BỘ Y TẾ
Viện Sốt rét Ký sinh trùng ~ Côn trùng Trung ương
BẢO CÁO KẾT QUÁ NGHIÊN CÚU ĐỂ TÀI CẤP CƠ SỞ
ÁP DỤNG PHƯƠNG PHAP CHAN ĐOÁN NHANH PHÁT HIỆN THIẾU GLUCOSE 6 PHOSPHATE
DEHYDROGENASE HONG CẤU
Chủ nhiệm đề tài: TS Ta Thi Tĩnh
Cơ quan chủ trì
Trang 2BỘ Y TẾ
Viện Sốt rét — Ký sinh trùng ~ Côn trùng Trưng ương
BAO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỂ TÀI CẤP CƠ SỞ
Ten dé ti
ÁP DỤNG PHƯƠNG PHAP CHAN DOAN NHANH
PHAT HIEN THIEU GLUCOSE 6 PHOSPHATE DEHYDROGENASE HONG CAU
Chủ nhiệm để tài : TS Tạ Thị Tĩnh
Cơ quan chủ trì để tài
Viện Sốt rét — Ký sinh trùng — Côn trùng Trung ương
Cấp quản lý: Viện Sốt rét — Ký sinh trùng — Côn trùng Trung ương Thời gian thực hiện: từ tháng 7 năm 2003 đến tháng 12 năm 2004
Tổng kinh phí thực hiện để tài 38.346.000 đồng
“Trong đó: kinh phí SNKH 38.346.000 đồng Nguồn khác (nếu có) — không
Trang 3BẢO CÁO KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ
: Áp dụng phương pháp chẩn đoán nhanh
phát hiện thiếu Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase Héng cau
1, Chủ nhiệm để tài: TS Tạ Thị Tĩnh
2 Cơ quan chit tri dé thi: Viện Sốt rết ~ Kỹ sinh trùng ~ Côn trùng Trung ương 3 Cơ quan quản lý để tài: Viện Sốt rét ~ Kỹ sinh trùng -: Côn trùng Trung ương
Trang 4G6PD: GOP: HC mU/l0°HC NADP: MIT PMS P Falciparum P vivax WHO:
NHUNG CHU VIET TAT
Glucose-6- Phosphate Dehydrogenase
Glucose-6-Phosphate Hồng cầu
Số đơn vi G6PD trên 1 m] máu hay trên 10? hồng cầu Nicotinamid Adenin Dinucleotid Phosphat
Trang 5MỤC LỤC Nội dung Trang 1 Dat vin dé 1 ? Tổng quan
2.1 Mot sé hiéu biét vé Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase
2.2 Tình hình thiếu G6PD trên thế giới và ở Việt Nam
2.3 Phương pháp [ormazan và phương pháp nhanh trong phát hiện thiếu G6PD
3 Phương pháp nghiên cứu 8
Thời gian, đối tượng và địa điểm nghiên cứu 8
“Thiết kế nghiên cứu 8 3.3 Cỡ mẫu 8 3.4 Phương pháp chọn mẫu 9 3.5, Các kỹ thuật sử dụng 9 3.6, Các chỉ số nghiên cứu 12 3.7 Phân tích số liệu 13
4 Kết quả nghiên cứu
4.1 Độ nhậy và độ đặc hiệu của phương pháp nhanh và phương 14 phấp formazan so với phương pháp định lượng
4.2 Xác định thời gian còn hoạt tính của hóa chất thử 16
Trang 6PHAN A - TOM TAT CAC KET QUA NOI BAT CUA DE TAI (chủ nhiệm để tài tự đánh giá)
1 Kết quả nổi bật của đề tài
(a) Đóng góp mới của đề tài;
Để tài đã áp dụng 2 phương phấp mới là phương pháp formazan và phương
pháp phương pháp nhanh (phương pháp nhanh) trong phát biện thiếu G6PD tại Việt Nam Trong đó đặc biệt là phương pháp nhanh có độ nhạy và độ đạc hiệu cao, kỹ thuật thực hiện đơn giản, không cần các trang thiết
bị đất tiền, do vậy có thể áp dụng được ở các tuyến cơ sở khi được cung
cấp hóa chất và dụng cụ
(b) Kết quá cụ thể (các sản phẩm cụ thể):
Kết quả nghiên cứu cho thấy :
-_ Phương pháp nhanh có độ nhạy 77% và độ đặc hiệu 98,8% khi phát hiện chung cho cả 2 giới, độ nhạy đạt 93,32: và độ đặc hiện 100% khi
phát hiện ở nam giới
-_ Phương pháp fonmazan có độ nhạy 68,0% và độ đặc hiệu là 98,1% khi phát hiện chung cho cả 2 giới, độ nhạy đạt 88,7% và độ đặc hiệu
100% khi phát hiện ở nam giới
(c) Hiệu quả về đão rạo: Đã giúp 1 thạc sỹ hoàn thành luận văn thạc sỹ và đã
bảo vệ xuất sắc tại trường đại học y Hà Nội với tên đẻ
: “Xác định tý lệ thiếu G6PD và tìm hiểu mối liên quan với bệnh sốt rết ở dân tộc Rag-lai và
Vân Kiểu tỉnh Khánh Hòa và Quảng Trị”
(d)Hiệu quả về kinh tế : Nếu phương pháp được áp dụng, có thể sản xuất
ngay trong nước, giá thành rẻ và chủ động
(e) Hiệu quả về xã hội : phòng tránh được đái huyết cầu tố cho các trường
hợp thiếu GóPD
(D Các hiệu quả khác : đã có 3 bài báo đăng trên
tạp chí :
1 Tạ Thị Tĩnh, Lê Minh Đạo, Nguyễn Minh Hùng, Đoàn Hạnh Nhân
Phương pháp nhanh phát hiện thiếu men glucose 6 photphate
dehydrogenase hồng cầu
Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 3
Trang 72 Tạ Thị Tĩnh, Lê Minh Đạo, Trần Thị Uyên, Nguyễn Minh Hùng,
Đoàn Hạnh Nhân
Tình hình thiếu men GóPD ở một số dân tộc Việt Nam
Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 6
năm 2004, trang 31-37
Tạ Thị Tĩnh, Lê Minh Đạo, Nguyễn Minh Hùng, Đoàn Hạnh Nhân
Độ nhạy, độ đặc hiệu của một số phương pháp định tính phát hiện
thiếu men glucose 6 phosphate dehydrogennasc hồng cầu
Tap chf y học thực hành, số 509, năm 2005, trang 33- 37
Áp dụng vào thực tiên sản xuất và đời sống xã hội : có khả năng ấp dụng vào
các cơ sở xét nghiệm
Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với để cương nghiên cứu đã được phê
duyệt,
a Tiến độ: Đứng tiến độ để ra
b Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu để ra: thực hiện dù
c Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương: tạo ra đẩy đủ,
tuy nhiên chất lượng có sản phẩm chưa đạt đ Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu để ra:
Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
“Tổng kinh phí thực hiện để tài: 38, 346 triệu đồng
Trong đó Kinh phí sự nghiệp khoahọc: — 38, 346 triệu đồng
Kinh phí từ nguồn khác: hóa chất (Viện trợ)
Toàn bộ kinh phí đã được thanh quyết toán : 38, 346 triệu đồng
Chưa thanh quyết tốn xong: khơng
Kinh phí tổn đọng : không triệu đồng,
Các ý kiến đề xuất,
Áp dụng phương pháp nhanh trong điều tra sàng lọc thiếu GóPD và chỉ
định xét nghiệm phát hiện có thiếu G6PD hay không trước khi điều trị
primaguin cho các bệnh nhân nhiễm P.vivax
~_ Tiếp tục cho nghiên cứu để kéo dài thời gian hóa chất có tác dụng với
phương pháp nhanh
Trang 8Cho nên việc lựa chọn phương pháp phát hiện thiếu GỐPD đơn giản, dễ áp dụng, giá thành rẻ để đưa vào áp dụng tại Việt Nanh là rất cần thiết, Chính vì vậy, chúng tôi
xây đựng đẻ tài với các mục tiêu sau:
MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
1 Đánh giá độ nhậy, độ đặc hiệp
của 2 phương phấp (phương pháp nhạnh và phương
