Tạo dòng biểu hiện và thu nhận tobaco etch virus protease tev và human rhinovirus 3c protease hrv3c ở bacillus subtilis

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TT KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN TOBACO ETCH VIRUS PROTEASE (TEV) VÀ HUMAN RHINOVIRUS 3C PROTEASE (HRV3C) Ở BACILLUS SUBTILIS Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: TT Khoa học Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Tp HCM Chủ nhiệm nhiệm vụ: PGS TS Nguyễn Đức Hoàng Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 ỦY BAN NHÂN DÂN ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TT KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TẠO DỊNG, BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN TOBACO ETCH VIRUS PROTEASE (TEV) VÀ HUMAN RHINOVIRUS 3C PROTEASE (HRV3C) Ở BACILLUS SUBTILIS (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 3/10/2019) Chủ nhiệm nhiệm vụ: Nguyễn Đức Hoàng Cơ quan chủ trì nhiệm vụ Phan Thị Phượng Trang Thành phố Hồ Chí Minh- 2019 TRUNG TÂM KHOA HỌC CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Độc lập - Tự - Hạnh phúc Tp Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng năm 2019 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN TOBACO ETCH VIRUS PROTEASE (TEV) VÀ HUMAN RHINOVIRUS 3C PROTEASE (HRV3C) Ở BACILLUS SUBTILIS Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Cơng nghệ Sinh học Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Nguyễn Đức Hoàng Ngày, tháng, năm sinh: 05/06/1976 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: PGS TS Chức danh khoa học: Giảng Viên cao cấp Chức vụ: Giám đốc Điện thoại: Tổ chức: 028-38301331 Nhà riêng: 028-37611179 Mobile: 0987823246 E-mail: ndhoang@hcmus.edu.vn Tên tổ chức công tác: Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Tp HCM Địa tổ chức: 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, Hồ Chí Minh City Địa nhà riêng: D7/198A Ấp 4, Phong Phú, Bình Chánh, Tp HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học Điện thoại: 028-38301331 Fax: E-mail: ndhoang@hcmus.edu.vn (cbb@ Website: http://cbbiotec.vn/ Địa chỉ: 227 Nguyễn Văn Cừ, District 5, Hồ Chí Minh City Họ tên thủ trưởng tổ chức: Nguyễn Đức Hoàng Số tài khoản: 3713.09071984.00000 Kho bạc: Quận 5, Tp Hồ Chí Minh Tên quan chủ quản đề tài: Trung tâm Khoa học Cơng nghệ Sinh học II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 10 năm 2017 đến tháng năm 2019 - Thực tế thực hiện: từ tháng 10 năm 2017 đến tháng năm 2019 - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng… năm… đến tháng… năm… Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 930 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 930 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi Số Thời gian Kinh phí Thời gian Kinh phí (Số đề nghị TT (Tháng, (Tr.đ) (Tháng, năm) (Tr.đ) toán) năm) 10/2017 – 465 12 tháng 465 372 12 tháng 372 9/2018 10/2018 – 9/2019 Sau 93 77 tốn kinh phí tồn Hợp đồng nghiệm thu nhiệm vụ c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Theo kế hoạch Số Nội dung TT khoản chi Tổng NSKH Thực tế đạt Nguồ Tổng NSKH Nguồ n n khác khác Trả công lao 419,957 419,957 41,903 41,903 423,097 423,097 423,097 423,097 86,946 86,946 914 914 930 930 động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng 914 914 - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ cơng đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số Số, thời gian ban TT hành văn Tên văn Ghi Quyết định việc