Nghiên cứu tạo hydro h2 từ bã mía bằng phương pháp lên men kỵ khí

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU TẠO HYDRO (H2) TỪ BÃ MÍA BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN KỴ KHÍ Chủ nghiệm đề tài: NGUYỄN DƯƠNG TÂM ANH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2016 TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Đề tài “Nghiên cứu tạo khí hydro từ bã mía phương pháp lên men kỵ khí” nằm xu "sản xuất lượng xanh từ chất thải" có ý nghĩa vừa bảo vệ môi trường vừa tạo nguồn nhiên liệu Nội dung nghiên cứu gồm có thu nhận hỗn hợp vi sinh vật có khả lên men kỵ khí sinh khí hydro (H2) từ nguồn bùn phân động vật, tiền xử lý bã mía thành nguồn chất dễ lên men phương pháp hóa lý khảo sát khả tạo khí H2 từ bã mía hỗn hợp vi sinh vật (VSV) kỵ khí qui mơ phịng thí nghiệm sử dụng chai serum 120 ml fermenter 3l 15 hỗn hợp vi sinh vật có khả lên men tạo H2 thu nhận từ 15 mẫu bùn thải kỵ khí gồm bùn thải từ cống rãnh sinh hoạt thuộc nội đô thành phố, bùn sản xuất từ nhà máy, từ bể biogas, phân động vật bùn từ nhà máy xử lý thải Trong việc tiền xử lý nguồn thải nhằm gia tăng khả thu nhận VSV lên men tạo H2, phương pháp sốc nhiệt cho kết tốt so với phương pháp ngâm acid Nhiệt độ 80oC 15 - 30 phút điều kiện xử lý nhiệt thích hợp cho đa số mẫu bùn (9/15 mẫu) với hàm lượng H2 435 - 877 ml/l hiệu suất sinh H2 đạt 1,02 - 1,60 mol H2/mol glucose Tất 15 hỗn hợp chủng VSV cho hiệu sinh H2 cao sau 48h lên men nhiệt độ phòng (28 - 32oC), pH 6,5 với nồng độ glucose nồng độ - 7,5 g/l cao nấm men nồng độ 11,5 g/l Hàm lượng H2 tích lũy hỗn hợp vi sinh vật dao động từ 400 - 900 ml H2/l với hiệu suất sinh H2 đạt 0,84 - 1,60 mol H2/mol glucose Các loài vi khuẩn chiếm ưu diện hỗn hợp vi sinh vật xác định phương pháp PCR – DGGE giải trình tự DNA Enterococcus, Escherichia/Shigella Clostridium Thành phần hóa học bã mía điều kiện nghiên cứu có chất rắn tổng 93,01%, độ ẩm 6,99%, carbohydrate 89,13%, 1,55 % tro thành phần khác 2,79% Phương pháp tiền xử lý bã mía thành chất dễ lên men sử dụng H2SO4 lỗng thích hợp so với dùng NaOH điều kiện xử lý: tỉ lệ bã mía : H2SO4 2% (w/v) = 1:10, 15 phút, 121oC, atm CMS chủng hỗn hợp có khả lên men tốt dịch bã mía qua tiền xử lý H2SO4 với hàm lượng H2 tích lũy hiệu suất sinh H2 300,136 ± 3,964 ml H2/l môi trường Kết tối ưu điều kiện nuôi cấy phương pháp bề mặt đáp ứng i RSM đưa giá trị tối ưu cho thơng số có ảnh hưởng quan trọng lên trình lên men sinh H2 gồm: nồng độ đường: 17,75 g/l, pH ban đầu: 6,3; tỉ lệ nạp giống 6,6 ml/ 40 ml môi trường (16,5%) với sai khác kết hàm lượng H2 tích lũy lý thuyết thực nghiệm 4% Kết lên men hệ thống fermentor 3l với thể tích môi trường 2l với giá trị tối ưu thông số nuôi cấy thu hàm lượng H2 tích lũy 2,444 l H2/l mơi trường ii SUMMARY OF RESEARCH CONTENT The topic “Biohydrogen production from sugarcane bagasse (SCB) by anaerobic dark fermentation” in trend "green energy production from waste" means both to protect the environment and to create sustainable fuel sources Research contents include obtaining microbial mixtures capable of anaerobically producing hydrogen (H2) from the sludge and animal sources, pretreating SCB into fermentable carbon sources by easy physicochemical methods and