pháp formazan) với phương pháp định lượng
2 Đánh giá hoạt tính còn tác dụng của hoá chất theo thời gian bản quản 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng, 12 tháng
3, Áp dụng kỹ thuật chẩn đoán nhanh phát hiện thiếu men GóPD trước khi điều trị một số thuốc có khả nâng gây đái huyết cẩu tố (primaquin) ở các vùng có tỷ lệ
Trang 92 TONG QUAN TAI LIEU
2.1 MOT SO HIEU BIET VE GLUCOSE 6 PHOSPHAT DEHYDROGENASE:
2.1.1 Vai trò của Glucose 6 Phosphat Dehydrogenase:
G6PD xúc tác phản ứng thứ nhất của chư trình Pentose Phosphai (hay còn gọi
con đường Hexose Monophosphat) Giai đoạn I của chu trình; oxy hod Glucose 6
phosphat (G6P) thinh 6 phospho gluconolactone dudi tác dụng của G6PD có
coenzym là Nicotinamid Adenin Dinucleotid Phosphat (NADP) [1,12] Chu tinh
Pentose Phosphat tao ra các phan tr NADPH;: chat cung cấp Hydro chủ yếu cho các
phân ứng khử của các quá trình tổng hợp như : tổng hợp axit béo, cholesterol, các
hormon steroid Đây là 1 chu trình kín trong đó cứ 3 phân tir G6P di vao sẽ tạo ra 3
phân tử C0;, 3 phân tử pentose phosphat và 6 NADPH; Trong đó NADPH, có vai
trò đặc biệt quan trạng trong tế bào hồng cầu chống lại các tác nhân gây oxy hóa, bảo vệ sự toần vẹn của hồng cầu
Trong lâm sàng người ta đã thông báo rằng có nhiều loại thuốc và hóa chất gây
ra hiện tượng tiêu huyết (đấi huyết cầu tố) ở người thiếu GốPD như : primaquin, sulfacetamide, nitrofurad, dapson sulfapyridine, toluidine blue, phenylhydrazine Một số thuốc (rong đó có: nhiều loại thuốc sốt rét ) có thể sử dựng an toàn khí dùng
s
ới liều điểu trị cho các trường hợp thiếu men G6PD như: chloroquin, proguanil, quinin, pyrimethamin, trimethoprim, sulfadiazine, sulfaguanidine
Dựa vào hoạt độ G6PD trong hồng cầu và những biểu hiện lâm sàng của chúng,
Trang 10Mặc di các biến thể ở lớp 2 và lớp 3 không gây huyết tấn mạn tính, nhưng,
huyết tán cấp tính có thể xảy ra khi xuất hiện cấc tác nhân gây oxy hóa như thuốc,
hóa chất hoặc nhiễm trùng
2.12 Cấu trúc và đột biến gen G6PĐ'
Gen qui
ịnh cấu trúc G6PD nam trên nhiễm sắc thể X, không có alen trên Y Như vậy bệnh thiếu hụt G6PD là một bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể X do mẹ
truyền cho con trai
Ở nam đo chỉ có 1 nhiễm sắc thể X (do mẹ truyền), nên khi bị đột biến thường
là thiếu hoàn toàn, hoạt độ G6PD còn rất thấp, nên biểu hiện bệnh ở nath cũng nặng
hơn nữ, có nguy cơ cao đái huyết cầu tố khi sử dụng một số thuốc gây ơ xy hố Thiếu G6PD ở nữ có 2 dạng: thiếu G6PD đồng hợp tử (homozygote) và thiếu GóPD dị hợp
ut (heterozygote)
G6PD được phân lập và giải trình tự bởi Persico và cộng sự, sau đó được bổ
sung bởi Takizawa và Yoshida Gen có 13 exon dài 20Kb, cxon đầu tiên không được
mã hoá Hảu hết các trường hợp thiếu G6PD là đo 1 amino axit bị thay đổi do đột
biến điểm trên AND và đến nay có trên 100 bất thường về phân tử của kiểu gen đã
được xác định [15,16]
2.1.3 Biểu hiện lâm sàng của thiếu men GóPD :
* Thiếu máu tan huyết (đái huyết cầu tổ):
Một số nguyên nhân gây tan máu lam sing:
Những người bị thiếu hụt G6PD thường không biểu hiện triệu chứng lâm sàng
Nhưng khi tiếp xúc với những tác nhân oxy hoá, lúc đó mới có các biểu hiện lâm
sàng, mà triệu chứng chủ yếu là cơn tan máu cấp Những tác nhân oxy hoá thường,
gặp như sau: Thuốc (trong các loại thuốc đã nêu ở trên thì primaguin là thuốc được
nhắc đến nhiều nhất, do primaquin là một trong những thuốc làm giảm tuổi thọ hồng cầu ở những người thiếu G6PD Sau khi cho bệnh nhân sử dụng thuốc này 1-2 ngày ham lượng Hemoglobin đã giảm xuống Những trường hợp tan máu ác tính nước tiểu trở nén den thim (black urine), bệnh nhân có những triệu chứng lâm sàng nặng như
Trang 11sốt cao, vàng mắt, vàng da .); Nhiễm trùng: Rất nhiều các bệnh nhiễm trùng có thể
gây nên tán huyết ở những người thiếu G6PD
* Vàng da kéo dài ở trể sơ sinh: Vàng da nhẹ là một hiện tượng hay gặp ở trẻ sơ sinh do vỡ hồng cầu trong những ngày đâu sau sinh Những trường hợp vàng da kéo dài có
thể đo nhiều nguyên nhân và một trong những nguyên nhân đó là do thiếu hụt GóPD,
“Thiếu GóPD có thể gây ảnh hưởng đến tính mạng và sức khỏe của trẻ sơ sinh Trên thể giới đã có những nghiên cứu về vàng da sơ sinh với thiếu G6PD © Dai loan vi Quảng đông khoảng 20-40% vàng da sơ sinh có liên quan đến thiếu G6PD
2.2 TÌNH HÌNH THIẾU G6PD TRÊN THẾ GIỚI YÀ Ở VIỆT NAM :
3.2.1 Trên thế g
Theo y văn trên thế giới có khoảng trên 200 triệu người thiếu GóPD, bệnh gặp
ít cả các dân tộc Tỷ lệ thiếu hụt GóPD khác nhau tùy thuộc vào dân tộc và vùng, lý, nhưng cao nhất là nhóm dân tộc Kurdish jews (Địa Trung Hải) lén tới 70%, người My da den tỷ lệ từ 1 đến I1% Vùng nam châu Á cũng là nơi có tỷ lệ cao, ít gặp hơn ở Bắc Âu [ L1] “Theo Jalloh, Kuni Iwai [12,15] tỷ lệ thiếu G6PD ở Lào là 7,2%; Thái Lan 11,5%: Indonesia 3,7%; Myanma 5,4%
Theo điều tra của Bouma tai Pakistan nim 1995, tỷ lệ thiến G6PD cũng rất khác nhau ở các dân tộc khác nhau, tỷ lệ thiếu G6PD ở nhóm dân tộc Pathan là
15.8%, Uzbak là 9,1%, Tajik 2,9% và Tukoman là 2,1% [I0]
Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy, tân suất thiếu enzym cao nhất gập Ở
những vùng dân tộc sống trong vùng sốt rét lưu hành
Theo báo cáo của Ganezakowski-M, tỷ lệ thiếu hụt G6PD chung ở Vanuatu (Đông Nam Tây Thái bình dương) là 6,8 %, mức độ khác nhau ở các điểm từ 0-39%, có sự tương quan thuận với mức độ sốt rết tại đây[14]
Một nghiên cứu của Devi tại Ấn độ cũng cho thấy, vùng sốt rét lưu hành nặng
tỷ lệ thiếu G6PD là 14,13% trong khi đó tại vùng sốt rét lưu hành nhẹ, tỷ lệ thiếu
enzym chỉ chiếm 5,5%
Trang 12Nam 1969, Đạng Hanh Phức dùng thử nghiệm sàng lọc đơn giản của Brewer ÿ lệ thiếu hụt GóPD ở Hà Nội là 5,3%, Hải Phòng 7,5 %
Năm 1978, Hoàng Văn Sơn, Viện Nhi Trung ương có một nghiên cứu cho thấy
cho kết qua:
tỷ lệ thiếu enzym từ 2-6 % ở những vùng không có sốt rét, một số vùng sốt rết lưu hành nặng tỷ lệ thiếu hụt lên tới 20-24% [6]
Một nghiên cứu của Đoàn Hạnh Nhân, Tạ Thị Tĩnh tiến hành theo phương pháp
chọn mẫu ngẫu nhiên trên 1676 nam học sinh phổ thông cơ sở, tuổi từ 6-15 tại 8
huyện thuộc 4 tỉnh (Hoà Bình, Hà Giang, Sơn La, Thanh Hoá) từ tháng 9/1996 -
1/1997 Kết quả cho thấy, thiếu G6PD hồng cầu có tỷ lệ cao tại một số vùng sốt rét
lưu hành nhẹ như Kim Bôi (34,1%), Mai Châu (20,4%), Như Xuân (19,7%), Mường
La (17,8%) và thấp tại một số vùng sốt rét không lưu hành như Mèo Vạc (0,3%) và Nga Sơn (0,5%) Tỷ lệ thiếu enzym ở các nhóm dân tộc khác nhau cho kết quả khác
nhau, cao nhất là nhóm đân tộc Mường (31%), dân tộc Thổ (22,6%) và dân tộc Thái
(19,3%); rất thấp ở nhóm dân tộc Kinh (0,5%) và dân tộc Mông (0,35) 13,5]
Một nghiên cứu khác cđa Đồn Hạnh Nhân, Tạ Thị Tinh và C§ năm 1999, tiến
hành tại Gia lai, Bình Phước nơi sốt rét lưu hành nặng cho biết tỷ lệ thiếu GóPD của
đân tộc Gia rai, Ba na, Xtiêng tương ứng là 2,3% ; 1,7% ; 3,4% và không có mối liên quan giữa thiếu G6PD với bệnh sốt rét [4]
Theo Nguyễn Thọ Viễn khi nghiên cứu trên bệnh nhân có KST sốt rết tỷ lệ thiếu
G6PD tối 60,71%, thiếu hoàn toàn tới 25%, trong lúc người không có KST sốt rét thiếu
GÓPD là 37,049 và hoàn toàn là 6,79% Qua đố tác giả đã nhận định sơ bộ hiện tượng thiếu G6PD có liên quan đến tình hình sốt rết [7]
2.3 PHƯỚNG PHÁP FORMAZAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NHANH TRONG PHÁT HIỆN
THIẾU G6PD:
2.3.1 Phương pháp formazan : do Hisaichi Fujii và cộng sự (người Nhật) để xuất
năm 1984 [13]: Đây là phương pháp định tính, dựa trên nguyên lý chuyển mầu của MTT từ một chất có màu vàng nhạt sang màu xanh sẵm với sự có mặt của G6PD Khi đó hoạt tính GỐPD trong các mâu máu khô được thu thập trên giấy thấm
Whatman3 sẽ được xác định bằng sự chuyển màu của MTT chứa trong gen thạch khi
Trang 13có ưu điểm là có thể tiến hành trên các mẫu máu khô (máu được lấy vào giấy thấm ), sau đó các mảnh giấy thấm chứa máu được đặt lên gen thạch chứa hóa chất, Đường
kính của vồng mầu xanh nói lên hoạt độ G6PD có trong mẫu máu Các trường hợp
thiếu G6PD không có vòng màu xanh sẵm (formazan) được tạo thành Tác giả dã so
sánh với phương pháp định lượng: kết quả cho thấy có mối tương quan thuận khá
chật giữa hoạt độ GÓPD và đường kính của vòng formazan được tạo thành Assumpeie' Pujades cũng đã so sánh 3 phương pháp : phương pháp formazan, phương pháp phát quang và phương pháp định lượng, kết quả cho thấy: 50 trường hợp chứng
(không thiếu G6PD) và 9 trường hợp thiếu G6PD ở nam, kết quả 3 phương phán là
như nhau Nhưng trong số 12 trường hợp thiếu G6PD ở nữ (thiếu GỐPD dị hợp tử) thì
phương pháp formazan xác định được 7/12 trường hợp, còn phương pháp phát quang
thì thất bại cá ở 12 trường hợp [9]
2.3.2 Phương pháp nhanh của Akira Hirono [8]
Đây là phương pháp định tính do Akira Hirono và cộng sự dua ra nam 1988,
đựa trên nguyên lý như phương pháp tạo vòng formazan Phương pháp này có ưu điểm
là trả lời kết quả nhanh chỉ sau 30 phút, lại không cần các dụng cụ, thiết bị đất tiền,
do vậy có thể tiến hành ngay tại thực địa Phương pháp này đã được áp dụng ở
Indonesia, Myanmar để phát hiện các trường hợp thiếu GóPD, đồng thời kết hợp với
phương pháp chẩn đoán nhanh sốt rết bằng kỹ thuật AO (aoridine orange staining) để chỉ định điều trị pimaquine cho các trường hợp bị sốt rét ngay tại thực địa khi đã
Trang 143 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3,1 Thời gian, đối tượng và địa điểm nghiên cứu :
Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2003-2004 trên các đối tượng và các địa
điểm sau:
- Tai labo Miễn Dịch, Khoa nghiên cứu điều trị sốt rết, Viện Sốt rét ~ Ký sinh
trùng ~ Côn trừng Trung ương cho nghiên cứu xác định thời gian của hóa chất còn tác dụng
~_ Trên nhóm dân tộc Mường tại Xã Sào Báy, huyện Kim Bi là huyện miễn
núi của tỉnh Hòa Bình, cách Hà Nội 120 km về phía Tây, Theo điều tra năm
1997 của Tạ Thị Tĩnh, tỷ lệ thiếu men GóPD ở đây rất cao (31% - phương
pháp phát quang, kit của hãng Sigma)
~_ Trên nhóm dan tộc Vân Kiểu tại Xã Thanh, huyện Hướng Hóa, tinh Quang Trị là vùng sốt rét lưu hành nặng
~_ Trên nhóm học sinh dân tộc Tày và Nùng tại trường trung cấp y tỉnh Cao
Bằng và nhóm học sinh dan toc Thái tại trường trung cấp y Sơn La
3.2 Thiết kế nghiên cứu ;
Đây là loại nghiên cứu đánh giá một nghiệm pháp chẩn đoán
33 Cỡ :
Để đánh giá phương pháp nhanh và phương pháp formazan (phương pháp định
tính), phương pháp định lượng đã được đùng làm thước đo (đánh giá độ nhạy,
độ đặc hiệu của 2 phương pháp định tính so với phương pháp định lượng):
Ap dụng công thức tính cỡ mẫu cho 2 tỷ lệ (trong cuốn phương pháp nghiên
cứu khoa học — Bộ môn dịch tễ, Đại học Y Hà Nội, 2002) Lp x Œ-p)+ p; x -pz}] n=Z me — (Pr Py Trong đó:
„ pị: Độ nhạy của phương pháp định lượng phát hiện thiếu G6PD = J00%=
+ py: ước tính độ nhạy của phương phấp định tính phất hiện thiếu G6PD =
95%= 0,95
%: Mức ý nghĩa thống kê được xác định = 0.05 ứng độ tin cậy là 95%
B: Mức ý nghĩa thống kê B thường được xác định 0,1
Trang 15Như vậy số mẫu cần phải tiến hành cả 2 phương pháp (phương pháp định lượng và phương pháp nhanh) là có 50 thiếu G6PD
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã định lượng :
- Với phương pháp nhanh : 167 mẫu gồm 60 mẫu thiếu, 8 mẫu bán thiếu và
99 mẫu không thiếu
- Với phương pháp formazan: 214 mẫu gồm 59 mẫu thiếu, l6 mẫu bán thiếu và 139 mẫu không thiếu,
Để thu được số mẫu thiếu G6PD ở trên, chúng tôi đã tiến hành điều tra sàng
lọc trên 1486 cá thể
3.4 Phương pháp chọn mẫu:
Chọn mẫu có chủ đích cho đánh giá độ nhạy, độ đặc biệu :
ác mẫu thiếu và bán thiếu : được chọn có chủ đích từ các điều tra cắt
