Nghiên cứu phân tích genotype và sự tương đồng kháng nguyên của virus care ở việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU, PHÂN TÍCH GENOTYPE VÀ SỰ TƯƠNG ĐỒNG KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CARE Ở VIỆT NAM CNĐT: LÊ HUỲNH THANH PHƯƠNG 9718 HÀ NỘI – 2013 i MỤC LỤC Phần I MỞ ĐẦU Phần II NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I NỘI DUNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp quan sát, thống kê sinh học 2.2 Phương pháp mổ khám 2.3 Phương pháp làm tiêu bệnh lý 2.4 Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch 2.5 Phương pháp nuôi cấy tế bào 11 2.6 Phương pháp phân lập virus Care tế bào tổ chức 12 2.7 Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50) 13 2.8 Phương pháp xác định đường biểu biễn nhân lên virus 14 2.9 Phương pháp tách chiết RNA 15 2.10 Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR 15 2.11 Phương pháp giải trình tự gene 17 2.12 Phương pháp xử lý số liệu, xây dựng sinh học phân tử 18 2.13 Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus định lượng protein 18 2.14 Phương pháp chế tạo kháng thể 19 2.15 Phương pháp ELISA 20 2.16 Phương pháp tinh chế kháng thể 21 2.17 Phương pháp thực phản ứng trung hòa virus 23 Phần III 25 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết thu thập mẫu chó mắc bệnh Care nghiên cứu đặc điểm bệnh lý, chẩn đoán bệnh Care phương pháp nhuộm tiêu vi thể hóa mơ miễn dịch 25 3.2 Kết phân lập virus môi trường tế bào, xác định số đặc tính sinh học virus 32 3.2.1 Kết phân lập virus Care môi trường tế bào Vero-DST 32 ii 3.2.2 Khả gây bệnh tích tế bào (CPE) hiệu giá chủng virus Care phân lập 35 3.3 Kết giải trình tự gene số chủng virus Care phân lập Việt Nam virus vacxin 42 3.3.1 Kết phản ứng RT- PCR 42 3.3.2 Kết giải trình tự gene virus Care 46 3.4 Kết xác định tương đồng gene chủng virus Care phân lập Việt Nam với chủng virus giới chủng virus vacxin 61 3.4.1 Kết so sánh trình tự nucleotide gene chủng virus Care nghiên cứu chủng virus vacxin 61 3.4.2 Kết so sánh trình tự axitamin đoạn gene P đoạn gene H chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin 63 3.4.3 Kết sinh học phân tử 69 3.4.4 Sự tương đồng nucleotide axitamin chủng virus Care nghiên cứu: 70 3.5 Kết chế tạo kháng thể đa dòng tương ứng với chủng virus Care phân lập Việt Nam chủng virus vacxin để dùng cho phản ứng trung hòa 72 3.5.1 Kết tinh chế kháng nguyên virus 72 3.5.2 Kết tạo kháng thể qua chuột 74 3.6 Kết xác định tương đồng kháng nguyên chủng virus Care phân lập chủng virus vacxin 78 Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 87 4.1 Kết luận: 87 4.2 Đề nghị: 88 Phần V TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 5.1 Tài liệu tiếng Việt 94 5.2 Tài liệu tiếng Anh 94 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hồ sơ mẫu thu thập 25 Bảng 3.2 Bệnh tích đại thể chó nghi mắc Care 26 Bảng 3.3 Bệnh tích vi thể chó nghi mắc bệnh Care 28 Bảng 3.4 Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch để xác định chó bị mắc bệnh Care 30 Bảng 3.5 Nguồn gốc chủng virus Care lựa chọn cho nghiên cứu 34 Bảng 3.6 Kết nghiên cứu khả gây bệnh tích tế bào chủng virus Care 36 Bảng 3.7 Hiệu giá đặc tính nhân lên chủng virus Care phân lập 39 Bảng 3.8 Các chủng virus Care lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên 40 Bảng 3.9 Hiệu giá virus chủng CDV1-P tế bào qua thời gian 41 Bảng 3.10 Hiệu giá virus chủng CDV2-H tế bào qua thời gian 41 Bảng 3.11 Kết phản ứng RT- PCR với gene H 43 Bảng 3.12 Kết RT-PCR với gene P 45 Bảng 3.13 So sánh tương đồng nucleotide axit amin đoạn gene H 70 Bảng 3.14 So sánh tương đồng nucleotide axit amin đoạn gene P 71 Bảng 3.15 Kết tinh chế kháng nguyên virus 73 Bảng 3.16 Biến đổi bệnh lý chuột gây miễn dịch 74 Bảng 3.17 Kết thu huyết có chứa kháng thể kháng virus Care 77 Bảng 3.18 Kết phản ứng ELISA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng virus Care 77 Bảng 3.19 Kết xác định số trung hòa chủng virus CDV1P 79 Bảng 3.20 Kết xác định số trung hòa chủng virus CDV6H 80 Bảng 3.21 Kết xác định số trung hòa chủng virus CDV13R 81 Bảng 3.22 Kết xác định số trung hòa chủng virus CDV16H 82 Bảng 3.23 Kết xác định số trung hòa chủng virus CDV19P 83 Bảng 3.24 Kết xác định số trung hòa chủng virus CDV VX 84 Bảng 3.25 Kết tương đồng kháng nguyên chủng virus Ca rê phân lập chủng virus vacxin 85 iv DANH MỤC HÌNH Ảnh 2.1 Hố miễn dịch dương tính Ảnh 2.2 Hố miễn dịch âm tính 11 Hình Phổi viêm, gan hóa 27 Hình Phổi viêm dính với thành ngực 27 Hình Đại não sung huyết, xuất huyết 27 Hình Hạch lympho màng treo ruột sưng, tụ máu 27 Hình Ruột xuất huyết, chứa căng phồng 27 Hình Xuất huyết niêm mạc ruột 27 Hình Phế nang đứt nát, lịng phế nang chứa nhiều dịch phù (HE x10) 29 Hình Phế nang thâm nhiễm tế bào viêm(HE x40) 29 Hình Lơng nhung ruột đứt nát (HE x10) 29 Hình 10 Viêm cầu thận, xuất huyết (HE x40) 29 Hình 11.Hạch lympho xuất huyết, nang lympho teo (HE x10) 29 Hình 12 Hạch lympho xuất huyết, số lượng lymphocytes giảm (HE x40) 29 Hình 13 Hóa miễn dịch dương tính phổi (IHCx10) 31 Hình 14 Hóa miễn dịch dương tính ruột (IHCx10) 31 Hình 15 Hóa miễn dịch dương tính thận (IHCx10) 31 Hình 16 Hóa miễn dịch dương tính hạch lympho (IHCx10) 31 Hình 17 CPE CDV-4H gây sau 24 gây nhiễm (10X) 38 Hình 18 CPE Onderstepoort (virus vacxin) gây sau 36 gây nhiễm (10X) 38 Hình 19 CPE CDV-4H gây sau 48 gây nhiễm (10X) 38 Hình 20 Tế bào Vero –DST bình thường (10X) 38 Hình 21 Kết phản ứng RT- PCR 44 Hình 22 Kết phản ứng RT-PCR 45 Hình 23 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gene Haemagglutinin virus Care 47 Hình 24 So sánh trình tự nucleotide đoạn gene H chủng virus Care nghiên cứu 57 v Hình 25 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gene Phospho protein virus Care 58 Hình 26 So sánh trình tự nucleotide đoạn gene P chủng virus Care nghiên cứu 60 Hình 27 So sánh trình tự axitamin đoạn gene H chủng virus Care nghiên cứu 66 Hình 28 So sánh trình tự axitamin đoạn gene P chủng virus Care nghiên cứu 67 Hình 29 Cây sinh học phân tử chủng virus Care nghiên cứu 69 Hình 30 Chuẩn bị kháng nguyên tinh chế 72 Hình 31 Tạo gradient đường saccarose 72 Hình 32 Chuẩn bị mẫu cho siêu ly tâm 72 Hình 33 Máy siêu ly tâm 72 Hình 34 Ni động vật thí nghiệm 76 Hình 35 Chuẩn bị kháng nguyên 76 Hình 36 Tiêm động vật thí nghiệm 76 Hình 37 Bệnh tích da sau tiêm 76 Hình 38 Chuẩn bị mổ chuột 76 Hình 39 Lấy máu tim chuột 76 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BSA : Bovine Serum Albumin cDNA : CompleDMEMtary DNA CDV : Canine distemper virus CPE : Cytophathogeneic Effect DAB : 3,3-diaminobenzidine DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA : Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay FBS : Fetal Bovine Serum HE : Haematoxilin – Eosin IHC : Immunohistochemistry MOI : Multiplicity Of Infection Ond : Onderstepoort PBS : Phosphate buffered saline RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction TBP : TATA-binding protein TCID50 : 50% Tissue Culture Infective Dose TMB : 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine vii Phần I MỞ ĐẦU Virus Care chó phát từ kỷ XVIII, tìm thấy Peru thuộc Châu Á, bệnh phân bố khắp giới Năm 1905, bệnh bác sĩ thú y người Pháp tên Henri Carré phân lập từ nước mũi chó bệnh lọc qua giấy lọc vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm cho chó, gây bệnh, ông cho nguyên nhân bệnh virus (Carré, 1905) Vì vậy, bệnh gọi bệnh Care (theo tên nhà khoa học) (David T Smith, 1979) Bệnh Care phát toàn giới Gần đây, bệnh công bố nước châu Á Nhật Bản (Lan cs, 2006), Thái Lan (Keawcharoen cs, 2005), Hàn Quốc (An cs, 2008) Ấn Độ (Latha cs, 2007) Bệnh Care bệnh lây nhiễm cao chó, gây tổn thương lớn hệ tiêu hóa, dày, ruột, hệ thần kinh trung ương hệ hơ hấp theo Hồ Đình Chúc (1993), Trần Thanh Phong (1996), Vương Đức Chất cs, (2004), Lê Thị Tài (2006), Tô Du Xuân Giao (2006), Nguyễn Văn Thanh (2007), Nguyễn Thị Lan Trần Trung Kiên (2010), Nguyễn Hữu Nam (2011) Năm 1923, Putoni lần chế vacxin nhược độc nhiên độc lực virus cao Sau năm 1948 với phát triển mạnh mẽ virus học nhiều vacxin phịng bệnh Care có hiệu đời Virus Care giống virus sởi hình thái cấu trúc Một số cơng trình nghiên cứu khác cho có liên quan kháng nguyên virus Care, virus sởi dịch tả trâu bò (Sidery cs, 1996), virus gây bệnh động vật nhai lại nhỏ, virus gây bệnh động vật có vú nước (cá heo, hải cẩu) (Griffin, 2001; Murphy, 1999) Virus Care (Canine distemper virus) thuộc họ paramyxoviridae có mối liên quan gần gũi tính kháng nguyên, sinh lý với virus sởi người virus dịch tả trâu bò lồi nhai lại Ba virus nhóm với giống Morbillivirus Morbillivirus virus tương đối lớn (đường kính 150 – 250 nm) với đối xứng hình xoắn ốc, chúng có lớp vỏ lipoprotein (Kennedy cs, 1989) Cấu trúc hạt virus bao gồm: Nucleocapside chứa ARN sợi không phân đoạn gần 1600 nucleotide mã hóa thành protein cấu trúc protein không cấu trúc (Diallo, 1990) N: Nucleocapsid, khối lượng phân tử 60 – 62 Kda bao quanh phòng vệ cho hệ gene virus, nhạy cảm với chất phân giải protein P: Phosphoprotein, khối lượng phân tử 73 – 80 Kda, nhạy cảm với yếu tố phân giải protein, đóng vai trị quan trọng chép RNA (Sidhu cs, 1993) M: Matrix, khối lượng phân tử 34 – 39 Kda, đóng vai trị quan trọng trưởng thành virus nối nucleocapsid với protein vỏ bọc F: Fusion glycoprotein bề mặt vỏ bọc, khối lượng phân tử 59 – 62 Kda, đóng vai trị kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn đến kết hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (hợp bào) H: Protein ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, glycoprotein thứ hai vỏ bọc, khối lượng phân tử 76 – 80 kda, thể tính chun biệt lồi virus Ở virus Care, protein không hấp phụ hồng cầu không ngưng kết hồng cầu L: Large protein có khối lượng phân tử lớn 200 kda, chưa rõ chức (Nguyễn Vĩnh Phước cs; Bell cs, 1992) Protein không cấu trúc (C) mã hóa từ khu đọc mở khác gene P (Lamb Kolakofsky, 2001) Chức thực tế