Khảo sát hàm lượng flavonoid và acid amin trong lá cây chùm ngây moringa oleifera lam trồng tại tp hcm và đồng nai

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ BÁO CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG FLAVONOID VÀ ACID AMIN TRONG LÁ CÂY CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA LAM.) TRỒNG TẠI TP HỒ CHÍ MINH VÀ ĐỒNG NAI TP.HCM 9/2012 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ BÁO CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG FLAVONOID VÀ ACID AMIN TRONG LÁ CÂY CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA LAM.) TRỒNG TẠI TP HỒ CHÍ MINH VÀ ĐỒNG NAI Cơ quan quản lý: Sở Khoa học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Chủ nhiệm đề tài: ThS Trần Quang Vinh TP.HCM 9/2012 MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) 1 Giới thiệu chung 2 Vị trí phân loại 1.3 Một số tác dụng Chùm ngây Giới thiệu sơ lƣợc hợp chất protein acid amin 2.1 Sơ lƣợc hợp protein acid amin 2.2 Vai trò acid amin 2.3 Một số nghiên cứu giá trị dinh dƣỡng Chùm ngây Giới thiệu sơ lƣợc hợp flavonoid 10 3.1 Giới thiệu chung hợp chất thứ cấp flavonoid 10 3.2 Thành phần hóa học Chùm ngây 12 Ứng dụng chùm ngây 13 4.1 Lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm 14 4.2 Lĩnh vực y dƣợc học Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu, thiết bị, dụng cụ hóa chất nghiên cứu 17 i 2.2 Khảo sát đặc điểm thực vật học Chùm ngây thu Đồng Nai TP.HCM 19 2.3 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu bột Chùm ngây 19 2.4 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật bột Chùm ngây 20 2.5 Khảo sát hàm lƣợng protein acid amin mẫu Chùm ngây 20 2.6 Khảo sát hàm lƣợng flavonoid mẫu Chùm ngây 24 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC 28 3.1 Đặc điểm thực vật học Chùm ngây: 29 3.2 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu bột Chùm ngây 35 3.3 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật Chùm ngây 36 3.4 Xác định hàm lƣợng protein acid amin 37 3.5 Hàm lƣợng protein, acid amin thu TP.HCM Đồng Nai 41 3.6 Xác định hàm lƣợng flavonoid thu TP.HCM Đồng Nai 44 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 4.1 Kết luận 50 4.2 Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ nguyên MeOH Methanol EtOH Ethanol Et2O Diethyl ether EtOAc Ethyl acetat Nghĩa tiếng việt SKLM Sắc ký lớp mỏng SKC Sắc ký cột PDA Photo-Diode Array Dãy diod quang HDL High density lipoprotein EDP Estradiol dipropionat NTU Nephelometric turbidity unit MPN Most Probable Number HPLC High performance liquid chromatography F Flavonoid UV-Vis Ultraviolet and visible Đơn vị độ đục SKĐ Sắc ký đồ TT Thuốc thử iii ĐẶT VẤN ĐỀ "Cây thần diệu”Moringa”- tức Chùm ngây Moringa oleifera Lam., có ý nghĩa việc chống suy dinh dưỡng khu vực đói nghèo Nhiều phận như: thân, rễ, lá, hoa, quả, nghiên cứu sử dụng nhiều giới Các phận chứa nhiều khoáng chất quan trọng, giàu chất đạm, vitamin, beta-caroten, acid amin, ngồi cịn có nhiều hợp chất quý zeatin, glycosinolate, pterigospermin, benzyl isothiocyanate, flavonoid (kaempferol, quercetin, acid caffeoylquinic), α-sitosterol Vì chúng sử dụng để chống suy nhược thể; suy nhược thần kinh; chống oxy hóa, đặc biệt giúp ổn định huyết áp, bảo vệ gan, hạ cholesterol Ở nước ta chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng, theo Võ Văn Chi (1999), Phạm Hoàng Hộ (2006) phận quả, non, hoa, nhánh non dùng làm rau ăn, phải nấu chín, Chùm ngây kích thích tiêu hóa, trái nồng, dùng cari, dầu từ hột dầu ăn, rễ có tác dụng làm giảm thụ thai, chứa isothiocyanate chống nhiều vi khuẩn có Mycobacterium phlei, chống siêu vi khuẩn trái rạ, toi gà, vỏ chứa alkaloid moringenin, moringin phấn khích tim Ngồi hạt cịn dùng để xử lý nước làm lắng nước (Nguyễn Hữu Thành cộng sự, 1997) Do có nhiều hữu ích nên có chương trình khuyến khích trồng 80 quốc gia giới [2] Vì để làm sáng tỏ giá trị sử dụng dược liệu tiến hành đề tài nhằm: - Tiêu chuẩn hoá dược liệu làm tài liệu cho nghiên cứu tiếp theo; - Xác định sơ thành phần hoá thực vật, hàm lượng flavonoid, acid amin…có Chùm ngây trồng nơi TP Hồ Chí Minh Đồng Nai; - Định hướng cho việc trồng Chùm ngây tự nhiên nhằm cung cấp làm dược liệu thực phẩm giàu dinh dưỡng Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) 1.1 Giới thiệu chung Cây Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) gỗ nhỏ, cao 10-12 m, kép lông chim lần, dài 30-60 cm Hoa trắng, trông giống hoa đậu, mọc thành chùy nách lá; cánh hoa 5, vểnh lên, nhị thụ xen với nhị lép, bầu nỗn buồng, đính phơi trắc mơ Quả dạng nang treo, dài 25-30 cm, ngang cm, có cạnh, chỗ có hạt gồ lên Hạt màu đen, có cạnh, to khoảng cm, có cánh mỏng bao quanh Cây hoa vào tháng 1, Cây có khả sống vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới Cây chịu hạn sinh trưởng tốt đất khô cằn, chịu lượng mưa từ 480-4000 mm/năm; nhiệt độ 18,7-28,5 0C, pH 4,5-8,0 Cây hoa sớm khoảng tháng sau trồng khoảng 12 tháng tuổi cho quả, hạt [2], [5], [19] Cây có nguồn gốc Ấn Độ, trồng mọc tự nhiên vùng nhiệt đới Châu Phi, nhiệt đới Châu Mỹ, Sri Lanka, Ấn Độ, Mexico, Malabar, Malaysia Philippines Ở nước ta, mọc hoang trồng tỉnh phía nam từ Đà Nẵng, Nha Trang, Phan Thiết vào đến Kiên Giang đảo Phú Quốc [2] 1.2 Vị trí phân loại Cây Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) Giới thực vật: Plantae Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida Phân lớp sổ: Dilleniidae Bộ Chùm ngây: Moringales Họ Chùm ngây: Moringaceae Chi: Moringa Loài: Moringa oleifera Lam Tên Việt Nam: Cây Chùm ngây Loài phổ biến Chùm ngây cải ngựa (Moringa oleifera Lam.), loài có nhiều cơng dụng, có nguồn gốc từ khu vực thuộc Bang Kerala Ấn Độ Lá ăn được, loài trồng nhiều nơi khu vực nhiệt đới loài chi Moringa có mặt Việt Nam Hình 1.1 Cây Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) trồng Đồng Nai (T.Q.V) 1.3 Một số tác dụng Chùm ngây [15], [ 22], [24] - Hoạt tính kháng nấm gây bệnh Nghiên cứu Institute of Bioagricultural Sciences, Academia Sinica, Đài Bắc (Taiwan) ghi nhận dịch chiết từ hạt Chùm ngây ethanol có hoạt tính diệt nấm gây bệnh loại Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum Microsporum canis Các phân tích hóa học tìm dầu trích từ Chùm ngây đến 44 hóa chất - Tác dụng Chùm ngây cholesterol lipid máu Nghiên cứu ĐH Baroda, Kalabhavan, Gujarat (Ấn Độ) hoạt tính thông số lipid Chùm ngây, thử thỏ, ghi nhận: Thỏ cho ăn Chùm ngây (200 mg/kg ngày) hay uống lovastatin (6 mg/kg/ngày) trộn hỗn hợp thực phẩm có tính cách tạo cholesterol cao, thử nghiệm kéo dài 120 ngày Kết cho thấy Chùm ngây Lovastatin có tác dụng gây hạ cholesterol, phospholipid, triglyceride, VLDL, LDL, hạ tỷ số cholesterol/ phospholipid máu so với thỏ nhóm đối chứng Khi cho thỏ bình thường dùng Chùm ngây hay Lovastatin mức HDL lại giảm thỏ bị cao cholesterol mức HDL lại gia tăng Riêng Chùm ngây cịn có thêm tác dụng làm tăng thải loại cholesterol qua phân - Các hoạt tính chống co-giật, chống sưng gây lợi tiểu Dịch trích nước nóng hoa, lá, rễ, hạt, vỏ thân Chùm ngây nghiên cứu Trung Tâm Nghiên Cứu Kỹ Thuật (CEMAT) Guatamala City hoạt tính dược học, thử chuột Hoạt tính chống co giật chứng minh thử nghiệm chuột lập, hoạt tính chống sưng thử chân chuột bị gây phù carrageenan tác dụng lợi tiểu lượng nước tiểu thu chuột ni nhốt lồng: Nước trích từ hạt cho thấy tác động ức chế rõ co giật gây acetylcholine liều ED50= 65.6 mg/ml môi trường; tác động ức chế phù gây carrageenan định 1000 mg/kg; hoạt tính lợi tiểu 1000 mg/kg Nước trích từ rễ cho số kết - Khả gây đột biến genes từ hạt Chùm ngây rang chín Một số hợp chất gây đột biến genes tìm thấy hạt Chùm ngây rang chín: Các chất quan trọng xác định 4( -L-rhamnosyloxy) phenylacetonitrile; 4-hydroxyphenylacetonitrile 4-hydroxyphenyl-acetamide - Khả ngừa thai rễ Chùm ngây Nghiên cứu ĐH Jiwaji, Gwalior (Ấn Độ) hoạt tính estrogenic, kháng estrogenic, ngừa thai nước chiết từ rễ Chùm ngây ghi nhận chuột bị cắt buồng trứng, cho uống nước chiết, có gia tăng trọng lượng tử cung Hoạt tính estrogenic chứng minh kích thích hoạt động mô tế bào tử cung Khi cho chuột uống nước chiết chung với estradiol dipropionate (EDP) có tiếp nối tụt giảm trọng lượng tử cung so sánh với gia tăng trọng lượng cho chuột uống riêng EDP Trong thử nghiệm 'deciduoma' liều cao 600 mg/kg có tác động gây rối loạn nơi 50 % số chuột thử Tác dụng ngừa thai rễ Chùm ngây cho nhiều yếu tố phối hợp - Hoạt tính kháng sinh hạt Chùm ngây ( -L-rhamnosyloxy) benzyl isothiocyanate xác định có hoạt tính kháng sinh mạnh hoạt chất trích từ hạt Chùm ngây (trong hạt Chùm ngây cịn có benzyl isothiocyanate) Hợp chất ức chế tăng trưởng nhiều vi khuẩn nấm gây bệnh Nồng độ tối thiểu để ức chế Bacillus subtilis 56 micromol/l để ức chế Mycobacterium phlei 40 micromol/l - Hoạt tính rễ Chùm ngây sạn thận loại oxalat Thử nghiệm ĐH Dược K.L.E.S, Nehru Nagar, Karnakata (Ấn độ) chuột bị gây sạn thận oxalat ethylen glycol ghi nhận dịch chiết nước alcohol rễ lõi gỗ Chùm ngây làm giảm rõ rệt nồng độ oxalat nước tiểu cách can thiệp vào tổng hợp oxalat thể Sự kết đọng tạo sạn thận giảm rõ cho chuột dùng dịch chiết biện pháp phòng ngừa bệnh sạn thận Giới thiệu sơ lƣợc hợp chất protein acid amin 2.1 