SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG V[.]
SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN SỰ TĂNG SINH KHỐI MÔ SẸO CÂY THÔNG ĐỎ LÂM ĐỒNG (Taxus wallichiana Zucc.) Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thanh Hiền Cơ quan chủ trì: Trung tâm phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 1/2009 MỤC LỤC Trang Trang mở đầu Danh sách chữ viết tắt i Danh sách bảng ii Danh sách biểu đồ iii Danh sách hình ảnh iv CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung thông đỏ 1.1.1 Vị trí phân loại đặc điểm cấu tạo loài Taxus wallichiana Zucc 1.1.2 Đặc điểm sinh thái phân bố thông đỏ Lâm Đồng 1.1.2.1 Đặc điểm sinh thái 1.1.2.2 Phân bố 1.2 Khai thác bảo tồn thông đỏ 1.2.1 Nguồn nguyên liệu thực vật thương mại 1.2.2 Bảo tồn thông đỏ 1.3 Các nghiên cứu thông đỏ Việt Nam 1.4 Những tiến gần nuôi cấy tế bào thông đỏ phục vụ sản xuất dƣợc chất taxol 1.4.1 Cảm ứng tăng trưởng mô sẹo 1.4.2 Chọn lọc dòng tế bào 1.4.3 Nghiên cứu động học nuôi cấy tế bào 1.4.4 Sự tích hợp trình sinh học 1.4.5 Kích thích sản xuất taxol 10 1.4.6 Nuôi cấy tế bào mật độ cao 10 1.4.7 Nuôi cấy bioreactor 11 1.5 Nuôi cấy mô sẹo 11 1.5.1 Nguồn mẫu 11 1.5.2 Khử trùng mẫu 11 1.5.3 Chuẩn bị mẫu cấy 12 1.5.4 Môi trường nuôi cấy 12 1.5.5 Cấy chuyền 12 1.5.6 Xác định tăng trưởng mô sẹo 13 1.6 Taxol 13 1.6.1 Sự tổng hợp taxol (paclitaxel) 13 1.6.2 Các phương pháp phân tích dùng sản xuất taxoid nuôi cấy Taxus spp in vitro 14 1.6.3 Tăng trưởng tế bào sản xuất taxoid 16 1.6.4 Cơ chế tác động taxol (paclitaxel) lên tế bào ung thư 18 CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1 Chuẩn bị mẫu 20 2.1.1 Nguồn mẫu ban đầu 20 2.1.2 Lấy mẫu 20 2.2 Tạo nguồn mẫu in vitro 21 2.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy 21 2.4 Phƣơng pháp thực 22 2.4.1 Xác định trọng lượng mô sẹo 22 2.4.2 Xác định trọng lượng tươi sinh khối 22 2.4.3 Hệ thống nuôi cấy lỏng lắc 22 2.4.4 Hệ thống ni cấy lỏng sục khí 22 2.5 Điều kiện thí nghiệm 22 2.6 Bố trí thí nghiệm 23 2.6.1 Thiết lập nuôi cấy mô sẹo in vitro khảo sát mơi trường thích hợp nhân nhanh mơ sẹo 23 2.6.2 Khảo sát nuôi cấy mô sẹo môi trường lỏng 23 2.6.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô sẹo 24 2.6.4 Khảo sát khả tái sinh mô sẹo 24 2.6.5 Kiểm tra diện taxol 10-DAB 24 2.7 Phân tích số liệu 24 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Thiết lập nuôi cấy mô sẹo in vitro khảo sát mơi trƣờng thích hợp nhân nhanh mơ sẹo 27 3.1.1 Ảnh hưởng vị trí mẫu cấy mơi trường lên hình thành phát triển mô sẹo 27 3.1.2 Ảnh hưởng than hoạt tính lên hình thành tăng trưởng mơ sẹo 30 3.1.3 Ảnh hưởng nước dừa lên sinh trưởng mô sẹo 31 3.1.4 Cấy chuyền nhân nhanh mô sẹo 32 3.2 Nuôi cấy mô sẹo môi trƣờng lỏng 32 3.2.1 Nuôi cấy mô sẹo môi trường lỏng 32 3.2.2 Nuôi cấy mô sẹo hệ thống nuôi cấy lắc 33 3.2.3 Ni cấy mơ sẹo mơi trường lỏng có sục khí 37 3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy mô sẹo 39 3.3.1 Ảnh hưởng thống khí 39 3.3.2 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng 39 3.3.2.1 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên hình thành mơ sẹo 39 3.3.2.2 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên tăng trưởng mô sẹo 40 3.4 Khả tái sinh mô sẹo 42 3.5 Kiểm tra diện taxol 10-DAB 43 CHƢƠNG KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Đề nghị 47 Phụ lục 48 Tài liệu tham khảo 49 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT 2,4-D 2,4 - Dichlorophenoxy acetic acid 10-DAB 10-deacetyl baccatin III AcCl chlorine acetate DMAP 4-dimethylaminopyridine DPC di-2-pyridylcarbonate Et3SiO triethylsilyl group IAA Indole - - acetic acid IBA Indole - - butyric acid NAA - Naphthalene acetic