Nghiên cứu nuôi nang trứng bò chưa trưởng thành trong điều kiện in vitro

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU NI NANG TRỨNG BỊ CHƯA TRƯỞNG THÀNH TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Mã số: DV 05 /15-16 Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Thị Thanh Giang Cán thực hiện: CN Nguyễn Ngọc Quỳnh Chi TP Hồ Chí Minh, năm 2017 MỤC LỤC I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI II ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn III TỔNG QUAN TÀI LIỆU Khái niệm chung 1.1 Tế bào trứng 1.2 Nang trứng Các phương pháp thu nhận nang trứng 17 2.1 Phương pháp học 17 2.2 Phương pháp hóa học 18 2.3 Sinh thiết buồng trứng in vivo 18 Hệ thuống nuôi cấy nang trứng 18 3.1 Hệ thống nuôi cấy 18 3.2 Môi trường nuôi cấy 20 3.3 Các nhân tố tăng trưởng chất bổ sung 23 Những nghiên cứu nuôi cấy nang trứng bò in vitro 27 4.1 Những nghiên cứu giới 27 4.2 Những nghiên cứu Việt Nam 30 IV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 Vật liệu 31 1.1 Đối tượng nghiên cứu 31 1.2 Dụng cụ-thiết bị, hóa chất 31 Phương pháp 32 2.1 Nội dung nghiên cứu 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 V KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 Nuôi cấy nang thứ cấp (nang chưa hình thành xoang 170-200 μm) 40 1.1 Kết phân lập nang thứ cấp 40 1.2 Kết q trình ni trưởng thành nang thứ cấp 40 i Nuôi cấy nang tam cấp 43 2.1 Phân lập nang trứng từ mô vỏ buồng trứng 43 2.2 Nuôi cấy nang trứng in vitro 44 2.3 Đánh giá hiệu q trình ni nang tam cấp 47 Nuôi phức hợp COGCs 50 4.1 Phân lập nang trứng 50 4.2 Nuôi tăng trưởng trứng 52 4.3 Đánh giá hiệu q trình ni phức hợp COCGs 55 VI KẾT LUẬN 59 VII TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC PL ii DANH SÁCH BẢNG Bảng Đặc điểm phát triển nang trứng bò giai đoạn đầu Bảng Tổng hợp hệ thống nuôi cấy in vitro 21 Bảng Một số nhân tố tăng trưởng 25 Bảng 4: Kết nhuộm Trypan Blue 40 Bảng 5: Kết nuôi trưởng thành nang thứ cấp 41 Bảng 6: Kết nhuộm Neutral Red 43 Bảng 7: Kết nuôi cấy nang trứng 44 Bảng 8: Kết IVM 47 Bảng 9: Kết nhuộm Aceto Orcein 48 Bảng 10 Kết IVF 49 Bảng 11: Kết nhuộm sống chết phức hợp COCGs 50 Bảng 12 Kết nuôi COCGs 52 Bảng 13: Kết IVM 55 Bảng 14: Kết nhuộm Aceto Orcein 57 Bảng 15: Kết IVF 57 PL iii DANH SÁCH HÌNH Hình Cấu tạo buồng trứng Hình Các giai đoạn trưởng thành nang trứng Hình Sơ đồ phát triển từ nang trứng 10 Hình Sơ đồ cấu tạo nang trứng thứ cấp 11 Hình Sơ đồ cấu tạo nang trứng tam cấp: 12 Hình Các yếu tố điều hòa nội tiết thể 13 Hình Một số trình tương tác tế bào nang 16 Hình Hệ thống nuôi cấy nang trứng 2D (trái) 3D (phải) 19 Hình Tình trạng nang trứng sau phân lập 44 Hình 10 Cấu trúc nang sau q trình ni cấy 45 Hình 11 Ni thành thục trứng 48 Hình 12 Phơi phơi tế bào 49 Hình 13 Phức hợp trứng-cumulus sau phân lập, thang