protein C sinh học virus khơng rõ ràng Mặc dù có khác biệt nhỏ kháng nguyên chủng CDV khác thường chấp nhận có serotype Tuy nhiên, có khác biệt đáng kể khả gây bệnh chủng virus phân lập type khu vực địa lý khác nói tới Các type CDV bao gồm: Asia (Nhật Bản, Trung Quốc), Asia (chỉ có Nhật Bản), Bắc Cực, động vật hoang dã châu Âu, USA 2, CDV cổ điển (Onderstepoort, Convac, Rockborne Snyder Hill) (Haas cs, 1997; 1999; Harder Osterhaus, 1997; Martella cs, 2006; 2007; Yoshida cs, 1998) Bên cạnh đó, dựa trình tự nucleotide đoạn gene mã hóa cho protein H, Lan NT cs, (2008) chia thành type virus lớn phân lập từ vùng địa lý khác nhau: type Châu Âu, cổ điển (Classic type), Asia 1, Asia USA Mặc dù nước giới dùng vacxin nhược độc để phịng bệnh gần tỷ lệ chó mắc Care tăng cách đáng kể số nước Nhật, nước châu Âu (Appel cs, 1987; Blixenkrone cs, 1993; Shin cs, 1995; Lan cs, 2005) Rất nhiều chó tiêm phịng vacxin phòng mà mắc bệnh (Blixenkrone cs, 1993; Lan cs, 2006) Yoon SH, Park JY, (2008) xác định trình tự gene quy định kháng nguyên hemagglutinin (H) từ bốn chó mắc virus Care phân lập Hàn Quốc Những trình tự đưa vào phân tích phát sinh lồi chủng virus Care (là EU1, EU2, EU3, NA1, NA2, Châu Á, Châu Á vacxin) Phân tích cho thấy ba số phân lập Hàn Quốc nằm nhóm Châu Á chủng cịn lại nằm nhóm Châu Á Như quốc gia lưu hành hai chủng virus Care khác Roger cs, (2003) nghiên cứu trường hợp mà hàng trăm chó thị trấn Alaska (Mỹ) chết ổ dịch Care Virus Care tìm thấy bàng quang, lách, phổi, tuyến nước bọt chó bị bệnh Kháng thể huỳnh quang trực tiếp kiểm tra cho kết dương tính (Mơ miễn dịch cho thấy diện virus lách, phổi, tuyến nước bọt) Trong nghiên cứu kỹ thuật RT-PCR sử dụng để xác nhận diện virus Care RNA virus phát RT-PCR não, Bảng 3.23 Kết xác định số trung hòa chủng virus CDV19P Huyết Chỉ số trung hịa Độ pha lỗng virus CDV19P TCID50 Huyết 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-4.17 đối + + + + chiếu + + + + + + + + + + + + + + + Huyết + + IN=10-4.17/10-2.25 10-2,25 = 10-1,92 + + Đối log 10-1,92= 83 CDV1P + + + + + Huyết + + IN=10-4.17/10-2.25 10-2,25 = 10-1,92 + + Đối log 10-1,92= 83 CDV6H + + + + + Huyết + + 10-2,167 IN=10-4.17/10-2,167 = 10-2 + + Đối log 10-2= 100 CDV13R + + + + Huyết + + IN=10-4.17/10-1.5 10-1.5 = 10-2.67 + Đối log 10-2.67= CDV16H + 467.7351 + + Huyết + 10-1.375 IN=10-4.17/10-1.375 = 10-2.795 + Đối log 10-2.795= CDV19P + 623.7348 + Huyết + + IN=10-4.17/10-1.83 10-1,83 = 10-2.34 + + Đối log 10CDV VX + 2.34 =218.7762 + + +: có bệnh tích tế bào -: Khơng có bệnh tích tế bào 83 Bảng 3.24 Kết xác định số trung hòa chủng virus CDV VX Huyết Độ pha lỗng virus CDV vacxin TCID50 Chỉ số trung hịa Huyết 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-4.375 đối + + + + chiếu + + + + + + + + + + + + + + + Huyết + + 10-2,167 IN=10-4.375/10-2,167 = 10-2.208 + + Đối log 10-2.208= CDV1P + + 161 + + Huyết + + 10-2,375 IN=10-4.375/10-2,375 = 10-2 + + Đối log 10-2 = 100 CDV6H + + + + + Huyết + + IN=10-4.375/10-2,5 10-2,5 = 10-1,875 + + Đối log 10-1,875= 74 CDV13R + + + + + + Huyết + + IN=10-4.375/10-1.54 10-1.54 = 10-2.835 + + Đối log 10-2.835 = CDV16H + 683.9116 + + Huyết + + IN=10-4.375/10-1.83 10-1.83 = 10-2.545 + + Đối log 10CDV19P + 2.545 =350.7519 + + Huyết + IN=10-4.17/10-1.5 10-1.5 = 10-2.875 + Đối log 10-2.875= CDV VX + 