Xây dựng quy trình định lượng virus viêm gan c bằng kỹ thuật real time rt pcr phục vụ cho việc nghiên cứu và điều trị bệnh viêm gan siêu vi c

THÀNH PHố Hồ cHÍMNH SỞ KHOA HỌC - CONG NGHỆ C*%HZ3/46 CHƯƠNG TRÌNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VIRUS VIEM GAN C BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME RT-PCR PHUC VU CHO VIEC NGHIEN CUU VA DIEU TRI BENH VIEM GAN SIEU VIC Chi nhiém dé tai : DGS TS F606 Wougnh Stuy Duong Cơ quan : Di truyền - Khoa Sinh học Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Bémén ĐHQG Thành phố Hồ Chí Minh THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2005 MỤC LỤC TỔNG QUAN 3.3 Phương pháp PCR, RT-PCR 3.4 3.5 3.6 3.7 Phương Phương Phương Phương pháp pháp pháp pháp PCR, RT-PCR đánh dấu với digoxigenin-dUTP điện trén gel agarose ELISA real-time RT-PCR 3.8 Phương pháp xử lý thống kê KẾT QUÁ - THẢO LUẬN Thiết kế oligonucleotide Kiểm tra hoạt động oligonucleotide 2.1 Hiệu nhân cặp primer RTHCVf-RTHCVr 2.2 Khdo sat hoat d6ng cia Taqman HCV 2.3 Khả nang lam ban mau (template) cia amplicon Xay dung phan ting real-time RT-PCR dinh lugng HCV 3.1 Hoạt động hệ primer-probe-amplicon phản ứng real-time RT-PCR 3.2 Khảo sát nồng độ MgCl; 3.3 Khảo sát nồng độ Taqman probe 3.4 Khảo sát hệ số tuyến tính đường chuẩn (standard curve) 3.5 Khảo sát tính lặp lai cia phan ting real-time RT-PCR MM 3.1 Phương pháp thiết kế primer-probe-amplicon 3.2 Phương pháp tách chiết RNA HCV OO Phương pháp ew Dung cụ ~ Thiết bị Wee 1.8 Thang DNA (Molecular Weight Marker) eee 1.5, Hóa chất thực phắn ứng lai ELISA 1,6 Hóa chất cho phản ứng PCR RT-PCR đánh dấu digoxigenin 1.7 Hóa chất cho phản ứng real-time RT-PCR Aw 1.3 Hóa chất tách chiết RNA 1.4 Hóa chất thực phản ứng PCR, RT-PCR ms 1.2 Mẫu bệnh phẩm HCV oO Vật liệu 1.1 Primer-probe-amplicon ree VẬT LIỆU - PHƯONG PHÁP MAANDNDADUUMUUHUAUYH MỤC TIỂU NGHIÊN CỨU - NỘI DUNG THỰC HIỆN 18 18 19 20 21 3.5.1 Hệ số biến thiên nội phản ứng (intraassay variability coefficicent) 3.5.2 Hệ số biến thiên liên phần ứng (interassay variability coefficicent) 3.6 Khảo sát độ nhạy phần ứng real-time RT-PCR 3.7 So sánh với SYBR Green I 4, So sánh quy trình định lượng HCV với quy trình định lượng HCV 22 25 26 5, Đánh giá sở y tế 5.1, Xây dựng quy trình định lượng dạng kit thử nghiệm 28 31 31 KẾT LUẬN 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 bDNA PHỤ LỤC TONG QUAN TAI LIEU Bệnh viêm gan siêu vi bệnh nhiễm trùng nhiều loại virus có tính với tế bào gan gây Các loại virus xâm nhập vào tế bào gan gây nhiều biến đổi gan, nghiêm trọng phần ứng viêm (inflammation) phản ứng hoại tử (necrosis) tế bào gan Bệnh viêm gan siêu vi C virus viêm gan C (Hepatitis C Virus - HCV) gây Hậu trầm trọng bệnh tình trạng xơ gan ung thư gan Hiện giới có khoảng 170 triệu người nhiễm HCV năm lại có thêm đến triệu người nhiễm Khoảng 80% người nhiễm HCV chuyển sang tình trạng nhiễm mạn tính, 10 đến 20% chuyển sang xơ gan đến 5% chuyển thành ung thư gan HCV làm trầm trọng thêm bệnh viêm gan loại virus khác đồng nhiễm Theo đánh giá chuyên gia thuộc Tổ chức Sức khỏe Thế giới (WHO) bệnh viêm gan siêu vi C mối đe dọa sức khỏe cộng đồng lớn kỷ có lẽ kỷ sau HCV lan truyền cộng đồng qua đường truyền máu sản phẩm máu, quan hệ tình dục, mẹ truyền sang Hiện nay, chưa có vaccine để phịng chống HCV tính biến động di truyền cao virus Bệnh viêm gan siêu vi C chữa khỏi với interferon kết hợp với ribavirin Tỉ lệ thành công thấp, khoảng 10 đến 20% dùng interferon từ 30 đến 50% có kết hợp với ribavirin Tuy