Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo bạc nano theo phương pháp sinh học bằng fusarium oxysporum

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM Trung tâm phát triển Khoa học Cơng nghệ Trẻ SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ Thành Đoàn TP HCM BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO BẠC NANO THEO PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC BẰNG Fusarium oxysporum NGUYỄN HOÀNG NGỌC PHƢƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 07/ 2014 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO BẠC NANO THEO PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC BẰNG Fusarium oxysporum CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI CƠ QUAN CHỦ QUẢN CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) , 07/2014 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU ỉnh sửa Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO BẠC NANO THEO PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC BẰNG Fusarium oxysporum CHỦ 07/2014 Các phƣơng pháp tổng hợp giữ ổn định hạt kim loại nano đƣợc công nghệ nano quan tâm nghiên cứu, đặc biệt phƣơng pháp tổng hợp “xanh”, thân thiện với môi trƣờng Bằng phối hợp lĩnh vực công nghệ sinh học công nghệ nano, tế bào sinh vật đƣợc sử dụng để sinh tổng hợp hạt nano thông qua trình chuyển hóa sinh học.Trong khoảng thập kỷ qua, trình tổng hợp nano kim loại ngoại bào nội bào vi nấm vi khuẩn đƣợc phát tiếp tụcđƣợc nghiên cứu Fusariumoxysporum loài vi nấm với lợi sinh tổng hợp ngoại bào hiệu suất tạo sinh khối cao, đƣợc quan tâm nghiên cứu trình sinh tổng hợp bạc nano từ sớm.Tuy nhiên, trình tổng hợp bac nano phƣơng pháp sinh học gặp nhiều trở ngại, tiêu biểu thời gian tạo sản phẩm kéo dài nồng độ bạc nano chƣa cao Chúng thử nghiệm phƣơng pháp sinh tổng hợp bạc nano chủng F oxysporum dựa phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt qua rút ngắn đƣợc thời gian cơng sức thu bạc nano INTRODUCTION Research in nanotechnology mostly deals with the synthesis and stabilization of various nanoparticles by physical and chemical processes Currently, there is a growing need to develop an eco-friendly process for nanoparticle synthesis and hence the focus turned towards “green” chemistry and bioprocesses As a result, researchers in the field of nanoparticles synthesis and assembly have turned to biological systems for inspiration This is not surprising given that many organisms, both unicellular and multicellular, are known to produce inorganic materials either intracellularly or extracellularly.In recent decade, the extracellular or intracellular biosynthesis of metal nanoparticles in fungi and bacteria have been explored and are being investigated Fusariumoxysporum, a fungus with the advantage of extracellular biosynthesis and high-efficiency biomass, is attracting studying the biosynthesis of silver nanoparticles.However, the biosynthesis of silver nanoparticles is impeded because of the time-consuming process and the low concentration of silver nanoparticles We investigated the new method of biosynthesis silver nanoparticles by culturing F oxysporum on agar surface and hence shortened the time and effort collecting i MỤC LỤC i DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vii DANH SÁCH ĐỒ THỊ, BIỂU ĐỒ viii Phần mở đầu Thông tin đề tài Mục tiêu Nội dung Sản phẩm đề tài 1 Tổng quan tài liệu Error! Bookmark not defined 1.1 Lịch sử ứng dụng tính kháng khuẩn hạt bạc 1.2 Tính chất hạt kim loại nano 1.3 1.2.1 Hiệu ứng bề mặt 1.2.2 Hiệu ứng kích thƣớc 1.2.3 Tính chất quang 1.2.4 Tính chất điện 1.2.5 Tính chất từ 1.2.6 Tính chất nhiệt 1.2.7 Tính kháng khuẩn hạt bạc nano 10 Các ứng dụng bạc nano 11 1.3.1 Trong công nghiệp điện máy 11 ii 1.4 1.5 1.6 1.3.2 Trong y dƣợc 12 1.3.3 Trong nông nghiệp 13 1.3.4 Trong sản phẩm gia dụng 15 1.3.5 Trong công nghệ xử lý nƣớc 16 1.3.6 Trong xúc tác 16 Phƣơng pháp tạo bạc nano 17 1.4.1 Phƣơng pháp khử hóa học 17 1.4.2 Phƣơng pháp vật lý 18 1.4.3 Phƣơng pháp polyol hỗ trợ nhiệt vi sóng (hóa-lý kết hợp) 19 1.4.4 Phƣơng pháp sinh học 20 Sơ lƣợc F oxysporum 24 1.5.1 Phân loại học 24 1.5.2 Đặc điểm sinh lý, sinh dƣỡng 24 1.5.3 Cơ chế sinh tổng hợp 25 Phƣơng pháp xác định tính chất kích thƣớc hạt bạc nano 27 1.6.1 Phƣơng pháp quét phổ – UV-Vis 27 1.6.