investigating the potential of fermetative H2 production from bagasse by the anaerobic microbial mixtures in laboratory scale using 120 ml serum bottles and 3l fermenter Fifteen microbial mixtures capable of fermenting H2 were collected from 15 samples including anaerobic sludge from the municipal sewage sludge, production plants, biogas digester, animal manure and wastewater treatment plants In the pretreatment of waste source to increase the ability to obtain the H2-producing mixtures, heat shock method gives better results than the acid soaking method In the method, 80oC for 15 to 30 minutes is suitable processing conditions for the majority of the sludge (9/15 samples) with H2 concentration is 435 - 877 ml/l and H2 yield of 1,02 - 1,60 mol H2/mol glucose All 15 mixed strains showed the highest efficiency of H2 production after 48 hours of fermentation at room temperature (28 - 32oC), pH 6,5 at a glucose concentration of 7,5 g/l and yeast extract of 1-1,5 g/l Accumulated H2 contents of the mixtures ranged from 400 - 900 ml H2/l with H2 yield of 0,84 to 1,60 mol H2/mol glucose The predominant bacteria present in the mixture of microorganisms was determined by PCRDGGE method-sequencing DNA can be Enterococcus, Escherichia/Shigella and Clostridium The chemical composition of SCB in this study is 93,01% of total solids, 6,99% of moisture, 89,13% of carbohydrate, ash of 1,55% and other components of 2,79% Pretreatment methods of SCB into fermentable substrate using dilute H2SO4 is more effective than using sodium hydroxide with the treatment conditions of the ratio of SCB: H2SO4 2% (w/v) = 1:10, 15 minutes, 121oC, atm in a autoclve iii CMS is the mixed strain capable of the best H2 production from H2SO4-pretreated SCB with the highest accumulate H2 content of 300,136 ± 3,964 ml H2/l The optimization of cultivation conditions by reponse surface methodology has shown optimal values of the parameters which have very importantly influence on H2 fermentation including the glucose concentration of 17,75 g/l, initial pH of 6,3; inoculum ratio of 6,6 ml/40 ml medium (16,5%) with differences in the theorical and experiment levels of H2 results accumulated of 4% Result of H2 fermentation in 3l fermentor with the medium volume of 2l in the optimized cultivation conditions is 2,444 l H2/l iv MỤC LỤC TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU i SUMMARY OF RESEARCH CONTENT iii MỤC LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii DANH SÁCH BẢNG xiv DANH SÁCH HÌNH xvi DANH SÁCH ĐỒ THỊ xvii PHẦN MỞ ĐẦU 1 Thông tin đề tài Mục tiêu Nộidung 3.1 Nội dung thực 3.2 Sản phẩm 4 Kinh phí tốn .5 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hiện trạng nguồn lượng sinh khối từ bã mía Việt Nam 1.2 Đặc điểm lý hoá bã mía 1.3 Các phương pháp tiền xử lý bã mía .9 1.3.1 Phương pháp vật lý 1.3.2 Phương pháp hóa học .9 1.3.2.1 Thủy phân base .9 1.3.2.2 Thủy phân acid .10 1.3.3 Phương pháp thủy nhiệt 12 1.3.4 Phương pháp sinh học 12 1.4 Tạo khí hydro (H2) nhiên liệu từ bã mía phương pháp lên men tối 14 1.4.1 Khí H2 sinh học .14 1.4.2 Sản xuất hydro phương pháp lên men tối 15 v 1.4.2.1 Cơ chế trình lên men tối tạo hydro 15 1.4.2.2 Các vi sinh vật sản xuất H2 đường lên men