acid Py pyridine PhMe Toluene MS Murashige Skoog, 1962 B5 Gamborg cộng sự, 1968 HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao i DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG Các thử nghiệm miễn dịch xác định taxol (paclitaxel) 16 Các loại mơi trường hình thành mơ sẹo 21 Trọng lượng tươi mơ sẹo hình thành từ mẫu cấy khác 27 loại môi trường khác sau 12 tuần ni cấy Kết hình thành mô sẹo sau 12 tuần nuôi cấy 30 Kết hình thành mơ sẹo sau 12 tuần ni cấy mơi trường có chứa than hoạt tính 31 Ảnh hưởng nước dừa lên sinh trưởng mô sẹo Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) sau tuần nuôi cấy 31 Trọng lượng tươi mô sẹo cấy chuyền sau tuần nuôi cấy 32 Kết mô sẹo nuôi cấy môi trường lỏng sau tuần nuôi cấy 33 Ảnh hưởng nước dừa ánh sáng lên sinh trưởng mô sẹo Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) sau tuần nuôi cấy 40 10 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy thời điểm lấy dịch huyền phù lên tái sinh mô sẹo Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) điều kiện tối 42 ii DANH SÁCH BIỂU ĐỒ SỐ TÊN BIỂU ĐỒ TRANG Trọng lượng tươi mơ sẹo hình thành từ đoạn thân 29 loại môi trường khác sau 12 tuần nuôi cấy Sinh khối tươi dịch huyền phù tế bào Thơng đỏ vịng 24 ngày nuôi cấy 34 Trọng lượng tươi sinh khối huyền phù tế bào thông 38 đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) sau 24 ngày nuôi cấy Sắc ký đồ phổ UV mẫu thử iii 44 DANH SÁCH HÌNH ẢNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG Cây thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) trưởng thành Các phận Thông đỏ (Taxus spp.) 3 Một số loài thuộc chi Taxus giới 4 Tế bào thông đỏ Taxus baccata quan sát kính hiển vi Cấu trúc phân tử taxol 14 Bán tổng hợp taxol theo phương pháp Potier Greene (1988) 15 Cơ chế hoạt động paclitaxel: ức chế phân chia tế bào chuyển từ G0 sang G1 tiền nguyên phân G2 phase nguyên phân chu trình tế bào 19 Cây thông đỏ nhân giống phương pháp giâm cành Viện Sinh học Tây Ngun 20 Qui trình ni cấy mơ sẹo 25 10 Qui trình tạo huyền phù tế bào tái sinh mô sẹo thông đỏ Taxus wallichiana Zucc 26 11 Sự hình thành mơ sẹo từ thân sau 12 tuần 28 12 Mô sẹo thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) sau tuần nuôi cấy môi trường C3 điều kiện sáng 32 13 Mô sẹo nuôi cấy lỏng nuôi cấy lắc 35 14 Ảnh hưởng ánh sáng nước dừa tăng trưởng mô sẹo 36 15 Nuôi cấy mô sẹo thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) hệ thống sục khí tự tạo 36 16 Huyền phù tế bào thơng đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) erlen sục khí: thiết lập (trái), sau tuần nuôi cấy (phải) có xuất cụm tế bào lớn 38 17 Ảnh hưởng ni cấy thống khí lên hình thành 41 iv phát triển mô sẹo sau tuần nuôi cấy 18 Ảnh hưởng ánh sáng lên nuôi cấy mô sẹo thông đỏ (sau tuần nuôi cấy) 41 19 Mô sẹo tái sinh sau tháng nuôi cấy môi trường thạch 43 v CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THÔNG ĐỎ 1.1.1 Vị trí phân loại đặc điểm cấu tạo lồi Taxus wallichiana Zucc Ngành: Lớp: Bộ: Họ: Chi: Loài: PINOPHYTA Pinopsida Pinales Taxaceae Taxus Taxus wallichiana Zucc Hình Cây thơng đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) trưởng thành Những quan sát thông đỏ Lâm Đồng cho thấy, thuộc loại đại mộc, trưởng thành đạt chiều cao 30 m, đường kính gốc 1,6 m, tán xịe rộng, vỏ ngồi có màu nâu đỏ nhạt, bên có màu đỏ sậm, thân nhẵn; mọc cách xếp hai dãy hình chữ S, dài khoảng – 3,5 cm, rộng – mm Mặt có màu xanh thẫm, mặt màu xanh nhạt (Hình 1, 2) Về mặt sinh sản, thơng đỏ đơn tính khác gốc; nón đực mọc nách tập trung đỉnh cành thành cụm, có màu vàng nhạt, hình trứng, cuống ngắn có – 10 nhị, nhị có – túi phấn; nón mọc đơn độc nách lá, phân bố dọc theo suốt đoạn