đánh giá nhiệm vụ nghiên cứu khoa học công nghệ Số 1022/QĐ- Quyết định việc phê duyệt SKHCN, ngày nhiệm vụ khoa học công nghệ 20/10/2017 Số Hợp đồng thực nhiệm vụ 180/2017/HĐ- nghiên cứu Khoa học Công nghệ SKHCN, ngày 20/10/2017 Số Văn việc Quyết tốn 2167/SKHCN- kinh phí đợt nộp báo cáo QLKH, ngày giám định nhiệm vụ “Tạo 27/9/2018 dòng biểu thu nhận Tobaco Etch Virus Protease (TEV) Human Rhinovirus 3C protease (HRV3C) Bacillus subtilis Số 1139/QĐ- Quyết định việc thành lập Họp hội đồng ngày SKHCN, ngày Hội đồng giám định nghiệm 2/11/2018 19/10/2018 vụ khoa học công nghệ (giữa kỳ) Số Quyết định việc thành lập Họp hội đồng 0806/QĐ/TTKH hội đồng nghiệm thu cấp nghiệm thu cấp &CNSH, ngày sở sở ngày 20/8/2019 Số: 870/QĐ- Quyết định họp hội đồng Họp hội đồng SKHCN, ngày nghiệp thu cấp Sở nghiệm thu cấp Sở 06/08/2019 20/9/2019 ngày 3/10/2019 Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức Tên tổ chức Nội dung Sản phẩm đăng ký theo tham gia thực tham gia chủ yếu Thuyết minh chủ yếu đạt Trung tâm Trung tâm Theo kế Khoa học Khoa học hoạch Ghi chú* Công nghệ Công nghệ Sinh học Sinh học - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân Tên cá nhân Nội dung Sản phẩm đăng ký theo tham gia tham gia chủ yếu đạt Thuyết minh thực PGS TS PGS TS Nguyễn Đức Nguyễn Đức Hoàng Hoàng Ghi chú* Xây dựng TMĐC, tham gia nội dung 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 viết báo cáo tổng kết đề tài PGS TS PGS TS Tham gia Phan Thị Phan Thị nội dung 1, 2, Phượng Trang Phượng Trang 5, 7, 8, 10, 12 ThS Trương ThS Trương Tham gia Thị Tinh Thị Tinh nội dung 1, 4, Tươm (NCS) Tươm (NCS) 7, 8, 9, 10,11 ThS Nguyễn ThS Lê Minh Trí Tham gia Dương nội dung 3,6, Vương 8, 10, 12 CN Huỳnh CN Nguyễn Tham gia Thị Kim Ngọc Yến nội dung 1, 4, Phương Nhi 7, (HVCH) CN Phan Thị CN Phan Thị Tham gia Thu Hạnh Thu Hạnh nội dung 2, 5, (HVCH) (HVCH) 8, 9, 12 ThS Huỳnh ThS Huỳnh Tham gia Quốc Việt Quốc Việt nội dung 3, 6, 8, 10, 12 GS Wolfgang Tham gia vào nội dung 13 Schumann - Lý thay đổi (nếu có): chuyển cơng tác hỗ trợ hiệu chỉnh báo để cơng bố Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) người tham gia ) Ghi chú* GS Wolfgang Schumann - Lý thay đổi (nếu có): Thêm GS Wolfgang Schumann để hỗ trợ hiệu chỉnh báo Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Số Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi chú* TT (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Thời gian Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo Thực tế kế đạt Người, quan thực hoạch Tạo vector để dịng hóa 10/201 10/2017 – Trung tâm vector khác vector biểu 7– 1/2018 Khoa học His-TEV 1/2018 (đúng theo Công nghệ kế hoạch) Sinh học (đã Vector vector biểu hồn tất) His-TEV (2 vector) Tiêu chí đánh giá: - PCR khuẩn lạc - Cắt hạn chế cho vạch - Đúng trình tự theo lý thuyết Tạo vector vector 10/201 10/2017 – Trung tâm biểu HRV3C dung 7– 1/2018 Khoa học hợp với His-tag 1/2018 Cơng nghệ 10 Tóm lại, đề tài hồn thành mục tiêu ban đầu đặt “Tạo dòng, biểu thu nhận Tobaco Etch Virus Protease (TEV) Human Rhinovirus 3C Protease (HRV3C) Bacillus subtilis” 117 Chương 5: KIẾN NGHỊ Kết nghiên cứu đề tài cho thấy việc sản xuất protease TEV HRV3C protease B subtilis hoàn toàn khả thi Việc biểu hai loại protease đóng vai trị quan trọng công nghệ tinh chế protein từ chủng chủ an toàn Bacillus subtilis tiền đề thúc đẩy khả ứng dụng chúng công nghệ protein tái tổ hợp phục vụ lĩnh vực y dược thực phẩm Tuy nhiên, để tiến tới việc thương