Sơ lƣợc hợp protein acid amin [18], [27] Protein thành phần tế bào, nguyên liệu cần thiết để tổng hợp thành phần cấu trúc thể Ngồi vai trị cấu tạo, protein cịn có vai trị sinh hóa quan trọng enzyme giữ nhiệm vụ xúc tác q trình chuyển hóa thể sinh vật Acid amin (aa): Là đơn vị cấu tạo nhỏ protein, sản phẩm thủy phân cuối peptid protein Acid amin chất hữu mà phân tử có chứa nhóm carboxyl – COOH nhóm amin –NH2 H2N CH COOH R Hình 1.2 Cấu trúc tổng quát acid amin Hiện có khoảng 22 loại acid amin, 22 loại acid amin thể không sản xuất số acid amin gọi acid amin thiết yếu, acid amin lại cần cho tăng trưởng, phải cung cấp từ bên ngồi Ngồi ra, cịn có số acid amin gặp phân tử protein (chúng dạng tự hay kết hợp không tìm thấy phân tử protein) Có acid amin thiết yếu,  Quy trình chiết xuất Bột Chùm ngây  Ngâm với EtOH 60%  Siêu âm 30 phút nhiệt độ 50 0C  Để lắng, lọc qua giấy lọc Bã dƣợc liệu Dịch chiết Tiếp tục chiết, siêu âm đến hết acid amin Dịch 1, 2, 3, Dịch 2,3,4 Bã dƣợc liệu Cô quay Dịch chiết đậm đặc (dịch chiết A) Hình 3.7 Sơ đồ chiết xuất protein tồn phần acid amin tự 3.4.2 Định tính protein acid amin  Định tính Protein phản ứng Biure: cho kết dương tính (hình 3.9)  Định tính acid amin phản ứng hóa học: kết nhận thấy acid amin phản ứng với thuốc thử Ninhydrin, thuốc thử Millon cho kết rõ, 38 thuốc thử Millon cho kết rõ Thuốc thử Xanthoprotein cho kết không rõ Kết thể hình 3.9 A B C Hình 3.8 Phản ứng hóa học A Phản ứng Biure, B Phản ứng Ninhydrin, C Phản ứng Millon  Định tính acid amin sắc kí lớp mỏng: Dịch chiết bột Chùm ngây theo quy trình chiết xuất (hình 3.8) chạy sắc kí, kết thể bảng 3.3 hình 3.9 Bảng 3.3 Kết thăm dò số hệ dung mơi chạy sắc kí lớp mỏng STT Hệ dung mơi Kết sắc kí 96% ethanol: nước (7:3) Vết dồn lên trên, arginin khơng chạy được, histidin có Rf thấp 96% ethanol: nước (5:1) Vết dồn, tách phenol: nước (3:1) Tách không tốt, vết arginin có Rf thấp phenol: amoniac đđ (3:1) Tách vết, vết arginin có Rf cao rõ n-butanol: acid nước (4:1:1) acetic: Tách vết n-butanol: acid nước (9:2:3) acetic: Tách không tốt hệ vết Arginin có Rf cao hệ 39 phenol: nƣớc = 3:1 Ethanol 96% : nƣớc (7:3) 1.Dịch chiết 3.Val 5.Met 2.Leu 4.Arg 6.His 1.Dịch chiết 3.Arg His 5.Val 2.Leu 4.Met phenol: amoniac đđ 3:1 n-butanol: acid acetic: nƣớc=4:1:1 4:1:1 5 1.Dịch chiết 3.Val 5.Met 2.Leu 4.Arg 6.His 1.Dịch chiết 3.His 5.Met 2.Dịch thủy phân 4.Arg Hình 3.9 Kết chạy sắc kí lớp mỏng số hệ dung môi 40 Kết chạy sắc kí lớp mỏng hệ dung mơi cho thấy hệ (phenol: amoniac đđ (3:1)) hệ (n-butanol: acid acetic: nước (4:1:1)) tách acid amin tốt hơn, chọn hệ 4, chạy sắc kí lớp mỏng cho acid amin 3.5 Hàm lƣợng protein, acid amin mẫu Chùm ngây thu TP.HCM Đồng Nai  Đường chuẩn albumin: Bảng 3.4 Xây dựng đường chuẩn albumin 0,1% Nồng độ 50 100 150 200 250 ∆OD 0,037 0,070 0,100 0,132 0,164 OD trung bình 0,010 0,047 0,080 0,110 0,142 0,174 protein (mg/l) Hình 3.10 Phương trình đường chuẩn albumin 41 3.5.2 Hàm lƣợng protein mẫu Chùm ngây thu TP.HCM Đồng Nai Bảng 3.5 Kết hàm lượng protein mẫu Chùm ngây thu TP.HCM