tối 17 1.4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men tối 18 1.5 Tình hình nghiên cứu tạo H2 từ bã mía .19 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nội dung Chọn lọc hỗn hợp giống vi khuẩn kỵ khí từ mẫu bùn thải có khả tạo H2 phương pháp lên men kỵ khí 21 2.1.1 Mô tả nội dung 21 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.1.2.1 Thu nhận mẫu bùn làm nguồn vi sinh vật có khả tạo H2 phương pháp lên men kỵ khí 21 2.1.2.2 Xác định độ ẩm, pH, carbohydrate tổng mẫu bùn thải làm nguồn thu nhận hỗn hợp giống vi sinh vật 21 2.1.2.3 Xác định điều kiện xử lý mẫu bùn thích hợp để thu nhận hỗn hợp giống vi sinh vật có khả tạo H2 phương pháp lên men 22 2.1.3 Các tiêu theo dõi .26 2.1.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 26 2.2 Nội dung Khảo sát thông số sinh - động học tăng trưởng lên men H2 hỗn hợp giống vi khuẩn phân lập thời gian tăng trưởng, nhiệt độ, pH môi trường, loại chất khác nhau, nồng độ chất, hàm lượng H2 sinh 26 2.2.1 Mô tả nội dung 26 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.2.1 Xác định thời gian tăng trưởng, nhiệt độ, pH mơi trường thích hợp 26 2.2.2.2 Xác định nguồn C nồng độ C thích hợp 27 2.2.2.3 Xác định nguồn N nồng độ N thích hợp 27 2.2.3 Các tiêu theo dõi .27 2.2.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 28 2.3 Nội dung Xác định chủng vi khuẩn chiếm ưu hỗn hợp giống phương pháp điện di gel có khuynh độ biến tính (DGGE) 28 vi 2.3.1 Mô tả nội dung 28 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.2.1 Tách chiết thu nhận DNA tổng số 15 chủng hỗn hợp VSV 28 2.3.2.2 Khuếch đại trình tự 16S tổng số chủng hỗn hợp VSV phương pháp PCR 29 2.3.2.3 Khuếch đại trình tự 16S chọn lọc chủng hỗn hợp VSV phương pháp PCR 30 2.3.2.4 Phân tách trình tự 16S chủng hỗn hợp VSV phương pháp DGGE 31 2.3.2.5 Phân tích BLAST dự đoán số chủng vi sinh vật chiếm ưu diện hỗn hợp vi sinh vật 32 2.3.3 Các tiêu theo dõi .33 2.3.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 33 2.4 Nội dung Khảo sát số thành phần hóa học bã mía .33 2.4.1 Mơ tả nội dung 33 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.4.2.1 Xác định carbohydrate 33 2.4.2.2 Xác định hàm lượng tro 34 2.4.2.3 Xác định độ ẩm 34 2.4.2.4 Tổng chất rắn 34 2.4.3 Các tiêu theo dõi .34 2.4.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 34 2.5 Nội dung Khảo sát số phương pháp xử lý bã mía để tăng cường hàm lượng carbohydrate dễ lên men dịch bã mía sau xử lý sử dụng cho lên men .34 2.5.1 Mô tả nội dung 34 2.5.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.5.2.1 Tiền xử lý bã mía dung dịch acid H2SO4 lỗng kết hợp với nhiệt độ cao 34 2.5.2.2 Tiền xử lý dung dịch NaOH loãng .35 vii 2.5.3 Các tiêu theo dõi .35 2.5.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 35 2.6 Nội dung Sử dụng hỗn hợp giống có hiệu suất cao để lên men tạo H2 nguồn chất phế thải giàu carbohydrate bã mía điều kiện lên men mẻ bình serum dung tích 120 ml 35 2.6.1 Mô tả nội dung 35 2.6.2 Phương pháp nghiên cứu 36 2.6.2.1 Xác định hiệu suất sử dụng đường dịch .36 2.6.2.2 Xác định hiệu suất sử dụng đường bã 36 2.6.3 Các tiêu theo dõi .37 2.6.