đo 100 μm 51 Hình 14 Hình thái phức hợp COGCs 53 Hình 15 Ni phức hợp COCGs 55 PL iv TÓM TẮT Ngay từ lúc chào đời, có từ vài trăm nghìn đến hàng triệu nang trứng nhỏ diện buồng trứng vật ni Sự phát triển nang trứng q trình phức tạp, nang trứng đóng vai trị thiết yếu để đảm bảo điều kiện tối ưu cho trưởng thành tế bào trứng Nhiều nghiên cứu nuôi cấy nang trứng tiến hành giới nghiên cứu này, nang trứng giai đoạn thứ cấp, tam cấp nang hình thành xoang (nuôi phức hợp trứng-cumulus) tiến hành nuôi cấy in vitro Trong thí nghiệm đầu tiên, nang trứng thứ cấp nuôi ba môi trường nuôi khác nhằm đánh giá tác động activin A, EGF thay đổi nồng độ FSH lên trưởng thành nang trứng Sự trưởng thành nang trứng đánh giá sau 18 ngày nuôi cấy dựa thống kê kích thước nang hình thái nang Các nang trứng ni mơi trường có bổ sung FSH kết hợp Activin A có khả tồn giữ cấu trúc hình cầu cao nhất, tỉ lệ nang cịn giữ cấu trúc sau 18 ngày ni cấy đạt giá trị cao 81,6% tỉ lệ đạt 70,1%, 77% tương ứng môi trường bổ sung EGF với nồng độ FSH định mơi trường thay đổi nồng độ FSH Trong thí nghiệm thứ 2, nang tam cấp nuôi cấy nhằm khảo sát tác động Hypoxanthine, Sodium pyruvate, FSH 17β Estradiol lên phát triển nang Các nang trứng đánh giá kích thước nang hình thái nang sau 13 ngày nuôi cấy Khả thành thục trứng thu nhận từ q trình ni trưởng thành nang đánh giá IVM IVF Kích thước nang trứng hầu hết môi trường nuôi tăng sau 13 ngày nuôi Mặc dù không khác biệt xử lý thống kê, nhóm nang nuôi môi trường bổ sung Sodium pyruvate, Estradiol, FSH đạt trung bình đường kính nang lớn nhất, đạt 2971,51 ± 91,24 μm Các nang trứng nuôi mơi trường sống, giữ cấu trúc hình cầu với tỉ lệ cao đạt tương ứng 85% trứng thu nhận từ q trình ni trưởng thành lô nghiệm thức cho tỉ lệ thành thục, khả thụ tinh cao tương ứng 53,41% 51,14% Từ kết cho thấy, Sodium pyruvate, 17β Estradiol, FSH hỗ trợ phát triển nang tam cấp tăng trưởng kích thước lẫn giữ ổn định cấu trúc nang, trứng thu nhận từ nang sau ni cấy có khả thụ tinh tạo phơi với hiệu suất >50% Thí nghiệm cuối, phức hợp trứng-cumulus thu nhận từ nang kích thước 0,5-1mm nuôi trưởng thành trứng môi trường nuôi bổ sung Sodium pyruvate, FSH 17β Estradiol điều kiện 2D 3D Sau 13 ngày nuôi cấy, tế bào trứng sau đánh giá tình trạng trưởng thành dựa vào giãn nở cụm tế bào cumulus bao quanh trứng, kích thước tế bào trứng xuất thể cực thứ khả tạo phôi in vitro Kết nghiên cứu cho thấy, đường kính trứng tăng từ 95 µm đến 107,2 ± 6,4 µm 113,1 ± 6.4 µm tương ứng nghiệm thức 2D 3D (pvalue < 0,05) Sau 13 ngày, 97,7% phức hợp bị dàn trải nghiệm thức (nuôi cấy 2D) làm cấu trúc giống nang có xoang Trong nghiệm thức (ni cấy 3D), cấu trúc trì sau 13 ngày 47% Tỷ lệ trứng trưởng thành xuất thể cực thứ nghiệm thức 45% trứng cực có khả thụ tinh IVF tạo phôi tế bào tế bào Từ kết nhận