cành Đặc biệt vào mùa hoa, “quả” phân bố đoạn cành cũ tiếp sau đoạn cành mang nón Nón đực nón phân bố đoạn cành Hạt có vỏ cứng, lúc cịn non có áo hạt màu trắng gốc hạt, sau phát triển dần lên bao phủ hạt màu sắc chuyển dần sang xanh, cuối hạt chín chuyển dần sang màu đỏ Thơng đỏ Lâm Đồng có điểm đặc biệt vào mùa “quả” chín lúc bắt đầu hoa (nghĩa từ lúc hoa đến chín trịn năm) Khi cịn non có màu xanh, già phần hạt chuyển sang màu nâu sậm, chín áo hạt chuyển sang màu đỏ, lý T wallichiana có tên địa phương “cây thơng đỏ” Hạt thơng đỏ có dạng hình thn dài, hai đầu nhọn, đường kính trung bình mm, chiều dài trung bình 1,5 cm Mùa hoa khoảng tháng – đến tháng – năm sau kết trái mùa chín khoảng tháng – 12 Cây sinh trưởng thích hợp với vùng đất có độ ẩm cao, thường thấy chúng mọc rải rác theo đường giao thủy hai đồi núi, khe suối cạn có nước, mọc hỗn giao với rộng, không thấy phân bố rừng kim loài 1.1.2 Đặc điểm sinh thái phân bố thông đỏ Lâm Đồng 1.1.2.1 Đặc điểm sinh thái Thông đỏ Lâm Đồng (T wallichiana) gỗ thường xanh, phân bố sườn hay chân đỉnh núi cao, đặc biệt tập trung khu vực giao thủy hai sườn núi hay đồi có nhiều đá tảng gần khe suối cạn Thông đỏ Lâm Đồng sinh trưởng tốt khu vực có rộng, hỗn giao với lồi kim, đặc biệt thường phân bố chung với: kim giao, dẻ, hồng tùng, đỉnh tùng, huỳnh đàn giả, thông lông gà, thông tre, du sam Thông đỏ Lâm Đồng phân bố độ cao 1.200 – 1.600 m, đất nâu vàng phiến thạch hay đất nâu đỏ basalt Cây sống nơi có độ ẩm đất cao (30 – 40%), độ ẩm khơng khí 85 – 90%, độ pH đất dao động 5,1 – 5,6; đất giàu mùn, tơi xốp, thảm mục dày Đây lồi ưa sáng Thơng đỏ Lâm Đồng lồi phân bố hẹp, q dạng nguy cấp (R) 1.1.2.2 Phân bố Ở nước ta có hai lồi thơng đỏ thuộc họ Taxacaea (thanh tùng) thông đỏ Trung Quốc (T chinensis) thông đỏ Hymalaya (T wallichiana) Thông đỏ Trung Quốc phân bố Thài Phìn Tủng (huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang), Mai Châu (Hịa Bình), đường lên đỉnh Fan Si Pan (Lào Cai), rừng rậm ẩm ướt núi đá vôi Thông đỏ Hymalaya mọc rải rác khu rừng rậm Khánh Hòa, Lâm Đồng Nguyễn Trí Minh (2000) nghiên cứu đặc điểm sinh học khả phát triển thông đỏ vùng Lâm Đồng, xác định T wallichiana phân bố tập trung ở: khu vực Xuân Thọ (thành phố Đà Lạt), khu vực núi Voi hai xã Hiệp Thạnh Hiệp An (huyện Đức Trọng), khu vực huyện Lạc Dương, khu vực Hồ Tiên thuộc xã Thạnh Mỹ (huyện Đơn Dương) Tuy có phân bố hơn, sinh khối tế bào erlen có sục khí lại tụ hợp lại thành cụm mà khơng phân tán bên dung dịch nuôi cấy Điều luồng khơng khí thổi vào bên erlen không đều, di chuyển cục dịng chất lỏngtrong dung dịch ni cấy tác động dịng khơng khí làm hình thành cụm tế bào Trong đó, chuyển động lắc trịn máy lắc trường hợp nuôi cấy lắc làm cho sinh khối phân bố tốt Kết thí nghiệm khẳng định ưu hệ thống ni cấy sục khí nhân sinh khối tế bào Huyền phù tế bào không thu từ hệ thống nuôi cấy di chuyển dịng khí thiết kế chưa phù hợp Như vậy, cần có nghiên cứu sâu để khẳng định ảnh hưởng điều kiện sục khí lên nuôi cấy huyền phù tế bào thông đỏ T wallichiana 3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy mơ sẹo 3.3.1 Ảnh hƣởng thống khí Sau tuần nuôi cấy, kết cho thấy hầu hết mơ sẹo bình thống khí (cả mơi trường đặc lỏng) hóa nâu chết Trong đó, bình đối chứng khơng thống khí phát triển bình thường Ở bình ni cấy lỏng thống khí, lượng chất lỏng cạn nhanh so với bình khơng thống khí; bình mơi trường đặc thống khí khơng có nước đọng thành bình Điều giải thích hệ thống thống khí, nước trao đổi qua lại mơi trường bình ni cấy mơi trường ngồi Chính vậy, độ ẩm bình thống khí thấp bình khơng thống khí Mặt khác, phân tử nước ngồi dễ dàng qua lớp giấy nên lượng mơi trường bình ni cấy lỏng thống