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua 27 1.6.3 Kính hiển vi điện tử quét 28 Nội dung nghiên cứu 30 2.1 2.2 Thu nhận sinh khối F oxysporum 30 2.1.1 Hoạt hóa, làm giống 30 2.1.2 Khảo sát hình thái F oxysporum 31 2.1.3 Nuôi cấy lỏng thu sinh khối 31 Khảo sát phƣơng pháp sinh tổng hợp bạc nano 31 2.2.1 Phƣơng pháp tổng hợp bạc nano môi trƣờng lỏng 31 iii 2.2.2 2.3 2.4 Phƣơng pháp tổng hợp bạc nano bề mặtagar 32 Nghiên cứu phƣơng pháp sinh tổng hợp môi trƣờng rắn 33 2.3.1 Ảnh hƣởng thời gian phản ứng 33 2.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ dung dịch AgNO3 33 2.3.3 Khả ổn định dung dịch bạc nano 34 2.3.4 Hoạt tính kháng khuẩn dung dịch bạc nano 34 Mơ hình máng nghiêng sinh tổng hợp bạc nano 36 2.4.1 Cấu tạo hoạt động 36 2.4.2 37 Kết - Thảo luận 39 3.1 Quan sát hình thái F oxysporum 39 3.2 Các phƣơng pháp sinh tổng hợp bạc nano khác 41 3.3 Nghiên cứu phƣơng pháp sinh tổng hợp môi trƣờng rắn 44 3.4 3.3.1 Ảnh hƣởng thời gian phản ứng 44 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ dung dịch AgNO3 45 3.3.3 Khả ổn định dung dịch bạc nano 47 3.3.4 Hoạt tính kháng khuẩn dung dịch bạc nano 49 Mơ hình máng nghiêng sinh tổng hợp bạc nano 51 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 53 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 54 4.1 Kết luận 54 4.2 Đề nghị 55 PHỤ LỤC i TÀI LIỆU THAM KHẢO vii iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT AOAC Association of Official Analytical Chemists CFU Colony Form Unit EDTA Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid Tetra Sodium Salt EPA Environmental Protection Agency FCC Fluid Catalytic Cracking FDA Food and Drug Administration FITI Testing and Research Institute NADH Nicotinamide Adenine Dinucleotide NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate PVA Poly Vinyl Alcohol PVP Poly Vinyl Pyrrolidone SEM Scanning Electron Microscopy SIAA Singapore Industrial Automation Association TEM Transmission Electron Microscopy UV-Vis Ultraviolet-Visible v DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1 Số nguyên tử lƣợng bề mặt hạt nano hình cầu Bảng 1.2 Độ dài đặc trƣng số tính chất vật liệu Bảng 2.1 Các dung dịch bạc nano thử nghiệm kháng khuẩn với hàm lƣợng bạc khác 35 Bảng 3.1 Bảng đỉnh hấp thu cƣờng độ hấp thu dung dịch bạc nano đƣợc sinh tổng hợp môi trƣờng Malt-Yeast với phƣơng pháp khác 42 Bảng 3.2 Bảng đỉnh hấp thu cƣờng độ hấp thu dung dịch bạc nano đƣợc sinh tổng hợp với nồng độ dung dịch AgNO3 khác 45 Bảng 3.3 Hiệu suất kháng khuẩn dung dịch bạc nano 49 Bảng 3.4 Đánh giá phƣơng pháp sinh tổng hợp nuôi chai máng nghiêng 52 vi DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Các hạt bạc nano với kích thƣớc khác [4] Hình 1.2 Q trình co ngun sinh kích thích bạc nano 0,1 ppm Escherichia coli qua ảnh chụp TEM bên phải, ảnh trái đối chứng [22] 10 Hình 1.3 Các sản phẩm điện máy ứng dụng công nghệ bạc nano [27] 12 Hình 1.4 Băng gạc y tế có tẩm bạc nano [24] 13 Hình 1.5 Thuốc trừ sâu MIFUM 0,6 DD [26] 14 Hình 1.6 Bình sữa Mummybear có tráng lớp bạc nano [30] 15 Hình 1.7 Thiết bị xử lý nƣớc uống nhiễm khuẩn với cột lọc PU@Ag Polyurethan xốp tẩm bạc nano 16 Hình 1.8 Hình TEM phân bố kích thƣớc hạt bạc nano đƣợc chế tạo xung laser 120 fs ns [1] 19 Hình 1.9 Tinh thể bạc nano vi khuẩn Pseudomonas stutzeri AG259 22 Hình 1.10 Cơ chế tổng hợp bạc nano vi khuẩn B.licheniformis [16] 23 Hình 1.11 Sợi nấm F oxysporum mơi trƣờng agar [31] 24 Hình 1.12 Hình thái sợi đa bào, bào tử hình liềm bào tử hình cầu nấm F.oxysporum 25 Hình 1.13 Giả thuyết chế trình sinh tổng hợp bạc nano F oxysporum] 26 Hình 2.1 Mơ hình hoạt động hệ thống máng nghiêng 36 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc F oxysporum ni mơi trƣờng rắn Malt-Yeast (A) hình từ Internet (B) [31] 39 Hình 3.2 Hình thái F oxysporum dƣới kính hiển vi 40 Hình 3.3 Dung dịch AgNO3 phƣơng pháp sinh tổng hợp bạc nano khác 41 Hình 3.4 Ảnh TEM hạt bạc nano đƣợc sinh tổng hợp với AgNO3 8mM đồ thị phân bố hạt bạc nano 47 Hình 3.5Mơ hình sinh tổng hợp bạc nano môi trƣờng agar dạng máng nghiêng sau lắp ráp (A) phủ agar (B), trải nấm F oxysporum lên bề mặt cho AgNO3 chảy qua (C) 51 vii [23] Clements, M (2009), Pullet production gets nano-silver