách làm cho yếu tố viêm thận C3 bệnh nhân phân cắt C3 huyết bình thường Và đem hỗn hợp cho định lượng C3c 12.6 Khảo sát phức hợp miễn dịch Rất nhiều chứng cho thấy phức hợp miễn dịch tham gia vào chế bệnh sinh tổn thương mô nhiều bệnh người Việc tham gia gây triệu chứng lâm sàng phức hợp miễn dịch thường đánh giá hai cách: cách thứ phân tích hình ảnh tổn thương mơ để tìm chứng lắng đọng phức hợp miễn dịch, cách tìm phức hợp miễn dịch huyết dịch thể Trong số bối cảnh lâm sàng việc phát phức hợp miễn dịch tỏ không cần thiết diện phức hợp miễn dịch lưu động không đặc hiệu cho bệnh phức hợp miễn dịch Các tổn thương phức hợp miễn dịch gây xuất mà khơng thấy có phức hợp miễn dịch lưu động; ngược lại lại thường tìm thấy phức hợp huyết người bình thường Phát phức hợp lưu động có ích cho việc đánh giá hiệu thay huyết tương Đối với tất trường hợp nghi ngờ có vai trị bệnh sinh phức hợp miễn dịch, nên tiến hành khảo sát trực tiếp sinh thiết mô được, nhớ khảo sát khơng thể thay thử nghiệm tìm phức hợp lưu động Việc xét nghiệm phức hợp miễn dịch huyết bệnh viện thực Hơn nữa, bệnh viện ln có khác lớn kết đạt mà việc chuẩn hóa điều kiện quan trọng trước đưa xét nghiệm vào thường quy xét nghiệm Hiện nay, giới ta có bán sản phẩm chuẩn cho phịng thí nghiệm miễn dịch đặc biệt chuyên khoa Nhưng dù sao, làm xét nghiệm này, kết qủa phải đánh giá phối hợp la-bô bác sĩ lâm sàng Có nhiều phương pháp phát phức hợp miễn dịch lưu động, phương pháp điều có ưu điểm riêng Nguyên lý phương pháp phát immunoglobulin có phức hợp mà khơng cần ý chất kháng nguyên Cơ sở kỹ thuật kết tủa lạnh (cryo-precipitation) chưa hiểu hoàn toàn phương pháp phát số phức hợp Những xét nghiệm phụ thuộc vào thụ thể bổ thể không phát phức hợp có mang kháng thể thuộc loại khơng cố định hoạt hóa bổ thể Những thử nghiệm thụ thể Fc không phát phức hợp chứa immunoglobulin khơng phải IgG Ngồi ra, tất phương pháp dễ bị gây trở ngại chất phức hợp miễn dịch Và, nay, chưa có cách để phân biệt immunoglobulin kết tủa không đặc hiệu với phức hợp miễn dịch thật Việc bảo quản huyết không cách, việc làm tan làm đông huyết nhiều lần làm cho immunoglonulin kết tủa Tuy vậy, qua nhiều báo cáo cơng trình hợp tác Tổ chức Y tế giới, người ta thấy rõ có số xét nghiệm (đặc biệt xét nghiệm liên kết C1q, thử nghiệm conglutinin, thử nghiệm ức chế yếu tố thấp đơn clôn, xét nghiệm dùng tế bào Raji) giúp phân biệt huyết bình thường Kết dương tính xét nghiệm chứng tỏ có diện phức hợp miễn dịch lưu động máu bệnh nhân 12.7 Khảo sát lymphơ bào Có ba kiểu xét nghiệm dùng để đánh giá tế bào: (1) đếm số lượng loại tế bào; (2) thử nghiệm in vivo; (3) đánh giá chức loại tế bào 12.7.1 Đếm số lượng tế bào lymphô Chúng ta bắt đầu khảo sát tiểu quần thể tế bào lympho từ biết chúng có mang dấu ấn bề mặt khác Đếm số lượng tế bào lympho tiểu quần thể T B có ý nghĩa bệnh thiếu hụt miễn dịch tăng sinh lymphô Xét nghiệm ngày áp dụng cho bệnh nhân nhiễm HIV để đánh giá mức độ suy giảm miễn dịch tiên lượng