khí thấp so với bình khơng thống khí (do bốc nước) sau khoảng thời gian nuôi cấy Sự thoát nước làm cho nồng độ chất khống chất điều hịa tăng trưởng có môi trường trở nên đậm đặc gây dộc cho tế bào nên mơ sẹo bình thống khí khơng phát triển Do đó, ni cấy thống khí khơng thích hợp cho việc ni cấy mơ sẹo Thơng đỏ (Hình 17) 3.3.2 Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng 3.3.2.1 Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng lên hình thành mơ sẹo Tiến hành ni cấy đoạn thân Thông đỏ điều kiện khác cường độ chất lượng ánh sáng khác nhau: đặt đèn Neon, đèn 3U (đều có cường độ 3000 lux) tối Kết cho thấy mẫu cấy hình thành mơ sẹo nhanh đặt tối (sau khoảng tuần) khơng hình thành mơ sẹo ni cấy đèn 3U Theo Gibson cộng (1993), ánh sáng ức chế tăng trưởng mô sẹo Trong thí nghiệm này, kết hồn tồn phù hợp với nhận định Đèn 3U loại đèn có cường độ ánh sáng mạnh chất lượng tốt cho phát triển chồi lại ức chế mạnh phát triển mô sẹo Các mô sẹo vàng nhạt, xốp sau cấy chuyền sang môi trường tương ứng, nuôi cấy ánh sáng đèn Neon phịng tối Hầu hết mơ sẹo tối cho 39 mơ sẹo có màu vàng nâu nhạt, số màu trắng Các mơ sẹo tối hình thành nhiều hợp chất phenol mô sẹo đặt ánh sáng Trong đó, mơ sẹo phát triển ánh sáng có màu xanh vàng (Hình 18) 3.3.2.2 Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng lên tăng trƣởng mô sẹo Môi trường C3 xác định môi trường tốt cho việc tạo mô sẹo theo kết thí nghiệm Tiếp tục cấy chuyền mô sẹo sang môi trường C3 C3CW để theo dõi ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên tăng trưởng mô sẹo Kết ghi nhận sau tuần ni cấy (Bảng 9, Hình 14) Bảng Ảnh hưởng nước dừa ánh sáng lên sinh trưởng mô sẹo Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) sau tuần nuôi cấy Môi trƣờng Sáng/Tối Trọng lƣợng tƣơi (g) Trọng lƣợng khơ (g) Hình thái mô sẹo C3 Sáng 1.25 ± 0.11 0.12 ± 0.03 Hơi xanh, cứng, sinh trưởng yếu C3∙CW Sáng 0.45 ± 0.12 0.05 ± 0.02 Hơi xanh, sinh trưởng yếu C3 Tối 1.37 ± 0.11 0.13 ± 0.04 Hơi vàng, mềm, sinh trưởng mạnh C3∙CW Tối 0.87 ± 0.09 0.03 ± 0.02 Hơi nâu, vụn Kết cho thấy môi trường C3 điều kiện tối hồn tồn thích hợp cho tăng trưởng mơ sẹo 40 Hình 17, 18 41 3.4 Khả tạo mô sẹo từ huyền phù Việc tạo mô sẹo từ huyền phù tế bào tiến hành điều kiện tối điều kiện sáng, khơng có mơ sẹo hình thành điều kiện sáng Các khối mơ sẹo quan sát sau tháng nuôi cấy huyền phù tế bào 25 ngày tuổi lên môi trường C3 điều kiện tối Huyền phù thu nhận vào ngày thứ sớm hồn tồn khơng có mơ sẹo Huyền phù thu nhận từ ngày thứ 10-20 tạo mơ sẹo sau tháng nuôi cấy môi trường đặc C2, C3, C4 điều kiện tối (số liệu chưa công bố) có mơ sẹo hình thành mơi trường đặc C5 (hình 19) Từ ngày thứ 12, huyền phù cho bước vào giai đoạn nhân sinh khối giai đoạn tiền ổn định Trong thời kỳ này, huyền phù trải qua giai đoạn phân bào sinh tổng hợp tích cực Khi tế bào thu nhận nuôi cấy môi trường C3, mô sẹo tạo thành tốt phát triển mạnh (Bảng 10) Ngược lại, việc sử dụng mơ sẹo thu nhận sớm tế bào vào giai đoạn đầu pha nghỉ làm chậm tạo thành mơ sẹo tạo mô sẹo không đồng Sự sinh trưởng phát triển mô sẹo tái sinh thể trạng thái sinh lý chúng huyền phù, nên tảng đáng tin cậy để xác định giai đoạn phát triển huyền phù, từ xác định giai đoạn tốt để trích xuất chất có hoạt tính taxol Ni cấy tế bào từ dịch huyền phù cải thiện trạng thái trao đổi chất chúng để nhân dòng tạo dòng tế bào nhiều biện pháp sau Sau tháng ni cấy, điểm tiếp xúc khối mô sẹo mơi trường ni cấy bị hóa nâu Điều sản sinh mức hợp chất polyphenolic mô sẹo, hợp chất ghi nhận khối mô sẹo ban đầu nuôi cấy môi trường đặc, điều cho thấy sản sinh chất trao đổi thứ cấp khối mô sẹo tương tự khối mô sẹo giai đoạn khác tiến trình Tác động ức