thấy, nang trứng thu nhận giai đoạn muộn có khả trưởng thành cao kích thước lẫn chức cấu trúc bề mặt nuôi cấy ảnh hưởng đến ổn định cấu trúc phát triển nang in vitro Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn đối tượng nang trứng khác điều kiện nuôi cấy phù hợp nhằm tạo tế bào trứng thành thục sẵn sàng để thụ tinh I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài: “Nghiên cứu ni nang trứng bị chưa trưởng thành điều kiện in vitro” (Mã số: DV 05 /15-16) Cơ quan quản lý: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM Địa chỉ: Số 2374 quốc lộ 1A, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, Tp.HCM Điện thoại: (08) 715 3792 Đơn vị chủ trì: Phịng Cơng nghệ Sinh học Động vật Cơ quan phối hợp chính: Khơng Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thanh Giang Tổ Công nghệ Sinh học Động vật Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP.HCM Cán bộ/Nhóm thực hiện: ThS Nguyễn Thị Thanh Giang CN Nguyễn Ngọc Quỳnh Chi Thời gian thực hiện: từ tháng 1/2015 đến 12/2016 Kinh phí duyệt: 500.000.000 VNĐ Kinh phí sử dụng: 500.000.000 VNĐ 10 Các nội dung nghiên cứu thực so với đề cương đăng ký STT Nội dung Kết thực Nội dung 1.1; 2.1 3.1 (thu nhận Tỉ lệ nang trứng sống nang trứng thứ cấp, phức hợp COCGs tam cấp, phức hợp nguyên vẹn 80% COCGs) Nội dung 1.2 1.3 (nuôi cấy Nang trứng sống đánh giá phát phát triển, hình thành triển nang thứ xoang cấp) PL Thời gian (bắt đầu – kết thúc) tháng 1/2015 – 6/2015 tháng 7/2015-9/2015 Đánh giá Đạt Đạt Nội dung 2.2 2.3 (nuôi cấy Nang trứng sống đánh giá phát phát triển triển nang tam cấp) Nội dung 2.4 2.5 (nuôi trưởng Trứng trưởng thành, thành đánh giá tỉ xuất thể cực lệ thụ tinh thụ tinh trứng thu từ nang tam cấp) Nội dung 3.2 3.3 (nuôi cấy Trứng trưởng thành, đánh giá trưởng xuất thể cực thành phức hợp thụ tinh COCGs) Nội dung 3.4 (đánh giá tỉ lệ thụ tinh trứng thu từ Trứng thụ tinh phức hợp COCGs); tổng hợp kết viết nghiệm thu PL 3 tháng Đạt 10/2015-12/2016 tháng Đạt 1/2016-5/2016 tháng Đạt 6/2016-10/2016 tháng 11/2016-12/2016 Đạt II ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Theo nghiên cứu báo cáo nay, thành phố Hồ Chí Minh tỉnh phía Nam chưa có đơn vị sản xuất để cung cấp phơi bị nhằm phục vụ ngành cơng nghiệp bị sữa Trong đó, có nhiều nghiên cứu việc thụ tinh ống nghiệm xác định giới tính phơi bò trước cấy chuyền Trong thời gian từ năm 2010 – 2014, Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh thực thành cơng nghiên cứu tạo phơi bị “Một số cải tiến quy trình tạo phơi bị in vitro làm tăng hiệu suất tạo phôi đến giai đoạn phôi nang” (Ngô Thị Mai Hương cs, 2011); “Nghiên cứu ứng dụng quy trình sinh thiết phơi nang xác định giới tính phơi bị từ phơi bào sinh thiết” (20112013, Ngô Thị Mai Hương cs, tài liệu chưa công bố) Những nghiên cứu thu số kết tỉ lệ thụ tinh đạt khoảng 80%; tỉ lệ phơi bị phát triển tới giai đoạn phôi nang đạt 25% thành công việc sinh thiết, xác định giới tính phơi bị trước cấy chuyền phản ứng PCR Tuy nhiên, nghiên cứu tạo phơi bị in vitro gặp khó khăn nguồn trứng trứng thu nhận buồng trứng bị (in vivo) có số lượng ít, số lượng nang trứng nhỏ thường nhiều nang trội ít, chí có buồng trứng khơng có nang trứng trội Tuy nhiên, buồng trứng bò “kho” chứa trứng chưa trưởng thành (những trứng nằm nang trứng thứ cấp, tam cấp ), thu nhận sử dụng nguồn trứng từ bị cao sản sử dụng hết khả sinh sản có đặc tính di truyền tốt Những bò cao sản 6.000 kg/1chu kỳ trở lên, sau hết thời hạn khai thác sữa (thường sau lứa sữa, độ tuổi – 10 tuổi) loại thải Trước giết mổ, nên thu buồng trứng để khai thác tồn nang trứng thứ cấp, tam cấp nuôi cấy có nguồn trứng chất lượng cao, tiến hành IVF tạo phơi bị cao sản Hiện nay, tổng đàn bị sữa nước ta có 200.000 con, 100.000 sinh sản [Thống kê 2013, Bộ NN.PTNT] Trong đó, bò cao sản (6.000kg/ck trở lên) chiếm tỷ lệ 10% , tức có 10.000 bị cao sản Khi đến tuổi loại thải, cần khai thác buồng trứng 10% số bò (= 1.000 con), có số lượng lớn nang thứ cấp nang tam cấp đem nuôi cấy, thu nguồn tế bào trứng chất lượng cao dồi Do đó, việc nghiên cứu ni trưởng thành in vitro trứng bò thu nhận giai đoạn nang trứng thứ cấp, tam cấp cần thiết Nguồn trứng này, sau nuôi trưởng thành, cung cấp nguồn nguyên liệu quan trọng cho việc sản xuất thương mại phơi bị chất lượng cao Ngồi ra, từ nguồn trứng thành lập ngân hàng trứng nhằm hỗ trợ cho nghiên cứu, ứng dụng chuyển gen phục vụ y học, tạo giống chất lượng cao, bảo tồn loại động vật bờ vực tuyệt chủng Trong đề tài này, để chuẩn phương pháp để giảm chi phí nghiên cứu, chúng tơi sử dụng trứng từ bị lị mổ (bò thịt, bò sinh sản kém, suất thấp khơng thể làm nguồn ngun liệu để tạo phơi bị chất lượng cao, sinh giống chất lượng cao) Khi bước vào giai đoạn sản xuất trứng để tạo phơi bị cao sản, cung cấp cho ngành Chăn ni bị sữa chúng tơi phải thu nhận trứng bò cao sản từ nước (hoặc nhập nước ngoài) hết thời hạn khai thác sữa, cắt lấy buồng trứng để thu nhận tất nang trứng (sơ cấp, thứ cấp, tam cấp), tới hàng ngàn cái, ni tới giai đoạn chín, làm thụ tinh ống nghiệm, tạo phôi in vitro Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn Nghiên cứu ni trưởng thành trứng bị giai đoạn nang trứng thứ cấp (đường kính nang 170-200 µm) giai đoạn hình thành xoang sớm (early antral follicle) thực nước từ năm 1994 (Figueiredo cs, 1994; Saha cs, 2000) Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu ni nang trứng chưa trưởng thành bị, nghiên cứu người thực từ năm 2006 Đây nghiên cứu thực Việt Nam để chủ động nguồn trứng cho nghiên cứu tạo phôi, chuyển gen, cloning Nghiên cứu thành công nuôi trứng chưa trưởng thành, kết hợp với kết đạt tạo phơi