lininghttp://www.wattagnet.com/Pullet_production_gets_nanosilver_lining.aspx [24] Công ty CP Dƣợc Danapha Ứng dụng kỹ thuật nano y dượchttp://www.danapha.com/htmls/news_detail.aspx?id=0c5f49b06e91-4421-a359-5456838b1cd6 [25] Nguyễn Hoàng Hải lọaihttp://vietsciences.free.fr/ [26] Nongnghiep.vn (2008), Thuốc BVTV nano bạc - Một tiến hoá lý VNhttp://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/45/45/6301/Thuoc-BVTVnano-bacMot-tien-bo-cua-hoa-ly-VN.aspx [27] Samsung Electronics (2006), http://www.samsung.com/sg/consumer/learningresources/silvernano/sil vernano/washingmachine.html [28] Tuấn Hà (dịch) (2009), VietNamNet.vn, Bạc y học dân gian Đông Tâyhttp://www.tin247.com/ky_1_bac_trong_y_hoc_dan_gian_dong_ta y-12-21435933.html [29] Tuấn Hà (dịch) (2009), Bạc y học ngày nayhttp://www.tinmoi.vn/Bac-trong-y-hoc-ngay-nay-0733279.html [30] Vnexpress.net (2008), Đồ dùng đựng thức ăn cho trẻ hiệu Mummy Bearhttp://vnexpress.net/gl/doi-song/mua-sam/2008/11/3ba0861f/ [31] Wikipedia.org Fusarium oxysporumhttp://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum (2007), Hạt nano kim ix (The th International Workshop on Advanced Materials Science And Nanotechnology) Facilitating the process of culturing Fusarium oxyporum and harvesting silver nanoparticles by agar-supporter method ABSTRACT: The development of reliable, eco-friendly processes for the synthesis of nanomaterials is an important aspect of nanotechnology today The biosynthesis of silver nanoparticles carried out by fungus Furasium oxysporum has recently announced by Brazilian scientists The aqueous silver ions when exposed to the fungus F oxyporum are reduced in solution, thereby leading to the formation of an extremely stable silver hydrosol It is believed that the reduction of the metal ions occurs by an enzymatic process, thus creating the possibility of developing a rational, fungal-based method for the synthesis of nanomaterials over a range of chemical compositions, which is currently not possible by other microbe-based methods In this article, we propose the new method to facilitate the process of culturing F oxyporum and harvesting silver nanoparticles This method using agar-supporter is quite simple, take less effort, and can be industrialized The silver nanoparticles are in the range of 3-10 nm (diameter average: 6.6 0.3nm) in dimensions and are stabilized in solution by proteins secreted by the fungus (above months) The concentration of biosynthesized silver hydrosol was 33.9 ppm The effect of bacteria resistance on Staphylococcus aureus is 94.35% within exposed minute Keywords: oxyporum Silver nanoparticles; Biosynthesis; Agar-supporter; Fusarium INTRODUCTION: Research in nanotechnology mostly deals with the synthesis and stabilization of various nanoparticles by physical and chemical processes Currently, there is a growing need to develop an eco-friendly process for nanoparticle synthesis and hence the focus turned towards “green” chemistry and bioprocesses As a result, researchers in the field of nanoparticles synthesis and assembly have turned to biological systems for inspiration This is not surprising given that many organisms, both unicellular and multicellular, are known to produce inorganic materials either intracellularly or extracellularly [1,2] Klaus-Joerger and coworkers have shown that the bacterium Pseudomonas stutzeri AG259, isolated from a silver mine, when placed in a concentrated aqueous solution of AgNO -3, played a major role in the reduction of the Ag+ ions and the formation of silver nanoparticles of well-defined size and distinct topography within the periplasmic space of the bacteria [3-5] Absar Ahmad and co-workers have demonstrated the ability of reduction Ag+ to Ag of the fungus F oxysporum [6] Nelson Durán and co-worker have also explained the mechanistic aspects of biosynthesis of silver nanoparticles by several Fusarium oxysporum strains [7] To develop a process producing nanoparticles at large-scale, There is a vital need to facilitate the process using F oxysporum biosynthesized silver nanoparticles that has still taken a lot of efforts We grew F oxysporum on agar and added x AgNO-3 solution simultaneously to provide the nutrition to the fungus through their roots inside agar supporter