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 37 2.7 Nội dung Tối ưu hóa số điều kiện lên men sinh H2 chai serum dung tích 120 ml .37 2.7.1 Mô tả nội dung 37 2.7.2 Phương pháp nghiên cứu 37 2.7.2.1 Khảo sát thông số ảnh hưởng tới khả sinh H2 37 2.7.2.2 Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng H2 thiết kế Plackett - Burman 38 2.7.2.3 Thiết kế BBD tối ưu yếu tố .39 2.7.3 Các tiêu theo dõi .39 2.7.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 39 2.8 Nội dung Thiết kế hệ thống bioreactor để lên men tạo H2 qui mơ phịng thí nghiệm (1 – 3l) 39 2.8.1 Mô tả nội dung 39 2.8.2 Phương pháp nghiên cứu 40 2.8.3 Các tiêu theo dõi .40 2.8.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 40 2.9 Nội dung Khảo sát khả lên men sinh H2 từ nguồn bã mía hệ thống bioreactor 40 viii 2.9.1 Mô tả nội dung 40 2.9.2 Phương pháp nghiên cứu 40 2.9.3 Các tiêu theo dõi .40 2.9.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .42 3.1 Kết nội dung Chọn lọc hỗn hợp giống vi khuẩn kỵ khí từ mẫu bùn thải có khả tạo H2 phương pháp lên men kỵ khí .42 3.1.1 Kết xác định độ ẩm, pH, carbohydrate tổng giá trị COD mẫu bùn thải làm nguồn thu nhận hỗn hợp giống vi sinh vật 42 3.1.2 Kết xác định điều kiện xử lý mẫu bùn thích hợp để thu nhận hỗn hợp giống vi sinh vật có khả lên men kỵ khí tạo H2 43 3.1.2.1 Điều kiện xử lý mẫu bùn thải tốt phương pháp sốc nhiệt 43 3.1.2.2 Điều kiện xử lý tốt phương pháp ngâm acid 44 3.1.2.3 So sánh hiệu hai phương pháp xử lý 46 3.2 Kết nội dung Khảo sát thông số sinh-động học tăng trưởng lên men H2 hỗn hợp giống vi khuẩn phân lập thời gian tăng trưởng, nhiệt độ, pH môi trường, loại chất khác nhau, nồng độ chất, hàm lượng H2 sinh 47 3.2.1 Khảo sát thời gian nuôi cấy đến khả tích lũy H2 chủng hỗn hợp VSV .47 3.2.2 Khảo sát pH môi trường ban đầu 48 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn C đến khả lên men sinh H2 49 3.2.5 Ảnh hưởng nồng độ glucose đến khả lên men sinh H2 50 3.2.6 Ảnh hưởng nguồn N lên khả sinh H2 hỗn hợp VSV 51 3.2.7 Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả lên men sinh H2 hỗn hợp VSV 52 3.2.8 Kết khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến trình lên men hàm lượng H2 tích lũy 15 chủng hỗn hợp VSV thu nhận từ nguồn khác tổng kết bảng sau 53 ix Hàm lượng H2 tích lũy (ml/l) 484.29± 30.83 617.03± 4.73 785.96± 35.73 789.82± 65.34 OD600 1.03± 0.05 1.21± 0.02 1.07± 0.01 1.33± 0.2 Hiệu suất sử dụng đường (%) 80.74± 0.28 78.02± 2.69 88.15± 1.41 85.94± 6.55 0.64± 0.04 0.85± 0.02 0.96± 0.06 0.98± 0.01 5.44± 0.02 5.16± 0.16 4.88± 0.01 4.82± 0.38 113.52± 10.18 738.92± 54.65 533.35± 39.33 479.16± 0.91± 1.34± 0.14 1.26± 1.1± 76.1± 0.17 75.72± 1.64 89.58± 1.83 82.61± 0.16± 0.23 1.04± 0.15 0.64± 0.03 0.62± 5.09± 0.02 4.81± 0.02 5.02± 0.02 4.75± 483.75± 30.06 669.52± 42.58 818.92± 10.0 699.18± 65.82 OD600 0.95± 0.04 1.03± 0.02 1.11± 1.32± 0.01 Hiệu suất sử dụng đường (%) 90.15± 6.51 88.9± 3.1 90.08± 93.25± 0.62 0.58± 0.01 0.81± 0.02 0.97± 0.8± 0.08 5.21± 0.09 5.13± 0.01 4.89± 5.09± 0.03 568.88± 30.59 808.98± 74.49 758.28± 741.91± 62.74 OD600 1.07± 0.05 1.34± 0.02 1.41± 1.43± 0.03 Hiệu suất sử dụng đường (%) 76± 11.29 79.22± 0.76 84.73± 88.18± 0.91 0.81± 0.08 1± 0.14 0.96± 0.98± 0.1 5.03± 0.16 4.76± 4.42± 4.39± 0.01 Hiệu suất sinh H2 (mol H2/mol glucose) pH sau nuôi BPM Hàm lượng H2 tích lũy (ml/l) OD600 Hiệu