bị IVF xác định giới tính phơi phịng thí nghiệm bước tiến lớn, đưa công nghệ hỗ trợ sinh sản vào thực tế chăn nuôi Việt Nam PL 398 399 400 401 402 403 404 405 598.6 600.6 611.3 719.5 579.2 617.5 727.8 693.6 647.5 725.9 729.5 730.1 729.9 720.8 Phức hợp COCGs STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Đối chứng 13 91.2 118.9 99.8 101.8 93.4 101.4 94.6 107.5 95.7 103.3 99.3 103.2 92.6 114.7 91.7 94.1 94.6 94.7 93.1 96.5 97.3 98.1 94.4 92.8 99.7 95.2 96.4 92.5 91.7 95.3 97.5 99.5 99.7 90.3 95.8 95.3 96.1 92 96.3 99.1 94.1 Nghiệm thức 13 95.5 120 96.3 119.3 94.6 110 94.4 119.5 92.8 118.9 96.8 101.8 95.2 101.4 96.4 107.5 96.3 103.3 91.7 103.2 95.3 119.3 97.5 103.6 99.5 109.5 99.7 119.4 90.3 118.4 95.8 117.5 95.3 116.4 96.1 109.3 94.6 119.9 96.3 119.4 99.1 118.9 94.1 101.8 94.6 101.4 94.7 107.5 93.1 103.3 96.5 103.2 97.3 118.3 98.1 103.6 94.4 109.5 92.8 119.4 99.7 118.4 95.2 105.3 96.4 118.4 92.5 103.2 PL 14 602.5 724.6 604.5 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 94.6 94.7 93.1 96.5 97.3 98.1 94.4 92.8 99.7 95.2 96.4 92.5 91.7 95.3 97.5 99.5 99.7 90.3 95.8 95.3 96.1 92 96.6 95.7 93.6 97.2 98.8 93.3 92.7 96.9 94.8 91.6 90.4 92.5 91.7 95.3 97.5 99.5 99.7 90.3 95.8 95.3 96.1 92 96.6 95.7 93.6 91.7 95.3 97.5 99.5 99.7 95.8 95.8 95.3 96.1 92 96.6 95.7 93.6 97.2 98.8 93.3 92.7 96.9 94.8 94.6 93.6 92.5 93.6 95.3 97.5 99.5 99.7 94 95.8 95.3 96.1 92 96.6 95.7 93.6 97.2 98.8 93.3 92.7 96.9 94.8 91.6 90.4 97.3 98.1 94.4 92.8 PL 15 106.3 117.5 119.1 118.9 101.8 101.4 107.5 103.3 103.2 119.7 103.6 109.5 115.2 103.3 103.2 118.9 103.6 109.5 115.2 118.4 117.5 116 109.3 116.6 119.4 118.9 101.8 101.4 107.5 117.4 116.3 119.6 112.6 107.9 103.3 103.2 114.7 103.6 109.5 115.2 118.4 117.5 113.5 109.3 116.6 119.4 118.9 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 97.2 98.8 93.3 92.7 96.9 94.8 91.6 90.4 97.3 98.1 94.4 92.8 99.7 95.2 96.4 92.5 91.7 95.3 97.5 99.5 99.7 90.3 95.8 95.3 96.1 92 96.3 99.1 94.1 94.6 94.7 93.1 96.5 97.3 98.1 94.4 92.8 99.7 95.2 96.4 92.5 91.7 95.3 97.5 99.5 99.7 90.3 99.7 95.2 96.4 92.5 94.7 95.3 95 96.3 95 94 95.8 95.3 96.1 95 96.3 97 94.1 94.6 94.7 93.1 96.5 97.3 95.2 94.4 92.8 96.1 95.2 96.4 92.5 93.9 95.3 97.5 94.6 96 94.9 95.8 95.3 96.1 94.7 93.4 94.6 95.7 96.3 92.6 91.7 94.1 94.6 PL 16 120 117.8 120 119.6 103.6 109.5 118.7 118.4 117.5 119 109.3 113.8 106.3 117.5 119.1 118.9 101.8 114.2 107.5 103.3 114.8 120 113 109.5 119.5 118.9 115.3 117.8 111.6 113.7 120 114.7 110 117 115.2 118.4 117.5 113.5 114.4 116.6 119.4 118.9 120 101.4 116.2 118.3 109.9 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 95.8 95.3 96.1 99.8 93.4 94.6 95.7 99.3 92.6 91.7 94.1 94.6 94.7 93.1 96.5 97.3 98.1 94.4 92.8 99.7 95.2 96.4 92.5 91.7 95.3 97.5 99.5 99.7 90.3 95.8 95.3 96.1 91.1 93.5 99.5 97.3 98.2 99.6 100 90.7 90 96.7 