ngang sàng lọc bằng các phương pháp phát quang hoặc phương pháp
nhanh Sau khi xác định có thiếu G6PD hoặc bán thiếu, đối tượng đó
sẽ được lấy 1 ml máu tĩnh mạch để định lượng hoạt độ G6PD
- Binh lượng hoạt độ G6PD từ các mẫu không thiếu : chúng lôi chọn theo phương phấp ngẫu nhiên đơn trong số không thiếu đã được xác
định bằng các phương pháp định tính
3.5 Các kỹ thuật sử dụng:
3.5L Phương pháp nhanh phát hiện thiết G6PD (Akira Hirono-
1998):
ø Hóa chất: Glucose 6 phosphate (G6P), nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate (NADP), Dimethy-thiazoly! dipheny!tetrazolium bromide (MTT),
Trang 16» Các bước tiến hành :
- Pha Tris-HCI: Pha 100 mM Tris-HCI : cân 12,1 g Tris hoa tan trong 900
ml nước cất cho dung dịch a xit chiohydric (HCL) 5N để chỉnh pH về 6,5, cuối cùng bổ sung nước cho đủ 1000 ml
-_ Pha DEAE ~ Sephadex A — 50 :
0,5 g Sephadex A-50 pha trong 5Ö ml Tris-HCI 0,1M, lắc kỹ cho Sephadex
tan hoàn toàn, Để lắng, lấy dung dịch ở trên đo pH, chỉnh pH về 6,5 bằng
dung dịch NaOH IN
-_ Khi tiến hành cho !00 mâu thử, hoá chất được pha như sau :
DEAE-Scphadex : 20ml, đệm Tris HCI: 20ml Sau đó pha hỗn dịch gồm:
GóP : 30,4 mg, NADP: 6,3 mg; MTT : 5,0 mg va PMS 5,0 mg trong 40 ml
nước cất 2 lần, trộn đều tất cả các thành phần
-_ Cho vào mỗi tubc eppendorf 0,8 ml hôn dịch trên Dung địch này bọc trong, giấy mầu để tránh ánh sáng và bảo quản ở 4°C
-_ Máu toàn phần lấy 5 4l từ đầu ngón tay hoặc từ máu chống đông Nhỏ vào tube chita 0,8 ml đung dịch trên, lấc kỹ, để hộp tối, ở nhiệt độ phòng, 30 phút sau đọc kết quả
+ Đạc kếi quả : sau 30 phút
Dung dich khi pha có mầu vàng chanh và trong suốt
-_ Người bình thường : đo trong máu có đủ GóPD, nên các thành phần có trong
dung dịch sẽ xây ra phản ứng làm cho dung địch chuyển mầu xanh thâm -_ Thiếu men G6PD ; đo trong máu không có hoặc quá thấp lượng G6PD, nên
phan ứng không xảy ra, dung dich không chuyển mâu
3.5.2 Phuong phdp formazan phát hiện thiếu G6PD (Hisaichi Fujij)
Phương pháp này xác định hoạt tính G6PD của máu khô trên gel thạch chứa các
hoá chất
+ Nguyên lý của kỹ thuật : Như phương pháp nhanh của Akira hìrono
© Hóa chất như phương pháp nhanh gồm : G6P, NADP, MTT, PMS, đệm Tris-HCI pH 6,5 và thạch (agar)
© Dung cu: ống đong, cốc mổ, bình nón, đĩa petri đường kính 9 mm hoặc
miếng kính kích thước (10 x 15 mm), lồ vỉ sóng, bình cách thủy, giấy
whatman 3
« Các bước tiến hành :
- Pha Tris— HCI pH 6,5 như pha dùng cho phương pháp nhanh
-_ Cân hóa chất : để làm được 20 mâu các thành phân như sau : đệm Tris : 20
ml; thạch ; 150 mg; GóP 25 mg; MADP: 5 mg; MTT: 5 mg và PMS : 5 mg
- _ Cho thạch vào bình nón, đổ một phân tư (1/4) dung địch đệm Tris cân dùng
vào bình chứa thạch Cho lò vì sóng hoặc đun cách thuỷ để thạch tan hoàn toàn cho bình thạch vào tủ ấm hoặc bình cách thuỷ, giữ ở nhiệt độ 55%C
-_ Cho 4 thành phần sau : G6P, NADP, MTT, PMS vao 3/4 dung dich dém Tris
còn lại ở trên Lắc tan hồn tồn (chú ý :khơng để ngoài ánh sáng lâu)
Trang 17
Để thạch 55 °C vào lọ chứa 4 hoá chất trên, lắc đều, đổ đĩa peti (độ dây khoảng 3 mm là tốt)
-_ Khi thạch đông đặc, bọc đĩa petri bằng kín miệng túi, để 4C
-_ Giấy thấm chứa máu đã được thu thập, dùng kìm bấm thành mảnh nhỏ có đường kính 6 mm, dùng kẹp nhỏ đật miếng giấy lên trên ặt thạch vừa đổ ở trên, cho bản thạch vào hộp ẩm, đậy kín, cho vào tủ ấm 37 °C sau 8-
10 giờ lấy ra đọc kết quả
+ Cách đọc kết quả:
-_ Không thiếu men : Vòng mầu xanh formazan sẽ được tạo thành xung quanh
mảng giấy thấm Đườiig kính > 12 mm là bình thường
- Thiếu mèn G6PD : Đường kính vòng fonmazan < 8 mm, hoặc không thấy
mầu xanh formazan được hình thành chỉ có mẫu hồng của hemolobin
khuyếch tán ra
-_ Bán thiếu ; Đường kính
3.5.3 Phương pháp định lượng (Kornberg A -1955):
Theo kit định lượng G6PD mã sản phẩm số 124672, của hãng Roche - Đức [2]
° Héa chit NADP, G6P, 4ém Tris-HCl pH 7,6, dung dich dém héng cau,
dung dich NaCl 0,9%, Digitonin
«+ Dụng cụ : máy quang phổ kế 5010 đã cài đặt sẵn chương trình định lượng G6PD, tube ly tam, tube lấy máu có chất chống đông, pipette các loại
+ Phương pháp riển hành: Lấy 02 mÌ máu nh mạch đã được chống đông rửa 3 lần trong Nael 0,9%, cặn hỏng cầu (HC) được phá vỡ bằng đigitonin
Dung dịch hồng cầu phá vỡ được ủ với NADF, GóP và đệm Tris-HCI trong
5 phút san đó đo hoạt độ G6PD trên máy quang phổ 5010 của hãng
Bochringer theo qui trình đo động học đã được cài đặt sẵn cho đo hoạt độ
G6PD Đồng thời tiến hành đếm số lượng HC? pl mau (x10) va tính ra số
lượng HC/ 1 ml máu (x10)
« Cách đọc kết quả: Hoạt độ G6PD/10° HC ( mU/10” HC) sẽ được tính bằng mật độ quang học đo được chia cho số lượng hồng câu đếm được trong l mÌ méu tối mầu, cho vào tui nilon, hàn
Người bình thường hoại độ G6PD: 131 + 13 mU/10HC
Để đánh giá phương pháp nhanh và phương pháp formazan, chúng tôi đã dùng phương pháp định lượng như là một thước đo chuẩn để đánh giá Theo
chuẩn mà nhà sẵn xuất đưa ra, người bình thường có hoạt độ G6PD từ 131 + 13
mU/10” HC) Kết quả đo được chúng tôi đã chia thành 3 lớp :
- Lép thiéu : hoạt độ G&PD < 60 mU/10°HC
- Lớp thiếu ít hay còn gọi bán thiếu : hoạt độ GóPD từ 60 -1 1§ mU/10°HC
-_ Lớp không thiếu : hoạt độ G6PD > 118 mU/10°HC
“Tương ứng các phương pháp định tính cũng được chỉa làm 3 nhóm : thiếu, bán
thiếu và không thiếu GóPD
Trang 18
3.6 Các chỉ số nghiên cứu :
«_ Độ nhạy, độ đặc hiệu của 2 phương pháp so với phương pháp định lượng
được áp dung theo công thức sau:
[ "Phương pháp | —_ Phương pháp định lượn; Cộng
định tính Thiếu GốPD ¡ Không thiếu |
Thiếu GóPD A | B A+B }
Không thiếu 6 ] D B+D
Cong A+ [ B+D A+B+CtD
A: Thiếu G6PD thật (đương tính thật) C: Không thiếu GóPD giá (âm tính giả) B; Thiếu G6PD giã (dương tính giả) _ D: Không thiếu G6PD thật (âm tính thật)