nhiên, việc điều trị với hai loại thuốc tốn Ngoài ra, phan tng phy kèm với việc điểu trị interferon ribavirin đơi cịn nghiêm trọng tình trạng bệnh thường làm xấu tình trạng bệnh sẵn có Việc điều trị tiếp tục bệnh nhân có dấu hiệu đáp ứng điểu trị thơng qua đấu hiệu lâm sàng, sinh hóa, miễn dịch trực tiếp hàm lượng HCV thể giảm xuống theo thời gian điều trị Ngoài ra, hàm lượng HCV thể trước điều trị cịn cung cấp thơng tín tiền đốn (prognosis) giúp cho việc định phương cách điều trị Nếu người bệnh nhiễm HCV genotype l có hàm lượng HCV co thể lớn triéu ban ml máu thời gian điều trị 48 tuần thay 24 tuân trường hợp khác Để đáp ứng mục tiêu theo dõi hàm lượng virus, người ta phát triển nhiều phương pháp nhằm định lượng HCV Phương pháp PCR ứng dụng vào việc định lượng virus thông qua vật liệu di truyền nó, điển hình PCR định lượng cạnh tranh (competitive quantitative PCR) Phương pháp phương pháp bán định lượng (semiquantitation), dựa vào so sánh cường độ sắn phẩm PCR gel agarose sản phẩm đích sẵn phẩm nhân đồng thời có cường độ biết, thơng qua so sánh đó, người ta suy hàm lượng sản phẩm đích hay nồng độ virus có mẫu bệnh phẩm ban đầu Phương pháp sử dụng rộng rãi nghiên cứu định lượng tác nhân gây bệnh Ứng dụng chuấn thực tế lâm sàng ít, đừng lại dang kit ty chế (home-made) chưa giá kết hóa chấp thuận quan có thẩm quyền Vì việc đánh thiên lớn dựa vào điện di gel agarose nên phương pháp có độ biến lượng virus kết Một phương pháp sinh học phân tử phát triển cho định qua bDNA Đây phương pháp phát trực tiếp tiểu thể virus thơng Bayer Corp việc khuếch đại tín hiệu buỳnh quang phân tử lai Hãng hóa với thiết bị phát triển phương pháp thành kit định lượng tự động Thực phẩm chuyên dụng Phương pháp bDNÑA quan quần lý Thuốc Nhiều Mỹ (DA) chấp thuận để sử dụng vào chẩn đốn thường quy người kỹ thuật nhóm nghiên cứu đưa phương pháp định lượng virus dựa Chí Minh, real-time PCR cho HCV thường so sánh với bDNA Ở thành phố Hồ Ngoài bDNA, bDNA phương pháp sử dụng cho định lượng HCV HIV hãng phương pháp PCR ELISA với kit định lượng HBV, HCV, thuận cho lưu Roche Diagnostics phương pháp khác FDA chấp lượng không hành sử dụng giới Tuy nhiên, phương pháp định Ngoài hai sử dụng rộng rãi thành phố Hồ Chí Minh nhiều nguyên nhân protein phương pháp kể trên, có số kit miễn địch dùng định lượng thể PCR HCV không sử dụng rộng rãi Cũng biến PCR định lượng real-time PCR khắc phục nhược điểm vừa kể cạnh tranh mà nhược điểm phương pháp định lượng Đựa mong muốn có cải tiến nhằm làm cho phương pháp định lượng hơn, năm 1991 dựa kỹ thuật PCR trở nên xác có độ tin cậy cao taqg polymerase, Holland cộng phát chức 5”-3' exonuclease mẫu đị có khả 0ee (1993), Bassler (1995), Livak (1995) phát triển loại gọi FRET thực phản ứng chuyển lượng huỳnh quang hay cịn bị cơng (Fluorescent energy transfer) với phát triển mặt thiết vào việc hình ty Perkin Elmer, Idaho Technologies, AcuGen góp phan cách khái quát, thành phương pháp định lượng mới, real-time PCR Một khả phát phần ứng real-ime PCR người ta có sử dụng tác nhân có Green I, Ethidium huỳnh quang Các tác nhân hóa chất SYBR fluorescein, bromide mẫu dị (probe) có gắn chất phát huỳnh quang đích Tamra hai đầu mút Trong phẩn ứng, có nhân bắn sẩn phẩm Cường chất liên kết với sân phẩm dich va bat đầu phát tín hiệu huỳnh quang đích độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với hàm lượng sản phẩm đầu đị nhân phản ứng Các tín hiệu huỳnh quang phát quang máy luân nhiệt real-time thu nhận xử lý Khi cường độ tín hiệu huỳnh xem mẫu vựơt qua đường tín hiệu huỳnh quang nên phản ứng mẫu trị chu kỳ đương tính người ta lấy thời điểm vượt qua (biểu qua giá xây dựng từ chu kỳ ngưỡng) để so sánh với đường cong (standard curve) ngưỡng mẫu chuẩn biết trước nổng độ sản phẩm đích mà suy nồng độ sản phẩm đích mẫu thử nghiệm ban dau Ngoài mục tiêu khác, định lượng nucleic acid ứng dụng xây dựng kỹ thuật này, Eink (1998) định lượng mRNA để nghiên cứu mức độ phiên mã tế bào riêng rẽ, Bustin McKay (1999) nghiên cứu phân bố protein mô, Yajima (1998) định lượng thành phẩn RNA telomerase người Về ứng dụng để phát tác nhân gây bệnh người virus, vi khuẩn, nấm ngày có nhiều cơng trình sử dung kỹ thuật để định lượng tác nhân gây bệnh nhằm phục vụ cho nghiên cứu chẩn đốn Trên đối tượng HCV, cơng trình sử dụng real-time RT-PCR nhằm định lượng virus xuất từ sớm Martell (1996) ngày nhiều Cho đến thị trường bắt đầu xuất kit thương mại HCV COBAS TaqMan 48 ASR (Roche Diagnostics) hay HCV Quantitation ASR (Abbott) Việc xây dựng quy trình real-time RT-PCR nhằm định lượng HCV để tài nằm xu chung đáp ứng nhu cầu chẩn đoán thực tế chỗ Việc có nhiều hãng bán hóa chất thiết bị cho realt-ime PCR Việt Nam Amersham Biosciences, Bio-Rad, ABgene, Perkin Elmer, thuận lợi lớn cho phát triển phương pháp ngồi định lượng, phương pháp cho phép đáp ứng nhu cầu khác chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi xác định genotype, phân tích đột biến kháng thuốc Sự tiện lợi, linh động (một loại máy làm nhiễu chức năng), phổ biến, cạnh tranh nhiều công ty số ưu điểm phương pháp phương pháp khác có mục tiêu Với mong muốn phát triển phương pháp có nhiều ưu điểm cộng với nhu câu thực tế sở y tế có quan hệ hợp tác nghiên cứu, tiến hành nghiên cứu để tài”Xây đựng quy trình định lượng virus viêm gan C kỹ thuật real-time RT-PCR phuc vy cho viéc nghiên cứu diéu tri bệnh viêm gan siêu vị C” MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Xây dựng quy trình định lượng HCV dựa kỹ thuật real-time RT-PCR (real-time RT-PCR HCV) nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu diéu tri bệnh viêm gan siéu vi C NOI DUNG THUC HIEN Thiết kế hệ primer-tagman probe-amplicon dùng phan ting real-time RT-PCR 2, Khảo sát hoạt động hệ oligonucleotide thiết kế hiệu nhân bản, độ đặc hiệu, khả làm bắn mẫu Xây dựng phản tng real-time RT-PCR HCV :khảo sát nồng d6 MgCl2, Taqman probe, nông độ cặp primer, hệ số tuyến tính đường chuẩn, độ nhạy, độ đặc hiệu, hệ số biến thiên nội liên phẩn ứng, so sánh với SYBR Green I So sánh với phương pháp bDNA Đánh giá hiệu sử dụng thực tế sở y tế VẬT LIỆU ~ PHƯƠNG PHÁP VẬT LIỆU SINH HỌC 1,1, Primer-probe-amplicon Trinh Tén RTHCVf_ | 5gcg tct agc cat gøc gtt RTHCVr | 5’acc erg ter ycc yrg cra 5'6FAMact cac cgg ttc Taqman ty agt atg 3' ttc 3! cge aga cca cta tag} Tm Vị trí gene 61°C 62°C 69,9°C 75-98 171-191 135-164 ctc TAMRA HCV 75-191 Amplicon | 5'gcgtctagccatggcgtfagtatgagtgtcgtgcagcctcc AggaccccccctCCCgggagagccatagtggtctgcggaa HCV CCgptgagtacaccggaaltgccaggacgaccgggt 3' Các oligonucleotide tổng hợp cung cấp công ty Integrated DNA Technologies (Mỹ) 1.2 Mẫu bệnh phẩm HCV Tất mẫu huyết nghỉ nhiễm HCV mẫu huyết đương tính HCV định lượng bDNA cung cấp Trung tâm Chẩn Đốn Y Khoa Hịa Hảo (Medic) thời gian từ tháng 1/2005 đến tháng 7/2005 1,3 Hóa chất tách chiết RNA Guanidinium thiocyanate (Roche Diagnostics) Silica (Sigma) Một số hoá chất thông dụng khác : Tris HCI, ethanol, acetone, Triton X-100 (Merck), diethylpyrocarbonate (Amersham Biosciences) 1.4 Hóa chat thic hién phan ting