Nghiên cứu nhân giống cây huyết dụ (cordyline terminalis kunth ) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP ===***=== KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HUYẾT DỤ (Cordyline terminalis Kunth.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn : Ths Nguyễn Thị Huyền PGS TS Nguyễn Văn Việt Sinh viên thực : Nguyễn Thị Quỳnh Trang Mã sinh viên : 1753070569 Lớp : K62 - CNSH Khóa học : 2017-2021 Hà Nội, 2022 LỜI CẢM ƠN Được đồng ý ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam, em thực đề tài tốt nghiệp: Nghiên cứu nhân giống Huyết Dụ (Cordyline terminalis Kunth.) phương pháp nuôi cấy in vitro Qua năm học tập rèn luyện Trường Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam, dìu dắt tận tình thầy trường phòng ban tạo điều kiện tốt cho em hồn thành chương trình học, đặc biệt thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS.Nguyễn Văn Việt Ths Nguyễn Thị Huyền tận tình hướng dẫn truyền đạt kinh nghiệm quý báu bảo tận tình cho em suốt trình thực đề tài Đồng thời xin cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình vật chất tinh thần đến từ gia đình, bạn bè, người sát cánh bên em suốt quãng thời gian học tập thực đề tài Trường Đại học Lâm Nghiệp Tuy em cố gắng để hoàn thiện đề tài tốt nghiệp này, song kiến thức chuyên mơn kinh nghiệm cịn hạn chế nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đóng góp ý kiến thầy để báo cáo em hoàn thiện Hà Nội, ngày 15 tháng 03 năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Quỳnh Trang DANH MỤC VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Giải thích ĐHST Điều hòa sinh trưởng BAP Benzyl amino purine NAA α – naphthalene acetic acid Kinetin N- (2 – Furfurylamino ) – – H – purin – 6- amine MS Murashige and Skoog (1962) IAA Indole acetic acid 10 CTTN Cơng thức thí nghiệm 11 ĐC Đối chứng 13 CT Công thức 14 IBA Indole butyric acid 15 2,4-D Dichlorophenol acetic acid 16 GA3 Gibberelin 17 Z zeatin 18 Ki Kinetin 19 TDZ Thidiazuron 20 BA Benzyl adenin ĐẶT VẤN ĐỀ Từ xa xưa, ông cha ta biết sử dụng nhiều loài dược liệu quý vào sống hàng ngày để chữa nhiều bệnh khác Ngày nay, tầm quan trọng nhu cầu sử dụng thuốc ngày nâng cao ngành dược nói chung người dùng truyền thống nói riêng Bởi vì, sử dụng dược liệu có nguồn gốc từ thực vật đem lại hiệu to lớn mặt điều trị tính an tồn cao Trong loại dược liệu dân gian, phải nhắc đến Huyết Dụ (Cordyline terminalis Kunth.) tác dụng to lớn làm mát máu, bổ huyết, cầm máu, làm tan máu ứ, thổ huyết, ho máu, tiểu tiện máu, giảm đau phong thấp, nhức xương, trị rong kinh, xích bạch đới, kiết lỵ Bên cạnh giá trị dược liệu, Huyết dụ ngồi đẹp nên cịn trồng làm cảnh trang trí chứa đựng giá trị phong thủy Do Huyết dụ mang đến nhiều giá trị y dược, làm cảnh phong thủy nên nhu cầu giống loài ngày tăng cao Hiện nay, việc sản xuất giống Huyết dụ chủ yếu phương pháp giâm cành với nhược điểm tốn nhiều thời gian, hệ số nhân giống thấp, dễ bị bệnh Vì vậy, việc sử dụng công nghệ nuôi cấy in vitro để tạo lượng số lượng lớn với chất lượng đồng thời gian ngắn cần thiết Công nghệ triển khai rộng rãi giới có Việt Nam, đem lại hiệu cao cho nhiều giống trồng khác Do đó, để nâng cao hiệu nhân giống lồi Huyết Dụ tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu nhân giống Huyết Dụ (Cordyline terminalis Kunth.) kĩ thuật nuôi cấy in vitro” PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm nuôi cấy in vitro Nuôi cấy in vitro hay nuôi cấy mô tế bào thực vật thuật ngữ mô tả loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật ống nghiệm có chứa mơi trường xác định điều kiện vơ trùng Mơi trường có chứa muối khống, vitamin, đường hormone tăng trưởng Kỹ thuật nuôi cấy nhằm cải thiện tính di truyền, nhân nhanh giống, bệnh học thực vật 1.1.2 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Haberlandt (1902) người đưa lý thuyết, Schleiden Butschli (người mơ tả xác q trình phân chia tế bào) Nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu với cơng trình ni cấy thành cơng rễ cà chua mơi trường lỏng chứa muối khống, glucose, dịch chiết nấm men White (1934) Tại Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đánh dấu cơng trình ni cấy bao phấn lúa thuốc (1978) [7] Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh Ngày nuôi cấy in vitro ứng dụng mạnh mẽ thực tiễn chọn nhân giống 1.1.3 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1902, Gottlibeb Haberlant-nhà thực vật học người Đức đặt móng cho ni cấy mơ tế bào thực vật Ơng đưa giả thuyết tính tồn tế bào sách “Thực nghiệm nuôi cấy tách rời” năm 1902 Theo ông: “ Tất tế bào thể đa bào mang tồn lượng thơng tin di truyền thể gặp điều kiện thích hợp, tế bào có khả tái sinh phát triển thành cá thể hồn chỉnh”[2] Tính tồn tế bào mà Haberlant đưa sở lí luận phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật Khả chồi, rễ quan khác cho kết khác Các mẫu non trẻ có phản ứng với mơi trường ni cấy cho chồi, rễ nhanh mẫu già Vì vậy, để chọn mẫu cấy phù hợp phải vào độ tuổi hay trạng thái sinh lý lồi Sự phân hóa tế bào chuyển hóa tế bào phơi sinh thành mơ chuyên hóa đảm nhận chức khác thể Ngược lại, phản phân hóa chuyển tế bào chuyên hóa chức trở lại thành tế bào phơi sinh điều kiện ni cấy thích hợp 1.1.4 Dụng cụ sử dụng q trình ni cấy mô tế bào thực vật Để thực trình ni cấy mơ tế bào thực vật cần trang bị phịng ni cấy vơ trùng, nồi hấp số điều kiện phù hợp với lồi Phịng ni cấy cần trang bị tủ cấy vô trùng, giàn cây, mơi trường, ống nghiệm, bình đun mơi trường, ống thủy tinh, Dụng cụ dùng nuôi cấy gồm: dao, kéo,panh, đĩa cấy, Dụng cụ khử trùng nồi hấp đốt kĩ trước sử dụng 1.1.5 Quy trình ni cấy mơ tế bào thực vật Chọn khử trùng mẫu Mục đích chủ yếu giai đoạn tạo nguồn vật liệu vô trùng để đưa vào môi trường nuôi cấy Chọn mẹ đạt chuẩn để làm nguồn vật liệu nhân giống Chú ý mẹ phải sở hữu đặc tính vượt trội, bệnh Thời điểm chọn mẫu: Thời điểm mẹ tăng trưởng mạnh Tạo thể nhân giống in vitro Môi trường nuôi cấy chọn lọc đặc biệt nhằm tạo thể nhân in vitro, có hai thể nhân thể chồi thể cắt đốt Nhân giống in vitro Nhân giống từ thể chồi vật liệu ni cấy Cây nhân giống có trạng thái sinh lý trẻ, môi trường nuôi cấy thông thường Tạo in vitro hoàn chỉnh Khi chồi đạt chiều cao, số lượng lá, chuyển sang mơi trường tạo rễ để hình thành hồn chỉnh Chuyển in vitro vườn ươm Cây đủ chiều cao, số lượng lá, rễ hoàn chỉnh đưa vườn ươm để thích nghi với điều kiện tự nhiên 1.1.6 Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng(ĐHST) ni cấy Chất ĐHST thực vật (hoocmon sinh trưởng) chất sinh để điều hịa q trình phát triển Mỗi giai đoạn điều khiển nhóm chất định a Auxin Auxin nhóm sử dụng rộng