để theo dõi liệu pháp chống virus thực nghiệm Người ta đưa sơ đồ đảm bảo chất lượng để chuẩn hóa dần xét nghiệm Tất đánh giá tế bào lympho phải tiến hành với máu chống đông lấy sau có ý kiến tham vấn la-bơ miễn dịch Trong xét nghiệm này, dùng máu toàn phần tế bào lympho tách Việc tách tế bào lympho từ máu toàn phần thực cách đặt máu chống đông heparin lên chất Ficoll có tỉ trọng thích hợp Sau ly tâm, hồng cầu bạch cầu múi chìm vào lớp Ficoll để lại tồn tế bào lympho vài monocyte bề mặt lớp Ficoll Lớp tế bào hút dễ dàng ống hút đem rửa để dùng (Hình 12.13) Tất sản xuất kháng thể đơn clôn để nhận diện tiểu quần thể tế bào lympho T máu ngoại biên Máu toàn phần hay tế bào lympho khiết ủ với kháng huyết chuột đặc hiệu tương ứng sau đem nhuộm với kháng thể cấp chống Ig chuột đánh dấu Các tế bào dương tính đếm kính hiển vi Một cách khác người ta cho lympho bào nhuộm qua chùm tia laser tia sáng phát từ chất đánh dấu tế bào cảm biến tiếp nhận Các tín hiệu điện tử thu giúp để phân tích tiểu quần thể tế bào Đó nguyên lý phương pháp gọi phép đếm tế bào máy (cytometry) Hiện giới có sẵn nhiều kháng huyết đơn clôn dùng để nhận diện đếm loại kháng nguyên CD xuất đặc trưng loại tế bào khác T giúp đỡ/khởi động (CD4), T ức chế/gây độc (CD8) Có điều cần lưu ý kết thể tỉ lệ CD4:CD8 kết khơng có ý nghĩa lắm; tỉ lệ CD4:CD8 thấp gặp hai trường hợp bệnh lý khác xa, suy giảm tế bào giúp đỡ gia tăng tế bào ức chế Do đó, kết nên trình bày dạng số tuyệt đối dựa vào số lượng lymphơ tồn phần Hình 12.13 Quy trình tách tế bào lymphơ khỏi máu tồn phần Lymphơ bào B chủ yếu nhận diện qua diện immunoglobulin bề mặt phân tử tổng hợp tế bào Phương pháp phát kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp dùng kháng huyết chống immunoglobulin người cộng hợp (conjugate) với chất huỳnh quang (fluorescein) Tế bào lympho ủ với chất cộng hợp này, sau đem rửa đọc vào kính hiển vi huỳnh quang máy đếm tế bào Immunoglobulin bề mặt nhìn thấy vòng nhẫn phát quang xung quanh tế bào Với phương pháp này, số tế bào lympho B đếm chiếm – 12% tổng số tế bào lympho máu ngoại biên Ngoài ra, người ta bán sẵn kháng thể đơn clôn khác đặc hiệu tế bào B để dùng cần 12.7.2 Phản ứng da mẫn muộn ( in vivo) Có hai loại phản ứng da in vivo dùng để phát lympho bào T mẫn cảm đặc hiệu, là: thử nghiệm nội bì, dùng kháng nguyên tiêm vào lớp nội bì (xem Hình 12.8), thử nghiệm áp: áp kháng nguyên lên da hấp thụ qua da Thử nghiệm nội bì nhiều người biết phản ứng tuberculin (Mantoux) Dẫn xuất protein tinh khiết (PPD) tuberculin chất chiết xuất từ Mycobacterium hominis Phản ứng dương tính thử nghiệm da mẫn muộn xuất sau 48 giờ: chỗ tiêm đỏ cứng khơng ngứa hay đau Phản ứng có cường độ tối đa sau 72 nhạt dần sau nhiều ngày Hình ảnh phân biệt dễ dàng với phản ứng Arthus, phản ứng xuất sau tiêm 12 – 24 giờ, có phù ngứa Trên 75% quần thể người lớn cho kết dương tính phản ứng tuberculin Nếu phản ứng xảy mạnh có nghĩa có nhiễm trùng mycobacterium hoạt động thể kết có ích