as well as to carry out the reduction reaction making of silver nanoparticles EXPERIMENTATION: Fusarium oxysporum was provided by VTCC (Vietnam Type Culture Collection), the liquid culture concluded: Malt extract 5g/L; Yeast extract 2g/L; (and agar 20g/L with agar culture) 1.Comparing the effect of different methods in silver nanoparticles biosynthesis The biosynthesis of silver nanoparticles carried out by fungus F oxysporum follows three methods simultaneously Method A: This methodology described previously was followed [6] Briefly, approximately 10 g of F oxysporum wet biomass was added in a erlenmeyer flask containing 100 mL of AgNO-3 solution (10-3M) and the reaction was carried out in the dark, shook at 120 rpm at 37 °C After days of incubation, the biomass was removed by filtering (0.25 m pores) and the absorptions were measured by using a UV-Vis spectrophotometer Method B: 10 g of F oxysporum wet biomass was shaken with 50ml distilled water for hours, and then centrifuged at 1000rpm, 10minutes, filtered the supernatant through pore 0.25µm Add 50 mL of AgNO-3 solution (2.10-3M) with the filtered solution After days of incubation, the sample was measured by using a UV-Vis spectrophotometer Method C: When F oxysporum grew well all over the surface of agar culture (20x40cm - equivalent 2g F oxysporum wet biomass),20mlAgNO-3 solution (103 M) was added and the reaction was carried out in the dark After days of incubation, the sample was measured by using a UV-Vis spectrophotometer Every method, we keep constantly the ration: Biomass (g) : Volume of AgNO 1mM (mL)= 1:10 Figure 1.agar – supporter filled by F oxysporum biomass in method C Measuring the silver biosynthesis intensity during period of reaction following method C In the experimentation following method C, aliquots of the reaction solution were removed and subjected to UV-Vis periodically within reaction days xi Investigating the influence of concentration of AgNO3 solution on silver biosynthesis In the experimentation following method C, we changed the concentration of AgNO3 solution from 2mM to 10mM After days of reaction, every samples were used for UV-Vis We also analyzed two samples 2mM and 10mM in order to evaluate fairly the size of silver nanoparticles in different concentration of AgNO The silver nanoparticles films were also formed on carbon-coated copper TEM grids and analyzed by transmission electron microscopy (TEM) on a JEM 1400 instrument at a voltage of 100 kV Evaluating the quality of silver nanoparticles following method C Silver nanoparticles were biosynthesized in water environment and stabilized by excreted proteins of the fungus After months, the stored sample and the fresh one were measured by UV-Vis to check their stability We investigated the effect of silver nanoparticles biosynthesized by method C on bacterium Staphylococcus aureus following Colony Count Method through the below equation: η= N1-N2 x 100% N1 Where η is the percentage of bacterial reduction, N1 is the number of surviving bacterial colonies from the control sample, and N2 is the number of surviving colonies from test sample After determining the concentration of silver nanoparticles (ppm) in solution biosynthesized by method C, we diluted following Table Every sample were spread on Petri plate containing Meat extract - Pepton agar culture (Meat extract 3g/L, pepton 10g/L, NaCl 5g/L, agar 20 g/L) and incubated in 36h, at 30oC Then, we count the colonies on every samples and built up a graph of relationship between ppm and percentage reduction of S aureus Table Diluting the silver hydrosol biosynthesized following method C Unit: microlitter - µl Samples C1 C2 C3 C4 C0 Volume of silver hydrosol 1000 750 500 250 Sterile distilled water 250 500 750 1000 Bacterium broth 1000 1000 1000 1000 1000 xii RESULTS AND DISCUSSION: 1.Comparing the effect of different methods in silver nanoparticles biosynthesis Control Method A Method B Method C Sample of Method Control Figure Picture of erlenmeyer containing the silver hydrosol biosynthesized by F oxysporum following the methods Peaks (nm) Absorbance 0 A 375 1.43 B 376 1.66 C 377 2.30 Figure UV-Vis spectrum of the silver hydrosol biosynthesized by F oxysporum following the