chế ánh sáng xác định, đặc biệt giai đoạn cấy chuyền tế bào từ huyền phù sang môi trường đặc Bảng 10 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy thời điểm lấy dịch huyền phù lên tái sinh mô sẹo Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) điều kiện tối Thời điểm Thời gian quan sát C2 C3 C4 C5 tháng - - - - tháng - - - - tháng - - - - tháng - - - - tháng - - - - tháng - - - - Ngày thứ Ngày thứ 15 42 tháng + + - - tháng + + - - tháng + + - - tháng + ++ + - tháng ++ +++ + + tháng +++ ++++ ++ ++ Ngày thứ 25 Lƣu ý: Thời điểm: thời điểm thu nhận huyền phù tế bào nuôi cấy môi trường thạch -: khơng có phục tráng mơ sẹo; +: thấy cách rõ ràng; ++: phát triển; +++: phát triển tốt; ++++: phát triển tốt, có cụm mơ sẹo lớn Hình 19 Mơ sẹo tái sinh sau tháng nuôi cấy môi trường thạch a: Trên môi trường C2; b: Trên môi trường C3; c: Trên môi trường C4; d: Trên môi trường C5 3.5 Kiểm tra diện taxol 10-DAB (Phụ lục) Mẫu 02 – 2007: Có diện pic với thời gian lưu trùng với pic taxol chuẩn, (khoảng 53 phút), thêm chuẩn taxol vào mẫu thử, diện tích pic tăng lên, kết luận pic taxol Khơng có diện pic 10-DAB sắc ký đồ Mẫu 03 – 2008: Có diện Taxol sắc ký đồ khơng có diện pic 10-DAB 43 Sắc ký đồ Phổ UV mAU mAU 232nm,4nm (1.00) 75 15 54.136 7.5 50 10 229 5.0 2.5 25 0.0 0 10 20 30 40 50 200 250 300 nm 250 300 nm Mẫu 02 - 2007 mAU 53.628 mAU 232nm,4nm (1.00) 25 75 20 50 229 15 10 25 0 10 20 30 40 50 200 Mẫu 02 – 2007 có thêm chuẩn Taxol mAU 228nm,4nm (1.00) 25 20 15 55.232 57.904 50.578 10 0 10 20 30 40 50 Mẫu 03 - 2008 Biểu đồ Sắc ký đồ phổ UV mẫu thử Như vậy, hai mẫu đem kiểm tra thấy có diện taxol Kết tiền đề cho nghiên cứu sâu nuôi cấy tế bào định lượng taxol tách chiết taxol làm dược liệu 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường điều kiện nuôi cấy lên tăng sinh khối mô sẹo Thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zucc.)” thu kết định Mô sẹo Thơng đỏ cảm ứng hình thành phát triển tốt từ đoạn thân non môi trường có chứa mg/l 2,4-D mg/l kinetin Mơ sẹo tăng trưởng tốt nuôi cấy tối điều kiện khơng thống khí Các mơ sẹo hình thành có hai dạng: xanh, cứng vàng nâu nhạt, xốp; mô sẹo xanh, cứng dần chuyển sang mô sẹo vàng nhạt, xốp sau nhiều lần cấy chuyền Thời gian cấy chuyền cần thiết sáu tuần Nước dừa có tác dụng tích cực với hình thành huyền phù tế bào Ni cấy mơ sẹo mơi trường lỏng lắc tĩnh có sục khí điều kiện tối hồn tồn, với mơi trường B5 có bổ sung mg/l 2,4-D, mg/l kinetin, 20% (v/v) nước dừa điều kiện thích hợp cho hình thành huyền phù tế bào thông đỏ Taxus wallchiana Zucc Huyền phù tạo có màu vàng cam đỏ, mịn có mật độ tế bào cao Kết tạo mơ sẹo thông đỏ từ huyền phù tế bào cho thấy khả sống sót tạo mơ sẹo tốt huyền phù tế bào Huyền phù tế bào lấy vào ngày thứ 15 trải môi trường thạch C3, điều kiện tối hoàn toàn, cho tạo mô sẹo tốt Kết kiểm tra mẫu mơ sẹo cho thấy có diện taxol khơng có diện 10-DAB Điều mở triển vọng tách chiết trực tiếp taxol từ mẫu mô sẹo nuôi cấy mà bán tổng hợp taxol từ tiền chất 10-DAB Do đó, làm giảm giá thành việc sản xuất taxol đường nuôi cấy mô tế bào 45 Tóm tắt qui trình thực Đoạn thân non Khử trùng mẫu (HgCl2 1‰, cồn 70o) Cấy môi trường có chứa mg/l 2,4-D mg/l kinetin Mô sẹo Cấy chuyền sau tuần Sinh khối mơ sẹo Ni cấy lỏng lắc tĩnh có sục khí điều kiện tối hồn tồn, với mơi trường B5 có bổ sung mg/l 2,4D, mg/l kinetin, 20% (v/v) nước dừa Theo dõi tăng trưởng tế bào Sinh khối mơ sẹo Xác định có diện taxol 10-DAB 46 Tái tạo mô sẹo từ huyền phù 4.2 Đề nghị Trong giới hạn thời gian điều kiện thí nghiệm đề tài này, chưa khảo sát nhiều nhân tố ảnh hưởng đến hình thành tăng trưởng huyền phù tế bào tái sinh mô sẹo, nhiều khía cạnh khác đáng quan tâm