rãi nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhóm có tác dụng sinh lý lên nhiều mặt trình sinh lý tế bào, chủ yếu làm tăng thể tích tế bào, kích thích hình thành rễ, kìm hãm sinh trưởng chồi bên, kìm hãm rụng hoa, rụng Trong IAA (Indole acetic acid) auxin tự nhiên có mơ thực vật, cịn NAA (Naphthyl acetic acid), IBA (Indole butyric acid), 2,4-D (Dichlorophenol acetic acid) auxin nhân tạo mà auxin nhân tạo thường có hoạt tính mạnh auxin tự nhiên Auxin có phận mô phân sinh đỉnh, phận non (auxin nội sinh) Nhóm có khả thúc đẩy phân chia tế bào, phát triển tế bào, tạo phôi soma b Cytokinin Các cytokinin dẫn suất adenine, có tác dụng kích thích sinh trưởng tế bào cấy mơ tăng tốc độ phân bào, kích thích tạo chồi bất định (khi nồng độ cao), ức chế phân hóa rễ mơ cấy Cytokinin sử dụng thường xuyên BAP (6-Benzylaminopurin), zeatin (Z) cytokinin tự nhiên Còn Ki (Kinetin), TDZ (Thidiazuron) BA (Kinetin Benzyl adenin) cytokinin tổng hợp c Gibberelin Đây chất có tác dụng kích thích giãn tế bào, kéo dài đốt, thân, cành Ngoài , cịn có tác dụng phá tính ngủ nghỉ củ, hạt, chồi, sinh lý phát triển hoa ức chế tạo rễ phụ tạo chồi phụ Được tạo đỉnh rễ, chồi non, hạt Chất sử dụng nhiều nhóm GA3(Gibberelin) 1.1.7 Ý nghĩa việc nhân giống in vitro a Ưu việt phương pháp này: - Số lượng giống cao, chọn lọc đặc tính tốt mong muốn (khả sinh trưởng, phát triển tốt, khả chống chịu sâu bệnh, suất cao, ) - Cây giống đồng kích thước với số lượng lớn - Nhân nhanh với số lượng lớn, tiết kiệm không gian, không phụ thuộc vào thời tiết vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ - Cây tạo điều kiện vô trùng, bệnh hạn chế tối đa khả phát tán bệnh - Dễ vận chuyển: Cây có kích thước nhỏ vận chuyển xa dễ dàng thuận tiện - Sản xuất quanh năm mà không phụ thuộc vào yếu tố bên mùa vụ , nhiệt độ, ánh sáng, b Hạn chế - Đòi hỏi trang thiết bị đại, tiên tiến phí lớn - Khả đột biến cao - Cây có đặc tính khơng mong muốn -Cây nhỏ địi hỏi phải chăm sóc đặc biệt giai đoạn sau ống nghiệm 1.2 Giới thiệu Huyết Dụ Tên khoa học: Cordyline terminalis Kunth Tên khác: Huyết dụng, Huyết dụ đỏ, Phát dụ, Long huyết, Thiết dụ, Phất dụ, Chổng đeng (Tày), Co trường lậu (Thái), Quyền diên (Dao) Thuộc chi: Cordyline Thuộc họ: Asparagaceae Thuộc bộ: Asparagales 1.2.1 Đặc điểm thực vật Cây Huyết Dụ có thân gỗ, mảnh khảnh chiều cao lên đến 3m trồng vườn Thân không bị phân thành nhánh có nhiều đốt sẹo giống thuộc họ cau, dừa Lá huyết dụ thường mọc tập trung phần đỉnh xếp thành dãy Lá có hình lưỡi kiếm, cuống dài bẹ Thơng thường có chiều dài từ 30 đến 50cm rộng từ 10 đến 15cm Mép có màu xanh, đỏ tía kết hợp màu sắc khác ấn tượng Gốc thắt lại, đầu thuôn nhọn, mép nguyên lượn sóng, hai mặt màu đỏ tía, có loại lại có mặt đỏ, cịn mặt màu lục xám; cuống dài có bẹ rãnh mặt Hoa Huyết Dụ mọc thành cụm tập trung phần thân thành chùm xim chùy phân nhánh, cụm hoa dài từ 30 đến 40cm Đồng thời, nhánh thường có nhiều hoa trắng, mặt ngồi có màu tía, đài 3, thuôn nhọn, cánh hoa 3, thắt lại giữa, nhị 6, thị ngồi tràng, bầu có ô Thông thường hoa Huyết Dụ mọc từ tháng 11 đến tháng năm sau Quả mọc thành chùm dài, hình cầu mọng Huyết dụ phân bố rộng khắp nước ta Hình 1.1 Hình thái Huyết Dụ (Nguồn: https://thuocdantoc.vn/duoc-lieu/cay-huyet-du) 1.2.2 Nguồn gốc phân loại a Nguồn gốc Cordyline chi thực