Đồng Nai Đồng Nai TP HCM Nơi thu mẫu Hàm lượng protein (%) Trung bình Huyện Quận Gị Quận Long Long Nhơn Củ Chi Vấp 12 Khánh Thành Trạch 20,42 ± 19,73 ± 21,24 ± 24,84 ± 20,11 ± 21,17 ± 0,6 0,6 0,4 0,4 0,6 0,4 20,46 22,84 Qua bảng 3.5 nhận thấy hàm lượng protein Đồng Nai cao so với TP.HCM khác biệt khơng có ý nghĩa, nhiên mẫu thu Long Khánh có hàm lượng protein 24,84% cao so với mẫu thu Long Thành, Nhơn Trạch tỉnh Đồng Nai, cao so với Huyện Củ Chi, Quận Gò Vấp, Quận 12 TP.HCM, mẫu Chùm ngây thu Long Khánh điều kiện chăm sóc tốt nên có hàm lượng protein cao Điều phù hợp với số nghiên cứu biến động hàm lượng protein trồng nhiều nguyên nhân như: mùa, môi trường (Ray Yu Yang cộng sự, 2006), hay thiếu hụt chất dinh dưỡng (Duzan and Steward (1983), Kim et al (1987) Sự thiếu hụt enzym Ribulose biphosphate carboxylase-oxygenase (Rubisco) làm ảnh hưởng tới hàm lượng protein (Moreno and Garci’a – Marti’nez (1984) Qua điều tra thu mẫu nhận thấy mẫu Chùm ngây thu Long Khánh chăm sóc tốt mẫu cịn lại thu ngồi tự nhiên nguyên nhân làm cho hàm lượng protein có khác biệt 3.5.3 Định lƣợng acid amin Kết định lượng acid amin phương pháp GC-EZ faast, Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm (phụ lục 1) 42 Bảng 3.6 Hàm lượng acid amin Chùm ngây Thành phần acid STT amin 10 11 12 13 14 15 16 Alanin Glycine Valin Leucine Isoleucine Threonine Serin Proline Aspartic acid Methionine 4-hydroxyproline Glutamic acid Phenylalanine Lysine Histidine Tyrosine Hàm lƣợng (%) 1,18 0,76 0,93 1,12 0,69 0,34 1,45 0,82 1,64 0,13 0,10 2,5 0,75 0,86 0,17 0,25 Kết cho thấy bột Chùm ngây có nhiều acid amin (bảng 3.6), chủ yếu 16 loại acid amin như: alanin, glycine, valin, leucine, isoleucine , threonine, serin, proline, acid aspartic, methionine, 4-hydroxyproline, acid glutamic, phenylalanine, lysine, histidine, tyrosine Trong acid amin có hàm lượng cao acid glutamic, acid aspartic, serin, alanine cịn có acid amin thiết yếu valin, leucine, phenylalanine, lysine…; điều phù hợp với nghiên cứu H.P.S Makkar, K Berker (1996) tiến hành Đại Học Hohenhein Đức Chùm ngây cho thấy Chùm ngây có nhiều acid amin, acid glutamic, acid aspartics có hàm lượng cao nhất, hàm lượng thấp cystein 3.5.4 Hàm lƣợng acid amin mẫu Chùm ngây thu TP.HCM Đồng Nai HPLC phương pháp phổ biến, dễ áp dụng để định lượng hàm lượng acid amin Dựa vào kết định lượng chọn acid amin thiết yếu acid amin mà thể trẻ em không tổng hợp để khảo xác hàm lượng acid amin nơi Tiến hành thu mẫu TP.HCM (Huyện Củ Chi, Quận Gò Vấp) Đồng Nai (Long Thành, Long Khánh), tiêu chuẩn hóa theo Dược Điểm 43 việt Nam IV, sau phân tích phương pháp HPLC Kết hàm lượng acid amin mẫu Chùm ngây thu TP.HCM Đồng Nai thể bảng 3.7, nhận thấy hàm lượng acid amin bột Chùm ngây thu địa điểm có chênh lệch khơng đáng kể Ngun nhân mẫu dược liệu có hàm lượng mẫu dùng để phân tích nhỏ (1,5 g) hàm lượng acid amin chiếm phần nhỏ nên biến động acid amin không rõ ràng Bảng 3.7 Hàm lượng acid amin Chùm ngây thu TP.HCM Đồng Nai STT Mẫu acid amin Huyện Củ Chi Gò Vấp Long Khánh Long Thành 10 His