Độ nhạy = Á/ A+C Độ đặc hiệu : D/ B+D
Để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu :
- Với phương pháp định lượng : các trường hợp có hoạt độ GóPD < 118
mU/I0°HC chúng tôi xếp nhóm thiếu G6PD Các trường hợp hoạt độ > 118 mU/10?HC chúng tôi xếp vào nhóm không thiéu G6PD
-_ Với 2 phương pháp định tính : các trường hợp thiếu và bán thiếu G6PD xếp vào
nhóm thiếu, còn lại là các trường hợp không thiếu G6PD
* Kha nang phù hợp chẩn đoán được tính toán bằng chỉ số Kappa (trong cuốn phương pháp nghiên cứu khoa học y học - Đại học Y Hà Nội 2001),
được tính như sau: Phuong phap A " Dương tính | Ấm tính Cong Duong tinh A B AB phương ¬ phápB | Am tinh i Cc D cD Cong +—xe BD ABCD (AC/ABCD X AB) + (BD/ABCD X CD) -_ Phù hợp ngẫu nhiên (%) = ABCD
- Phi hợp tiểm ẩn = 100% — phù hợp ngẫu nhiên (%)
~_ Phù hợp thực tại = (A + DỊ/ABCD - phù ñợp ngẫu nhiên, Phù hợp thực tại
Kappa=
Phù hợp tiểm ẩn
Trang 19Chi sé Kappa từ0 đến 1,0 và duoc chia ra làm 5 mức: - Từ 0 <0.2: phù hợp quá ít; - Từ 0,2 — < 0,4: phù hợp thấp; -Từ0,4— < 0,6: phù hợp vừa; - Từ0,6— <0,8 : phù hợp khác ~ Từ 0,8 ~ 1,0: phù hợp cao
«Thời gian hóa chất còn tác dụng theo thời gian : sau 1 tháng, 3 thang: theo
dõi độ trong, mầu sắc của các sẵn phẩm pha chế tại labo
3.7 Phân tích số liệu:
Số liệu được phân tích với phần mềm Stata 8.0, sử dụng test khi bình phương trong sơ sánh đánh giá và các phương pháp thống kê trong đánh giá độ nhạy,
độ đặc hiệu và khả năng phù hợp chẩn đoan
Trang 20
4 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU Bảng 1 : Địa điểm và số mẫu nghiên cứu
[TT ; Tên địa điểm nghiên cứu ` — Sốmẫu
1 | Huyện Kim Bói (Hòa Bình) 109
2 _ ¡ Viện sốt rét (Hà Nội) 12
3 | Trường Trung cấp Y Sơn La, 48
4ˆ [Hướng Hóa, Quảng Tìị 829
[5] Throng Trung cap Y Cao Bang 201 :
{_6_|Huyen Lak, Dak Lak —_ —_ 197 “|
L_ Tổng cộn 1486
4,1 Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp nhanh và phương pháp formazan so với phương pháp định lượng:
Bảng 2: So sánh kết quả định lượng và phương pháp nhanh 2 ay Hoạt độ
Phương pháp Kết quả định lượng TH
nhanh <60 9 60-118 | >I18 3 3 tung enh) Cang
MUAGHC | mUAOHC | MUNOHC | croc) | ¡ Thiếu 58 2 0 22,3 + 19,3 60 Bán thiếu 6 1 I 4133 43,7 8 ¡ Không thiếu § 12 T79 144+47.5 99 [Cong 72 15 so | 167 ˆ| Nhận xét: - Giữa 2 kỹ thuật có sự tương đồng vẻ chẩn đoán là (58 + 6+2 + 1+ 79)/167= 87,4% Số không phù hợp 21/167= 12,6%, trong số không phù hợp này đáng xem xét nhất có :
- 8 trường hợp có kết quả định lượng hoạt độ G6PD từ <60 mU/10°HC, nhưng
phương pháp nhanh cho kết quả không thiếu, thì 6 trường hợp là nữ
- Còn 12 trường hợp định lượng hoạt độ G6PD từ 60 -118 mŨ/10° HC mà phương pháp nhanh cho kết quả không thiếu, thì 11 trường hợp là nữ
Kết quả cũng cho thấy: các trường hợp phương pháp nhanh cho kết quả thiếu G6PD, có hoạt độ GóPD trung bình đo được rất thấp 22.3 + 19,3 mU/10HC, và hoạt độ
G6PD trung bình tăng lên với các trường hợp bán thiếu và trong 99 trường hợp không thiếu hoạt độ G6PD trung bình là 144+ 47,5 mU/10°HC
Trang 21Bảng 3 : So sánh kết quả định lượng và phương pháp formaZan | Phương pháp | — Kếếquảđịnhlượng | H9siđộ | formazan < 60 S118 trung bình | Cộng mm | mU/10°HC | mU/I?HC | mÚ/i@HC| C6PP }| Thiếu 58 I 0 18,8 + 16,4 59 Bán thiếu _ 108 {| 4 2 | 46,2 + 446 16 Không thiểu | “16 t 17 106 1446+544 | 139 | Cộng — Em: mm _L 24 Nhận xét: - Giữa 2 kỹ thuật có sự tương đồng về chẩn đoán là (58 + 10 + +4 + 106/21 đáng xem xét nhất :
§3,6%, Số không phù hợp là 35/214= 16,4%, trong số không phù hợp này
-_ 16 trường hợp có kết quả định lượng hoạt độ G6PD từ <60 mU/10°HC thì 9
trường hợp là nữ
- _ 17 trường hợp định lượng hoạt độ G6PD từ 60 -118 mU/10? HC mà phương
pháp nhanh cho kết quả không thiế
thì 17 trường hợp đều là nữ
Các kết quả định lượng ở nhóm thiếu, bán thiếu và không thiếu GóPD, hoạt độ G6PD
cũng tăng tương ứng là 18,8; 46,2 và 144,6 mU/IữHC
Để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của các phương pháp định tính chúng tôi đã ấp dụng công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu phần phương pháp nghiên cứu trang 12
Bang 4 : Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương phấp nhanh sơ với phương pháp định lượng
ƒ Phương j Phương pháp định lượng _ -
pháp Chung 2 giới Nam ] Nữ
nhanh | Thiếu | Không | Thiếu Không | Thiếu Không
Thiếu |] 67 1 42 0 25 1
Khong {| 20 79 3 43 17 36
Cộng - |” 87 30 45 4 42 37
Nhận Xết :
- Chung cho cả 2 giới: Độ nhạy : 67/87 = 77 %; Độ đạc hiệu : 79/80 = 98,8%
Trang 22Bang § : Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp Ïormazan
so với phương pháp định lượng
Phương a _ Phuong pháp định lượng ]
pháp Chung 2 giới Nam Nữ j
formazan| Thiếu | Không | Thiết ' Không | Thiến | Không
Thiếu | 73 2 4 oO | 26 2
Không | 33 j 106 6 51 27 55
Cong {106 $108 53 5l | 53 37
Nhận xót:
- Chung cho cả 2 giới: Độ nhạy : 73/106 = 68,9%; Độ đặc hiệu : 106/108 = 98,1% - Phát biện ở nam : Độ nhạy : 47/ 53 = 88,7 %; Độ đặc hiệu : 51/51 = 100 %
- Phát hiện ở nữ : : Độ nhạy : 26/53= 40,1 %; Độ đặc hiệu : 55/57 = 96,5 %
4.2 Xác định thời gian cồn hoạt tính của hóa chất thử: 4.2.1 Đối sối phương pháp nhanh:
Trong thành phần cửa chất thử có các chất sau: GóP, NADP, MTT, PMS như ở phần phương pháp đã nêu Trong đó chỉ có MTT là chất dễ bị chuyển màu nhất khi bị tác động của ánh sáng, không khí Do vậy tất cả các sản phẩm sau khi pha
đều phải được đóng kín, bọc giấy bạc để tránh ánh sáng và bảo quản trong tủ lạnh
ở 4C, khi dùng mới lấy từ tủ lạnh ra Bình thường khi pha dung dịch có mau vàng chanh vä trong suốt, để 30 phút phần sephadex sẽ lắng xuống dưới tạo thành 2 tớp nhưng vẫn chỉ có màu vàng chanh Khi các dung địch bị oxy hóa sẽ chuyển