cho chẩn đốn trường hợp nghi ngờ mắc lao; phản ứng âm tính nói lên thể trước chưa tiếp xúc với vi khuẩn lao hệ miễn dịch tế bào bị suy giảm, ví dụ trường hợp sarcoidosis thiếu hụt miễn dịch Phản ứng bì cho biết rằng, trước bệnh nhân mẫn cảm với kháng nguyên thử hay chưa (do đó, kháng ngun thử cịn gọi kháng nguyên gợi lại) Để tránh khả phản ứng âm tính chưa tiếp xúc, xét nghiệm tình trạng suy giảm miễn dịch người ta dùng panel kháng nguyên thường gặp để thử Panel thường bao gồm PPD, Candida albicans, streptokinase-streptodornase, quai bị trichophyton; 95% người lớn bình thường đáp ứng với kháng nguyên Riêng trẻ em chúng chưa tiếp xúc với kháng ngun nói mơi trường Bởi chứng thiều hụt tế bào T tiên phát thường thể vào tuổi trẻ em nên dùng thêm thử nghiệm DNCB (dinitro-choloro-benzene) để đánh giá Bệnh nhân cho mẫn cảm với DNCB cách bôi lên da 10 ngày sau cho thử thách lại với DNCB hịa lỗng nhiều lần Với người bình thường phản ứng dương tính xuất vòng 48 với đỏ cứng da Thử nghiệm áp thử nghiệm thiết phải dùng đến cần xác định kháng nguyên nguyên nhân gây viêm da tiếp xúc Một số kháng nguyên dễ dàng hấp thụ bôi lên da Một số khác hấp thụ nên cho lên giấy cellulose dán vào da Sự lựa chọn kháng nguyên phụ thuộc vào tiền sử tiếp xúc, nhiều bệnh nhân nhạy cảm lúc với nhiều kháng nguyên Nồng độ kháng nguyên dùng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm khơng có sản phẩm chuẩn Thời gian để phản ứng dương tính xuất phụ thuộc vào mức độ hấp thụ thay đổi từ – ngày Để cho tiện, người ta thường đọc thử nghiệm áp sau – ngày Kết gọi dương tính thấy có đỏ da, phù, ngứa, cứng chỗ tiếp xúc kháng nguyên 12.7.3 Các thử nghiệm chức Các thử nghiệm chức in vitro miễn dịch tế bào nên tiến hành triệu chứng lâm sàng có gợi ý bất thường miễn dịch tế bào Như vậy, có nghĩa rằng, thử nghiệm cần thiết trường hợp bị thiếu hụt miễn dịch; nhiên chúng có ích việc theo dõi điều trị liệu pháp miễn dịch Khi tế bào lymphơ cho tiếp xúc với chất kích thích đó, số tế bào lymphơ nhỏ đáp ứng cách chuyển dạng thành nguyên bào thời gian vài ngày Quá trình gọi chuyển dạng lymphô bào (lymphocyte transformation) Các chất kích thích gồm có ba loại (Bảng 12.4) Đáp ứng tăng sinh sau kích thích đo kỹ thuật cho thâm nhập thymidine có đánh dấu phóng xạ vào DNA tế bào lympho Ức chế di tản bạch cầu (leukocyte migration inhibition, LMI) thử nghiệm dễ thực không dùng làm xét nghiệm thường quy Lymphô T sản xuất lymphokin tiếp xúc với kháng nguyên mà chúng mẫn cảm trước Một lymphokin gây ức chế di chuyển số tế bào trung tính, chất gọi yếu tố ức chế di tản bạch cầu định lượng in vitro Các thử nghiệm chức ln địi hỏi phương tiện tốn nhiều thời gian (Bảng 12.4) Ngoài ra, cần xét nghiệm tế bào sống mẫu máu xét nghiệm phải chống đơng đưa đến la-bơ Vì có khác lơ thí nghiệm chưa có sản phẩm chuẩn mà việc phân tích kết trở nên khó khăn Tốt nên phân tích với chun gia phịng thí nghiệm miễn dịch Bảng 12.4 Các tác nhân gây chuyển dạng lymphơ bào T Tác nhân kích