749.8942 + + +: có bệnh tích tế bào -: Khơng có bệnh tích tế bào 84 Từ bảng kết xác định số trung hòa chủng virus Care kháng thể sản xuất được, đánh giá tương đồng kháng nguyên chủng virus Care phân lập theo mức độ cộng (+), hai cộng (++) ba cộng (+++), cộng có mức độ trung hòa thấp mức độ trung hòa kháng thể virus cao ba cộng Kết trình bày bảng 3.25 Bảng 3.25 Kết tương đồng kháng nguyên chủng virus Care phân lập chủng virus vaxin KN virus Kháng thể CDV1P CDV6H CDV13R CDV16H CDV19P CVD VX CDV1P +++ ++ ++ + + + CDV6H ++ +++ ++ + + + CDV13R ++ ++ +++ + + + CDV16H + + + +++ ++ ++ CDV19P + + + ++ +++ + CVD VX + ++ + ++ ++ +++ Kết bảng tương đồng kháng nguyên cho thấy chủng virus Care phân lập chủng virus vacxin có tương đồng kháng nguyên với nhiên mức độ tương đồng cao hay thấp có khác biệt Trong chủng chia thành nhóm tương đồng khác Các chủng virus Care CDV1P, CDV6H, CDV13R có mối tương đồng kháng nguyên cao với tương đồng thấp với chủng lại Trong chủng CDV16H CDV19P có mối tương đồng kháng nguyên cao với chủng CDV vacxin Như thấy chủng virus CDV vacxin có khả sản sinh kháng thể bảo hộ cho chó nhiễm virus Care nhiên vacxin có khả bảo hộ cao chó nhiễm chủng CDV tương đồng cao với chủng CDV vacxin CDV16H, CDV19P, với chó nhiễm chủng 85 CDV1P, CDV6H, CDV13P vacxin có hiệu lực bảo vệ thấp Chính để có vacxin có hiệu lực tốt cần lựa chọn chủng thuộc hai nhánh tương đồng kháng nguyên khác để sản xuất vacxin có kháng thể sinh có khả trung hịa tồn kháng ngun virus Care 86 Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận: Đã phân lập 55 mẫu virus Care mơi trường tế bào Vero – DST Bệnh tích tế bào xuất sau 24 đến 48 sau gây nhiễm virus, đạt mức phá hủy cao 60 đến 84 sau gây nhiễm tế bào Vero-DST bị phá hủy hoàn toàn sau 96 Virus Care có hiệu giá cao từ 3,16x104 đến 6,67x104 Hiệu giá virus tế bào lớn hiệu giá virus ngồi tế bào Chúng tơi giải trình tự tồn đoạn gene H 10 chủng virus Care lựa chọn nghiên cứu có độ dài 1824bp đoạn gene P có độ dài 390bp Các đoạn gene tham chiếu ngân hàng gene Các chủng virus Care mà nghiên cứu nằm nhánh phát sinh khác cụ thể: + Các chủng virus: CDV2H, CDV3P, CDV5R, CDV6H, CDV10P, CDV12H, CDV13R nằm nhánh phát sinh thuộc nhóm Asia1 + Các chủng virus CDV16H, CDV19R CDVVX nằm nhánh phát sinh thuộc nhóm vacxin classic Chế tạo loại kháng thể đa dòng tương ứng với chủng virus Care phân lập Việt Nam virus vacxin Các kháng thể có độ đặc hiệu cao Sự tương đồng kháng nguyên cho thấy chủng virus Care phân lập chủng virus vacxin có tương đồng kháng nguyên với Tuy nhiên tương đồng chia thành nhóm khác biệt, chủng virus Care CDV1P, CDV6H, CDV13R tương đồng cao với tương đồng thấp với chủng virus Care CDV16H, CDV19P chủng virus vacxin 87 4.2 Đề nghị: Tiếp tục nghiên cứu lựa chọn chủng virus Care thích hợp cho việc sản xuất vacxin phòng bệnh Phát triển tiếp đề tài việc sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ chẩn đoán chế tạo Kit chẩn đoán nhanh bệnh Care 88 Phụ lục Đồ thị 3: Đường biểu diễn nhân lên chủng CDV3-P Virus tế bào CDV3-P Virus dịch tế bào CDV3-P 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi 0.5 2.16 2.83 5.5 6.83 5.16 3.83 2.83 0.83 0.5 1.16 2.16 2.83 3.16 2.83 1.16 Đồ thị 4: Đường biểu diễn nhân lên chủng CDV5-R 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi Virus tế bào CDV5-R