vật có nguồn gốc từ đảo Thái Bình Dương vùng Đơng Nam Á Có khoảng 15 lồi gỗ lâu năm thường xanh b Phân loại Cordyline australis loài thường thấy trồng trọt Nó giống yucca có dài, sẫm hẹp Có số giống trồng lồi này, bao gồm ‘Dark Star’ với màu đỏ, ‘Jive’ phát triển nhỏ ‘Pink Champagne’ với màu xanh cây, màu kem màu hồng Cordyline terminalis loài khác với nhiều giống trồng khác Nó sặc sỡ với rộng có màu vàng, cam, đen, đỏ, xanh pha trộn nhiều màu sắc, tùy thuộc vào giống Đây loài trồng sử dụng phổ biến Việt Nam để làm thuốc làm cảnh Cordyline fruticosa bao gồm giống "Soledad Purple" có lớn màu xanh bật Các non nhuốm màu tím hoa màu tím nhạt Cordyline stricta tương tự ‘Soledad Purple.’ Các cụm hoa màu tím nhạt dài đến hai feet (0,6 m) 1.2.3 Giá trị dược liệu kinh tế Huyết Dụ Trong Đông y, Huyết dụ dùng làm vị thuốc có tác dụng chữa bệnh tốt Lồi có tính mát xuất thuốc trị lao phổ, rong huyết, băng huyết,… tốt Lồi có vị nhạt, tính mát có tác dụng 10 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro Trong quy trình nhân giống lồi tạo mẫu bước đóng vai trị quan trọng ảnh hưởng đến q trình Mơi trường ni cấy có chứa đường, vitamin, yếu tố thuận lợi cho vi khuẩn nấm phát triển Đây tác nhân cạnh tranh dinh dưỡng, oxy với mẫu thực vật Do đó, khâu khử trùng khơng triệt để làm cho vi sinh vật cịn sót lại bề mặt mẫu nhanh dẫn đến môi trường bị nhiễm khuẩn nấm kết mẫu cấy khơng thể phát triển Vì vậy, việc nghiên cứu tìm phương pháp khử trùng mẫu phù hợp đạt hiệu cao cần thiết HgCl2 hóa chất khử trùng bề mặt thường sử dụng nghiên cứu tạo mẫu in vitro khả tiêu diệt loài vi sinh vật bao gồm vi khuẩn nấm tốt Trong nghiên cứu tạo mẫu Huyết dụ in vitro sử dụng HgCl2 0,1% với thời gian khác Kết thu được trình bày bảng 3.1 đây: Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu Huyết dụ in vitro Thời gian (phút) Tỷ lệ mẫu (%) Tỉ lệ mẫu tái sinh chồi (%) KT1 48,89 47,78 KT2 63,33 60,00 78,89 71,11 KT4 90,00 85,56 KT5 98,89 73,33 CTTN KT3 Loại hóa chất HgCl2 0,1% 27 Ftính (244,76) > Fcrit (5,19) 120 100 80 60 40 20 phút phút Tỉ lệ mẫu phút phút phút Tỉ lệ mẫu tái sinh Biểu đồ 3.1: Tỉ lệ mẫu tái sinh chồi Từ kết bảng cho thấy mẫu nuôi cấy khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% với thời gian khác (5-9 phút) cho hiệu mẫu chồi tái sinh khác Ở thời gian khử trùng phút cho tỉ lệ mẫu thấp (48,89%) Tiếp tục tăng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% lên 6-9 phút có tỉ lệ mẫu tăng dần đạt cao cơng thức thí nghiệm KT5 (9 phút) 98,89% Tuy nhiên, so sánh tỉ lệ mẫu tái sinh chồi tăng thời gian khử trùng từ 5-8 phút tỉ lệ chồi tái sinh tăng dần, đạt cao (85,56%) công thức thí nghiệm KT4 (8 phút) Ở thời gian khử trùng phút HgCl2 0,1% tỉ lệ mẫu cao tỉ lệ mẫu tái sinh lại giảm (so với thời gian khử trùng phút) HgCl2 có chứa gốc clorua có khả oxy hóa liên kết peptide nên làm biến tính protein vi sinh vật (Ramakrishna cộng sự, 1991) Do đó, HgCl2 có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật mạnh Tuy nhiên, sử dụng thời gian dài khơng tiêu diệt vi sinh vật, HgCl2 cịn thẩm thấu vào bên gây độc cho tế bào thực vật, làm ảnh hưởng đến sức sống khả tái sinh in vitro Từ thấy, thời gian khử trùng phút HgCl2 0,1% dài nên làm giảm khả tái sinh in vitro Huyết dụ 28 Từ kết trên, nhận thấy cơng thức thí nghiệm KT4 phù hợp với mẫu Huyết Dụ khử trùng với HgCl2 phút cho tỉ lệ mẫu (90,00%) tỉ lệ tái sinh chồi (85,56%) cao Đây công thức khử trùng tối ưu tất công thức tiến hành với mẫu Huyết Dụ Hình 3.1 Chồi Huyết Dụ tái sinh mơi trường nuôi cấy khởi động sau tuần nuôi cấy Ghi chú: A, B, C chồi Huyết dụ tái sinh môi trường nuôi cấy khởi động 3.2 Kết nhân nhanh chồi 3.