different methods A, B, C After about reaction days in AgNO3 solution with F oxysporum (method A and C) or their extracellular proteins (method B), the initial transparent solution changed into brown from the lightest sample A to the darkest sample C They all showed the present of silver nanoparticles because of the reduction ion Ag+ Ag0 based on the extracellular proteins of F oxysporum [1] The diagram of UV-Vis spectrum in Figure showed the peaks of three samples around 380nm This gave an evident for the present of silver nanoparticles in three ones, but the sample A was unclear Moreover, the absorbance in sample C was the highest (Absorbance: 2.30) This proved the concentration of silver nanoparticles in sample C was the most Using the equivalent fungus biomass in three methods, we got the best result in method C Meanwhile, following the method C, we saved a lot of efforts, raw materials and time for the step of harvesting biomass Measuring the silver biosynthesis intensity during period of reaction following method C xiii Figure UV-Vis spectrum of the silver hydrosol at different times of reaction UV-Vis spectrum in Figure showed two samples had a peak at range 380nm (eclipsed area) This proposed the present of silver nanoparticles These samples were the solutions after days (peak: 377nm; Abs: 2.37) and days (peak: 380nm; Abs: 2.71) in reaction Hence, after days exposed in AgNO solution, F oxysporum could biosynthesize silver nanoparticles They maybe needed time to arrange their gene for NO3- metabolism Investigating the influence of concentration of AgNO3 solution on silver biosynthesis 2mM Abs 4mM 6mM 8mM 10mM 250 350 450 550 650 750 Wavelength (nm) Figure UV-Vis spectrum of the silver nanoparticle solutions of synthesized by different concentrations of AgNO3 UV-Vis spectrum in Figure showed two samples with peaks at range 380nm (eclipsed area) This proposed the present of silver nano particles These peaks are 374nm (in AgNO3 2mM solution), 375nm (4mM), 376 nm (6mM), 378nm (8mM) and 378nm (10mM) The absorbance increased following the concentration of AgNO3 solution However, the higher the concentration of AgNO3 solution is, the more extensive the peak of with is It suggested the diameter of silver xiv nanoparticles was smaller at the lower concentration of AgNO solution than that at the higher one TEM analysis proved our hypothesis about the relationship between the concentration of AgNO3 solution and the diameter of silver nanoparticles A AgNO mM AgNO 32 mMdaverage dtb: 6,6 : 6.6 0.3 nm 0,3 B AgNO3 mM daverage: 10.4 1.0 nm Figure 6.TEM micrographs recorded from drop-coated films of the different concentration of AgNO3 solutions incubated with F oxysporum and their particle size distribution histograms of biosynthesized silver nanoparticles determined from TEM images (A) AgNO3 mM (B) AgNO3 mM The scale bar corresponds to 50 nm Evaluating the quality of silver nanoparticles following method C xv Figure UV-Vis spectrum to examine the stability of the biosynthesized silver hydrosol after months The silver hydrosol biosynthesized in distilled water stored in normal condition without stabilizer After months, its UV-Vis spectrum gave a similar with the fresh sample with no evidence of flocculation of the particles They all had the peaks in range of 380nm, a sign leading the present of silver nanoparticles Some authors propose that the reduction of the silver ions in F oxyporum occurs by extracellular enzymatic proteins and several naphthoquinones and anthraquinones with excellent redox properties In this process, they can stabilize silver nanoparticles by their excreted protein C1 33.90 1.88 * 105 94.35 C2 25.43 2.22 * 105 93.35 C3 16.95 3.89 * 105 88.32 C4 8.48 6.80 * 105 79.60 C0 3.33 * 105 Co ntrol C Percentage reduction of S aureus (%) Density of bacterium (CFU/ml) Concentration of silver (ppm) Samples 9,60 % 8,32% 3,35% 4,35% C C C Figure Graph and results of the percentage 2reduction of S aureus when C exposed with the biosynthesized siver hydrosol within minute xvi The silver nanoparticles can resist S aureus completely if we increase the concentration of silver hydrosol We can solve this matter by some ways: evaporating and condensing the silver hydrosol or