94.7 95.5 92.5 91.7 95.3 94.7 93.1 96.5 95 96.1 94.4 92.8 94 95.2 96.4 92.5 93 95.3 97.5 95.2 96 94.1 95.8 95.3 96.1 94.3 93.5 96 97.3 95.7 95 97.3 93 97 96.7 94.7 95.5 92.5 93 95.3 97.5 96 94 95.1 95.8 95.3 96.1 95.9 93.4 94.6 95.7 96 PL 17 116.7 119.7 108.5 115.3 117.3 116.6 119.4 119.5 119 120 120 116.2 118.3 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 97.5 99.5 99.7 90.3 95.8 95.3 96.1 99.8 93.4 94.6 95.7 99.3 92.6 91.7 94.1 94.6 94.7 93.1 96.5 97.3 98.1 94.4 92.8 99.7 95.2 96.4 92.5 91.7 95.3 97.5 99.5 99.7 90.3 95.8 95.3 96.1 91.1 93.5 99.5 97.3 98.2 99.6 94.1 94.6 94.7 93.1 96.5 92.6 95.2 94.1 94.6 94.7 93.1 96.5 96.2 95 94.4 92.8 97 95.2 91.2 96.1 93.4 94.6 95.7 95.9 93.5 96.3 94.1 94.6 94.7 93.1 96.5 95.2 96 94.4 94.5 96.2 95.2 96.4 95.1 95.4 95.3 95.8 96.5 96.1 94.7 95.8 95.3 96.1 94.7 96.3 99.1 94.1 PL 18 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 97.3 98.1 94.4 92.8 99.7 95.2 96.4 92.5 91.7 95.3 97.5 99.5 99.7 90.3 95.8 95.3 96.1 92 96.6 95.7 93.6 97.2 98.8 93.3 92.7 96.9 94.8 91.6 90.4 92.5 91.7 95.3 97.5 99.5 99.7 90.3 95.8 95.3 96.1 92 96.6 95.7 93.6 97.2 98.8 93.3 92.7 94.6 94.7 93.1 96.5 94.9 95.7 94.4 95.3 96.1 95.7 96.6 95.7 93.6 96.1 94.4 94.1 94.9 96.9 94.8 94.6 96.1 95.5 94.6 95.3 96.8 95.7 96.1 90.3 95.8 95.3 96.1 96.5 96.6 95.7 93.6 95.3 95.9 93.3 94.9 96.9 94.8 94.9 94.6 95.1 96.2 94.4 95.5 PL 19 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 96.9 94.8 91.6 90.4 97.3 98.1 94.4 92.8 99.7 95.2 96.4 93.4 94.6 95.7 99.3 92.6 91.7 94.1 94.6 94.7 93.1 96.5 97.3 98.1 94.4 92.8 99.7 95.2 97.7 92.7 98.2 95.5 95.2 96.4 93.4 94.6 95.7 94.8 92.6 95.7 94.1 94.6 94.7 93.1 96.5 97.3 95.5 94.4 94.7 99.7 95.2 97.7 92.7 98.2 95.4 94.6 96.6 96.6 96.3 97.7 94.6 95.5 NANG TRỨNG THỨ CẤP Nghiem thuc Ngay Mean Standard Error Median Standard Deviation Sample Variance Range Minimum Maximum Ngay 18 184 0.921518 175 13.03224 169.8392 30 170 200 PL 20 251.6643 1.606437 241 19.00761 0.416964 59 230 289 Sum Count Largest(1) Smallest(1) Confidence Level(95.0%) 36800 200 200 170 35233 140 289 230 1.817194 3.176211 Nghiem thuc Ngay Mean Standard Error Median Standard Deviation Sample Variance Range Minimum Maximum Sum Count Largest(1) Smallest(1) Confidence Level(95.0%) Ngay 18 181.005 0.850111 174 12.02238 144.5377 30 170 200 36201 200 200 170 259.2705 2.035787 262.5 22.48601 505.6204 59 230 289 31631 122 289 230 1.676381 4.030378 Nghiem thuc Ngay Mean Standard Error Median Standard Deviation Sample Variance Range Minimum Maximum Sum Count Largest(1) Smallest(1) 180.095 0.851885 173 12.04748 145.1417 30 170 200 36019 200 200 170 PL 21 Ngay 18 276.5149 0.940357 279 10.88541 118.4923 42 247 289 37053 134 289 247 Confidence Level(95.0%) 1.679881 1.859989 SO SANH KHAC BIET DUONG KINH NANG VAO NGAY Summary Statistics Count