màu xanh tím và kết tủa Không đồng déu Qua theo dõi chúng tôi nhận thấy như sau: « Thời hạn và dạng đóng gói : Thời gian Đóng sẵn trong tube Đóng lọ 200 ml có nút xoáy 7 eppendof thể tích I,Š ml _ oe
Sau 1 tháng chuyển mẫu xanh tím màu vàng chanh
Sau 2 thắng mầu xanh tím
Như vậy - khi được đồng sẵn trong các tube eppendof thì hóa chất chuyển màu rất nhanh, nhưng nếu đồng trong cầc lọ to khi dùng mới chuyển sang tube eppendof thì thời hạn bảo quần được lâu hơn (gần 2 tháng)
© Kếtquả đánh giá hoạt tính G6PD theo thời gian :
30 học sinh lớp kỹ thuật viên trong Viện Sốt rét — Ký sinh trùng — Côn trùng Trung ương đã tham gia vào theo dõi nầy :
Trang 23Kết quả Min-Max Kết quả phương Kết quả phương
Số theo dõi định lượng _ (mU/10?HC) pháp nhanh pháp nhanh
_ (mUA OC) lần 1 sau 1 thắng
30 157425 123-214 không thiếu không thiếu
3030 30/30
Nha vi heo đối trên 30 học sinh kết quả định lượng cũng như thứ phương pháp nhanh lấn ¡ đều không phát hiện | trường hợp thiếu GóPD nào Sau 1 tháng kiểm tra lại hóa chất pha của phương pháp nhanh vẫn trên 30 học sinh đó đã cho kết quả
tương đồng với kết quả lần 1
4.2.2 Đối với phương phdp formazan:
Do các hóa chất tham gia vào chất thử cũng tương tự như phương pháp nhanh, chỉ
khác 1 thành phần là sephadex được thay thế bằng thạch Như vậy các bản thạch sau khí đổ được bọc kín trong cấc túi màu đen và bảo quần ở tủ lạnh 4 %C Qua theo dõi chúng tôi thấy các bản thạch bị chuyển mầu và xuất hiện nấm mốc sau 3 tuần
4.3 Triển khai kỹ thuật :
Việc triển khai kỹ thuật đã được đưa xuống 2 trung tâm y tế huyện: huyện Kim
Bội và huyện Mai Châu của tỉnh Hòa Bình Các kỹ thuật viên đã được hướng dẫn tỷ rhỉ cách tiến hành kỹ thuật và mỗi bệnh viện đã được cung cấp bản qui trình tiến hành kỹ thuật, hóa chất để thực hiện cho 30 mẫu thử cũng như chứng thiếu G6PD để so sánh nhận biết kết quả Kết quả thăm đò được thống kê ở bằng sau:
Sau khi triển khai kỹ thuật xuống 2 trung tâm y tế, cả 2 trung tâm đều cho nhận Xét:
-_ Kỹ thuật thực hiện đơn giản : có: 2/2 phứctạp: 0/2
-_ Cách nhận biết kết quả : dé: 2/2 khó: 0/2
-_ Kỹ thuật có giá trị giúp chẩn đoán ở bệnh viện : có:
~_ Thời hạn của hóa chất còn sử dụng được: 1 tháng
-_ Để nghị cũa2 trung tâm : cung cấp hóa chất và dụng cụ để thực hiện kỹ
thuật,
Trang 25§ BẢN LUẬN
5.1 Độ nhạy và độ đặc hiệu của 2 phương pháp định tính phát hiện thiếu
G6PD:
Kết quả nghiên cứu đã cho thấy trong 167 trường hợp được so sánh giữa 2
phương pháp: phương pháp nhanh phát hiện thiếu men G6PD có độ nhạy, độ đặc
hiệu tương ứng là 77% và 98,8% chung cho cả 2 giới, nếu chỉ phát hiện thiếu
G6PD ở nam thì độ nhạy và độ đặc hiệu tăng lên tương ứng 93,3% và 100%, trong
khi độ nhạy chỉ đạt 59,5% và độ đặc hiệu đạt 97,3 khi phát hiện thiến G6PD ở
nữ Phương phdp formazan có độ nhạy và độ đác hiệu thấp hơn phương pháp
nhanh: xét chung cả 2 giới độ nhạy là 68,9%; độ đặc hiệu: 98,1%; nếu chỉ phát
hiện ở nam thì độ nhạy đạt 88,7% và độ đặc hiệu đạt 100%; nhưng khi phát hiện
thiếu G6PD ở nữ thì độ nhạy giảm xuống còn 49,1% và độ đặc hiệu còn 96,5% Trong nghiên cứu này phương pháp nhanh cho kết quả không tương đồng ở 21 trường hợp thì 20 trường hợp kết quả định lượng là thiếu (<118 mU/10°HC), phương pháp nhanh cho kết quả không thiếu; chỉ có 1 trường hợp phương pháp định lượng bình thường thì phương phấp nhanh cho kết quả thiếu Trong số 20
trường hợp đầu thì 17 trường hợp là nữ giới và trong đó có 5 trường hợp có hoạt độ
G6PD khá cao từ 104 ~ 116 mU/IHC
Với phương pháp formazan: trong số 214 trường hợp được tiến hành song song giữa 2 phương pháp thì có 35 trường hợp cho kết quả không thống nhất với nhau
Trong đó 33 trường hợp kết quả định lượng là thiếu G6PD, nhưng phương pháp
formazan không thiếu và 2 trường hợp phương pháp định lượng không thiếu
nhưng phương pháp formazan cho kết quả thiếu Trong số 33 trường hợp đầu thì
27 trường hợp là nữ và có 5 trường hợp hoạt độ G6PD từ 104— 117 mU/10°HC
"Theo y văn, rất nhiều phương pháp định tính không phát hiện được các trường
hop thiéu men G6PD ỡ nữ (thiếu GóPD dị hợp tử) trừ phương pháp phân tích gen
Thiếu G6PD là bệnh đi truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X, không có alen
trên Y Locus gen qui định cấu trúc G6PD nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể
X [11]: Ở nam do chỉ có I nhiễm sắc thể X (do mẹ truyền), nên khi bị đột biến
Trang 26thường là thiếu hoàn toàn Vì vậy tỷ lệ thiếu GóPD ở nam cao hơn nữ rõ rệt và
biểu hiện bệnh ở nam cũng nặng hơn nữ, có nguy cơ cao đái huyết cầu tố khi sử
dụng một số thuốc gây ð xy hoá Trong một nghiên cứu của Tạ Thị Tĩnh [5]: tại
Kim Bôi Hòa Bình khi điều tra hồi cứu lại những người đái huyết cầu tố đã nhận
thấy tỷ lệ này ở nam giới là 13/14 trường hợp, chiếm 92,9% Thiếu G6PD ở nữ có 2 dạng: thiếu GỐÓPD đồng hop tir (homozygote) vA thiếu G6PD di hop tir
(heterozygotes) Các trường hợp thiểu GốPD đồng hợp tử : là cả 2 X (1 nhận từ bố và 1 nhận từ mẹ) đều bị đột biến, hoạt độ G6PD hồng cầu rất thấp, do vậy biểu
hiện bệnh nặng, dễ xảy ra đái huyết cầu tố khi sử dụng các thuốc gây oxy hóa,
nhưng tỷ lệ này rất thấp Trường hợp thiếu G6PD dị hợp tử: thì chỉ cố 1 X bị đột
biến Trong trường hợp này, có 2 quần thể hồng cầu : một quần thể bình thường và
một quần thể thiếu G6PD, Thông thường 2 quần thé này phân bố theo tỷ lệ 1:1
Tuy nhiên trong 1 số trường hợp, các hồng cầu thiếu G6PD chiếm tới 90%, hồng
cầu lành chỉ có 10% và số trường hợp khác lại ngược lại [1,!1]: Vì vậy nhiều
phương pháp định tính không phát hiện được các trường hợp thiếu G6PD dị hợp tử
do quần thể hồng cầu thiếu chiếm tỷ lệ quá thấp Trong nghiên cứu nầy, phương
pháp nhanh đã phát hiện được 03,3% số trường hợp thiếu ở nam và 59,5% số
trường hợp thiếu ở nữ Phương pháp formazan đã phát hiện được 88,7 số trường
hợp thiếu ở nam và 49,1% số trường hợp thiếu ở nữ Như vậy độ nhạy của cả 2