increasing the ration of Biomass (g): volume of AgNO3 CONCLUSIONS: - The new method of nano-size silver biosynthesis on agar is more effective than in liquid environmet It achieves better results, saves raw materials, efforts and time We hope to design a continous system which can harvest silver hydrosol haft-automatically based on this idea - The biosynthesis happened after days F.oxysporum was exposed with AgNO solution There a (tỉ lệ thuận) relationship between the concentration of the AgNO solution and the diameter of silver nanoparticle The higher the former is, the larger the latter is The AgNO3 2mM solution giving 6.6 0.3 nm silver nanoparticles (in average) should be used in biosynthesized with F oxysporum REFERENCES [1] K Simkiss, K.M Wilbur, Biomineralization, Academic Press, New York, 1989 [2] S Mann (Ed.), Biomimetic Materials Chemistry, VCH, Weinheim, 1996 [3] T Klaus, R Joerger, E Olsson, C.G Granqvist, Proc.Natl Acad Sci USA 96 (1999) 13611 [4] T Klaus-Joerger, R Joerger, E Olsson, C.G Granqvist, Trends Biotechnol 19 (2001) 15 [5] R Joerger, T Klaus, C.G Granqvist, Adv Mater 12 (2000) 407 [6] Absar Ahmad, Priyabrata Mukherjee, Satyajyoti Senapati, Deendayal Mandal, M Islam Khan, Rajiv Kumar, Murali Sastry, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 28 (2003) [7] Nelson Durán, Priscyla D Marcato, Oswaldo L Alves, Gabriel IH De Souza, Elisa Esposito, Journal of Nanobiotechnology (2005), 3:8 CONTACT: Nguyen Hoang Ngoc Phuong 227 Nguyen Van Cu Ward Phu Nhuan Dist HCMC 0983732601 xvii (Kỷ yếu Hội Nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc Khu vực phía Nam lần 1) Fusarium oxysporum , Nguyễn Thị Mỹ Lan, Lê Thị Mỹ Phƣớc Khoa Sinh - Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM MỞ ĐẦU Các chủng vi sinh vật gây bệnh ngày trở nên kháng thuốc, điều thúc đẩy nhà khoa học tìm loại chất kháng khuẩn hiệu hơn, không gây tác dụng phụ lên người sử dụng Bạc nano (những hạt bạc có kích thước siêu nhỏ, phần triệu mét) tỏ lựa chọn tối ưu.Ở kích thước nano, bề mặt riêng lớn, nên hạt bạc nano có tính chất điện, quang từ thay đổi mạnh, chúng tạo oxygen hoạt tính từ khơng khí nước từ phá hủy màng tế bào, vơ hiệu hóa enzyme cần cho trình sinh dưỡng vi khuẩn Đặc biệt, bạc nano kiểm chứng không gây độc người [4,8,9] Việcchế tạo bạc nano thực phương pháp như: khử hóa học, vật lý, hóa lý [2,6] Nhưng số phương pháp cịn hạn chế quy mơ sản xuất, hóa chất đắt tiền phóng xạ ảnh hưởng đến môi trường Hiện nhà nghiên cứu quan tâm đến tổng hợp sinh học, phương pháp thực đơn giản thân thiện với môi trường, tạo hạt nano với tiêu chuẩn tốt (khoảng 2-5 nm), hạt nano ổn định quy trình tổng hợp polymer sinh học (chính protein vi sinh vật) sản xuất với quy mơ công nghiệp [1,3,5,7] Trong đề tài này, tiến hành khảo sát ảnh hưởng số điều kiện (môi trường phản ứng, thời gian phản ứng, nồng độ AgNO3) đến trình sinh tổng hợp bạc nano, kiểm tra khả ổn định, hoạt tính kháng khuẩn dung dịch bạc nano sinh tổng hợp từ chủng F oxysporum nhằm tìm điều kiện, phương pháp tổng hợp bạc nano tối ưu có khả phát triển lên quy mô công nghiệp NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Giống vi sinh vật Chủng Fusarium oxysporum (Viện Bảo Tàng Giống Chuẩn Quốc Gia – Hà Nội) dùng để sinh tổng hợp bạc nano Chủng Staphylococus aureus (Phịng thí nghiệm Chuyển Hóa Sinh Học – ĐH Khoa Học Tự Nhiên) dùng để khảo sát khả kháng khuẩn bạc nano 2.2 Phƣơng pháp 2.2.1 Khảo sát phƣơng pháp sinh tổng hợp bạc nano khác Cách A: Chủng Fusarium nuôi cấy môi trường Malt-Yeast (Malt extract: 20g/L, Yeast extract: g/L) khoảng ngày ly tâm thu 10g sinh khối, rửa qua nước cất, cho vào dung dịch 100ml AgNO3 1mM, ủ tối nhiệt độ phòng, sau ngày hút dịch đo phổ UV-Vis kiểm tra diện bạc nano Cách B: 10g sinh khối Fusarium cho vào 100ml nước cất lắc 150rpm 4h Ly tâm, lọc qua lỗ 250nm lấy nước lọc cho vào 100ml AgNO3 2mM ủ tối nhiệt độ phòng, sau ngày hút dịch đo phổ UV-Vis Cách C: Cấy khoảng 2g Fusarium mọc kín khoảng 20x15 cm bề mặt mơi trường Malt-Yeast rắn (môi trường lỏng bổ sung 20% agar), cho 20ml dung dịch AgNO 1mM vào, ủ tối nhiệt độ phòng, ngày hút dịch đo phổ UV-Vis Mẫu O (đối chứng): Trộn 100 ml nước cất hòa với 100 ml AgNO3 mM ủ tối nhiệt độ phòng, ngày hút dịch đo phổ UV-Vis 2.