suất sử dụng đường (%) Hiệu suất sinh H2 (mol H2/mol glucose) pH sau ni BCT Hàm lượng H2 tích lũy (ml/l) Hiệu suất sinh H2 (mol H2/mol glucose) pH sau ni BLS Hàm lượng H2 tích lũy (ml/l) Hiệu suất sinh H2 (mol H2/mol glucose) pH sau nuôi PB Hàm lượng H2 tích lũy (ml/l) OD600 302.85± 51.17 753.64 ± 2.36 0.54± 0.01 1.02± 131 757.39± 66.34 1.28± 0.07 738.84± 2.31 1.31± 0.04 Hiệu suất sử dụng đường (%) 85.31± 0.04 88.51± 1.29 89.15± 2.09 92.59± 4.65 0.38± 0.06 0.91± 0.03 0.91± 0.06 0.86± 0.04 5.89± 0.01 4.93± 0.04 4.86± 0.17 4.97± 0.07 Hiệu suất sinh H2 (mol H2/mol glucose) pH sau ni BHH Hàm lượng H2 tích lũy (ml/l) 562.24± 44.93 745.74 ± 53.38 731.1± 62.14 671.04± 54.18 OD600 0.88± 0.38 0.8± 1.12± 0.07 0.96± 0.09 Hiệu suất sử dụng đường (%) 89.14± 4.32 72.03± 3.7 86.33± 1.48 75.61± 3.25 0.68± 0.02 0.89± 0.2 0.91± 0.09 0.95± 0.17 5.32± 0.15 5.21± 4.56± 0.07 4.63± 0.01 424.68± 41.8 645.26 ± 99.05 919.67± 68.5 734.58± 78.54 OD600 1.08± 0.02 1.12± 0.01 1.13± 1.29± 0.04 Hiệu suất sử dụng đường (%) 82.14± 0.37 88.65± 2.58 81.71± 90.85± 0.28 0.55± 0.06 0.80± 0.07 1.21± 0.87± 0.11 5.4± 0.19 5.09± 0.06 4.8± 5.01± 0.06 Hiệu suất sinh H2 (mol H2/mol glucose) pH sau nuôi BPL Hàm lượng H2 tích lũy (ml/l) Hiệu suất sinh H2 (mol H2/mol glucose) pH sau nuôi Phụ lục 12 Ảnh hưởng tỉ lệ xử lý (bã mía: H2SO4 2%, w/v) lên hàm lượng đường dịch bã sau xử lý Lượng Lượng đường đường trong dịch(mg/g) bã(mg/g) KXL ¯ ¯ 891.27±44.32 0.5:10 265.78±0.38 348.41±3.2 614.19±2.82 Tỷ lệ xử lý (w/v) 1:10 1.5:10 2:10 Tổng lượng đường(mg/g) Hiệu suất thu hồi đường (%) 100 68.91 ± 0.45 349.51±2.33 405.04±13.63 754.55±11.29 84.66 ± 1.79 308.89±7.35 413.23±12.85 722.12±5.5 81.02 ± 0.87 205.45±1.78 656.23±9.26 73.63 ± 1.47 450.78±7.48 132 Phụ lục 13 Ảnh hưởng nồng độ tác nhân xử lý H2SO4 lên lên hàm lượng đường dịch bã sau xử lý Nồng độ Lượng đường Lượng đường Tổng lượng Hiệu suất thu H2SO4 (%, dịch bã w/v) (mg/g) (mg/g) KXL ˍ ˍ 891.27±44.32 52.97±3.81 599.67±9.39 652.64±13.2 73.23 ± 2.09 245.26±10.48 502.94±13.88 748.2±24.36 83.95 ± 3.87 0.5 đường (mg/g) hồi đường (%) 100 322.65±6.34 406.46±20.54 729.11±26.88 81.81 ± 4.27 369.22±0.91 394.78±10.11 764±11.01 85.72 ± 1.75 338.72±7.18 356.58±11.06 695.29±3.87 78.01 ± 0.61 335.18±3.32 372.98±15.94 708.16±12.62 79.46 ± 319.82±7.07 361.13±19,6 680.95±12.53 76.4 ± 1.99 Phụ lục 14 Ảnh hưởng thời gian xử lý acid lên lên hàm lượng đường dịch bã sau xử lý Thời gian Lượng Lượng đường xử lý đường trong (phút) dịch(mg/g) bã(mg/g) - - 891.27±44.32 15 341.91±1.44 453.52±3.99 795.42±2.55 20 356.87±1.97 447±18.06 30 329.62±0.99 385.62±14.81 715.24±13.82 80.25 ± 2.19 60 330.53±2.97 344.67±13.12 675.19±10.15 75.76 ± 1.61 90 243.67±4.72 277.8±14.5 Tổng lượng đường(mg/g) Hiệu suất thu hồi đường (%) 100 89.25 ± 0.4 803.87±16.09 90.19 ± 2.55 521.47±19.22 58.51 ± 3.05 Phụ lục 15 Ảnh hưởng thời gian xử lý NaOH 2% lên hàm lượng H2 tích lũy hiệu suất sinh H2, lượng đường khử giải phóng hiệu suất sử dụng bã rắn sau xử lý 133 Hàm lượng Thời gian % H2 H2 (ml/ l môi trường) (giờ) Hiệu suất Đường Hiệu suất sinh H2 pH sau lên sinh (mol/ mol men dịch glucose) sử dụng bã (%) (mg) 5.69± 0.11 120.09± 1.19 0.74± 0.03 6.16± 0.01 4.44± 0.18 8.62± 0.18 181.87± 3.73 1± 0.02 6.12± 0.01 5.4± 0.14 6.87± 