từ huyền phù tế bào Chúng tơi đề nghị nên có nghiên cứu hình thành, tăng trưởng huyền phù tế bào tái sinh mô sẹo từ huyền phù: Ảnh hưởng nhiệt độ Ảnh hưởng nồng độ khoáng, tiến hành khảo sát loại môi trường khác Ảnh hưởng số chất đặc biệt bổ sung vào môi trường, ví dụ acid amine, enzyme, v.v… Đánh giá hàm lượng taxol có huyền phù mô sẹo tái sinh Một số nghiên cứu cải tiến hệ thống sục khí ni cấy huyền phù tế bào cần tiến hành Cần khảo sát điều kiện kết hợp sục khí ni cấy lắc để thu huyền phù tế bào tốt Ngoài mơ sẹo, chúng tơi đề nghị nên có nghiên cứu phát sinh phôi từ huyền phù tế bào thông đỏ T wallichiana Những nghiên cứu lĩnh vực cung cấp nhiều thông tin sinh lý, phát sinh hình thái tạo nguồn nguyên liệu phục vụ công tác chuyển gene, trước mắt để chiết xuất taxol góp phần bảo vệ loài thực vật quý 47 PHỤ LỤC Thành phần mơi trường khống MS (Murashige Skoog, 1962) B5 (Gamborg cộng sự, 1968) Thành phần Khoáng đa lượng NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 (NH4)2SO4 NH4H2PO4 NaH2PO4.H2O Khoáng vi lượng KI H3BO3 MnSO4.4H2O MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Na2.EDTAb FeSO4.7H2Ob Vitamin chất hữu khác myo-Inositol Nicotinic acid Pyridoxine HCl Thiamine HCl Glycine MS B5 mg/l 1650 1900 440 370 170 mg/l 0.83 6.2 22.3 8.6 0.25 0.025 0.025 37.3 27.8 mM 20.6 18.8 3.0 1.5 1.25 M 5.0 100 100 30 1.0 0.1 0.1 100 100 mg/l 2500 150 250 134 150 mg/l 0.75 3.0 10 2.0 0.25 0.025 0.025 37.3 27.8 mM 25 1.0 1.0 1.0 1.1 M 4.5 50 60 7.0 1.0 0.1 0.1 100 100 mg/l M mg/l M 100 0.5 0.5 0.1 2.0 555 2.5 0.3 27 100 1.0 1.0 10 - 555 30 - 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ARTECA R.N., WICKREMESINHE E 1993 High yield production of taxol and related cytostatic compounds PCT Int Appl WO 9323-955 (Patent) [2] BRINGI V., KADKADE P.G 1993 Increased yields of taxol and taxanes from cell cultures of Taxus species PCT Int Appl WO 9317-121 (Patent) [3] CHEN W.M 1990 Chemical constituents and physiological activity of Taxus spp Acta Pharm Sin 25 (3): 227–240 [4] CHRISTEN A.A., GIBSON D.M., BLAND J 1991 Production of taxol or taxol-like compounds with Taxus brevifolia callus cell culture U.S Patent US 5019504 (Patent) [5] CONSTANTIN M.J., HENKE R.R., MANSUR M.A 1977 Effects of activated charcoal on callus growth and shoot organogenesis in tobacco In Vitro Cell Dev Biol.–Plant 13: 293–296 [6] CRAGG G.M., SCHEPARTZ S.A., SUFFNESS M., GREVER M.R 1993 The taxol supply crisis New NCI policies for handling the large-scale production of novel natural product anticancer and anti-HIV agents J Nat Prod 56 (10): 1657–1668 [7] DƢƠNG TẤN NHỰT, ĐINH VĂN KHIÊM, NGUYỄN THỊ DIỆU HƢƠNG, NGUYỄN THỊ THANH HẰNG, NGUYỄN TRÍ MINH 1995 Nghiên cứu khả rễ đoạn cắt (cutting) thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana) Báo cáo đề tài cấp sở Phân viện sinh học Đà Lạt Lâm Đồng [8] EDGINGTON S.M 1991 Taxol: out of the woods Bio/Technol (10): 933–938 [9] ELLIS D.D., ZELDIN E.L., BRODHAGEN M., RUSSIN W.A., MCCOWN B.H 1996 Taxol production in nodule cultures of Taxus J Nat Prod 59: 246–250 [10] FETT-NETO A.G., DICOSMO F., REYNOLDS W.F., SAKATA K 1992 Cell culture of Taxus as a source of the antineoplastic drug taxol and related taxanes Bio/Technol 10: 1572–1575 [11] FETT-NETO A.G., ZHANG W.Y., DICOSMO F 1994a Kinetics of taxol production growth, and nutrient uptake in cell suspensions of Taxus cuspidata Biotech Bioeng 44: 205–210 [12] FETT-NETO A.G, MELANSON S.J., NICHOLSON S.A., PENNINGTON J.J., DICOSMO F 1994b Improved taxol yield by aromatic carboxylic acid and amino acid feeding to cell cultures of Taxus cuspidata Biotech Bioeng 44: 967–971 [13] GAMBORG O.L., MILLER R.A., OJIMA K 1968 Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells Exp Cell Res 50: 151–158 49 [14] GAN F.Y., ZHENG G.Z 1994 Advances in cell technological studies on Taxus spp Gouwai Yiyao – Zhiwuyao Fence (4): 156–159 (In Chinese) [15] GIBSON D.M., KETCHUM R.E.B., CHRISTEN A.A 1993 Initiation and growth of cell lines of Taxus brevifolia (Pacific yew) Plant Cell Rep 12 (9): 479–482 [16] GIBSON D.M., KETCHUM R.E.B., HIRASUNA T.J., SHULER M.L 1994 Potential of plant cell culture for taxane production In: SUFFINESS M (Ed.) Taxol science and applications C.R.C Press, Boca Raton New York London Tokyo pp 71–95 [17] HIRASUNA T.J., PESTCHANKER L.J., SRINIVASAN V., SHULER M.L 1996 Taxol production in susepnsion cultures of Taxus baccata Plant Cell Tiss Org Cult 44: 95–102 [18] HOLTON R.A., SOMOZA C., KIM H.B., LIANG F., BIEDIGER R.J., BOATMAN P.D., SHINDO M., SMITH C.C., KIM S., NADIZADEH H., SUZUKI Y., TAO C., VU P., TANG S., ZHANG P., MURTHI K.K., GENTILE L.N., LIU J.H 1994 First total synthesis of taxol Functionalization of the B ring J Am Chem Soc 116: 1597–1598 [19] JAZIRI M., ZHIRI A., GUO Y.W., DUPONT J.P., SHIMOMURA K., HAMADA H., BANHAELEN M., HOMÈS J 1996 Taxus sp cell, tissue and organ cultures as alternative sources for taxoid production: A literature survey Plant Cell Tiss Org Cult 46: 59–75 [20] KANG Q.S., HOU S.S 1993 Recent advances in the research on the natural antitumour drug taxol Nat Prod Res Dev (3): 61–68 [21] KETCHUM R.E.B., GIBSON D.M 1994 Rapid production of taxol in suspension cell cultures of Taxus spp Plant Physiol 105 (1): suppl., 49 [Derwent Biotechnology Abstracts 13 (15): No 94-08827 (1994)] [22] KOZAI T 1991 Micropropagation under photoautotrophic conditions In: DEBERGH P.C., ZIMMERMAN R.H (Eds.) Micropropagation – technology and application Kluwer Academic Publishers, Dordretch, the Netherlands pp 447–469 [23] LÊ THỊ THỦY TIÊN 2008 Nuôi cấy tế bào Taxus sp để thu nhận taxol hợp chất liên quan” Luận án Tiến sĩ Sinh lý thực vật Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TPHCM [24] MAI VĂN TRÌ, NGUYỂN QUẢNG AN, GUERNARD D., GUERITEVOEGELEIN F 1995 Thành phần hoá học thơng đỏ Taxus chinensis Tạp chí Hố Học 33 (1): 57–58 [25] MURASHIGE T., SKOOG F 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15: 473–479 [26] NARAYANASWAMY S 1977 Regeneration of plants from tissue cultures In: REINERT J., BAJAJ Y.P.S (Eds.) Plant cell, tissue, and organ culture Springer-Verlag, Berlin, Germany pp 179–206 50 [27] NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG, LÊ THỊ THỦY TIÊN 2002 Công nghệ tế bào NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh TP Hồ Chí Minh [28] NGUYỄN TRÍ MINH 2000 Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả phát triển thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) vùng Lâm Đồng Luận văn thạc sĩ khoa học ngành sinh học Trƣờng đại học Đà Lạt Lâm Đồng [29] NISSEN S.J., SUTTER E.G 1990 Stability of IAA and IBA in nutrient medium to several tissue culture procedures HortSci 25: 800–802 [30] PAN M.J., VAN STADEN J 1998 The use of charcoal in in vitro culture – a review Plant Grow Regul 26: 155–163 [31] PARK I.S., KIM J.H., YOUN J.H., BYUN S.Y., KIM D.I 1994 Effects of sugar concentration on growth and taxol production in Taxus cuspidata cell cultures In: TEO W.K., YAP M.G.S., OH S.K.W (Eds.) Better living through innovative biochemical engineering National University of Singapore, Singapore pp 131–133 [32] SAITO K., OHASI H., HIKI M., TAHARA M 1993 Process for producing taxol by cell culture of Taxus species PCT Int Appl WO 9313961 (Patent) [33] SCHENK R.U., HILDEBRANDT A.C 1972 Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonuous plant cell cultures Can J Bot 50: 199–204 [34] SCHIPPMANN U 2001 CITES medicinal plants significant trade study Project S German Federal Agency for Nature Conservation, Bonn, Germany [35] SHULER M.L., HIRASUNA T.J., MOSER S 1994 Effects of media manipulation on growth and taxol production in Taxus sp Abstr Pap Am Chem Soc 207 Meet., Pt 2, BTEC 21 [36] SKOOG F., MILLER C.O 1957 Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro Symp Soc Exp Biol 11: 118–131 [37] SRINIVASAN V., PESTCHANKER L., MOSER S., HIRASUNA T.J., TATICEK R.A., SHULER M.L 1995 Taxol-production in bioreactors: kinetics of biomass accumulation, nutrient uptake, and taxol production by cell suspensions of Taxus baccata Biotech Bioeng 47: 666–676 [38] STROBEL G.A., STIERLE A., VAN KUIJK F.J.G.M 1992 Factors influencing the in vitro production of radiolabeled taxol by Pacific yew, Taxus brevifolia Plant Sci 84 (1): 65–74 [39] TORRES K.C 1989 Overview of callus (tissue) and organ culture In: TORRES K.C (Ed.) Tissue culture techniques for horticultural crops Chapman & Hall Publisher, the U.S.A pp 73–84 51 [40] TORRES K.C 1989 Overview of cell suspension culture In: TORRES K.C (Ed.) Tissue culture techniques for horticultural crops Chapman & Hall Publisher, the U.S.A pp 151–160 [41] VIDENSEK N., LIM P., CAMPBELL A., CARSON C 1990 Taxol content in bark, wood, root, leaf, twig and seedling from several Taxus species J Nat Prod 53: 1609–1610 [42] WANI M.C., TAYLOR H.L., WALL M.E., COGGON P., MCPHAIL A.T 1971 Plant antitumour agents V1 The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumour agent from Taxus brevifolia J Am Chem Soc 93: 2325–2327 [43] WEATHERHEAD M.A., BURDON J., HENSHAW G.G 1978 Some effects of activated charcoal as additive to plant tissue culture media Z Planzenphysiol 89: 141– 147 [44] WICKREMESINHE E.R.M., ARTECA R.N 1993 Taxus callus cultures: initiation, growth optimization, characterization and taxol production Plant Cell Tiss Org Cult 35 (2): 181–193 [45] WICKREMESINHE E.R.M., ARTECA R.N 1994 Taxus callus cultures: optimizing growth and production of taxol J Plant Physiol 144: 183– 188 [46] YOON S.Y., PARK J.M 1994 Production of taxane compounds by cell suspension culture of yew tree In: TEO W.K., YAP M.G.S., OH S.K.W (Eds.) Better living through innovative biochemical engineering National University of Singapore, Singapore pp 68–70 [47] ZAMIR L.O., NEDEA M.E., GARNEAU F.X 1992 Biosynthetic building blocks of Taxus canadensis taxanes Tetrahedron Lett 33: 5235–5236 [48] ZHONG J.J, SHEN L.N., WANG S.J 1995 Recent advances in plant cell culture engineering Chin J Ind Microbiol 25 (1): 25–29 [49] ZHU W.H., LU J., LI X.L., HU Q 1991 Observation on callus induction of several Taxus spp J Chin Med Mat 14 (9): 5–7 [50] ZOBAYED S.M.A., ZOBAYED F.A., KUBOTA C., KOZAI T 2000 Water control and survival of Ipomoea batatas grown photoautotrophically under forced ventilation and photomixotrophically under natural ventilation Ann Bot 88: 603–610 TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN (INTERNET) [51] http://campus.queens.edu/faculty/jannr/cells/ [52] http://en.wikipedia.org/wiki/Taxaceae [53] http://www.answer.com/main/content/wp/en/thumb/4 [54] http://www.bmsdanmark.dk/Filer/Bilder/taxol [55] http://www.fao.org/DOCREP 52 [56] http://www.gilmerwood.com/ [57] http://www.hearehardwoods.com/Inventory/LumberLinks/YewTree [58] http://www.lamdong.gov.vn/ [59] http://vidal.podmed.ru/packs/taxol [60] http://www.spectrumscience.com/images/subpage/side_bar_pics [61] http://www.science.siu.edu/landplants/Coniferophyta [62] http://www.taxol.com/ [63] http://www.vnpt.com.vn/Vnpt/CultureSociety/Stam/NewStamp/Y2001 53