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian phản ứng đến việc tổng hợp bạc nano Thực thí nghiệm 2.2.1 cách C, cách khoảng thời gian ngày hút dịch đo phổ UV-Vis 2.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ dung dịch AgNO3 đến việc tổng hợp bạc nano Thực thí nghiệm 2.2.1 cách C, thay đổi nồng độ dung dịch AgNO từ mM, mM, mM, mM, 10 mM xviii 2.2.4 Kiểm tra khả ổn định dung dịch bạc nano đƣợc tổng hợp phƣơng pháp sinh học Chụp phổ UV-Vis dung dịch thu từ thí nghiệm 2.2.1 cách C Lưu mẫu Sau tháng, chụp phổ UV-Vis lần để kiểm tra độ ổn định dung dịch bạc nano 2.2.5 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dung dịch bạc nano Dung dịch bạc nano sinh tổng hợp gửi mẫu xác định hàm lượng bạc Trung tâm phân tích CASE Đem pha loãng để khảo sát khả kháng khuẩn Staphylococus aureus phương pháp trải đĩa, đếm số khuẩn lạc KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát phƣơng pháp sinh tổng hợp bạc nano khác Đối A chứng B C Hình Phổ UV-Vis ảnh dung dịch bạc nano với phương pháp sinh tổng hợp khác Sau khoảng đến ngày tiếp xúc với F oxysporum (sinh khối hay nước lọc sinh khối), dung dịch AgNO3 môi trường phản ứng sinh tổng hợp bạc nano chuyển sang màu vàng nâu, + khử ion Ag Ag tạo bạc nano tác dụng enzyme ngoại bào F.oxysporum tiết môi trường nuôi [1] Ảnh dung dịch thu sau phản ứng cách C đậm cách A, B cho biết lượng bạc sinh tổng hợp tạo nhiều Dựa vào đồ phổ UV-Vis Hình cho thấy phổ mẫu có đỉnh nhơ cao vùng 380 nm, mẫu (đỉnh 375 nm), mẫu (đỉnh 376 nm), mẫu (đỉnh 377 nm), xác định có diện bạc nano Độ hấp thu đỉnh nhô cao mẫu lớn đáng kể so với mẫu mẫu 3, điều chứng tỏ lượng bạc nano tạo mẫu nhiều xix 3.2 Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian phản ứng đến việc tổng hợp bạc nano 4.5 ngày 3.5 ngày Abs 3 2.5 1.5 0.5 250 350 450 550 650 750 Wavelength (nm) Hình Phổ UV-Vis dung dịch bạc nano theo thời gian phản ứng Đồ phổ UV-Vis Hình cho thấy có phổ có đỉnh hấp thu nhô cao vùng 380 nm (vùng khoanh trịn) xác nhận có diện bạc nano Đó phổ dung dịch sau thời gian ngày (đỉnh hấp thu 377 nm, cường độ hấp thu 2.37) ngày (đỉnh hấp thu 380 nm, cường độ hấp thu 2.71) Như vậy, dung dịch AgNO3 phản ứng môi trường nuôi cấy F oxysporum sau ngày trở lên sinh tổng hợp dung dịch bạc nano, điều giải thích chủng cần thời gian để tái xếp lại cấu trúc gen, tham gia vào trình sử dụng NO3 3.3 Kết khảo sát ảnh hƣởng nồng độ dung dịch AgNO đến việc tổng hợp bạc nano 2mM Phổ UV-Vis Hình cho thấy tất phổ có đỉnh nhô cao vùng 380 6mM nm, xác định có diện 8mM bạc nano Các đỉnh nhô cao 10mM nồng độ AgNO3 khác là: mM (đỉnh 374 nm), mM (đỉnh 375 nm), mM (đỉnh 376 nm), mM (đỉnh 378 nm), 10 mM (đỉnh 378 nm) Cường độ hấp thu đỉnh tăng dần theo gia tăng nồng độ dung dịch 750 AgNO Abs 4mM 250 350 450 550 650 Wavelength (nm) Hình Phổ UV-Vis dung dịch bạc nano tổng hợp từ với nồng độ AgNO3 khác Khi nồng độ AgNO3 tăng độ hấp thu đỉnh lớn cho thấy lượng bạc nano sinh nhiều, nhiên nồng độ AgNO3 thấp đỉnh hấp thu nhọn hơn, điều có khả hạt bạc nano sinh nồng độ thấp có kích thước nhỏ xx 35 30 AgNO AgNO 23 25 mM mMdtbd: 6.6 : 6,6 tb tần số (%) 0.3 20 0,3 15 10 5 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 đƣờng kính (nm) 35 AgNO3 30 mM tần số (%) 25 20 dtb: 10.4 1.0 15 10 5 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 đƣờng kính (nm) Hình Ảnh TEM hạt bạc nano sinh tổng hợp với AgNO đồ thị phân bố hạt bạc nano Ảnh chụp TEM hạt bạc nano chứng minh nhận xét ban đầu xác, với nồng độ AgNO3 cao lượng bạc nano sinh nhiều, kích thước hạt trung bình lớn độ phân bố kích thước hạt rộng Với nồng độ AgNO 8mM kích thước hạt trung bình 10.4 nm độ phân bố kích thước hạt – 20 nm, cịn với nồng độ AgNO3 2mM kích thước hạt trung bình 6.6 nm độ phân bố kích thước hạt – 28 nm xxi 3.4 Kết kiểm tra khả ổn định dung dịch bạc nano đƣợc tổng hợp phƣơng pháp sinh học 2.5 Abs 1.5 Chụp phổ UV-Vis mẫu dung dịch bạc nano: tạo thành sau thời gian tháng Dung dịch D2 Dung dịch D1 0.5 350 450 550 650 750 Wavelength (nm) Hình 5.Phổ UV-Vis để kiểm tra khả ổn định dung dịch bạc nano Hiệu suất kháng khuẩn (%) 100 Đồ phổ UV-Vis Hình cho thấy phổ dung dịch bạc nano lúc tạo thành (D1) sau thời gian tháng (D2) có đỉnh nhơ cao khoảng 375 nm xác nhận có diện bạc nano, phổ gần giống nhau, chứng tỏ dung dịch bạc nano