PCR, RT-PCR Ready-to-go RT-PCR bead (Amersham Biosciences) Ready-to-g0 PCR bead (Amersham Biosciences) 1.5 Hóa chất dùng cho phản ting lai ELISA B6 kit PCR ELISA DIG Detection (Roche Diagnostics) 1.6 Héa chất cho phần ứng PCR RT-PCR đánh dấu với digoxigenin Digoxigenin dUTP (Roche Diagnostics) 1.7 Héa chat cho phan ifng real-time RT-PCR cDNA synthesis kit (Bio-Rad) 1Q supermix (Bio-Rad) IQ SYBR Green I (Bio-Rad) 1.8 Thang DNA (Molecular Weight Marker) Thang DNA stt dung 14 thang 100 bp (ABgene) va 50 bp (Fermentas) Thang 100 bp Vach Kớch thc (bp) xe | â |ơ |a fr Bw NY 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 2, DỤNG CỤ ~ THIẾT BỊ Tủ cấy vô trùng (Việt Nam) Vortex (Heidolph) Máy luân nhiệt (MI Research) Máy luân nhiệt real-time iCycler (Bio-Rad) Thiết bị điện di : Bộ điện di nằm, điện di đứng (Hoefer) Ly tâm eppendorf lạnh (Hermle) Bên ú nhiệt khô (Fisher Scientific) Máy lắc (Ika Labortechnik) Máy chụp hình kỹ thuật số (Olympus) lọc tia UV (Kodak) Tủ ấm ổn nhiệt (Heraeus) Máy vi tính (Việt Nam) Máy Một 10 pl, 200 eppendorf rửa máy đọc microtiter plat© (Tecan) số dụng cụ thơng dụng : Pipetman kênh loai 200 pl (Gilson), pipetman r), yl va 1000 pl (Biohit), tip 10 pl, 200 pl va 1000 pl cé phin lọc (Greine 1,5 ml (Biopur - Eppendorf) PHƯƠNG PHÁP 3.1 Phương pháp thiết kế primer-probe-amplicon (117) từ Chúng tơi tải (download) tất trình tự gen HCV hoàn chỉnh tai website ngân hàng liệu NCBI (National Center for Biology Information) phần www.ncbi.nlm.nih.gov va sau đó, tách riêng phan trinh ty nucleotide mềm Annhyb Tất 117 trình tự gen hoàn chỉnh bao gồm tất gen HCV thành genotype HCV phân loại Chúng chia việc so hàng (alignment) đoạn ngắn khoảng 500 nucleotide tiến hành ClustalX Dựa so hàng, đoạn tất 117 trình tự với phần mềm tất genotype khác chọn vùng bảo ton gen HCV bắt đầu tiến hành thiết kế oligonucleotide thiết kế theo tiêu chuẩn đưới Cac oligonucleotide Primer Probe Thành phần GC; 20-80% Thành phần GC: 20-80% otide lap lai Tránh nueleotide lặp lại, G_ | Tránh nucle Tm : 58-60°C Tm : 68-70°C nucleotide Khơng có G dau 5' cudi cing đầu 3' không chứa hai G C từ 50 Chọn mạch khn có nhiều C G để | Kích thước sẵn phẩm PCR 150 bp làm probe chỉnh sửa Các oligonucleotide thiết kế kiểm tra đặc tính cho phù hợp với yêu cầu phân mềm OligoAnalyzer DT) 3.2 Phương pháp tách chiết RNA HCV yanate, RNA virus Virus ly giải dung dịch guanidinium thioc cách giải hấp phụ hấp phụ silica Sau nhiều bước rửa, RNA thu nhận tách chiết bảo quần với H;ạO xử lý diethylpyrocarbonate RNA sau 20°C lúc sử dụng Chuẩn bị dung dịch - Dung dich L6: Guanidinium (100 ml), Triton X-100 (2,6 g), EDTA thiocyanate 0,2 M pH (22 ml) Lam tan bổn ổn nhiét 60°C - Dung dịch L2 : Guanidinium (120 g), Tris HC! 0,1 M pH 6,4 thiocyanate (120 8), Tris HC! 0,1 M pH 6,4 (100 mì) Làm tan bổn ổn nhiệt 60°C - Dung dich silica : Cho 60 g silica HạO cất hai lần (dd H;O) cho đủ 500 24 Hút bỏ 440 mÌ ml vào ống đong Trộn để nhiệt độ phòng hai lần cho đủ 500 ml để nhiệt độ phòng dịch Cho tiếp HO cất trộn Hấp khử trùng Hút bỏ 430 mi dịch thêm vào 600 HI HCI 10 N, Cách tiến hành 900 pl dung địch L6, 30 HÌ Cho vào eppendorf 1,5 mÌ 200 pl huyét thanh, víp 30 giây Loại bỏ dịch silica Vortex nhẹ Lắc ngang 15 phút.Ly tâm 13.000 silica Ly tâm 13.000 vip Cho ml dung dich L2 vao Vortex vita dui tan can 30 giây Loại dịch Lặp lại bước thêm lân 272 273 3.61 3.86 Cheng Lan Trân Thị Cẩm Tú Nữ 30 274 3.137 | Kheng Leng Nữ 54 2.66x10° Trung 275 3.241 Nữ 45 C) Trung 276 3.274 | Lê Nguyễn NHật Nam |2I 