thích Kháng ngun Mitogen Lymphơ bào đồng loại Ví dụ PPD Mycobacterium hominis Phytohaemagglutinin (PHA) Phản ứng lymphơ hỗn hợp Tính đặc hiệu đáp ứng Có Khơng Có u cầu có tiếp xúc trước Có Khơng Khơng 12.8 Đánh giá tế bào trung tính tế bào mono 12.8.1 Đếm số lượng tế bào trung tính tế bào mono Số lượng tuyệt đối tế bào máu tính dễ dàng từ cơng thức máu 12.8.2 Tạo “cửa sổ da” Khả tập trung tế bào trung tính tế bào mono ổ viêm phụ thuộc vào sản xuất chất thu hút có tính hóa hướng động tế bào khả tế bào di chuyển nơi có yếu tố thu hút Cả hai thành phần đánh giá in vivo cách tạo chỗ trầy da tối thiểu (thường cẳng tay) Tốc độ tế bào đến xuất nơi trầy da đánh giá cách thu thập tế bào lam kính nhỏ đặt lên chỗ trầy da Để cho việc thu thập tế bào viêm chắn người ta thường bơi lên chỗ trầy chất hóa hướng động (với số lượng định sẵn) 12.8.3 Thử nghiệm chức in vitro Tế bào trung tính tách từ máu toàn phần dùng phương pháp li tâm gradient tỉ trọng mô tả tách lymphô, sau làm cho khiết cách cho ly giải toàn hồng cầu bị lẫn vào Tế bào mono thu hoạch lớp giao diện (interface) với lymphơ bào (xem Hình 12.13) tách riêng cách cho bám dính lên bề mặt thủy tinh chất dẻo rửa tế bào lymphô (Tế bào mono tế bào bám dính, khác với tế bào lymphơ.) Hóa hướng động di chuyển có mục đích tế bào phía chất thu hút mà thường casein peptid tổng hợp f-Met-Leu-Phe Khả tạo tính hóa hướng động huyết bệnh nhân khảo sát cách ủ huyết tươi với nội độc tố Các tế bào cần thử nghiệm tách từ kích thích hóa hướng động màng siêu lọc (có lỗ nhỏ) Sau ủ, màng lọc lấy ra, cố định nhuộm Khoảng cách tế bào di chuyển qua màng lọc hướng đến kích thích đo kính hiển vi quang học thường dùng Thực bào chức ăn vật lạ tế bào Khả ăn xác định cách ủ tế bào thực bào với hạt trơ hạt latex, vi khuẩn Các hạt hay vi khuẩn bên tế bào thực bào thấy kính hiển vi Chúng ta khuếch đại khả thực bào để dễ quan sát cách cho opsonin hóa hạt trước với huyết bình thường cho vào mơi trường có tế bào thực bào Đồng thời qua phương pháp thực bào đánh giá khả opsonin hóa huyết bệnh nhân cách làm ngược lại tức sau cho hạt latex tiếp xúc với huyết bệnh nhân, ta đưa chúng vào cho tế bào trung tính bình thường ăn Hoạt tính enzym nội bào (intracellular enzyme activity) đánh giá thử nghiệm giết vi khuẩn (bacterial killing) khả khử thuốc nhuộm (dye reduction) Một thử nghiệm khả diệt khuẩn nội bào chuẩn bao gồm ủ bạch cầu với vi khuẩn sống tụ cầu vàng chẳng hạn Sau ủ, tế bào ly tâm loại bỏ vi sinh vật ngoại bào Vi khuẩn ăn vào, chưa bị giết chết, đánh giá cách cho ly giải tế bào nước cất giải phóng vi khuẩn bên ra; vi khuẩn nuôi cấy thạch dinh dưỡng để xem tỉ lệ vi khuẩn sống Nếu khả thực bào bình thường số lượng vi khuẩn sống phản ánh mức độ giết nội bào Thử nghiệm nitroblue tetrazolium (NBT) giúp đánh giá khả “ăn” thực bào khử thuốc nhuộm NBT từ màu vàng sang để chuyển sang màu xanh Các tế bào phân lập cho vào dung dịch chứa NBT Sau ủ, tế bào đem rửa chiết xuất NBT ăn vào bên tế bào đo mức