Virus dịch tế bào CDV5-R 0.83 1.16 2.16 5.83 6.16 7.16 3.16 1.83 0.5 0.5 0.83 2.83 2.16 3.16 2.83 1.16 89 Đồ thị 5: Đường biểu diễn nhân lên chủng CDV6-H 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi Virus tế bào CDV6-H Virus dịch tế bào CDV6-H 0.83 2.16 2.83 6.83 5.5 5.83 3.83 2.16 0.5 0.83 1.16 2.5 3.16 2.83 2.16 1.16 Đồ thị 6: Đường biểu diễn nhân lên chủng CDV10-P 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi Virus tế bào CDV10-P 0.83 2.16 2.5 3.83 5.5 5.83 3.83 2.5 Virus dịch tế bào CDV10-P 0.5 0.83 1.16 2.5 3.83 2.83 2.16 1.16 90 Đồ thị 7: Đường biểu diễn nhân lên chủng CDV12-H 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi Virus tế bào CDV12-H 0.83 1.5 2.83 3.16 5.83 5.16 3.83 2.16 Virus dịch tế bào CDV12-H 0.5 1.83 1.16 2.83 3.16 3.5 2.16 0.83 Đồ thị 8: Đường biểu diễn nhân lên chủng CDV13-R 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi Virus tế bào CDV13-R 0.83 2.83 3.83 6.5 5.16 4.5 3.83 2.5 Virus dịch tế bào CDV13-R 0.5 0.83 1.16 2.16 3.16 2.83 2.16 1.16 91 Đồ thị 9: Đường biểu diễn nhân lên chủng CDV16-H 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi Virus tế bào CDV16-H Virus dịch tế bào CDV16-H 0.5 2.83 4.16 6.16 5.5 5.83 3.83 1.83 0.83 1.16 1.5 2.83 3.16 2.5 2.16 1.16 Đồ thị 10: Đường biểu diễn nhân lên chủng CDV16-H Virus tế bào CDV19-P Virus dịch tế bào CDV19-P 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi 0.5 2.5 3.5 6.16 5.5 4.83 2.83 2.16 0.83 1.16 2.16 2.5 3.5 2.5 2.5 0.83 92 Phụ lục 152 điểm sai khác nucleotide Chủng virus CDV-10P so với chủng vacxin CDV-VX 90 (T A), 91 (GA), 108 (T C), 114 (TC), 133 (TC), 136 (TC), 139 (GA), 162 (TC), 322 (CA), 330 (GA), 339 (GA), 369 (T C), 387(AG), 426(GA), 432(TC), 436(GA), 462(TC), 465(GT), 466 (TA), 469 (AG), 475 (AG), 479(GA), 484(GT), 507(TC), 511(CA), 522(CA), 525(AC), 528(TC), 531(GA), 533(GC), 538(AG), 552 (AG), 555(AG), 556(CT), 589(AG), 593(TA), 606(AC), 609(CA), 626(CT), 631(CA), 640(CA), 660 (GA), 678(CA), 687(CT), 696(CT), 712(GT), 717(AT), 721(AG), 723(AG), 733(AT), 735(TG), 739(GA), 764(CT), 771(AC), 792(AT), 801(AG), 819(AC), 824(-C), 825(CG), 827(GA), 829(GA), 830(AC), 831(AT), 833(TC), 835(CA), 838(AG), 839(GC), 841(CA), 843(AG), 845(T - ), 864(TC), 868(TC), 876(GA), 877(GA), 894(AT), 903(TC), 909(AG), 926(GA), 937(GA), 958(CT), 963(GA), 970(TG), 981(TC), 996(GA), 999(AG), 1009(GA), 1024(AG), 1031(AG), 1047(CT), 1056(TG), 1059(TC), 1074(TA), 1076(CT), 1094(CT), 1095(CA), 1096(CT), 1100(CT), 1116(AG), 1119(AG), 1126(GA), 1127(GA), 1128(TC), 1140(AT), 1156(AT), 1164(CT), 1194(CT), 1201(AG), 1212(AT), 1243(GC), 1248(TC), 1249(GA), 1272(GA),1275(CT), 1281(CT), 1299(TC), 1305(TC), 1336(AG), 1356(TA), 1362(CT), 1365(AG), 1375(AG), 1378(GC), 1399(GA), 1422(AG), 1423(CA), 1424(TC), 1437(AG), 1450(TA), 1476(AG), 1492(TC), 1495(AG), 1500(AG), 1505(GA), 1515(CT), 1517(TC), 1528(AT), 1539(GA), 1550(GA), 1572(GA), 1578(CT), 1584(AC), 1588(AG), 1590(TC), 1599(GA), 1619(AG), 1645(CT), 1674(GA), 1714(AG), 1738(AC), 1750(GA), 1756(GA), 1758(CT) (Giải thích: 90 (T A) có nghĩa có sai khác nucleotide vị trí nucleotide thứ 90 1824 nucleotide theo thứ tự trình tự thu nhận nucleotide T bị thay thể nucleotide A) 93 Phần V TÀI LIỆU THAM KHẢO 5.1 Tài liệu tiếng Việt 1.Hồ Đình Chúc (1993), Bệnh Care đàn chó Việt Nam kinh