mại hóa sản xuất cơng nghiệp, nhóm nghiên cứu cần tiếp tục tối ưu môi trường nuôi cấy, điều kiện lên men điều kiện tinh chế protein quy mơ thể tích lớn nhằm tăng hiệu suất thu nhận, tăng tính cạnh tranh giảm giá thành sản phẩm Đồng thời, kết nghiên cứu đề tài minh chứng cụ thể cho tiềm ứng dụng sản xuất protein tái tổ hợp chủng chủ B subtilis Đề tài có tham gia nghiên cứu sinh, học viên cao học sinh viên đại học nên giúp đào tạo nguồn nhân lực góp phần cho việc phát triển Cơng nghệ sinh học protein tái tổ hợp cho TP HCM khu vực Chúng mong muốn Sở tiếp tục ủng hộ để phát triển hướng Công nghệ Sinh học phân tử Bacillus, nhằm tạo sản phẩm thương mại ứng dụng khác có giá trị tương lai 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Alexander, M (1991), Introduction to Soil Microbiology, Krieger Pub Co, Malabar, Fla [2] Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G.E and Pedersen, J (2011), “Reprint of: Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins”, Protein expression and purification [3] Bolognesi, M., Spallarossa, A and Ascenzi, P (2001), “Human rhinovirus 3C protease: a cysteine protease showing the trypsin(ogen)-like fold”, Biochemistry and Molecular Biology Education, 29(4), 169–172 [4] Bush-Pelc, L.A., Marino, F., Chen, Z., Pineda, A.O., Mathews, F.S and Di Cera, E (2007), “Important Role of the Cys-191–Cys-220 Disulfide Bond in Thrombin Function and Allostery”, Journal of Biological Chemistry, 282(37), 27165–27170 [5] Chang, J.Y (1985), “Thrombin specificity Requirement for apolar amino acids adjacent to the thrombin cleavage site of polypeptide substrate”, European Journal of Biochemistry, 151(2), 217–224 [6] Collins-Racie, L.A., McColgan, J.M., Grant, K.L., DiBlasio-Smith, E.A., McCoy, J.M and LaVallie, E.R (1995), “Production of recombinant bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli using the novel secretory fusion partner DsbA”, Bio/Technology (Nature Publishing Company), 13(9), 982–987 [7] Cui, W., Han, L., Cheng, J., Liu, Z., Zhou, L., Guo, J and Zhou, Z (2016), “Engineering an inducible gene expression system for Bacillus subtilis from a strong constitutive promoter and a theophylline-activated synthetic riboswitch”, Microbial Cell Factories, 15(1), 199 [8] Dougherty, W.G., Parks, T.D., Cary, S.M., Bazan, J.F and Fletterick, R.J (1989), “Characterization of the catalytic residues of the tobacco etch virus 49-kDa proteinase”, Virology, 172(1), 302–310 [9] Earl, A.M., Losick, R and Kolter, R (2008), “Ecology and genomics of Bacillus subtilis”, Trends in microbiology, 16(6), 269 119 [10] Feng, Y., Xu, Q., Yang, T., Sun, E., Li, J., Shi, D and Wu, D (2014), “A novel self-cleavage system for production of soluble recombinant protein in Escherichia coli”, Protein Expression and Purification, 99, 64–69 [11] Gasparian, M.E., Bychkov, M.L., Dolgikh, D.A and Kirpichnikov, M.P (2011), “Strategy for improvement of enteropeptidase efficiency in tag removal processes”, Protein Expression and Purification, 79(2), 191–196 [12] GE Healthcare GST Gene Fusion System pGEX Vectors: https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail_10652_14205849 -1_0?storeId=10652 Accessed: 2014-06-10 [13] Goel, A., Colcher, D., Koo, J.S., Booth, B.J., Pavlinkova, G and Batra, S.K (2000), “Relative position of the hexahistidine tag effects binding properties of a tumor-associated single-chain Fv construct”, Biochimica et biophysica acta, 1523(1), 13–20 [14] Hosfield, T and Lu, Q (1999), “Influence of the amino acid residue downstream of (Asp)4Lys on enterokinase cleavage of a fusion protein”, Analytical Biochemistry, 269(1), 10–16 [15] Human Rhinovirus 3C Protease as a Potential Target for the Development of Antiviral Agents: (2007), http://www.ingentaconnect.com/content/ben/cpps/2007/00000008/0000000 1/art00003 Accessed: 2018-06-02 [16] Jenny, R.J., Mann, K.G and Lundblad, R.L (2003), “A critical review of the methods for cleavage of fusion proteins with thrombin and factor Xa”, Protein Expression and Purification, 31(1), 1–11 [17] Kapust, R.B., Tözsér, J., Fox, J.D., Anderson, D.E., Cherry, S., Copeland, T.D and Waugh, D.S (2001), “Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency”, Protein engineering, 14(12), 993–1000 [18] Kunst, F et al (1997), “The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis”, Nature, 390(6657), 249–256 120 [19] Liew, O.W., Ching Chong, J.P., Yandle, T.G and Brennan, S.O (2005), “Preparation of recombinant thioredoxin fused N-terminal proCNP: Analysis of enterokinase cleavage products reveals new enterokinase cleavage sites”, Protein Expression and Purification, 41(2), 332–340 [20] Ludeman, J.P., Pike, R.N., Bromfield, K.M., Duggan, P.J., Cianci, J., Le Bonniec, B., Whisstock, J.C and Bottomley, S.P (2003), “Determination of the P1’, P2’ and P3’ subsite-specificity of factor Xa”, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 35(2), 221–225 [21] Malcolm, B.A., Chin, S.M., Jewell, D.A., Stratton-Thomas, J.R., Thudium, K.B., Ralston, R and Rosenberg, S (1992), “Expression and characterization of recombinant hepatitis A virus 3C proteinase”, Biochemistry, 31(13), 3358– 3363 [22] Nakano, M.M and Zuber, P (1998), “Anaerobic growth of a “strict aerobe” (Bacillus subtilis)”, Annual Review of Microbiology, 52, 165–190 [23] Ngo, H.K., Nguyen, A.L.T., Huynh, P.T.K., Nguyen, P.V., Tran, T.L., Nguyen, H.D and Phan, T.T.P (2016), “Expression and purification of listeriolysin O from Listeria monocytogenes harbouring E247M and D320K mutations in Bacillus subtilis”, Science and Technology Development Journal, 19(3), 20–31 [24] Nguyen, H.D., Phan, T.T.P and Schumann, W (2007), “Expression vectors for the rapid purification of recombinant proteins in Bacillus subtilis”, Current Microbiology, 55(2), 89–93 [25] Nguyen, N.H., Phan, T.T.P., Tran, T.L and Nguyen, H.D (2014), “Investigating the expression of GFP fused with HIS-TAG at N- or Cterminus using plasmid pHT253 and pHT254 in Bacillus subtilis”, Science and Technology Development Journal, 17(4), 5–11 [26] Peschke, U., Beuck, V., Bujard, H., Gentz, R and Le Grice, S (1985), “Efficient utilization of Escherichia coli transcriptional signals in Bacillus subtilis”, Journal of Molecular Biology, 186(3), 547–555 121 [27] Phan, T., Huynh, P., Truong, T and Nguyen, H (2017), “A generic protocol for intracellular expression of recombinant proteins in Bacillus subtilis”, Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 1586, 325–334 [28] Phan, T., Huynh, P., Truong, T and Nguyen, H (2017), “A Generic Protocol for Intracellular Expression of Recombinant Proteins in Bacillus subtilis”, Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 1586, 325–334 [29] Phan, T.T.P., Nguyen, A.L.T and Nguyen, H.D (2013), “Cloning and expression of LTB in Escherichia coli and Bacillus subtilis”, Science and Technology Development Journal, 16(1), 13–22 [30] Phan, T.T.P., Nguyen, H.D