độ khử quang phổ kế Một cách khác tế bào quan sát kính hiển vi đếm số lượng bạch cầu múi có chứa tinh thể xanh Các tế bào thực bào khử NBT chúng hoạt hóa Số lượng tế bào hoạt hóa máu ngoại biên bình thường thay đổi; có người cho số lượng tế bào hoạt hóa tăng cao có nhiễm trùng vi khuẩn, điều tranh cãi Trong xét nghiệm cải tiến từ thử nghiệm có tên “thử nghiệm NBT hoạt hóa”, người ta cho “mồi” tế bào trước cách cho chúng tiếp xúc với lượng định nội độc tố trước cho tiếp xúc NBT Thử nghiệm có ưu điểm khơng phụ thuộc vào hoạt hóa tế bào trung tính in vivo xem xét nghiệm sàng lọc dễ làm dùng rộng rãi Khi làm thử nghiệm phát lân quang (chemiluminescence): tế bào trung tính (của người bình thường) phát chùm tia sáng có độ dài sóng lớn kích thích hạt opsonin hóa Thử nghiệm giúp phát khả opsonin hóa huyết cách đáng tin cậy, kết thu dùng tế bào trung tính người bệnh thay đổi địi hỏi phải làm thêm xét nghiệm khác Một ưu điểm kỹ thuật đánh giá huyết bệnh nhân với vi sinh vật mà bệnh nhân nhiễm Kỹ thuật iode hóa protein cho phép đánh giá tính nguyên vẹn chế giết myeloperoxidase - hydrogen peroxide Enzym phát nhờ tính chất chuyển iodua kali 125I thành iodua ion gắn vào protein nội bào Tỉ lệ “125I tự do/125I gắn protein” cho phép đánh giá khả sản xuất enzym tế bào trung tính 12.9 Định typ HLA Kháng nguyên bạch cầu người (HLA) tên dành cho kháng ngun hịa hợp mơ (ghép) chủ yếu người Có nhiều kháng ngun hịa hợp mơ bạch cầu, kháng nguyên hệ HLA quan trọng Những kháng nguyên diện tất mô thể, dễ dàng định týp HLA tế bào lympho máu ngoại biên chúng có mật độ đủ lớn tế bào Khác với hệ thống ABO hồng cầu, khơng có kháng thể anti-HLA tự nhiên thể người Các sinh phẩm dùng để định týp kháng thể sản xuất trình miễn dịch xảy truyền máu thai kỳ Thử nghiệm thường dùng thử nghiệm gây độc lympho bào (lymphocytotoxic test) Tế bào lymphô sống tách từ máu ngoại vi ly tâm gradient tỉ trọng đề cập Dung dịch tế bào sau trộn với huyết định týp khác nhau, sau bổ thể (người ta thường dùng huyết thỏ bình thường để làm nguồn cung cấp bổ thể) thêm vào Sau ủ thời gian 37oC, tế bào kháng thể nhận diện bị giết phản ứng ly giải qua trung gian bổ thể Tế bào chết phát hiện qua khả chúng ngăn cản thuốc nhuộm xâm nhập Nếu đa số (>90%) tế bào bị giết kháng huyết đó, điều có nghĩa mang HLA tương ứng nên bị kháng thể nhận diện Thử nghiệm tiến hành thường quy trung tâm chuyên khoa chuyên định týp HLA cho trường hợp ghép quan Kỹ thuật địi hỏi nhiều thời gian, đắt tiền trình độ kỹ phải cao phải có nhiều kinh nghiệm việc đọc kết Do trước đề nghị làm kết xét nghiệm này, cần phải xin ý kiến tham vấn trước, trí phải lấy máu chống đơng gởi đến cho la-bô Hiện nay, việc định týp HLA thực kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) để phát gen HLA Kỹ thuật tốn có độ xác độ nhạy cao nhiều so với kỹ thuật khác Khá nhiều bệnh cho thấy có phối hợp với kháng nguyên HLA định Ví dụ, bệnh viêm đốt sống dính khớp, có 90% bệnh nhân dương tính với HLA-B27, ngược