nghiệm điều trị, Cơng trình nghiên cứu, Hội thú y Việt Nam 2.Lê Thị Tài (2006), Một số bệnh virus , NXB Nông nghiệp Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2009), Giáo trình miễn dịch học thú y, NXB Nông nghiệp, tr: 79 – 84 Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2010), Giáo trình miễn dịch học ứng dụng, NXB Nơng nghiệp, tr: 153 – 156 Nguyễn Hữu Nam, (2011), báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp bộ, tr: 16, 30-34 Nguyễn Thị Lan, Trần Trung Kiên (2010), nghiên cứu bệnh Care chó vùng Hà Nội phương pháp giải phẫu bệnh lý mô hóa miễn dịch Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y – tập XVII – số 2, tr: 14-18 Nguyễn Văn Thanh (2007), Bài giảng Bệnh chó mèo Nguyễn Vĩnh Phước (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, NXB Nông nghiệp Tô Du, Xuân Giao (2006), Kỹ thuật ni chó mèo phịng trị bệnh thường gặp, NXB Lao động xã hội 10 Trần Thanh Phong (1996), Một số bệnh truyền nhiễm chó, Tủ sách trường Đại học Nơng lâm thành phồ Hồ Chí Minh, tr: 54-68 11 Vương Đức Chất, Lê Thị Tài (2004), Bệnh chó mèo cách phịng trị, NXB Nơng Nghiệp 5.2 Tài liệu tiếng Anh 12 An, D Tae-Young, K., Dae-Sub, S., Bo-Kyu, K & Bong-Kyun, P (2008) An Immunochromatography assay for rapid antemortem diagnosis of dogs suspected to have canine distemper Journal of Virological Methods 147, tr: 244-249 94 13 Appel, M.J 1987 Canine distemper virus pp 133–159 In: Virus Infections of Carnivores (Appel, M.J ed.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands 14 Bell SC, Carter SD, Bennett D (1991) Canine distemper viral antigenes and antibodies in dogs with rheumatoid arthritis Res Vet Sci.50(1):64-8 15 Blixenkrone-Moller, M., Svansson, V., Have, P., Orvell, C., Appel, M., Rode Pedersen, I., Henriksen, P (1993) Studies on manifestations of canine distemper virus infection in an urban dog population Veterinary Microbiology 37, tr: 163-173 16 Carpenter MA, Appel MJ, Roelke-Parker ME, Munson L, Hofer H, East M, O'Brien SJ (1998) Geneetic characterization of canine distemper virus in Serengeti carnivores Vet Immunol Immunopathol 65(2-4):259-66 17 Carre, H (1905) Sur la maladie des jeunes chiens Les Comptes Rendus de L’Academie des Sciences 140, tr: 689-690 18.David T Smith, Donald S Martin (1979), Zinser’s Text book of Bacteriology, tr: 808-810 19 Diallo, A (1990) Morbillivirus gruop: geneome organisation and protiens Veterinary Microbiology 23, tr 155-163 20 Griffin, D E (2001) Measles virus In Fields Virology, 4th edn, tr: 1401-1441 Edited by Knipe, D M Philadelphia, PA: Lippincott Williams and Wilkins 21.Haas, L., Liermann, H., Harder, T C., Barrett, T., Lochelt, M., Von Messling, V., Baumgarner, W & Greiser-Wilke, I (1999) Analysis of the H genee, the central untranslated region and the proximal coding part of the F genee of dild-type and vacxin canine distemper viruses Veterinary Microbiology 69, tr: 15-18 22 Haas, L., Marthens, W., Greiser-Wilke, I., Mamaev, L., Butina, T., Maack, D & Barrett, T (1997) Analysis of the haemagglutinin genee of current wild-type canine distemper virus isolates from Germany Virus Research 48, tr: 165-171 95 23 Harder TC, Osterhaus AD (1997)Canine distemper virus a morbillivirus in search of new hosts, Trends Microbiol, tr:120-124 24.Keawcharoen J, Theamboonlers