and Schumann, W (2013), “Construction of a 5’-controllable stabilizing element (CoSE) for over-production of heterologous proteins at high levels in Bacillus subtilis”, Journal of Biotechnology, 168(1), 32–39 [31] Phan, T.T.P., Nguyen, H.D and Schumann, W (2012), “Development of a strong intracellular expression system for Bacillus subtilis by optimizing promoter elements”, Journal of Biotechnology, 157(1), 167–172 [32] Phan, T.T.P., Tran, L.T., Schumann, W and Nguyen, H.D (2015), “Development of Pgrac100-based expression vectors allowing high protein production levels in Bacillus subtilis and relatively low basal expression in Escherichia coli”, Microbial Cell Factories, 14, 72 [33] Puohiniemi, R., Butcher, S., Tarkka, E and Sarvas, M (1991), “High level production of Escherichia coli outer membrane proteins OmpA and OmpF intracellularly in Bacillus subtilis”, FEMS microbiology letters, 67(1), 29– 33 [34] Qian, Y., Willeke, K., Grinshpun, S.A., Donnelly, J and Coffey, C.C (1998), “Performance of N95 respirators: filtration efficiency for airborne microbial and inert particles”, American Industrial Hygiene Association Journal, 59(2), 128–132 122 [35] Raran-Kurussi, S., Cherry, S., Zhang, D and Waugh, D.S (2017), “Removal of Affinity Tags with TEV Protease”, Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 1586, 221–230 [36] Schallmey, M., Singh, A and Ward, O.P (2004), “Developments in the use of Bacillus species for industrial production”, Canadian journal of microbiology, 50(1), 1–17 [37] Schilling, O and Overall, C.M (2008), “Proteome-derived, databasesearchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites”, Nature Biotechnology, 26(6), 685–694 [38] Schumann, W (2007), “Production of recombinant proteins in Bacillus subtilis”, Advances in Applied Microbiology, 62, 137–189 [39] Terpe, K (2003), “Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems”, Applied microbiology and biotechnology, 60(5), 523–533 [40] Thanh, H.K., Trang, P.T.P., Thuoc, T.L and Hoang, N.D (2014), “A study on using strong promoter Pgrac212 to enhance the secretional expression of reporter alpha-amylase in Bacillus subtilis”, TAP CHI SINH HOC, 36(1se), 90–96 [41] Tiwaki, S., Srivastava, R and Singh, C (2015), “AMYLASES: AN OVERVIEW WITH SPECIAL REFERENCE TO ALPHA AMYLASE”, Journal of Global Biosciences, 4(Special Issue 1), 1886–1901 [42] Toymentseva, A.A., Schrecke, K., Sharipova, M.R and Mascher, T (2012), “The LIKE system, a novel protein expression toolbox for Bacillus subtilis based on the liaI promoter”, Microbial Cell Factories, 11, 143 [43] Tran, D.T.M., Phan, T.T.P., Huynh, T.K., Dang, N.T.K., Huynh, P.T.K., Nguyen, T.M., Truong, T.T.T., Tran, T.L., Schumann, W and Nguyen, H.D (2017), “Development of inducer-free expression plasmids based on IPTGinducible promoters for Bacillus subtilis”, Microbial Cell Factories, 16(1), 130 123 [44] Truong, T.T.T., Phan, T.T.P and Nguyen, H.D (2017), “Purification of p24 protein expressed in Bacillus subtilis and evaluation of its immunogenicity in mice”, Science and Technology Development Journal - Natural Sciences, 1(T1), 69–79 [45] Vergis, J.M and Wiener, M.C (2011), “The variable detergent sensitivity of proteases that are utilized for recombinant protein affinity tag removal”, Protein Expression and Purification, 78(2), 139–142 [46] Walker, P.A., Leong, L.E., Ng, P.W., Tan, S.H., Waller, S., Murphy, D and Porter, A.G (1994), “Efficient and rapid affinity purification of proteins using recombinant fusion proteases”, Bio/technology (Nature Publishing Company), 12(6), 601–605 [47] Wanga, Q.M and Chen, S.