0.09 149.49± 0.16 0.93± 0.011 6.16± 4.55± 0.19 6.85± 0.14 139.99± 2.02 0.87± 0.012 6.19± 0.03 3.55± 0.1 2.75± 0.16 3.05± 0.14 2.28± 0.13 1.84± 0.02 Phụ lục 16 Ảnh hưởng nhiệt độ xử lý NaOH 2% lên hàm lượng H2 tích lũy hiệu suất sinh H2, lượng đường khử giải phóng hiệu suất sử dụng bã rắn sau xử lý Hàm lượng Nhiệt độ % H2 (oC) Hiệu suất Hàm lượng H2 tích lũy pH sau sinh H2 đường sinh (ml/ l môi lên men (mol/ mol glucose) dịch (mg) trường) 130.8±2.89 6.11±0.01 0.86±0.04 Hiệu suất sử dụng đường bã (%) 50 6.17± 0.09 4.54±0.03 2.65± 0.02 60 9.02± 0.06 187.31±0.09 6.11±0.01 1.27±0.02 5.29±0.074 2.71± 0.03 70 6.94± 0.04 140.72±0.16 2.09± 0.11 6.1±0.01 0.86±0.01 4.09±0.074 Phụ lục 17 Ảnh hưởng nồng độ NaOH lên hàm lượng H2 tích lũy hiệu suất sinh H2, lượng đường khử giải phóng hiệu suất sử dụng bã rắn sau xử lý Hàm lượng Nồng độ NaOH % H2 H2 tích lũy (ml/ l mơi pH sau lên men 134 Hiệu suất Hàm lượng Hiệu suất sử sinh H2 đường sinh dụng đường (mol/ mol dịch bã trường) (%) 8.17± 0.1 8.91±0.16 186.12±3.25 6.15±0.01 10± 0.07 7.43±0.05 147.2± 2.79 6.17±0.03 0.94±0.01 174.3±2.11 glucose) 6.13±0.01 1.05±0.04 1.1± 0.07 192.21±3.36 6.05±0.01 1.17±0.02 6.9± 147.2± 2.16 6.16±0.01 1± 0.09 (mg) (%) 3.41± 0.085 2.1± 0.06 4.7 ± 0.095 2.24± 0.03 4.19± 2.12± 0.04 2.8± 0.05 1.04± 0.04 2.42 ±0.015 0.94± 0.04 Phụ lục 18 Ảnh hưởng tỉ lệ xử lý (bã mía: NaOH 2%, w/v) lên hàm lượng H2 tích lũy hiệu suất sinh H2, lượng đường khử giải phóng hiệu suất sử dụng bã rắn sau xử lý Hàm lượng Tỉ lệ xử lý % H2 (w/v) 0.5:10 Hiệu suất H2tích lũy pH sau sinh H2 (ml/ l môi lên men (mol/ mol trường) 92.53±5.3 Hiệu suất đường sử dụng bã dịch (mg) (%) 6.16±0.04 0.69± 0.01 3.56± 0.05 2.18± 0.09 9.23±0.01 171.18±1.32 6.13±0.01 0.91± 0.02 3.82± 0.02 2.24± 0.04 1.5:10 7.5±0.44 141.74±3.85 6.18±0.01 0.84± 0.06 1.35± 0.94± 0.04 2:10 1.15±0.23 26.61±2.64 0.15± 0.05 1.2± 0.07 0.81± 0.18 1:10 4.84± 0.2 glucose) Hàm lượng 6.33±0.01 Phụ lục 19 Kết sau lên men chủng hỗn hợp mơi trường Chen có chứa dịch bã mía sau xử lý Chủng VSV % H2 PVC BTG PB CMS 5,121 ± 0,03 1,205 ±0,046 5,502±0,009 13,37 ± 0,111 91,22 ± 0,782 21,047 ± 0,57 108,006±3,25 300,13 ± 3,96 0,482 ± 0,001 0,128±0,005 6,097 ± 0,015 6,083 ± 0,015 6,163 ± 0,015 5,583 ± 0,021 Hàm lượng H2 sinh (ml/l môi trường) Hiệu suất sinh H2 (mol/ mol glucose) pH sau lên men 135 0,513±0,014 1,465 ± 0,059 Hiệu suất sử dụng đường (%) 73,866± 0,149 63,872±1,469 77,331±0,209 76,509± 2,054 1.493 ± 0.003 1.442 ± 0.027 1.692±0.005 Khối lượng đường sử dụng (g) 1.648 ± 0.044 Phụ lục 20 Kết khảo sát vùng cực trị nồng độ đường đánh giá thông qua sinh H2 pH sau lên men Khối lượng bã mía cần cân (g) Nồng độ đường tương Hàm lượng % H2 H2 (ml/ l môi trường) ứng pH sau lên men Hiệu suất sinh H2 (mol/ mol glucose) (g/l) 5.79 11.06±0.21 8.69 7.5 16.45±0.42 11.58 10 18.8±0.19 14.48 12.5 20.19±0.07 17.38 15 22.1±0.08 20.27 17.5 27.47±0.85 23.17 20 26.06 22.5 28.96 25 24.055 ± 0.76 294,88± 0,98 470,06 ± 1,92 548,90 ± 5,18 584,63 ± 18,5 610,69± 9,37 649,58 ± 7,37 632,54± 6,36 21.687 ± 590,84 ± 0.822 9,54 20.523 ± 586,51 ± 136 5,993 ± 0,025 1,542 ± 0,056 5,66 ± 0,035 1,216 ± 0,057 5,167 ± 0,101 1,377 ± 0,073 5,16 ± 0,017 1,331 ± 0,116 5,037 ± 0,006 1,383 ± 0,022 4,903 ± 0,006 1,62 ± 0,065 4,92 ± 