1.12x10* 277 Quang 3.517 | Định Kim Ngọc Nam | 24 5.72x10° Trung 278 3.542 _ | Nguyễn Thanh Của Trung 279 3.647 280 Nguyễn Thị Thanh Huyễn ©) Trung 57 187x106 Nữ 45 ©) 3.675 | Nguyễn Thị Lượng Nữ 45 2.06x10° 282 283 4378 | Mai Phú Sáu 4.433 | Nguyễn Thị Thanh Thảo Nam |49 31 8.46x10° €©) Lam Hồng 284 5.16 Nam | 44 (€} Kiểmt lại 286 3.119 | Neou Ton Nam | 37 4,50x10° Hoang 287 288 289 5.206 | Lê Văn Nụ 3.304 | Huỳnh Kim Thoại 3.312 | Tăng Văn Lơ 63 40 €) 1.13x10” Hoàng 291 292 6.294 | Lê Thúc Kháng 6.492 | Lê Thị Situ 281 285 290 293 | Nguyễn Thị Lan 3.683 | Nguyễn Thị Như Ý Quan Tấn Lực 5.100 | Nguyễn Văn Bảo Ne |32 Nam | 46 3,12x108 C) 6.202 _| Nguyễn Văn Mo Nam | 46 Nam | 51 Nữ 55 ©) 5.30x10” 2.11 Nam |43 () | 54 Đặng Văn Triết 294 [2.60 295 2.102 | Đặng Minh KHanh | Trương thi Bn nam 296 2.162 _† Huỳnh thị Bé Nữ 47 297 2.166 Nữ 34 ©) 298 299 300 301 302 303 304 2.199 2/231 2.240 2.346 6.119 6.339 6.438 Nữ Nữ, 41 28 36 40 © 1.93x10" C) 3.93x10° ©) 112x10) oO 307 2.65 | Nguyễn Ngọc Lễnh | | _| _| | | | Lim Eng Trần Thị Siêm Phạm Đông Xuân Phạm Thị Bút Phạm Thị Kim Anh Cao Trí Thao Nguyễn Thị Phỉ 305 | 6.526 _| Huynh Thi Ngưu 306 _ |2.17 | Nguyễn Văn Út 308 2.49 _|Ng6 Van Thanh | Trần Thị Gái Nự_ Nữ Nữ Nam Nữ |64 {69 51 6] 49 © Lâm K.Mién Lâm Trung(pm) 8.44x10° ae Lâm 9.4x10° 1.20x10! Nguon © Trung 1.40x10* 51 Q Nữ 63 9.22x10° Nữ 53 48 5.58x10” 2.14x10° Trung Trung | Phạm Kim Ngọc Nữ 53 ©) Trung 3.218 | Võ Thị Kim Xuyến Nữ 48 (-} Hoang ©) 3.231_| Nguyén Tan Dat 2.175 310 3.42 311 312 3.76 3.79 313 3.171 314 | Lê Thị Bích Nghĩa Chanh Maily Nguyễn Thị Năm Nguyễn Thái Bình 315 3.299 _| Nguyén Cong Thân 317 3.248 | Nguyễn Thị Thu 318 319 3.408 | Phạm Văn Phước 3.566 | Kham Sovana 316 51 Phương Nam Nữ |40 44 320 321 322 50 Nữ 3.648 | Đăng Lệ Hà 3.651 | Phạm đăng Hoàng Tân | Nam | 24 |45 Nam 3.678 | Hà Phước Thành 3.800_| Trdn Quang Trung 324 325 45 4.1 Chea Geth Cheo Kim Veng 326 4.7 328 329 330 323 327 €) Q.Minh Giai 51 4.12 | Đặng Văn Thủ 4.76 _ | Hỗ A Sáng Nam |43 4.216 | Diu Thanh Du Ca Nam | 12 6.24x10! 1.37x10" 5.28x L0” Tâm Lâm Trung, 2.03x10° €Œ) Hoang Trung Lê Thị Nguyệt 49 4.388 _! Nguyễn Thị Nhàng 4.441 | Chhoc Seng Nữ Nữ 41 59 338 5.43 — | Nguyễn Thị Chỉ 344 345 346 347 348 2.70x10° 3.92x105 5.44x10° Trung Trung(pm) Nữ Đăng Thị Phép, 335 336 343 â â) 46 |Đ5 N N 341 342 œ) Nữ Nam 35 53 j1 340 Phtic 20 4.222 _| Nguyễn Văn Ró 4.244 _ Lê Xuân Thu 4.305 _| Quách Thị Em 337 6.12x10° Trung (pm) Nam_| 331 332 333 334 _ Trung Nữ 309 |4.57 _ | Nguyễn Văn Trọng 5.14 Nam |34 | Lý Tú Anh 5.68 Tao Xin Sang 5.169 | Chên Ghết 5.194 | Nguyễn Anh Kiệt 5.238 | Nguyễn Ngọc Khanh 5.239 | 5.277 | 4.458 | 5.556 _| 6.73 | Đỗ Thanh Hà Triết Võ Minh Thành Bùi Thanh Danh Nguyễn Thị Hồng ANh ©) (-) 1.88x10° 3.96x10” Trung Trung_ Trung QO QO Lam €) Hoàng 5.36x10” 122x108 C) Nam | 60 (} Nam | 47 2.40x10! (-) 33 €) 48 © Q 7.7610 2.20x10” 5.92x10° 124 Nam Nam | 36 30 Hương Hương 6.128 6.161 349 350 Trần Qc Tín Nam Trịnh Phơi Nam 17 66 €) 1.78x10” Trung Phiệt 22.1 Kết real-time RT-PCR Diag-Center— 150 mẫn nghỉ nhiễm HCV STT | Code Full Name Age | Sex | 35422 | Pham thi kim chau 2_ | 35567 | Le thi ba Date E F 31.3.05 31.3.05 Result (copies/mL) 5.88410" 1.90x10° 3_ | 4; 35578 | Phung anh wan 35902 | Truong nhut minh 44 47 M M 31.3.05 04.4.05 2.06x107 Negative 5_ | 36115 | Huynh thi duyen |36192 | Ly ngoc bach 136254 | Phan my phuong 31 52 35 F M F 06.4.05 07.4.05 07.4.05 Negative Negative Negative | 36204 | Dang thi hue | 35840 | Phan van tien 10_| 36371 | Nguyen thi duyen 56 57 35 F M FB 07.4.05 02.4.05 02.4.05 Negative Negative 6.06x108 11 | 36536 | Thai phuọc tai 12_| 36857 | Bui thuy 13_ | 37118 | Ton hai 52 51 40 M F F 12.4.05 15.4.05 18.4.05 2.28x10° Negative 3.98x107” 14 | 37586 | Ung ngọc quang 47 M 224.05 Negative 15_ | 37836 | Cao ton 54 M 25.4.05 Negative 33 M 27.4.05 Negative 34 26 50 47 36 F F M F F 26.4.05 28.4.05 05.5.05 06.5.05 06.5.05 8.56x10* 3.30x10" Negative Negative Negative 22_| 39036 | Tran pham xuan phuong 23_ | 39055 | Nguyen thi anh huong 24 | 39249 | Nguyen pham 42 45 42 M F M 10.5.05 10.5,05 12.35.05 Negative 5.56x10° 1,49x10° 25 _| 26 _| 27_ | 28 | 29 | 51 69 54 42 48 M F M M M 12.5.05 12.5.05 16.5.05 18.5.05 19.5.05 1.10x10° Negative 1.81x10° Negative 1.01x10" 31 _| 40007 | Co van manh 53 M 21.5.05 Negative 32 44 M 24.5.05 Negative 59 F 25.5.05 Negative 16_| 38149 | Principe leopoldo 17_| 18 | 19 | 20_| 2I _| 37964 38218 38636 38720 38722 30 | | | | | 39210 | 39244 | 39487 | 39770 | 39874 | Nguyen bach lan phuong On kiet nhu Tran tan nam Dang kim minh Nguyen thi Ngọc van bui Duong muoi Trinh duc dat Nguyen huu toan Vuong chau | 39906 | Ngọ van hoa ¡40263 | Huynh van anh 33_ | 40331 | Dang ngoc le 45 M |20505 | 8.60x107 34 | 40519 | Vu thuy nga 35 | 40528 | Nguyen nhan 36 | 40547 | Bui thi nguyet thu Negative 2.76x10* 39 23 F M 26.5.05 27.5.05 41 E 275.05 F M 30.5.05 30.5.05 07.6.05 07.6.05 Negative Negative Negative Negative 07.6.05 Negative 5.86x L0” 53 48 42 45 M F 41 | 41614 | Pham nhan cuong 34 M 65 21 M M 08.6.05 13.6.05 Negative Negative 44 | 42182 | Thai thi lien 45 | 42183 | Nguyen thi vui 53 F 52 F 14.6.05 14.6.05 1.01x10° Negative 46 | 42184 | Huynh thi mai phuong 47 _| 42185 | Nguyen van le 48 | 42362 | Huynh quoc vinh 49 63 25 F M M 14.6.05 14.6.05 16.6.05 42404 | Dinh cong hoa 49_| 50 | 42331 | Huynh to muoi 51 | 42487 | Trinh xuan nguyen 23 49 49 M E M 16,6.05 16.6.05 17.6.05 52 | 42579 | Nguyen thi bich van 47 F 20.6.05 Negative 53_| 54_| 42672 | Tran thi hue 42714 | Ha dat cuong 65 41 F M 20.6.05 21.6.05 8.68x10° Negative 44 |F 21.6.05 Negative 56_| 43009 | Le minh bach 32 M 23.6.05 1.26x10° 37 38 39 40 | | | | 40837 | 40835 | 41539 | 41554 | Nguyen thi ngoc lan Nguyen van phap Trinh quoc luong Nguyen thí lan 42 | 41653 | Ly van minh 43 | 42024 | Nguyen manh hai 55 | 42768 | Tran thi thuong 57 | 43046 | Nguyen thi linh 58 | 43068 | Do loan §9 | 43135 | Duong quynh hoa 60 | 43197 | Nguyen manh binh 61 62 63 64 65 66 67_| | _| | | | | 43412 | 43636 | 43646 | 43596 | 43842 | 43935 | 44256 | Nguyen van Ho xuan Ngo thi hong lac Vo thi loan Thang dc Ho thi Sophia 5.68x10° Negative Negative Negative 2.34x10° 2.78x10? 63 F 24.6.05 Negative 43 F 24.6.05 7.98x10° 75 32 F M 24.6.05 25.6.05 Negative Negative 42 46 58 M M F 29.6.05 017.05 01.705 Negative 2.88x10" Negative 47 48 34 33 F M F F 30.6.05 04.7.05 04.7.05 07.705 3.54x10” 1.61x10° Negative 5.38x10° 68 | 44287 | Tran van 69 _| 43914 | Ly kim thinh 49 63 |F M 08.705 94.7.05 Negative Negative 71 | 44081 | Dang thi mai 60_ |F 06.7.05 Negative F 09.7.05 3.38x10" 70_ | 44320 | Nguyen bay 72_| 44421 | Tran thi kim lien 73 | 44432 | Thai phuoc tai 45 48 32 |F |M 08.507 | 097.05 3.57x10” Negative F 35 M 47 01m | F 15.7.05 18.7.05 19.7.05 Negative Negative Negative Dang kim minh Nguyen thi tao Nguyen thi bich Tran tan quy Tran thi thu Pham thi la Nguyen van chau Truong binh hien 46 33 35 43 30 67 56 49 F E |F |M |F ỊF M |M 21.7.05 22.705 26.7.05 28.7.05 28.7.05 01.8.05 2.8.05 02.8.05 Negative 