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả nhân nhanh chồi Cytokinin biết đến nhóm chất điều hịa sinh trưởng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, hình thành sinh trưởng chồi in vitro Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ cytokinin môi trường nuôi cấy giai đoạn tạo chồi in vitro Các loại cytokinin thường sử dụng nuôi cấy in vitro như: BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin Các chồi thu từ thí nghiệm tạo mẫu in vitro phía đạt chiều cao từ 3-4 cm cắt bớt cấy sang môi trường dinh dưỡng chứa MS + 30 g/l đường sucrose + g/l agar + (0,3-1 mg/l) BAP nhằm đánh giá ảnh hưởng BAP lên khả nhân nhanh chồi Huyết dụ Kết trình bày bảng 3.2 sau: Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi Huyết dụ 29 CTTN BAP (mg/l) Hệ số nhân nhanh (lần) Chiều cao TB/chồi (cm) Chất lượng chồi CT0 0,3 2,06 2,07 + CT1 0,5 3,79 2,83 +++ CT2 0,7 4,15 3,67 +++ CT3 5,14 3,07 ++ Ftính (236,32) > Fcrit (3,48) Ftính (19,58) > Fcrit (3,11) Chú thích: + Chất lượng chồi (các chồi nhỏ, không đều) ++ Chất lượng chồi (các chồi trung bình, xanh, nhỏ, khơng đều) +++ Chất lượng chồi tốt (chồi cao, thân mập, to, chồi xanh đồng đều) 5.14 4.51 3.79 3.67 3.07 2.06 2.08 2.07 1 hệ số nhân nhanh Chiều cao TB chồi Biểu đồ 3.2: Hệ số nhân nhanh chiều cao trung bình chồi Từ kết thu cho thấy: hàm lượng BAP khác có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu nhân nhanh chồi Huyết dụ in vitro Khi bổ sung BAP hàm lượng từ 0,3-1 mg/l vào môi trường dinh dưỡng hệ số nhân nhanh chồi thu dao động từ 2,06 đến 5,14 lần Mặc dù, công thức thí nghiệm bổ sung 30 1mg/l BAP vào mơi trường nuôi cấy thu hệ số nhân chồi cao (5,14 lần) chồi thu ngắn, nhỏ, khơng đồng đều, chiều cao chồi trung bình có xu hướng giảm Ngược lại cơng thức thí nghiệm bổ sung 0,5 0,7 mg/l BAP hệ số nhân chồi thu thấp 3,79 4,15 lần chất lượng chồi thu tốt, xanh, thân mập, đồng Phân tích phương sai nhân tố cho thấy BAP có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân chồi chiều cao chồi Tuy nhiên, chênh lệch cơng thức thí nghiệm bổ sung 0,5 0,7 mg/l BAP không nhiều nên tiếp tục lựa chọn công thức để bổ sung thêm kinetin với hàm lượng khác (0,1-0,4 mg/l) để đánh giá ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh chồi Huyết dụ in vitro Hình 3.2 Chồi Huyết Dụ môi trường nhân nhanh sau tuần Ghi chú: CT0) Nhân nhanh CT0 CT1) Nhân nhanh CT1 CT2) Nhân nhanh CT2 CT3) Nhân nhanh CT3 31 3.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi Trong thí nghiệm này, BAP kinetin hai loại cytokinin sử dụng với tác dụng kích thích hình thành chồi mẫu cấy Trong nhiều trường hợp bổ sung kết hợp BAP kinetin vào môi trường nuôi cấy cho hiệu nhân chồi cao so với riêng rẽ Trên sở chọn môi trường tốt mục 3.2.1 công thức CT1 (0,5 mg/l BAP) CT2 (0,7 mg/l BAP), tiếp tục bổ sung kinetin với nồng độ khác (0,1-0,4 mg/l) Sau tuần nuôi cấy, kết trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin đến nhân nhanh chồi CTTN Chất