0,01 1,494 ± 0,08 5,073 ± 0,015 1,285 ± 0,038 5,123 ± 0,015 1,321 ± 0,053 0.648 1,47 Phụ lục 21 Kết hiệu suất sử dụng đường thí nghiệm xác định vùng cực trị cho nồng độ đường ban đầu Nồng độ Cơ chất bã mía (g) đường tương ứng (g/l) Hiệu suất sử Hiệu suất sử Tổng hiệu Tổng lượng dụng đường dụng đường suất sử dụng đường sử bã (%) dịch (%) đường dụng 5.79 4,458±0,294 88,764 ±0,614 29,227±0,534 1,461 ± 0,027 8.69 7.5 5,832±0,172 86,824 ±2,082 28,08±0,991 1,404 ± 0,05 11.58 10 6,033±0,162 88,971 ±0,833 28,887±0,252 1,922 ± 0,284 14.48 12.5 5,955±0,244 88,552 ±0,82 28,493±0,046 1,425 ± 0,002 17.38 15 6,984±0,291 83,785 ± 0,799 29,593± 0,32 2,939 ± 0,048 20.27 17.5 8,12±0,042 95,992 ± 30,87 ±0,173 3,987 ± 0,136 23.17 20 2,302±0,583 95,915 ±0,296 29,527±0,233 3,905 ± 0,047 26.06 22.5 0±0 72,69 ±4,961 19,765 ± 3,447 ± 0,086 28.96 25 0±0 53,858 ± 1,262 12,028 ± 2,745 3,32 ± 0,041 Phụ lục 22 Kết khảo sát vùng cực trị pH ban đầu môi trường đánh giá thông qua khả sinh H2 pH sau lên men pH ban pH sau lên Hiệu suất sinh đầu % H2 Hàm lượng H2 men H2 5.5 11.64 ± 0.63 223,195 ± 4,85 5,277 ± 0,006 2,034 ± 0,071 12.1 ± 0.9 266,71 ± 2,271 5,553 ± 0,023 1,525 ± 0,028 6.5 12.7 ± 1.94 294,88 ± 0,98 5,993 ± 0,025 1,542 ± 0,056 11.99 ± 0.21 256,99± 3,508 5,93 ± 0,01 1,539 ± 0,032 7.5 10.06 ± 0.43 198,45 ± 1,616 6,283 ± 0,021 1,303 ± 0,098 137 Phụ lục 23 Kết khảo sát vùng cực trị pH ban đầu môi trường đánh giá thông qua khả sử dụng nguồn C Hiệu suất sử dụng Hiệu suất sử dụng Tổng hiệu suất sử đường bã sau đường dịch dụng đường dịch xử lý (%) sau xử lý (%) bã sau xử lý (%) 5,5 3,626±0,023 79,514 ± 0,263 26,187 ± 0,208 4,205±0,168 86,995 ± 0,395 28,393 ± 0,367 6,5 4,458±0,294 88,764 ± 0,614 29,227 ± 0,534 4,258±0,122 78,479 ± 0,669 25,86 ± 0,265 7,5 3,634±0,271 79,669 ± 1,01 25,833 ± 0,751 pH ban đầu Phụ lục 24 Kết khảo sát vùng cực trị nhiệt độ nuôi cấy đánh giá thông qua khả sinh H2 pH sau lên men Nhiệt độ (oC) Hàm lượng H2 % H2 (ml/l môi pH sau lên men trường) Hiệu suất sinh H2(mol H2/ mol glucose) 30 8.87 ± 0.14 175,43 ± 2,82 5,92 ± 0,01 0,99 ± 0,018 35 11.31 ± 0.43 248,04 ± 3,96 5,91 ± 0,006 1,37 ± 0,01 40 10.19 ± 1.76 225,74 ± 7,86 5,87 ± 0,053 1,26 ±0,002 45 4.82± 0.52 84,44 ± 4,51 5,68 ± 0,09 0,54 ± 0,07 Phụ lục 25 Kết khảo sát vùng cực trị nhiệt độ nuôi cấy đánh giá thông qua khả sử dụng nguồn C Hiệu suất sử dụng Tổng hiệu suất sử dụng dịch đường sau xử đường dịch bã lý (%) sau xử lý (%) 3,317±0,08 87,057 ± 0,483 28,413 ± 0,856 35 6,324±0,125 88,112 ± 0,747 28,593 ± 0,341 40 7,345±0,086 89,012 ± 3,248 28,967 ± 0,808 Nhiệt Hiệu suất sử dụng độ (oC) bã sau xử lý (%) 30 138 45 1,327±0,124 84,418 ± 1,242 27,373 ± 0,566 Phụ lục 26 Kết khảo sát vùng cực trị tỉ lệ nạp giống đánh giá thông qua khả sinh H2 pH sau lên men tỉ lệ % H2 (ml/40ml) 9.639 ± 1.234 13.518 ± 0.162 14.064 ± 0.352 14.084 ± 0.068 11.283 ± 0.67 Hàm lượng H2 (ml/l môi trường) pH sau lên men Hiệu suất sinh H2 (mol/ mol gucose) 180,97 ± 4,88 5,69 ± 0,424 1,335 ± 0,009 273,354 ± 3,275 5,19 ± 0,026 1,373 ± 0,006 303,6 ± 5,889 5,143 ± 0,015 1,946 ± 0,033 296,712 ± 1,525 5,387 ± 0,401 1,666 ± 0,03 229,478 ± 8,615 5,845 ± 0,035 1,645 ± 0,069 Phụ lục 27 Kết khảo sát vùng cực trị tỉ lệ nạp giống đánh giá thông qua khả sử dụng nguồn