-H (2007), “Human rhinovirus 3C protease as a potential target for the development of antiviral agents”, Current Protein & Peptide Science, 8(1), 19–27 [48] Waugh, D.S (2011), “An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags”, Protein Expression and Purification, 80(2), 283–293 [49] Waugh, D.S (2005), “Making the most of affinity tags”, Trends in biotechnology, 23(6), 316–320 [50] Wenzel, M., Müller, A., Siemann-Herzberg, M and Altenbuchner, J (2011), “Self-inducible Bacillus subtilis expression system for reliable and inexpensive protein production by high-cell-density fermentation”, Applied and Environmental Microbiology, 77(18), 6419–6425 [51] Wenzel, M., Müller, A., Siemann-Herzberg, M and Altenbuchner, J (2011), “Self-inducible Bacillus subtilis expression system for reliable and inexpensive protein production by high-cell-density fermentation”, Applied and Environmental Microbiology, 77(18), 6419–6425 [52] Xu, H., Wang, Q., Zhang, Z., Yi, L., Ma, L and Zhai, C (2019), “A simplified method to remove fusion tags from a xylanase of Bacillus sp HBP8 with HRV 3C protease”, Enzyme and Microbial Technology, 123, 15– 20 124 [53] Yansura, D.G and Henner, D.J (1984), “Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81(2), 439–443 [54] Youell, J., Fordham, D and Firman, K (2011), “Production and single-step purification of EGFP and a biotinylated version of the Human Rhinovirus 14 3C protease”, Protein expression and purification, 79(2), 258–262 [55] Zukowski, M.M and Miller, L (1986), “Hyperproduction of an intracellular heterologous protein in a sacUh mutant of Bacillus subtilis”, Gene, 46(2–3), 247–255 125 PHỤ LỤC Phụ lục Kết xác định nồng độ protein tinh phương pháp quang phổ Công thức xác định nồng độ protein: C = (A280-A320)/[Abs 0,1%] Protein His-TEV His-HRV3C His-GST-HRV3C BsLysSN-6xHisTEV C/S-GFP BsLysSN-6xHisHRV3C C/S-GFP Abs 0,1% 1,126 0,28 1,122 0,6 0,57 A280 A320 3,32 0,22 3,38 0.25 3,28 0,24 0,93 0,21 0,92 0,18 0,99 0,2 0,92 0,13 0,89 0,11 0,89 0,12 1,05 0,04 1,1 0,05 1,14 0,05 1,89 0,04 1,95 0,06 1,97 0,07 Nồng độ (mg/ml) 2,75 ± 0,04 2,68 ± 0,11 0,69 ± 0,01 1,75 ± 0,05 3,30 ± 0,04 126 Phụ lục Kết phân tích AlphaEase để xác định độ tinh protein (Chỉ số % thể độ tinh protein mục tiêu) A His-TEV B His-HRV3C C His-GST-HRC3C 127 D BsLysSN-6xHis-TEV C/S-GFP E BsLysSN-6xHis-HRV3C C/S-GFP 128 Phụ lục Kết phân tích AlphaEaseFC để so sánh biểu pha tan TEV B subtilis điều khác Điều kiện Protease Nhiệt độ (oC) Nồng độ IPTG (mM) His-TEV Thời gian (giờ) Chỉ số Area 23 364064 30 432653 37 151442 2266 0,01 3117 0,05 2967 0,1 3466 0,5 4294 4077 285313 558589 806182 985970 1119803 10 1308252 12 1181571 129 Phụ lục Kết phân tích AlphaEaseFC để so sánh biểu pha tan His-HRV3C B subtilis điều khác Điều kiện Protease Chỉ số Area 23 2737 30 2689 37 2099 808 0,01 1050 Nồng độ IPTG 0,05 2918 (mM) 0,1 4371 0,5 4254 4446 712 3594 4991 4546 4189 10 5037 12 5148 Nhiệt độ (oC) His-HRV3C Thời gian (giờ) 130 Phụ lục Kết phân tích AlphaEaseFC để so sánh biểu pha tan His-GST-HRV3C B subtilis điều khác Điều kiện Protease Chỉ số Area 23 3096 30 2642 37 3245 16311 0,01 17860 Nồng độ IPTG 0,05 20146 (mM) 0,1 20571 His-GST- 0,5 24100 HRV3C 23743 986 5016 6112 6333 6597 10 7229 12 8783 Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) 131