ĐHST (mg/l) Hệ số nhân Tỷ lệ Chiều cao nhanh chồi hữu TB/chồi (lần) hiệu (%) (cm) Đặc điểm chồi NT1 0,5 0,1 3,72 65,42 3,27 + NT2 0,5 0,2 4,54 76,96 3,80 ++ NT3 0,5 0,3 5,30 90,57 4,77 +++ NT4 0,5 0,4 3,82 79,43 3,53 ++ NT5 0,7 0,1 3,64 69,60 3,27 ++ NT6 0,7 0,2 4,61 78,06 4,33 +++ NT7 0,7 0,3 4,34 71,33 3,83 ++ NT8 0,7 0,4 3,60 55,20 2,90 + Ftính(41,41) > Fcrit(3,48) Ftính(9,35) > Fcrit(3,47) Ftính (21,81) > Fcrit (3,11) Chú thích: + Chất lượng chồi (các chồi nhỏ, không đều) 32 ++ Chất lượng chồi (các chồi trung bình, xanh, nhỏ, khơng đều) +++ Chất lượng chồi tốt (chồi cao, thân mập, to, chồi xanh đồng đều) 0.5BAP+0.1ki 0.5BAP+0.2ki 0.5BAP+0.3ki 0.5BAP+0.4Ki 0.7BAP+0.1ki 0.7BAP+0.2ki 0.7BAP+0.3ki 0.7BAP+0.4ki Hệ số nhân nhanh Chiều cao TB chồi Biểu đồ 3.3: Hệ số nhân nhanh chiều cao chồi môi trường 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Biểu đồ 3.4: Tỉ lệ chồi hữu hiệu môi trường Kết bảng 3.3, biểu đồ 3.3 3.4 cho thấy bổ sung tổ hợp BAP kinetin vào môi trường nuôi cấy cho hệ số nhân chồi chất lượng chồi thu cao hẳn so với việc bổ sung BAP Việc bổ sung BAP kinetin có ảnh hưởng rõ rệt 33 đến hệ số nhân chồi chất có tác dụng lên kích thích phân hóa, sinh trưởng phát triển chồi mẫu cấy in vitro Trong đó, tác dụng chủ yếu kích thích phân chia tế bào đặc biệt ảnh hưởng đến hình thành phân hóa chồi Trong cơng thức thí nghiệm cho hệ số nhân chồi cao từ 3,6 (NT8)-5,3 (NT3) lần Việc sử dụng môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l kinetin cho kết hệ số nhân chồi cao (5,3 lần), tỉ lệ chồi hữu hiệu 90,57%, chiều cao chồi đạt trung bình 4,77 cm, chất lượng chồi đồng đều, chồi cao, mập, xanh đậm Từ kết trên, kết luận cơng thức NT3 (MS + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 30 g/l sucrose + g/l agar ) cơng thức thích hợp để nhân nhanh chồi Huyết Dụ Hình 3.3 Chồi Huyết Dụ tái sinh môi trường nhân nhanh Ghi chú: a,b chồi Huyết Dụ tái sinh môi trường nhân nhanh 3.3 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ Huyết Dụ Tạo hoàn chỉnh bước quan trọng nhằm khép kín quy trình ni cấy in vitro Cây có rễ khỏe mạnh có khả sống sinh trưởng tốt đưa từ điều kiện phịng thí nghiệm trồng ngồi vườn ươm Trong thí nghiệm cơng thức thí nghiệm bố trí với mơi trường MS có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng NAA nồng độ khác Kết thu thập tổng hợp bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ 34 CTTN NAA Tỉ lệ rễ (mg/l) (%) Số rễ TB/cây Chiều dài rễ (cm) ĐC 0 0 RT1 0,3 68,89 2,16 1,97 RT2 0,4 Chất lượng rễ Không rễ Rễ ngắn, mảnh Rễ trắng, ngắn, rễ 78,89 2,61 2,33 mập Rễ trắng, dài, mập RT3 0,5 93,33 5,72 3,60 mạp, nhiều, có lông hút nhỏ Rễ trắng, mập, RT4 0,7 85,56 4,56 3,1 ngắn, rễ cứng lơng hút Ftính (230,24) > Fcrit (2,47) 100 93.333 85.556 90 78.889 80 68.889 70 60 50 40 30 20 10 0 ĐC 0.3NAA 0.4NAA 0.5NAA 0.7NAA Biểu đồ 3.5: Tỷ lệ chồi rễ qua môi trường (%) 35 5.722 4.556 2.156 2.611 0 ĐC 0.3NAA 0.4NAA 0.5NAA 0.7NAA Biểu đồ 3.6: Số rễ trung bình chồi mơi trường 3.6 3.5 3.1 2.333 2.5 1.967 1.5 0.5 0 ĐC 0.3NAA 0.4NAA 0.5NAA 0.7NAA Biểu đồ 3.7: Chiều dài trung bình rễ mơi trường (cm) Kết cho thấy nồng độ NAA khác có ảnh hưởng khác lên khả rễ Huyết dụ Ở CTTN đối chứng với mơi trường MS khơng bổ sung NAA chồi Huyết Dụ khơng có khả rễ Ở cơng thức thí nghiệm cịn lại bổ sung từ 0,3-0,7 