Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.Xây dựng mô hình thiếu oxytái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Ngơ Thị Hải Yến XÂY DỰNG MƠ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO CƠ TIM H9C2 CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN Chuyên ngành: Sinh lý người động vật Mã số: 9420101.04 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2023 Công trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - ĐHQGHN Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Thị Thu Phản biện: PGS.TS Đỗ Thị Thảo Phản biện: PGS.TS Hồng Văn Tởng Phản biện: TS Phạm Ngọc Toàn Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ họp Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - ĐHQGHN vào hồi ngày tháng năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Thiếu máu cục (TMCB) tim nguyên nhân gây tử vong hàng đầu bệnh tim mạch Ở Việt Nam, bệnh TMCB có xu hướng ngày tăng, trẻ hóa gây tử vong với tỉ lệ 11,8% (theo số liệu năm 2019) [122] Ngoài việc ảnh hưởng tới sức khỏe, tàn tật tử vong, chi phí chăm sóc người bệnh với suất lao động hằng năm tạo áp lực gánh nặng cho phát triển kinh tế - xã hội Do vậy, nỡ lực giảm thiểu yếu tố nguy việc áp dụng biện pháp kết hợp điều trị bệnh ưu tiên y tế hàng đầu Đối với bệnh lý TMCB tim, thời điểm tái thơng dịng máu cho vùng mơ bị thiếu máu thuốc điều trị yếu tố định thành công việc điều trị cho người bệnh Tuy nhiên việc tái tưới máu (TTM) cũng làm trầm trọng tởn thương trước giai đoạn TMCB Các tổn thương gọi tổn thương thiếu máu cục bộ-tái tưới máu (TMCB-TTM) hay tổn thương thiếu oxy-tái cung cấp oxy (HR) [59] Song song với phát triển kỹ thuật lâm sàng nhằm tái thơng dịng sớm, việc tìm kiếm thuốc với hiệu tốt hơn, gây tác dụng phụ giúp giảm thiểu tổn thương gây TMCB-TTM tim hướng nghiên cứu nhận quan tâm nhà khoa học [102] Việc nghiên cứu chế sinh bệnh cũng tìm kiếm chất có tác dụng bảo vệ tế bào tim tổn thương TMCB-TTM thường thực mơ hình thực nghiệm in vivo, ex vivo in vitro Trong đó, mơ hình TMCB-TTM in vitro còn gọi mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy in vitro phương pháp hiệu để nghiên cứu sàng lọc bước đầu hoạt chất tiềm bước sở tiền đề cần thiết cho bước nghiên cứu để phát triển thuốc cũng điều trị bệnh lý [58, 162] Mơ hình HR phổ biến giới, nhiên Việt Nam nghiên cứu sử dụng mơ hình còn chưa nhiều Do đó, việc nghiên cứu xây dựng mơ hình HR in vitro cung cấp thêm cơng cụ sử dụng giai đầu nghiên cứu khảo sát đánh giá tác động hợp chất tế bào tim mơ hình bệnh lý Mơ hình HR in vitro phân tích tế bào phân lập từ mơ tim dịng tế bào tim ni cấy [58, 139] Trong số đó, dịng tế bào H9C2 tách từ mô tâm thất tim phôi chuột BDX1 Kimes Brandt [76] sinh trưởng tương đối tốt, cho phép ni cấy dễ dàng Đồng thời, dịng tế bào cũng thể nhiều đặc điểm giống với tế bào tim phân lập chuyển hóa lượng, nhạy cảm với nồng độ oxy Vì vậy, H9C2 thường lựa chọn ứng dụng nhiều nghiên cứu bệnh lý tim phì đại tim, TMCB-TTM, chuyển hóa vật chất tế bào phân tích độc tính thuốc điều trị [76, 153] Tuy nhiên, nghiên cứu thực nghiệm bệnh lý TMCB tim sử dụng tế bào H9C2 còn Việt Nam Do vậy, việc ứng dụng tế bào H9C2 nghiên cứu thực nghiệm bệnh TMCB-TTM hứa hẹn tạo hướng cách tiếp cận bệnh lý Việt Nam Bên cạnh đó, nghiên cứu cho thấy tởn thương TMCB-TTM tim có liên quan mật thiết đến thay đổi cấu trúc chức bào quan ti thể [20, 81]; vậy, nghiên cứu đánh giá vai trò thuốc điều trị TMCB-TTM tim dựa phân tích ti thể lựa chọn phù hợp [8, 148] Trên thực tế, công việc phân tích hoạt chất có tác dụng bảo vệ tim hướng đích ti thể đạt số thành tựu đáng kể [130]; cũng cần tiếp tục mở rộng với hi vọng mang lại thêm lựa chọn cũng tối ưu hóa điều kiện sử dụng thuốc có sẵn Nguồn dược liệu nước ta phong phú, có tiềm lớn số lượng chất lượng chất có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm chống ung thư [65, 142] Nhiều nghiên cứu tiến hành nhằm sàng lọc, phân tích tìm hiểu vai trị thành phần thuốc điều trị bệnh [4, 65] Tuy