Average Standard Coeff of deviation variation N0_NT1 200 184.0 13.0322 7.08274% N0_NT2 200 181.005 12.0224 6.64202% N0_NT3 200 180.095 12.0475 6.68951% Total 600 181.7 12.4679 6.86182% N0_NT1 N0_NT2 N0_NT3 Total Minimum Maximum Range Stnd skewness 170.0 170.0 170.0 170.0 200.0 200.0 200.0 200.0 30.0 30.0 30.0 30.0 1.38784 4.06821 4.98867 5.87181 Stnd kurtosis -5.44413 -3.86101 -3.27007 -7.70478 ANOVA Table Source Sum of Squares Between 1669.81 groups Within groups 91444.2 Total (Corr.) 93114.0 Df Mean Square 834.905 F-Ratio P-Value 5.45 0.0045 597 153.173 599 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups N0_NT3 200 180.095 X N0_NT2 200 181.005 X N0_NT1 200 184.0 X Contrast Sig Difference +/- Limits N0_NT1 * 2.995 2.43064 N0_NT2 N0_NT1 * 3.905 2.43064 N0_NT3 N0_NT2 0.91 2.43064 N0_NT3 * denotes a statistically significant difference SO SANH KHAC BIET DUONG KINH NANG VAO NGAY 13 Summary Statistics Count Average Standard Coeff of deviation variation N18_NT1 140 251.664 19.0076 7.55277% N18_NT2 122 259.27 22.486 8.6728% N18_NT3 134 276.515 10.8854 3.93665% PL 22 Minimum Maximum Range Stnd skewness 230.0 230.0 247.0 289.0 289.0 289.0 59.0 59.0 42.0 2.01413 -0.0868215 -5.06146 Total 396 262.417 20.8179 N18_NT1 N18_NT2 N18_NT3 Total Stnd kurtosis -3.4473 -4.01031 1.08972 -6.12828 ANOVA Table Source Sum of Squares Between 44027.5 groups Within groups 127159 Total (Corr.) 171186 Df 7.93313% Mean Square 22013.7 230.0 F-Ratio P-Value 68.04 0.0000 289.0 393 323.559 395 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean N13_NT1 140 N13_NT2 122 N13_NT3 134 Homogeneous Groups 251.664 X 259.27 X 276.515 X Contrast Sig Difference +/- Limits N18_NT1 * -7.60621 4.37998 N18_NT2 N18_NT1 * -24.8506 4.2739 N18_NT3 N18_NT2 * -17.2444 4.4254 N18_NT3 * denotes a statistically significant difference NANG TRUNG TAM CAP Đối chứng Ngày Mean Standard Error Median Standard Deviation Sample Variance Range Minimum Maximum 665.9061728 2.49046515 658.5 50.11964434 2511.978749 178.4 577.8 756.2 PL 23 Ngày 13 2704.944025 15.87319307 2699.1 283.0595805 80122.72613 959 2056.4 3015.4 59.0 -2.63008 Sum Count Largest(1) Smallest(1) Confidence Level(95.0%) 269692 405 756.2 577.8 4.895889071 860172.2 318 3015.4 2056.4 31.23012098 Nghiệm thức Ngày Mean Standard Error Median Standard Deviation Sample Variance Range Minimum Maximum Sum Count Largest(1) Smallest(1) Confidence Level(95.0%) 674.2667494 2.577699409 687.4 51.7469545 2677.7473 179 577.8 756.8 271729.5 403 756.8 577.8 5.067454575 Ngày 13 2806.211189 13.05904352 2854.6 220.8484653 48774.04465 671.4 2367.4 3038.8 802576.4 286 3038.8 2367.4 25.70441053 Nghiệm thức Ngày Mean Standard Error Median Standard Deviation Sample Variance Range Minimum Maximum Sum Count Largest(1) Smallest(1) Confidence Level(95.0%) 664.791 