phương pháp đều phát hiện cao ở nam, nhưng khá thấp ở nỡ; trong khí độ đặc hiệu
lại rất cao với phương pháp nhanh độ đặc hiệu là 100% (ở nam) và 97,3% (ở nữ);
phương pháp Formazan độ đặc hiệu cũng 100% (ở nam) và 96,5% (ở nữ) Điều đó
khẳng định khi 2 phương pháp định tính này cho kết quả xác định không thiếu thì
độ chính xác tới 100% (ở nam) và 96% (ở nữ)
Để đánh giá độ chính xác của 2 phương phấp định tính mà chúng tối đã áp
dụng trong để tài Chúng tôi đã dùng thêm 1 phương pháp định tính nữa là phương
pháp phát quang, sit dung kit cba hang sigma (s6 sản phẩm 203) Phương pháp phát
quang là một phương pháp đã được ủy ban quốc tế về các tiêu chuẩn trong huyết học để nghị sử dụng trong phát hiện sàng lọc các đối tượng thiếu men G6PD từ
Trang 27năm 1967 [18] Do có sự phối hợp với Viện Sốt rét — Ký sinh trùng - Côn trùng
Qui Nhơn và các số liệu về phương pháp phát quang tại Kim Bôi giai đoạn 1997, nên chúng tôi đã có số liệu để so sánh 3 phương pháp với nhau
Bảng 6: So sánh phương pháp nhanh với phương pháp phát quang
Phươngpháp | Phương pháp nhanh — Cộng Ị
| _ phát quang Thiếu Không thiếu |
Thiếu 60 a) ! 72
| Không thiếu | 13 _47 484
Cộng 73 483 556
Như vậy: Phương pháp nhanh đã nhận định có 483/556=86,9% trường hợp không thiếu G6PD và 73/556 =13,1% trường hợp thiếu GóPD Vì thế đứng trên phương điện xác suất thì sẽ có 86,0 % của 484 trường hợp không thiếu G6PD xác định bằng phương pháp phát quang phù hợp với phương pháp nhanh và 13,1% của 72 trường hợp thiếu GốPD được xác định bằng phương phấp phát quang phù hợp với
phương pháp nhanh Như vậy mức độ phù hợp của 2 phương pháp là [(0,869 x 484) + (131 x THY 556 = 713% (Con số này được gọi là phù hợp ngẫu nhiên), Do đó, đồng lẽ có thể phù hợp đến 100% thì sẽ còn có 1009%-77,3 %=22,7% phù hợp không phải do ngẫu nhiên, con số 22,7% gọi là phù hợp tiểm ẩn
Để xác định khả năng phù hợp nói chung, 2 phương pháp cùng xác định được 60 trường thiếu G6PD và 471 trường hợp không thiếu G6PD Như vậy 2 phương pháp đã phù hợp tới (60 + 471)/556 = 05,5% Nhưng trong 95,5 % này có 77,3% là phù hợp ngẫu nhiêu còn lại 18,2% là phù hợp không phải do ngẫu nhiên (phù hợp
Trang 28Bảng 7: So sánh phương pháp formazan với phương pháp phát quang
Phuong pháp Phuon phap formazan _ Cộng
phát quang Thiếu | _ Không thiếu 2 ị
Thiếu 53 I 19 T72
Không thiếu 8 i 312 320
Cộng 61 | 331 392
Với cách tính tương tự, khi so sánh phương pháp formazan với phương pháp
phát quang chúng tôi tính được chi so Kappa = 0,76 Như vậy giữa 2 phương phấp có
sự phù hợp khá về chẩn đoán
Nhưng vậy so với phương pháp định tính đã được giới thiệu bởi ủy ban quốc về các tiêu chuẩn trong huyết học, trong điều tra sàng lọc thiếu GóPD là phương pháp
phát quang, thì 2 phương pháp : phương pháp nhanh (Akira hirono - 19998) và
phương pháp formazan (FuJji-1978) mà chúng tôi đưa vào áp dụng trong nghiên cứu
này đã có sự tương đồng cao vẻ chẩn đoán
Trong 1 nghiên cứu của Asumpcio Pụadus [9], khi so sánh đồng thời phương pháp
phát quang và phương pháp formazan với phương pháp định lượng trên 50 trường hợp
không thiếu G6PD, 9 trường hợp thiếu G6PD ở nam (hemizygote) và 12 trường hợp
thiếu G6PD ở nữ (heterozygote), tác giả cũng nhận thấy: các trường hợp ở nam giới cá
3 phương pháp đều cho kết quả tương đồng nhau, nhưng ở nữ thì phương pháp
formazan chỉ phát hiện được thiếu ở 7/12 trường hợp, trong khí phương pháp phat
quang thì không phát hiện được trường hợp nào Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng
đã tiến hành đồng thời cả 4 phương pháp trên 76 đối tượng, kết quả cho thấy: nếu phát
hiện ở nam thì cả 4 phương pháp (phương pháp nhanh, formazan, phát quang và định lượng) đều cho kết quả như nhau; nhưng nếu phát hiện ở nữ thì phương pháp nhanh
cho kết quả tương đồng với định lượng là 65,7%, trong khi formazan là 60% và phát
quang là 54,3%
5.2 Yê thời gian còn hoạt tính của hóa chất và khả năng áp dụng :
Trang 29trong các tube 1,5 ml thi dung địch sau pha chuyển màu dưới 1 tháng Có khả năng do nắp đậy của các tube khơng hồn toàn chặt nên dung dịch vẫn tiếp xúc với không khí va vi khuẩn làm hóa chất bị oxy hóa nên chuyển màu, vì khi dùng các lọ có nút xoáy vô trùng thì dung dịch gỹi được lâu hơn Kết quả cũng cho thấy nếu dung dịch không bị chuyển mầu thì dung địch sau pha 1 tháng vẫn cho kết quả chính xác như ban đầu
+ Nhược điểm của 2 phương pháp là thời hạn quá ngắn, tuy nhiên cả 2 phương pháp đều có ưu điểm là tiến hành đơn giản, có thể áp dụng trong điều tra hành loạt
Phương pháp formazan có ưu điểm là có thể tiến hành trên các mẫu máu khô và có thể
tiến hành với số lượng lớn, nhưng chỉ thực hiện được tại phòng thí nghiệm Còn phương pháp nhanh cố tính ưu việt hơn hẳn với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn cũng như tính đơn giản, dễ thực hiện, không cần các trang thiết bị đất tiền, Qua triển khai tại 2 huyện Kim Bởi và Mai Châu của tỉnh Hòa Bình cho thấy phương pháp này có thể áp dụng được ở tất cả các tuyến (nơi có trang thiết bị bảo quản lạnh để gữi hóa chất,
chúng ta có thể tận dung thiết bị này ở tuyến xã của chương trình tiêm chủng mở
rộng), khí mà thời hạn quá ngắn của hóa chất đã được khắc phục Hiện nay 1 số nước trong khu vực Đông Nam châu á như : Philippin, Miến Điện, Inđônêxia đã sử dụng phương pháp nhanh trong phát hiện thiếu G6PD trước khi điều trị primaquin cho bệnh
nhân mắc sốt rét, đặc biệt với các trường hợp sốt rét do P.vivax [12,13,15,16,17}
Trang 30KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu chúng tôi đi đến 3 kết luận sau:
} Độ nhậy và độ đặc hiệu của 2 phương phấp so với phương pháp định lượng:
Phương pháp nhanh có độ nhạy là 77% và độ đặc hiệu là 98,8% khi phát
hiện chung cho cả 2 giới; độ nhạy đạt 93,3% và độ đặc hiệu 100% khi phát