5.24x10° 1.29x10” 1.09x10° 1.14x10* 3.92x10” Negative Negative 85 | 46547 | Tran manh cuong 25 M 2.8.05 1.12x10” 86 | 46566 | Xin kiem than 87 |47005 | Dinh thi man 88 | 47017 | Huynh dai chi 43 48 38 M |F M 02.8.05 08.8.05 8.8.05 Negative Negative Negative 89 | 47279 | Nguyen trung 90 | 47674 | Ngo van hoa 42 45 M M Al 62_ 32 61 63 36 M ||M |M |M |FE 09.8.05 15.8.05 19.8.05 19.8.05 20.8.05 23.8.05 23.8.05 23.8.05 Negative Negative Negative Negative Negative 3.56x10" Negative 2.02x104 97 | 48572 | Long phat 44 M 24.8.05 Negative 26 60 |F |M 24.8.05 25.8.05 3.42x10° 7.26x10° 100 | 48881 | Vu thuy nga 101 | 48974 | Nguyen van cung 40 AT F M 26.8.05 29.8.05 Negative Negative 34 |E 29.8.05 7.62x10° 103 | 49473 | Co van manh 53 M 05.9.05 Negative 31 F 08.9.05 9.72x10° 42 M 08.9.05 Negative 75 46 36 M |M |F 09.9.05 12.9.05 14.9.05 Negative 6.64x10° 6.61x10” 45 M 14.9.05 Negative 65 49_ 51 |M IE 15.9.05 23.9.05 M_ | 013.05 44944 | Tran bach tuyet 74_| 75_ | 45132 | Ung ngoc quang 45254 | Ung thi phuong 76_| 77_| 78 79 80 81 82 83_ 84 91 92 93 94 95 96 _| _| | | | | | | | | | _| _| 45442 | 45562 | 45851 | 46091 | 46113 | 46458 | 46466 | 46465 | 48024 | 48217 | 48303 | 48452 | 48472 | 48449 | Ha đai cuong Hashimoto akihiko Nguyen manh binh Bang tinh Mai chi Huu thi thu hanh 98 | 48644 | Vole mai thao 99 | 48721 | Duong kim tuong 102 | 49074 | Nguyen thi 104 | 49861 | Bui thuy 105 | 49874 | Tran tuan nam 106 | 49972 | Bui thien ngo 107 | 50166 | Nguyen duc phong, 108 | 50355 | Hong keng 109 ! 50422 | Lam on 110 | 50462 | Ly van minh 111 | 51149 | Huynh to muoi 112 | 33296 | Phan chinh 113 [33321 | Dao xuan bịnh 43 | M [013.05 | Negative Negative 1.56x10° 3.88x10 01.3.05 F 8.24x10° 114 | 33322 | Nguyen thi xuan 38 M_ | 033.05 1.65x10° 116 | 33648 | Nguyen quoc thong |33713 | La hong 117 118 | 33707 | Nguyen van dang 119 | 34273 | Luu to keo 45 42 39 68 M M M EF 05.3.05 07.3.05 05.3.05 14.3.05 3.16x10! Negative Negative Negative 36 Ẹ 15.3.05 1.02x10° : M 15.3.05 1.10x10 24 32 40 32 53 38 M M FE M M_| M_| 16.3.05 16.3.05 17.3.05 17.3.05 21.3.05 21.3.05 8.2310? 5.02x10* 9.02x10° 6.22x10* 2.71x10° 3.47x10° 33 M 21.3.05 5,75x 0ˆ 34 M_ : 132 | 35096 | Tran thi thuan 115 | 33641 | Pham tan 120 | 34332 | Danh thí sau 121 | 34362 | Ngo van thuan 122 | 34397 | Nuyen vinh 123 124 125 126 127 128 | | | | | | 34487 | 34499 | 34582 | 34586 | 34829 | 34836 | Nguyen van nghi Do duc chung Huynh lan Bui van tuan Dao xuan tuan Vu van son 129 | 34845 | Truong tuan hoang 39 | 15.3.05 | M_|{ 6.59x10' 223.05 7.20x10° F 22.305 Negative 34 F 23.3.05 Negative 38 M 25.3.05 8.70x10° 134 | 35263 | Luc danh hieu 135 | 35778 | Phung anh tuan 136 | 35757 | Nguyen thí hiep 15 44 38 M M | F 125305 01.405 01.4.05 1.38x10° 2.06x10” 3.26x10° Ly ngoc bach Phan my phuong Dang thi hue Phan van tien 52 35 56 M F F 07.4.05 074.05 07.405 Negative Negative Negauve 57 M 02.4.05 Negative 130 | 34994 | Bui duc thai 131 | 35000 | Ha thí thang 133 | 35226 | Nguyen van 137 138 139 140 | | | | 36192 36254 36204 35840 | | | | 141 142 143 144 | | | | 35866 36352 36355 36591 | | | | 145_| 146 147 148_| 149 150 Dang tu dung Toan huu kien Phung khanh van Vụ viet 36794 | Cao van cuoc | 36940 | | 37504 | 37710 | | 37875 | | 38150 | Le anh thuy Nguyen ngọc lan Bui ngoc oanh Lac van kiet Tran thi hien | 09 43 30 52 02.4.05 F M_ | 08.405 08.4.05 M_| 12.4.05 M 1.12x107 3.81x10° 2.30x10° 2.60x10° 36 M 14.4.05 1.26x10° 26 46 44 19 16 F F F M_| F 16.4.05 214.05 23.4.05 25.4.05 275.04 7.75x10” 6.75x10° 