A, Jantaradsamee P, Rungsipipat A, Poovorawan Y, Oraveerakul K (2005) Nucleotide sequence analysis of nucleocapsid protein genee of canine distemper virus isolates in Thailand Division of Virology, Deparment of Pathology, Faculty of Veterinary Science, Chulalongkorn University, Bangkok 10330 Thailand, Veterinary Microbiology, tr:137-142 25 Kennedy S, Smyth JA, Cush PF, Duignan P, Platten M, McCullough SJ, Allan GM (1989).Histopathologic and immunohistochemmical studies of distemper in seal, Veterinary Pathology, tr: 97-103 26 Lamb, R A & Kolakofsky D (2001) Paramyxoviridae: The viruses and their replication In FundaDMEMtal Virology, 4th edn, tr: 689-724 Edited by Kinpe D M & Howley, P M Philadelphia: Lippincoot Williams and Wilkins 27 Lan NT, Yamaguchi R, Furuya Y, Inomata A, Ngamkala S, Naganobu K, Kai K, Mochizuki M, Kobayashi Y, Uchida K, Tateyama S (2005), Pathogeneesis and phylogeneetic analyse of canine distemper virus strain 007Lm, a new isolate in dogs, Vet Microbiol 110, tr: 197-207 28 Lan NT, Yamaguchi R, Inomata A, Furuya Y, Uchida K, Sugano S, Tateyama S (2006), Comparative analyses of canine distemper viral isolates from clinical cases of canine distemper in vaccinated dogs Vet Microbiol, tr:32-42 Epub 2006 Feb 28 29 Latha D, Geetha M, Ramadass P, Narayanan RB, (2007) Evaluation of ELISA based on the conserved and functional middle region of nucleocapsid protein to detect distemper infection in dogs Vet Microbiol, tr: 251-260 Epub 2006 Nov 26 30 Martella V, Cirone F, Elia G, Lorusso E, Decaro N, Campolo M, Desario 96 C, Lucente MS, Bellacicco AL, Blixenkrone-Møller M, Carmichael LE, Buonavoglia C (2006) Heterogeneeity within the hemagglutinin genees of canine distemper virus (CDV) strains detected in Italy Vet Microbiol, tr:301-309 31 Martella V, Elia G, Lucente MS, Decaro N, Lorusso E, Banyai K, Blixenkrone-Møller M, Lan NT, Yamaguchi R, Cirone F, Carmichael LE, Buonavoglia C (2007) Geneotyping canine distemper virus (CDV) by a hemi-nested multiplex PCR provides a rapid approach for investigation of CDV outbreaks, Vet Microbiol, tr: 32-42 32 Murphy, F A., Gibbs, E P J., Horzinek, M C & studdert, M J (1999) Veterinary Virology San Diego, Calif: Academic Press 33 Nguyen Thi LAN, Ryoji YAMAGUCHI, Tran Trung KIEN, Takuya HIRAI, Yuichi HIDAKA andNguyen Huu NAM (2008), First Isolation and Characterization of Canine Distemper Virus in Vietnam with the Immunohistochemical Examination of the Dog, J Vet Med Sci, tr: 155-162 34 Shin Y, Mori T, Okita M, Gemma T, Kai C, Mikami T (1995) Detection of canine distemper virus nucleocapsid protein genee in canin e peripheral blood mononuclear cells by RT-PCR J Vet Med Sci.57(3):439-45 35 Sidery W B., Macdonald I A, Blackshaw P.E (1996), superior mesenteric artery blood flow and gastric emptying in humans and the differential effects of high fat and carbohydrate meal, Gut 35, p.186.190 36 Sidhu MS, Husar W, Cook SD, Dowling PC, Udem SA (1993) Canine distemper terminal and intergeneic non-protein coding nucleotide sequences: completion of the entire CDV geneome sequence Virology, tr:66-72 37 Yoshida E, Iwatsuki K, Miyashita N, Gemma T, Kai C, Mikami T (1998) Molecular analysis of the nucleocapsid protein of recent isolates of canine distemper virus in Japan Vet Microbiol, tr: 237-244 97