hiện ở nam giới
Phương pháp formazan có độ nhạy là 68,9% và độ
phát hiện chung cho cả 2 giới, độ nhạy đạt 88,7% và phát hiện ở nam giới
© hiệu là 98,1% khi jac hiệu 100% khi
Hóa chất pha tại labo miễn địch, Khoa Nghiên cứu điều trị sốt rết cho phương pháp nhanh phát hiện thiếu G6PD có hoạt tính thấp : 2 tháng và phương pháp formazan dudi 1 tháng
Phương pháp nhanh có thể đưa vào áp dụng tại các cơ sở xét nghiệm tuyến
huyện để phát hiện các bệnh nhàn thiếu G6PD trước khi điều trị một số
thuốc có khả năng gây đái huyết cầu tố ĐỀ NGHỊ “Tiếp tục cho nghiên cứu kéo dài thời gian hóa chất có tác dụng với phương pháp nhanh Đánh giá khả năng phù hợp chẩn đoán của phương pháp nhanh với phương pháp phân tích gen
Áp dụng phương pháp nhanh trong điều tra sàng lọc thiếu G6PD và chỉ định
xét nghiệm phát hiện có thiếu G6PD hay không trước khi điều trị primaquin
cho các bệnh nhân nhiễm P.vivax,
Hà Nội, ngày 12 thắng 9 năm 2005
Trang 31TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Hữu Chấn — 1983
Một số hiểu biết về glucose 6 phoaphat dehydrogenase hồng cầu Một số chuyên
để về hóa sinh học tập I, nam 1983, nha xuat bản Y học, tr 219-224
2, G6P-DH - 1999,
Qiúi trình định lượng G6PD của Roche Diagnostics 1999
3 Đoàn Hạnh Nhân, P,verle, Tạ Thị Tĩnh, Trần Thị Uyên, Nguyễn Diệu Thường, Lê
Minh Đạo, Lê văn Hợi, Trịnh Thuý Liễu - 1997
Điền tra thiếu men Glucose 6 phosphate dehydrogenase hồng cầu ở mẹ sống trong vùng sốt rét lưạt hành nặng rại Miễn Bắc Việt Nam
Ky yếu còng trình nghiên cứu khoa học, ( 1991-1996), Viện Sốt rét — Ký sinh
trùng — Côn trùng Trung Ương, tp I, trang 203-209
4 Đoàn Hạnh Nhân, Tạ Thị Tĩnh, Trần Thị Uyên, Nguyễn Minh Hùng, Lê Minh Dao, Dang Thi To va Cộng sự ~ 2000
Thiếu G6PD ở một số dân tộc sống trong vùng sốt rét lim hành
Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học 1996 - 2000, trang 265-269
5 Tạ Thị Tĩnh, P verle, Đoàn Hạnh Nhân, Nguyễn Diệu Thường, Lê Minh Đạo,
Trần Thị Uyên, Lê Văn Hợi - 1997
Thiếu men Glucose 6 phosphate dehydrogenase hông câu và đái huyết câu tố tại
tuyện Kim Bơi, Hồ Bình
Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, ( 1991-1996), Viện Sốt rét — Ký sinh trùng - Côn trùng Trung Ương, tập I, trang 210-215
6 Hoàng Văn Sơn và cộng sự ~ 1978
GóPD và bệnh sốt rét ở Việt Nam, Công trình nghiên cứu khoa học y được Việt
Nam năm 1978, trang 201 — 211
7 Nguyễn Thọ Viễn, Huỳnh Công Chánh, Mai Văn Sơn, Nguyễn Tân — 1979
Sử dụng primaqtdn dài ngày điều trị chống tái phát P.vivax và vấn để GGPD ở
người Việt Nam KỶ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Viện Sốt rét ~ Ký sinh
trùng - Côn trùng Trung wong 1975-1979, trang 192 ¬ 196
8 Akira Hirono, Hisaichi Fujii and Shiro Miwa — 1998, An improved single-step screening method for G6PD
J Trop Med Hyg., Vol 26 No 1, 1998, pp 1-4
9 Assumpcio’ Puades, Mitcheil lewis, Anna Maria Salvati, Shiro Miwa, Hisaichi Fujii, Rocio Zarza — 1999,
Evaluation of the blue formazan spot test for screening glucose 6 phosphate
dehydrogenase deficiency
International Journal of Hematology 69 (1999) 234-236
10.Bouma M.1., Goris M et al — 1995
Prevalence and clinical presentation of GOPD in Pakistani Pathan and Afghan refugee Communities in Pakistan; implication for the use of primaquin in regional
Trang 32Trans Roy Soc Trop Med Hug, Jan-feb, 89(1), pp 62-64
11.Emest Beutler ~ 1994, G6PD deficiency
Blood Vol 84, No 11 (December 1), 1994: pp 3613-3636,
12 Jalloh A, Tantular LS., Pusarawati S., Kawilarang A.P., Kerong H et al - 2004
Rapid epidemiologic assessment of ghicose 6 phosphate dehydrogenase deficiency
in malaria endemic areas in Southeast Asia using a novel diagnostic kit
Tropical Medicine and Intemational Health May 2004, Vol 9, No 5, pp 615-623 13.Hisaichi Fujii, Keisuke Takahashi and Shiro Miwa - 1984
A new simple screening method for ghecose 6-phosphate dehydrogenase deficiency
ACTA Hematology JPN-47, 1984, pp 185-188
14.Ganezzakowski M, Town M Bowden DK, Kaneko A., Clegg J.B- 1995
Multiple G6PD variants correlate with malaria edemichy in Vanuatu
(Southwestem Pacific)
AnJ Hum Genet 1995, 56, pp 294-30]
15.Kuni Iwai, Akira hirono, Hiroyuki Matsuoka, Fumihiko Kawamoto et al - 2001
Distribution of glucose 6 phosphate dehydrogenase mutations in Southeast Asia
J Hum Genect (2001) 108: 445 — 449
16 Hiroyuki Matsuoka, Jichun wang, Makoto Hirai, Meiji Arai et al — 2004
G6PD mutations in Myanmar: GOPD Mahidol (487 G>A) is the most common
variant in the Myanmar population
J Hum Geneet (2004) 49: 544— 547
17 Yantular LS., K Iwai, Klin Lin, S Basuki et al — 1999
Field trials of a rapid test for G6PD deficiency in combination with a rapid
diagnosis of malaria
Tropical Medicine and International Heath April 1999, Vol 4, No 4, pp 245 — 250
18 WHO working group — 1967
Standardization of procedures for the study of GOPD WHO technology represent
service Vol 366, pp 601 — 611
Trang 33pHÙ LUC 4 PHIẾU NHẬN XÉT VỀ KỸ THUẬT CHAN ĐOÁN NHANH THIẾU MEN GóPD L Kỹ thuật thực hiện đơn giản? — C6 E Khong | ] 3, Cách nhận biết kết quả ? khó [TT
3 Kỹ thuật có giá trị giúp chẩn đoán ở bệnh viện? CoO Ee Khong (1
4, Thời hạn của hóa chất dể được bao lầu ?
2uin [ | 4uuản[E] 6win 1 stun (tauren E]
5 Để nghị của anh/chị :
® th Views SSP SEAR ESI Fin tan Br Chet bn 2%
has Chap tebe Ne "am tiền il Yes Din Cats bien dj Used
ngs my i Bhi Cy a
Ngiy<23 Thing./Z Nam Joty
Nc nban-ctta benh vien Người nhận xét
F tên, đồng dấu) (Ký, sỉ rõ họ và tên) they
Trang 34
ri LOC4/ PHIẾU NHẬN XÉT VỀ KỸ THUẬT CIẦN ĐOÁN NHANH THIẾU MEN GóPD 1 Kỹ thuật thực hiện dơn giần? — Có Không (7) 2 Cách nhận biết kết quá ? bs Ed Khó TT
3 Kỹ thuật có giá trị giúp chẩn đoán ở bệnh viện? Có [ “| Khơng [TÍ
4 Thời hạn của hóa chất để được bao lâu ?