2.680147622 647.15 53.60295244 2873.27651 179 577.8 756.8 265916.4 400 756.8 577.8 5.268975367 SO SANH KHAC BIET DUONG KINH NANG VAO NGAY ANOVA Table Source Sum of Df Mean F-Ratio Squares Square Between 21592.9 10796.4 4.02 groups Within groups 3.23773E6 1205 2686.91 Total (Corr.) 3.25932E6 1207 PL 24 Ngày 13 2971.507647 4.955327489 3006.4 91.37172416 8348.791977 360.7 2751.9 3112.6 1010312.6 340 3112.6 2751.9 9.747062079 P-Value 0.0182 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals Stnd error Count Mean (pooled s) Lower limit DC_N0 405 665.906 2.57572 662.336 NT1_N0 403 674.267 2.58211 670.688 NT2_N0 400 664.791 2.59177 661.199 Total 1208 668.326 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups NT2_N0 400 664.791 X DC_N0 405 665.906 X NT1_N0 403 674.267 X Upper limit 669.476 677.845 668.383 Contrast Sig Difference +/- Limits DC_N0 - NT1_N0 * -8.36058 7.14828 DC_N0 - NT2_N0 1.11517 7.1617 NT1_N0 * 9.47575 7.17053 NT2_N0 * denotes a statistically significant difference SO SANH KHAC BIET DUONG KINH NANG VAO NGAY 13 ANOVA Table Source Sum of Df Mean F-Ratio Squares Square Between 1.19408E7 5.97042E6 133.35 groups Within groups 4.21297E7 941 44771.3 Total (Corr.) 5.40706E7 943 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals Stnd error Count Mean (pooled s) Lower limit DC_N13 318 2704.94 11.8655 2688.5 NT1_N13 286 2806.21 12.5117 2788.87 NT2_N13 340 2971.51 11.4752 2955.6 Total 944 2831.63 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean DC_N13 318 NT1_N13 286 NT2_N13 340 Homogeneous Groups 2704.94 X 2806.21 X 2971.51 X Contrast Sig Difference +/- Limits DC_N13 - NT1_N13 * -101.267 33.7964 DC_N13 - NT2_N13 * -266.564 32.3525 NT1_N13 * -165.296 33.2746 NT2_N13 * denotes a statistically significant difference PHUC HOP COGCs PL 25 Upper limit 2721.39 2823.55 2987.41 P-Value 0.0000 Nghiệm thức Ngày Ngày 13 Mean Standard Error Median Standard Deviation Sample Variance Range Minimum Maximum Sum Count Largest(1) Smallest(1) Confidence Level(95.0%) Nghiệm thức Mean Standard Error Median Standard Deviation Sample Variance Range Minimum Maximum Sum Count Largest(1) Smallest(1) Confidence Level(95.0%) 95.33433333 0.155027827 95.3 2.685160737 7.210088183 10 90 100 28600.3 300 100 90 0.305083861 Ngày 95.25033333 0.097196486 95.3 1.683492514 2.834147046 9.4 90.3 99.7 28575.1 300 99.7 90.3 0.191275848 107.2571429 2.615053231 103.3 6.918780515 47.86952381 17.5 101.4 118.9 750.8 118.9 101.4 6.398804742 Ngày 13 113.1347518 0.541035431 116 6.424439785 41.27342655 18.6 101.4 120 15952 141 120 101.4 1.069656111 T-TEST: SO SÁNH SỰ KHÁC BIỆT TRUNG BÌNH KÍCH THƯỚC NANG TẠI NGÀY GIỮA NGHIỆM THỨC t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances Mean Variance Observations Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T