nhiên, Việt Nam, nghiên cứu vai trò hoạt chất có tiềm điều trị bệnh lý TMCBTTM tim hướng đích ti thể cịn Vì vậy, việc nghiên cứu sàng lọc hoạt chất có tiềm hướng đích ti thể vấn đề cấp thiết, có ý nghĩa lý luận thực tiễn Trên sở đó, đề tài “Xây dựng mô hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên” thực nhằm mục tiêu: - Thiết lập hoàn thiện mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy in vitro tế bào tim H9C2; - Đánh giá tác dụng bảo vệ số hoạt chất tiềm tế bào tim H9C2 mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy in vitro NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN Để thực mục tiêu đề tài, nội dung triển khai nghiên cứu gồm: 1.1 Thiết lập hồn thiện mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy tế bào H9C2 - Thiết lập buồng thiếu oxy hồn thiện mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy; - Đánh giá hiệu mơ hình thiết lập tế bào H9C2 với đối chứng dương 1.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ số hoạt chất tế bào H9C2 mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy in vitro: - Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào tim H9C2 Naringin (từ Trần bì) mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy; - Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào tim H9C2 Liquiritin (từ rễ Cam thảo) mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy; - Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào tim H9C2 cao Sâm Ngọc Linh Majonoside R2 (từ Sâm Ngọc Linh) mơ hình thiếu oxytái cung cấp oxy; - Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào tim H9C2 cao Sâm Vũ Diệp Araloside A Methyl Ester (từ Sâm Vũ Diệp) mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy TÍNH MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 2.1 Tính đề tài luận án - Đề tài luận án nghiên cứu Việt Nam cung cấp liệu việc thiết lập buồng thiếu oxy hồn thiện mơ hình bệnh thiếu oxy-tái cung cấp oxy sử dụng tế bào tim H9C2 - Đề tài luận án nghiên cứu Việt Nam cung cấp liệu tác dụng bảo vệ tế bào tim chuột H9C2 hướng đích ti thể mơ hình bệnh thiếu oxy-tái cung cấp oxy số cao chiết hoạt chất thiên nhiên như: Naringin, Liquiritin, cao butanol Sâm Ngọc Linh, cao butanol Sâm Vũ Diệp, Majonoside R2 Araloside A Methyl Ester 2.2 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án - Kết luận án thiết lập buồng thiếu oxy, xây dựng hồn thiện mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy sử dụng tế bào tim H9C2 - Kết luận án cung cấp liệu tác dụng bảo vệ tế bào tim số cao, hoạt chất tách chiết từ thảo dược Việt Nam mơ hình bệnh in vitro Đây sở cho nghiên cứu sàng lọc phát triển thuốc, tìm kiếm chất có tác dụng bảo vệ tim tổn thương thiếu oxy-tái cung cấp oxy - Kết luận án cung cấp liệu khoa học góp phần nâng cao giá trị sinh học thảo dược Việt Nam CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 BỆNH THIẾU MÁU CỤC BỘ CƠ TIM Thiếu máu cục (TMCB) tượng bệnh lý gây giảm lưu lượng máu cung cấp đến vùng mô, quan [72] Ở tim, TMCB thường gọi nhồi máu tim hay TMCB tim Nguyên tắc chung điều trị bệnh TMCB tim nhanh chóng tái thơng dòng máu để giảm thiểu tái tổn thương cho mô tim Tuy nhiên, điều làm tởn thương gây giai đoạn TMCB trở nên trầm trọng Đây tổn thương thiếu máu cục bộtái tưới máu (TMCB-TTM) hay tổn thương thiếu oxy-tái cung cấp oxy (khi xét yếu tố tác động thay đởi nồng độ oxy) 1.2 TÁI TƯỚI MÁU VÀ TỞN THƯƠNG TÁI TƯỚI MÁU Các tổn thương TMCB-TTM bao gồm việc sản sinh gốc tự oxy hóa, bám dính bạch cầu vào tế bào nội mạc, kết tụ bạch cầu - tiểu cầu,… [44] 1.3 TI THỂ TRONG TỔN THƯƠNG THIẾU MÁU CỤC BỘ-TÁI TƯỚI MÁU CƠ TIM Nhiều nghiên cứu chỉ vai trò quan trọng ti thể chế bệnh TMCB-TTM tim [81, 125] 1.4 CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU TRONG TỔN THƯƠNG THIẾU MÁU CỤC BỘ-TÁI TƯỚI MÁU CƠ TIM Các đường tín hiệu liên quan tới điều hòa hoạt động chức cũng sinh ti thể đích hướng tới nghiên cứu tìm kiếm thuốc/chất có tác dụng bảo vệ bào quan trước tởn thương TMCB-TTM 1.5 