có khả ổn định tốt môi trường nước nhờ polymer sinh học (chính protein vi sinh vật) giúp ổn định, tránh tượng kết tụ hạt bạc nano Dung dịch bạc nano sinh tổng hợp với chủng F.oxysoprum có khả ổn định tốt thời gian tháng (không bổ sung chất ổn định) Đây ưu điểm phương pháp sinh học 80 60 40 20 0 10 15 20 25 Hàm lƣợng Ag (ppm) 30 35 3.5 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dung dịch bạc nano với 40 nồng độ khác chủng Staphylococus aureus Hình cho thấy khả kháng khuẩn dung dịch bạc nano tăng theo hàm kháng khuẩn theo hàm lượng Ag lượng bạc dung dịch: hiệu suất kháng khuẩn thấp 79.60% nồng độ Ag (8.48 ppm) cao 94.35% nồng độ Ag (33.9 ppm) Hình Đồ thị biểu diễn hiệu suất 4.KẾT LUẬN: Trên sở thực mục tiêu nghiên cứu đề ra, đề tài đạt số kết sau: - Sinh tổng hợp bạc nano với chủng F oxysporum nuôi cấy môi trường rắn Malt-Yeast phương pháp hiệu quả, tiết kiệm thời gian cơng sức - Q trình sinh tổng hợp bạc nano xảy sau ngày sinh khối F.oxysporum tiếp xúc với dung dịch AgNO3 - Nồng độ AgNO3 ảnh hưởng đáng kể đến sinh tổng hợp bạc nano, nồng độ AgNO3 cao lượng bạc nano sinh nhiều hơn, nồng độ AgNO thấp tạo hạt bạc nano có kích thước nhỏ Nồng độ AgNO3 2mM nồng độ thích hợp để thu lượng lớn AgNO có kích cỡ nhỏ, trung bình - Dung dịch bạc nano sinh tổng hợp từ chủng F oxysoprum có khả ổn định tốt thời gian tháng (không bổ sung chất ổn định) - Dung dịch bạc nano sinh tổng hợp từ chủng F oxysoprum có hoạt tính kháng khuẩn (chủng S aureus) tốt, hiệu suất kháng khuẩn 94.35% với hàm lượng bạc dung dịch bạc nano 33.9 ppm TÀI LIỆU THAM KHẢO Ahmad A et al, 2003 Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using the fungus Fusarium oxysporum Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 28, p.313–331 xxii Abhilash S., Joydeep, 2004 Nanoparticles for nanotechnology, Journal of physics science and Idea, p.50-57 Basavaraja S., Balaji S.D., Lagashetty A., Rajasab A., Venkataraman A., 2007 Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using the fungus Fusarium semitectum, Materials Research Bulletin 43, p 1166-1167 Demling, R.H., Burrel R.E., 2006 The benifical effects of nanocrystalline siver as a topical antimicrobial agent, Leadership Medica16(7), p Souza and Elisa Esposito, 2005 Mechanistic aspects of biosynthesis of silver nanoparticles by several Fusarium oxysporum strains, Journal of Nanobiotechnology, p 6 Klabunde, K J., Wiley 2001 “Nanoscale Materials in Chemistry”, p.23 Musarrat J., Al-Khedhairy A A., Singh B.R., Diwedi S and Azam A., 2009 Biosynthesis and Characterization of Protein-Capped Silver Nanoparticles using Fungus Fusarium oxysporum f sp ciceri and their Antibacterial Potential Nano conference p 250 Shrivastava S et al 2007 Characterization of enhanced antibacterial effects of novel silver nanoparticles, Nanotechnology 18, p 225-103 Wang S et al 2007 Antibacterial activity of nano-SiO2 Antibacterial agent grapted on wool surface, Surface and Coatings TechnologyVolume 202, Issue 3, December 2007, p 460-465 Investigating the biosynthesis of silver nanoparticles by Fusarium oxysporum Nguyen Hoang Ngoc Phuong, Đoan Quang Nhat, Nguyen Thi My Lan, Le Thi My Phuoc Faculty of Biology – University of ScienceHCMCity Abstract: The development of reliable, eco-friendly processes for the synthesis of nanomaterials is an important aspect of nanotechnology today Beside the physical or chemical methods of synthesis of silver nanoparticles, the biosynthesis carried out by fungus or bacteria is a very new direction The biosynthesis of silver nanoparticles by F.oxysporum was exposed with solution AgNO3 1mM after days When increasing the concentration of solution AgNO 3, the quantity of silver nanoparticles also raised However, at the low concentration of solution AgNO3, the size of silver nanoparticles was smaller The silver nanoparticles were in the range of 3-10 nm (average: 6.6 0.3 nm) in dimensions and stabilized above months The concentration of biosynthesized silver hydrosol was 33.9 ppm The effect of resistance on Staphylococcus aureus is 94.35% within exposed minute Keywords: silver nanoparticles, biosynthesis, Fusarium oxysporum Thông tin liên lạc: Nguyễn Hoàng Ngọc Phương 227 Nguyễn Văn Cừ Phường Quận TP.HCM Email: nhnphuong@hcmus.edu.vn xxiii