với tỉ lệ thấp (8%) HLA nhân dân Đây bệnh mà việc định týp HLA xem có ích cho chẩn đoán Trong bệnh khác, phối hợp với HLA tỏ yếu nhiều Hơn nữa, tần xuất gen (tính qua “mức độ phổ biến” kháng nguyên quần thể) người bình thường cao nỗi diện chúng khơng nói lên gen có phối hợp với bệnh xảy hay khơng 12.10 Sản xuất kháng huyết dùng cho phịng thí nghiệm miễn dịch lâm sàng Kháng huyết sử dụng thử nghiệm nói thường sản xuất động vật cách cho tiêm kháng nguyên cần thiết Trước kháng huyết sản xuất động thể chủ yếu sản phẩm đáp ứng miễn dịch đa clơn, có nghĩa kháng huyết có nhiều kháng thể sản xuất từ nhiều clơn tế bào B khác Mặc dù kháng thể khác cấu trúc chi tiết vùng biến đổi tất cho phản ứng với kháng ngun tương ứng (người ta gọi tính phản ứng đơn đặc hiệu) Hình 12.14 Nguyên lý sản xuất kháng thể đơn clôn Trong năm vừa qua người ta tạo bước tiến quan trọng sản xuất kháng thể huyết sản xuất kháng thể đơn clôn, tức kháng thể sản xuất dòng tế bào, phân tử kháng thể sản xuất hoàn toàn giống vùng thay đổi vùng định chúng Những kháng thể đơn clôn phản ứng với định kháng nguyên kháng nguyên dùng Chúng ta biết hỗn dịch tế bào lách vật gây mẫn cảm, có chứa nhiều tế bào B chịu trách nhiệm sản xuất nhiều kháng thể chống nhiều epitope khác kháng nguyên đưa vào Những tế bào B cho liên hợp với dịng tế bào u tủy khơng sản xuất kháng thể để tạo nên tế bào lai mang khả tương bào ác tính Các tế bào lai sau tách chọn dịng (Hình 12.14) Việc ni cấy quy mơ lớn giúp cung cấp số lượng đáng kể kháng thể tinh khiết cho phản ứng với độ xác cao Nhờ vào tiềm sử dụng cho chẩn đoán điều trị mạnh, ngày người ta có nhu cầu sản xuất kháng thể đơn clơn người có kháng thể khơng tạo nguy xảy phản ứng mẫn Tuy vậy, việc sản xuất kháng thể đơn clôn người cịn gặp nhiều khó khăn kỹ thuật 12.11 Kỹ thuật DNA tái tổ hợp miễn dịch lâm sàng Những tiến sinh học phân tử năm qua mở nhiều ứng dụng quan trọng chẩn đoán điều trị bệnh miễn dịch Do vậy, nhà miễn dịch học lâm sang cần phải hiểu thuật ngữ phương pháp mà nhà sinh học phân tử sử dụng 12.11.1 Kỹ thuật thuật ngữ Các enzym endonuclease hạn chế (restriction endonuclease) enzym lấy từ vi khuẩn có khả cắt chuỗi DNA vị trí đặc biệt liên quan đến trình tự nucleotid định Dùng enzym với tính đặc hiệu khác cho phép cắt chuỗi DNA thành đoạn, mà đoạn có chứa gen đặc biệt cần tách khỏi phần cịn lại phân tử DNA (Hình 12.15) Hình 12.15 Lập đồ gen kỹ thuật Southern Blot Trong kỹ thuật Southern blot, đoạn DNA, sau cắt endonuclease hạn chế, cho điện di gel agarose, đoạn nhỏ di chuyển xa đoạn lớn Trong số đoạn có đoạn có chứa gen mà ta quan tâm Bằng cách dùng chất kiềm ta làm tách đôi đoạn dsDNA thành ssDNA Sau blot ssDNA sang giấy nitrocellulose, ta cho đoạn DNA chuỗi đơn tách lai với đoạn ssDNA bổ sung tương ứng đánh dấu Sau rửa quan sát đèn đọc phát xạ (autoradiography) thấy có phát xạ vị trí vị trí có chứa đoạn gen mà ta quan tâm Có nhiều bệnh di truyền, khuyết tật gen khơng thể biết việc tìm gen khuyết tật