MƠ HÌNH NGHIÊN CỨU THIẾU MÁU CỤC BỘ-TÁI TƯỚI MÁU CƠ TIM Trong mơ hình nghiên cứu TMCB-TTM, mơ hình in vitro, còn gọi mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy (Hypoxiareoxygenation, HR) thường sử dụng phổ biến giai đoạn đầu nghiên cứu sàng lọc thuốc, chất thử có tác dụng bảo vệ 1.6 TẾ BÀO CƠ TIM H9C2 Dòng tế bào tim H9C2 nhánh dịng tế bào có nguồn gốc từ mô phôi chuột BD1X, Rattus norvegicus 1.7 NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT CĨ TIỀM NĂNG BẢO VỆ TIM CHỐNG LẠI TỞN THƯƠNG THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY Nội dung nghiên cứu luận án tập trung vào việc phân tích sàng lọc hoạt chất chiết từ dược liệu có tác dụng bảo vệ tế bào tim TMCB-TTM Các hoạt chất phân tích gồm: Naringin, Liquiritin, cao Sâm Ngọc Linh Majonoside R2, cao Sâm Vũ Diệp Araloside A Methyl Ester CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU 2.1.1 Đối tượng Mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy in vitro; Tác dụng bảo vệ tế bào H9C2 tổn thương thiếu oxy-tái cung cấp oxy số hoạt chất tự nhiên 2.1.2 Vật liệu - Tế bào tim chuột H9C2 (ATCC® CRL-1446™, Mỹ) tặng Trung tâm nghiên cứu bệnh chuyển hóa tim mạch, Trường Đại học Inje, Hàn Quốc - Một số hợp chất cao chiết dược liệu sử dụng nghiên cứu liệt kê Bảng 2.1 Bảng 2.1 Cao chiết dược liệu, tinh chất Tên chất Naringin (từ Trần bì, Pericarpium Citri Reticulatae) Liquiritin (từ rễ Cam thảo, Radix Glycyrrhizae) Cao Butanol Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) Cao Butanol Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem) Majonoside R2 (từ Panax vietnamensis) Araloside A Methyl Ester (từ Panax bipinnatifidus Seem) Công thức, KLPT C27H32O14, 580,5 g/mol C21H22O9, 418,4 g/mol Độ tinh Nơi cung cấp khiết 95,7% Viện Dược liệu 96,13% Viện Dược liệu Đại học Phenikaa Đại học Phenikaa C41H70O14, 787,0 g/mol C48H76O18, 941,1 g/mol 95% Đại học Phenikaa 95% Đại học Phenikaa 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Kế hoạch triển khai nghiên cứu Kế hoạch triển khai nghiên cứu khái qt hóa Hình 2.1 Hình 2.1 Sơ đồ khái quát hóa kế hoạch triển khai nghiên cứu 2.3.2 Ch̉n bị mơi trường, hóa chất 2.3.3 Nuôi tế bào H9C2 2.3.4 Đánh giá ảnh hưởng DMSO lên khả sống tế bào 2.3.5 Gây mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy 2.3.5.1 Gây mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy CoCl2 2.3.5.2 Thiết kế, tạo và thử nghiệm buồng thiếu oxy (hypoxia) Hình 2.4 Sơ đồ nguyên lý hoạt động buồng hypoxia 2.3.6 Phân tích độc tính cao dược liệu, hợp chất tế bào H9C2 điều kiện bình thường 2.3.7 Thử tác dụng sản phẩm chiết từ dược liệu tế bào H9C2 giai đoạn tái cung cấp oxy 2.3.8 Phân tích tỉ lệ tế bào sống 2.3.9 Phân tích hàm lượng cardiolipin màng ti thể 2.3.10 Phân tích điện màng ti thể 2.3.11 Phân tích lượng gốc oxy phản ứng 2.3.12 Phân tích lượng Ca2+ ti thể 2.3.13 Phân tích mức độ biểu protein bằng western blot 2.3.14 Chụp ảnh tế bào 2.3.15 Xác định tín hiệu huỳnh quang bằng máy đếm tế bào theo dòng chảy 2.3.16 Xác định tín hiệu huỳnh quang bằng máy đo huỳnh quang đĩa 96 giếng 2.3.17 Phân tích số liệu 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO H9C2 TRONG MÔ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY 3.2.1 Kết phân tích tác dụng bảo vệ Naringin mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy (mơ hình HR) 3.2.1.1 Tác dụng Naringin đối với tỉ lệ sống tế bào điều kiện ni bình thường Nar (1,6-320 µM) khơng thể độc tính với tế bào H9C2 Do vậy, Nar dải nồng độ chọn dùng trong nghiên cứu 3.2.1.2 Tác dụng Naringin đối với tỉ lệ sống tế bào điều kiện bệnh lý Trong nhóm tế bào bị gây mơ hình bệnh, nhóm bở sung Nar (80, 160 µM) có tỉ lệ sống cao Do vậy, Nar hai nồng độ chọn dùng cho thí nghiệm 3.2.1.3 Tác dụng Naringin đối với ti thể mơ hình HR a Tác dụng của Naringin đới với cardiolipin màng ti thể Nar có tác dụng bảo toàn hàm lượng CL thể qua việc làm tăng tín hiệu huỳnh quang NAO (màu xanh) nhóm tế bào xử lý với hoạt chất so với nhóm HR+DMSO (p