mg/l NAA tất cho rễ với tỉ lệ cao (từ 68,89-93,33%) Tuy nhiên, số rễ trung bình chiều dài rễ trung bình chất lượng rễ có khác biệt rõ rệt Trong tỉ lệ chồi rễ cao 93,33% công thức bổ sung 0,5 mg/l NAA, số rễ trung bình mẫu 5,72 rễ chiều dài rễ trung bình đạt 3,6 cm, rễ trắng, mập có nhiều lơng hút 36 Hình 3.4 Rễ Huyết Dụ môi trường nuôi cấy Ghi chú: ĐC) Công thức đối chứng RT2) Ra rễ công thức RT1) Ra rễ công thức RT3) Ra rễ công thức RT4) Ra rễ công thức 37 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Thời gian khử trùng tạo mẫu Huyết Dụ với cơng thức thí nghiệm KT4 phù hợp với mẫu Huyết Dụ khử trùng với HgCl2 phút cho tỉ lệ mẫu (90,00%) tỉ lệ tái sinh chồi (85,56%) cao - Nhân nhanh chồi Huyết Dụ cơng thức thí nghiệm NT3 với MS + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 30 g/l sucrose + g/l agar đạt hệ số nhân nhanh 5,30 lần, chiều cao trung bình 4,77 chồi/mẫu, tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt 90,67% - Ra rễ tạo hồn chỉnh Huyết Dụ cơng thức MS bổ sung 0,5 NAA +30 g/l sucrose + g/l agar cho tỉ lệ rễ 93,33%, số rễ TB/ chồi 5,72 chiều dài rễ TB 3,6 cm Tồn kiến nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn, tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp nên chưa thể huấn luyện chưa nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường bên ngồi đến khả sống sinh trưởng Huyết Dụ vườn ươm, nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng chế độ tưới nước, chế độ chiếu sáng chế độ bón phân đến khả sinh trưởng phát triển ngồi vườm ươm Vì vậy, kiến nghị cần tiếp tục nghiên cứu thêm nội dung để bổ sung vào quy trình nghiên cứu 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Dương Thị Ngọc Anh, Ngô Thị Mai Anh, Phan Thúy Hiền, Nguyễn Thị Hương, Hoàng Thị Như Nụ, Lê Xuân Thảo , Vũ Hoài Sâm, Nguyễn Thị Xuyên, (2018), “ Nghiên cứu nhân giống in vitro địa hoàng (Radix Rehmanniae glutinosae)”, Tạp chí Dược liệu, tập 23, số 6, trang 374 - 380 Nguyễn Thị Lý Anh (2/1990), “Nhân giống trồng in vitro”, Khoa CNSH-ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội La Việt Hồng, Phạm Ngọc Khánh, Phạm Thị Quy, Nguyễn Thị Thanh, Trần Hồng Thu, Đinh Phương Thảo, (2017), “ Xác định thị phân tử tái sinh chồi in vitro loài Hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll ex Hemsl.) thu SaPa- Lào Cai”, Tạp chí Khoa Học Cơng Nghệ, tập 164, số 04, trang 189-193 Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Văn Khiêm, Bùi Đức Quỳnh, Vũ Hoài Sâm (2016), “ Nghiên cứu nhân giống in vitro bách hợp (Lilium brownii f.e Brown), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(1), trang 121-129 Thị Á Kim, Hồ Lê Diễm Trinh, Nguyễn Thị Tường Vi (2018), “ Nhân giống in vitro Đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f et Thomson) từ mô sẹo”, Tạp chí phát triển Khoa Học Cơng Nghệ ,Chuyên san Khoa Học Tự Nhiên, tập 2, số 4, trang 56-61 Phan Lê Thị Muội (1978), “Tạo lúa từ hạt phấn ni cấy in vitro”,Tạp chí Sinh vật động học Lê Thị Muội (1979), “Tạo thuốc đơn bội từ hạt phấn nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật nơng nghiệp Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Quỳnh Trang, Bùi Văn Thắng(2017), “Nghiên cứu nhân giống in vitro Re hương (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) meisn)”,tạp chí khoa học cơng nghệ Lâm