4.76x10” 9.10x10° 5.85x10° ) (+) (+) œ) (+) œ ) @ @ ©) ©) ©) € l/cƒ cức eZ z9 08 |0/1 ;01xz£Ø1 c0Ix€l'8 £6€ | LET ;01+68'£ ÿnb 2-24 (/saydo2) c01+6'6 g01+€€'6 €8 901 98 LOH Buy | 21H-nuy | 3V20H | 3VSHH | LO2 | 1SVY | 11V Bugs ug] enb 39y oul AW dy Supnyg HLN 96€ đun UộI1-9g íÉ2 Suen uely-qu uy suey U@tJ,— 911, ẤN Surin UghL-ed 12D DION € b NUN TNL OL] VIEN {UẸNJ Uđ | £ ¢ quy UA @1| ° [ tưộtqL 3onỊ 8upuL | uy 26ó8N qnH | ugyu qugq ug? gs OH | LIS 1T2d=LN 9009-1621 #A 3ugs tui 6ny quys os gnb 195J 'cÊ đ) Â) (+) â); Â) @) |e 99 |eoz |0I1Z zst_ Đt | 9ore | 99 | ss | Ore zs | Eze Let 99 ;01z8'2 ;01xztLẽ OT x67'T z01xS£L ,01x€ữ'L nẹr1 2q ugTy -FID wry 94[, 12g-Á€O OW wy uy add | Tf en †qL u8qd | ẽI 8un2 i41 É1 | FL (+) @) C) | sat ne E2 &)+ ©) ©) WOH 41 een} quị ẩuom[, €/86 — (2V ôq2 u$ÁnH ary, eg BueIp ULL qued 271 OST nud UBL O USL WOH 41 Bury ugh -OUL SIN SđutI +) +H) ;0Ix€€'€ ;01+€9'€ g01+t1'€ SUNH WBA VT; qu nạtL| trệngL i1 @1| 01 L wiry fyL ugsndN 0w ML SN] SugH 908N OG | El G) | €6 oF 901 OS'S |6er VOT t6 6L |bpiz |8 C) â @ Â) ) G) œ) (+) 10L œ®) @) @) (+) -JUtg QUIA BX LEL ;01+£9't /01+I" dry vel |/£ s0Izếl'€ Uy-IOW PUD, ) 9q ẩ8utnÒ 8N | ZZ 1pqq y n1 | Tế O8W URA 0A | vouy 003N INL 3N | 61 Sung A g1| ŸN | §1 \u8tL 9ƯổN JL qUệnH | 91T quy WOH dl Id dL 10 284 9D 161 ST ing quény | ST LT OL bbz 41L sue qupyy-quey we} 90H ny 8uonp 07/ZZ WOH 4L aL 'Ò02 sug qun o9q 9s 611 | cer g01+¿8'ẽ ua ~ 191 012 J9 |EIL LE s01+96 T WOH 41 ©) |?9L 6E SL Ol elZ (+) CG) | ve 69T z9 11z ©) (+) | 6% |0 ©) (+) ©) ) |0 €) @) ) ©) LEl ,0Ix€'b @œ) (+) SóI 007 WOH (+) œ®) (+) © ©) ©) | 12% 9L Li QOL KEP s01+€'€ s01+£'£ zIE z8 Ol aS T IST +s 88 g01xb€ | se 86 ©) 88 ,01zP£1 ©) [oe 161 Cy © 0ET © ) [912 (+) œ) © 0€1 s01x@1 ;01+£9 +8 011 (+) © ul (+) (+) WOH dy nud ue Y 8uorT YULA Td WEL uga a7 dy [1 dey 8uọq - quy'J 082 91L 1g 8ueI - UộI]-Áÿ1 182 - Buel well A@T HD PUL UBD WOH di dea 9Ð 'Ò d99ẨnH uetq đt/té OD YL VL ug1J| uÿuN 2ÿ 9H} OF e1 u#A ẨN | 86 ugdnyy iqL 3N | LZ - uỌA Ì41L9A | 91 quyu[ 8uorL | cế Buend uvA ugÁnÖN | tz #1 ugnXx trẹq | €z BẢN NHẬN XÉT Hf mu BW ENA Che Reebp iyo “ Ay uøm 77401/4// BF Sab 2⁄21 ẤM npn) lig FER ¿20g Chit hikoig thy qui? cae 08 Mie Led shay HE Xa/ AM £ A0 Harm we av chy) sae 12//- wheaisy Êlájo - apun fac Mie Keng quu Ay shader gap tiny tie sag wa tte aby” tring quia’ ĐI Dee — Phi dip wi cae be coms CD Seng | Cứ VP oS Ferg Fate “ã ve fe cle” ep Fini SP reap hig OEELe ð eA, f a 0Ð / fs Le Leah — pe ae ~ Poy Eas =a, == = Lo /Z ; CỘNG HOÀ Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc ~====-==~==ei #~~-v~=-==ee PHIẾU THĂM DÒ Ý KIẾN Đơn vị sử dụng : BỆNH VIÊN ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HCM Tên mat hang : BO Kit dinh lugng real-time HCV Nội dung nhận xét : Số lượng hàng sử dụng: 25Z Đánh giá số đặc tính: Tính ổn định sản phẩm: B Tốt Đ { Kém Ư trung bình Tính tiện dụng sản phẩm: & Tốt O kha Kém C trung binh Giá cả: & G Hop ly Khéng hgp ly 4, Đánh giá chung kit: Tp HCM ngayAthing năm 25 Người nhận xét — aa CỘNG HOÀ Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc " focenenecene PHIEU THAM DO Y KIEN Don vj sit dung : TRUNG TAM XET NGHIEM QUOC TE DIAG CENTER Tên mặt hàng : Bộ Kit định lượng real-time HCV Nội dung nhận xét : Số lượng hàng sử dụng: 4Ø© tet HCV - RNA, Đánh giá số đặc tinh: Tính ổn định sản phẩm: df Tet D D trung bình Kém Tính tiện dụng sản phẩm: #Ý Tết D Kém U trung bình Giá cả: Không hợp lý V Hop ly Đánh giá chung kit: Tp HCM ngày2Öháng nam 260s" Người nhận xét BS.Nur Thị Tah Thay