C tỉ lệ nạp giống Hiệu suất sử dụng Hiệu suất sử dụng Tổng hiệu suất sử dụng (ml:40ml môi đường bã đường dịch đường dịch bã trường) sau xử lý (%) sau xử lý (%) sau xử lý (%) 2,307±0,237 76,752 ± 0,132 23,673 ± 2,001 5,645±0,198 79,142 ± 0,965 28,632 ± 0,418 6,899±0,126 79,142 ± 0,965 25,227 ± 0,284 5,321±0,163 78,707 ± 0,351 24,647 ± 0,633 6,782±0,218 74,393 ± 0,483 24,113 ± 0,979 139 Phụ lục 28 Kết khảo sát vùng cực trị thời gian nuôi cấy đánh giá thông qua khả sinh H2 pH sau lên men Hàm lượng H2 Thời gian % H2 Hiệu suất sinh H2 (ml/ l môi pH sau lên men (mol/ mol trường) (ngày) glucose) 9,7 ± 0,21 228,35±4,22 6,36±1,25 0,79±0,02 1,5 12,57 ± 0,24 241,27±8,25 6,16±1,92 1,29±0,01 12,7 ± 1,94 294,88 ± 0,98 5,99 ± 0,02 1,54 ± 0,06 2,5 11,57 ± 0,24 269,19 ± 5,86 5,99 ± 0,006 1,37 ± 0,02 10,53 ± 0,31 235,51 ± 5,44 ± 0,02 1,31 ± 0,012 3,5 10,40 ± 0,14 213,77 ± 4,95 5,98 ± 0,012 1,21 ± 0,026 10,35 ± 0,26 219,13 ± 5,89 ± 0,035 1,22 ± 0,022 4,5 9,8 ± 0,16 213,55 ± 9,38 5,95 ± 0,01 1,17 ± 0,03 Phụ lục 29 Kết khảo sát vùng cực trị thời gian nuôi cấy đánh giá thông qua khả sử dụng nguồn C Hiệu suất sử dụng Hiệu suất sử dụng Tổng hiệu suất sử dụng đường bã sau đường dịch đường dịch bã xử lý (%) sau xử lý (%) sau xử lý (%) - 62,73±1,78 25,66± 1,31 1,5 1,47±0,72 81,7±0,73 28,72± 1,21 4,458±0,294 88,764 ± 0,614 29,227 ± 0,534 2,5 4,853±0,002 89,488 ± 0,535 29,307 ± 0,761 5,658±0,671 88,205 ± 0,215 28,493 ± 0,046 3,5 6,792±0,114 88,122 ± 0,286 28,893 ± 0,67 7,56±0,409 88,474 ± 0,342 28,08 ± 0,991 4,5 7,972±0,551 89,178 ± 0,47 29,253 ± 0,801 Thời gian nuôi (ngày) Phụ lục 29 Kết lên men hệ thống fermentor theo thời gian 140 Thời gian pH (giờ) Hàm lượng H2 (ml/l môi trường) % H2 Hiệu suất sử dụng đường (%) 6,3 ±0 - 0,01±0 ± 0,24 6,28 ±0,01 - 0,01±0 3,76±0,134 6,24 ±0,02 - 0,03±0 8,78±0,521 6,23 ±0,01 - 0,03±0 8,46±0,45 6,22 ±0 - 0,85±0,34 10,97±0,145 10 5,93 ±0,07 - 4,32±0,225 12,54±0,13 12 5,66 ±0,04 48,33 5,25±0,8 23,82±0,24 14 5,53 ±0,03 199,069 24,22±1,71 29,15±0,421 16 5,44 ±0,04 220,979 37,57±2,56 39,5±0,35 18 5,33 ±0,04 240,987 46,5±2,97 48,28±1,4 20 5,3 ±0,01 247,682 43,11±2,56 54,86±1,5 22 5,28 ±0,01 266,335 50,27±1,18 59,87±2,1 24 5,26 ±0,01 269,631 44,55±3,11 66,46±2,3 26 5,22 ±0,02 269,609 51,26±1,95 71,16±2,5 28 5,2 ±0,01 269,854 49,28±2,17 75,86±3,5 30 5,16 ±0,01 268,468 49,64±2,59 79,94±3,6 32 5,12 ±0,03 242,807 48,71±2,45 81,19±2,1 34 5,12 ±0,01 172,223 28,82±1,47 84,64±4,2 36 5,11 ±0,01 140,854 28,59±2,71 86,52±4,2 38 5,1 ±0,01 - - 87,15±3,2 40 5,1 ±0,01 - - 86,21 42 5,09 ±0,01 - - 86,83±4,1 44 5,09 ±0,01 - - 86,9±3,2 46 5,08 ±0,01 - - 87±1,42 48 5,03 ±0,01 - - 87,2±3,24 141 Phụ lục 31 Hệ thống máy sắc ký khí GC 6890 tích hợp đầu dị TCD (A) sắc ký đồ khí H2 (B) (A) (B) 142 Phụ lục 32 Hình ảnh bã mía sử dụng làm nguồn carbon nghiên cứu Bã mía qua tiền xử lý Bã mía chưa tiền xử lý Phụ lục 33 Hình ảnh mơi trường ni cấy chứa bã mía có oxy (A) khơng có oxy (B) nhận biết thị màu resazurin (A) (B) 143 Phụ lục 34 Kết giải trình tự gen 16S rDNA mẫu 1_357f Phụ lục 35 Kết giải trình tự gen 16S rDNA mẫu 2_357f 144 Phụ lục 36 Kết giải trình tự gen 16S rDNA mẫu 3_357f Phụ lục 37 Kết giải trình tự gen 16S rDNA mẫu 4_357f Phụ lục 38 Kết giải trình tự gen 16S rDNA mẫu 5_357f 145