Nghiệp tháng 10/2017:42-48 Nguyễn Quang Thạch (2009), sở công nghệ sinh học,NXB Giáo dục, tập 39 10 Bùi Văn Thắng (2017), “Nhân giống in vitro hà thủ đỏ (Polygonum multiforum Thunb.)”, tạp chí Khoa học Cơng nghệ Lâm nghiệp, số 4:2328 11 Hồng Thị Thế, Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thủy (2013), “Quy trình nhân giống in vitro ba kích (Morinda officenalis How)”, tạp chí Khoa học Phát triển, tập 11, số 3: 285-292 12 Hồ Lê Diễm Trinh, Nguyễn Thị Tường Vi, (2018), “ Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllium Thunb)”, Tạp chí Nơng Nghiệp Phát Triển Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, số 5, trang 89-92 Tài liệu nước 13 N.Ramakrishna, J.Lacey, J.E.Smith “Effect of surface sterilization, fumigation and gamma irradiation on the microflora and germination of barley seeds”, International Journal of Food Microbiology Volume 13, Issue 1, May 1991, Pages 47-54 14 Firoj Ahmed, Prabir K Das, M Amirul Islam, K M Rahman, Md Mustafizur Rahman and M S T Selim, 2003, “Antibacterial Activity of Cordyline terminalis Kunth Leaves”, Journal of Medical Sciences, 3: 418422 15 Tui Ray, Prasenjit Saha, S.C.Roy (2006), “Commercial production of Cordyline terminalis (L) Kunth from shoot apex meristem and assessment for genetic stability of somaclones by isozyme markers”, Scientia Horticulturae, Volume 108, Issue 3, Pages 289-294 16 Asad Shabbir, Nosheen Hameed, Amir Ali, Rukhsana Bajwa (2009), “Effect of different cultural conditions on micropropagation of rose (Rosa indica L.)” Pakistan Journal of Botany, 41(6): 2877 – 2882 17 M.Amzad Hosain, Mohan Raj Nagooru(2011), “Biochemical Profiling and Total Flavonoids Contents of Leaves Crude Extract of Endemic Medicinal Plant Corydyline terminalis L Kunth”, Pharmacognosy Journal, Volume 3, Pages 25-30 40 18 Bruno Trevenzoli Favero, Gláucia Dias, Q.A.C Carmello (2012), “ Vase life of new tropical cut foliage: Cordyline terminalis”, Discover scientific knowledge and stay connected to the world of science, Acta Horticulturae 945(945):351-35 19 Tui Ray , Prasenjit Saha, Satyesh C Roy (2013), “Micropropagation of Cordyline terminalis”,Methods MolBiol 11013:269-77 doi:10.1007/978-1-62703-074-8_21 20 Romuald T.Fouedjou, Rémy B.Teponno, Luana Quassinti, Massimo Bramucci Dezemona Petrelli , Luca A.Vitali, Dennis Fiorini, Léon A.Tapondjou, Luciano Barboni (2014), “ Steroidal saponins from the leaves of Cordyline fruticosa (L.) A Chev and their cytotoxic and antimicrobial activity”, Phytochemistry Letters, Volume 7, Pages 62-68 21 Y.H.Dewira, bg, M.E.EL-Mahrouk, A.N.EL-Banna (2015) , “In vitro propagation and preliminary results of Agrobacterium-mediated genetic transformation of Cordyline fruticosa” , South African Journal of Botany, Volume 98, Pages 45-51 22 Marzena Warchoł, Edyta Skrzypek, Tadeusz Kusibab, Franciszek Dubert (2015), “Induction of somatic embryogenesis and biochemical characterization of Cordyline australis (G Forst.) Endl ‘Red Star’ callus”, Scientia Horticulturae, Volume 192, Pages 338-345 Tài liệu Wed 21 https://thuocdantoc.vn/duoc-lieu/cay-huyet-du 22 http://vuonduoclieu.vn 23 https://www.shopthaoduoc.net/ 24 http://thaythuocVietNam.vn 25 http://www.dongyVietNam.org.vn 26 http://trungtamduoclieu.com 27 http://caythuoc.vn 28 http://vuonthuocquy.vn 41