không thực Trong trường hợp này, gen gây bệnh liên kết chặt chẽ với vị trí nhận diện endonuclease hạn chế Dùng endonuclease biết để dị tồn genome người giúp tìm vị trí endonuclease loại bỏ vị trí tồn Như vậy, đoạn DNA tạo enzym hạn chế định có chiều dài khác người khác Người ta gọi điều tính đa dạng chiều dài đoạn hạn chế (restriction fragment length polymorphism, RFLP), tính chất di truyền đơn giản theo kiểu Mendel RFLP cung cấp cho ta lượng lớn dấu ấn liên kết (linkage marker) để tìm gen gây bệnh gia đình, mà khơng cần phải biết thân gen Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (recombinant DNA technology) dựa vào việc sử dụng plasmid phương tiện để truyền đoạn DNA lạ, ví dụ gen người Plasmid mảnh DNA hình trịn, nhỏ, xuất tự nhiên bào tương vi khuẩn Dùng endonuclease đặc hiệu mở vịng plasmid gắn vào đoạn gen người, ta tạo phân tử DNA lai (hybrid DNA) có chức sinh học riêng Nếu sau plasmid đưa vào loại vi khuẩn (ví dụ E coli) ta cho ni cấy vi khuẩn để sản xuất loại đoạn DNA gắn vào plasmid Kỹ thuật DNA tái tổ hợp thường dùng để sản xuất chế phẩm sinh học tính khiết sử dụng chẩn đốn điều trị số mục đích sinh học khác 12.11.2 Ứng dụng chẩn đoán Kỹ thuật khuyếch đại DNA cung cấp cho phương tiện chẩn đốn trước sinh (prenatal diagnosis) xác bệnh di truyền Vật phẩm dùng cho chẩn đoán mẩu mô lấy từ gai nhau, từ kỹ thuật soi thai (fetoscopy) chọc túi ối (amniocentesis) Kỹ thuật giúp chẩn đoán giai đoạn tiền lâm sàng bệnh nhiễm sắc thể có thời kỹ khởi bệnh muộn, bệnh phụ nữ liên quan giới tính, kể thiếu hụt miễn dịch di truyền Người ta ghi nhận thử nghiệm gen sử dụng ngày nhiều cho việc chẩn đoán bệnh Việc phát tượng tái xếp (rearrangement) gen immunoglobulin gen thụ thể tế bào T (TCR gene) cung cấp cho cơng cụ để phân tích nguồn gốc tế bào lympho ác tính khơng mang dấu ấn kinh điển tế bào B tế bào T, tìm nguồn gốc tế bào ung thư bệnh bạch cầu tế bào dạng tóc (hairy cell leukemia) tăng dội nguyên bào bệnh bạch cầu tủy mạn Ngoài ra, thử nghiệm gen giúp ta phân biệt bệnh tăng sinh lympho đa clôn đơn clôn 12.11.3 Ứng dụng điều trị Kỹ thuật DNA tái tổ hợp mang lại nhiều tiến điều trị thông qua việc tổng hợp hợp chất sinh học liệu pháp gen Sinh tổng hợp có tiến hành cách gắn gen người vào plasmid làm vật truyền sau cho nhân lên thành clơn Có nhiều loại hormone (ví dụ insulin) thuốc điều hịa miễn dịch (ví dụ interferon) tổng hợp theo cách Một ứng dụng quan trọng phương pháp ứng dụng sản xuất vắc xin Một xác định kháng nguyên vi khuẩn có khả gây miễn dịch bảo vệ tạo clơn với gen tương ứng Một vắc-xin tái tổ hợp sản xuất dùng phổ biến vắc xin viêm gan B Hiện nhà nghiên cứu cố gắng để tìm vắc xin có hiệu khác nhằm chống lại bệnh nhiễm trùng phổ biến giới vắc-xin sốt rét HIV Một mục đích công nghệ gen thay gen bị khiếm khuyết thể người Liệu pháp gen nhiều tranh cãi rối loạn miễn dịch thiếu hụt adenosine deaminase purine nucleoside phosphorylase ứng cử viên quan trọng cho việc sử dụng liệu pháp để điều trị