Arg Thr Val Met Ile Leu Phe Try Lys 0,52 1,24 1,09 0,98 0,45 0,54 1,39 0,99 0,55 1,04 0,54 1,23 1,09 1,00 0,47 0,56 1,40 0,98 0,52 1,06 0,55 1,25 1,07 0,96 0,46 0,54 1,38 1,2 0,51 1,06 0,52 1,25 1,09 0,98 0,46 0,54 1,39 0,99 0,53 1,06 3.6 Xác định hàm lƣợng flavonoid mẫu Chùm ngây thu TP.HCM Đồng Nai 3.6.1 Định tính flavonoid:  Phản ứng với kiềm: dung dịch chứa flavonoid thường có biến đổi màu sắc làm cho dung dịch có màu đậm  Phản ứng với FeCl3 5%: Tuỳ theo số lượng vị trí nhóm OH phenol mà cho màu lục, xanh nâu  Phản ứng với thuốc thử Cyanidin: Flavanol, flavanonol cho màu đỏ đậm 44 3.6.2 Định tính flavonoid sắc ký lớp mỏng: Dịch chiết mục 3.2 đem chấm sắc ký, phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử FeCl3 5%/EtOH Sau triển khai số hệ dung môi thấy hệ hệ cho kết tốt (hình 3.11, hình 3.12) Phun thuốc thử FeCl3 5% Soi UV 254nm Hình 3.11 SKĐ hệ 3: n-Butyl acetat – Nước (15:5) Soi UV 254 nm Phun thuốc thử FeCl3 5% Hình 3.12 SKĐ hệ 4: n-Butyl acetat – Nước – Axit formic (15:5:5) (lớp dưới) 1- Dịch chiết chưa thủy phân 2- Dịch chiết thủy phân HCl 10% 3- Chuẩn quercetin Nhận xét: Trong hệ khơng có mặt axit formic nên vết tách kéo đuôi, silicagel tẩm axit formic, vết tách gọn (hình 3.12) Vì ta chọn hệ n-Butyl acetat - Nƣớc - Axit formic (15:5:5) (lớp dưới) để triển khai sắc ký 45 3.6.3 Hàm lƣợng flavonoid mẫu Chùm ngây thu TP.HCM Đồng Nai Chuẩn bị dịch chuẩn: Cân xác 10 mg quercetin, hịa tan với 10 ml Methanol bình định mức 10 ml (1mg/ml) Sau đó, pha lỗng mẫu thành nồng độ: 10; 20, 30; 40; 60; 80 µg/ml Xây dựng đường chuẩn: Hút ml dịch chuẩn nồng độ khác cho vào ống nghiệm khác có chứa ml nước cất Đối với mẫu thử không ta thay dịch chuẩn ml nước cất Sau đó, thêm vào ống nghiệm 0,3 ml NaNO2 5% Sau phút, ta thêm 0,3 ml AlCl3 10% Sau phút, ta thêm vào ống ml NaOH 1M định mức thành 10 ml nước cất Sau mẫu ổn định ta đem đo quang bước sóng 510 nm Bảng 3.8 Kết đo OD mẫu chuẩn quercetin Nồng độ µg/ml 10 20 30 40 60 80 OD (510 nm) 0,002 0,009 0,013 0,017 0,028 0,038 y = 0.0005x - 0.0023 R2 = 0.9968 0.04 0.035 0.03 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 0 10 20 30 40 50 60 70 Hình 3.13 Đường tuyến tính quercetin 46 80 90 Ở nồng độ 10; 20; 30; 40; 60; 80 g/ml, phương trình hồi quy có dạng Y = 0,0005x - 0,0023 với R2 = 0,9968, sai số lý thuyết thực nghiệm nhỏ, áp dụng cho định lượng  Chọn giới hạn định lượng flavonoid tổng với chuẩn quercetin bước sóng 510 nm từ nồng độ 10 - 80 g/ml phương trình hồi quy là: Y = 0,0005X Từ phương trình hồi qui ta suy hàm lượng flavonoid có 1ml mẫu: F = K/ 0,0005 g/ml = 1/5 *K.10-2 g/ml Hàm lượng flavonoid có 100g mẫu khơ: K *10-2 * n X*n A= = a * 2,504* 100 5a K: Giá trị OD mẫu bước sóng 510 nm n: Độ pha loãng mẫu a: Khối lượng mẫu thực khô g mẫu độ ẩm x% 2,504: Hệ số chuyển đổi quercetin flavonoid A: Hàm lượng flavonoid có 100 g mẫu Bảng 3.9 Hàm lượng flavonoid toàn phần mẫu bột thu Tp Hồ Chí Minh Đồng Nai Đồng Nai Tp.HCM Nơi thu mẫu Huyện Củ Chi Quận Gò Vấp Quận 12 Long Khánh Long Thành Nhơn Trạch Độ ẩm (%) 6,2 6,4 6,6 6,5 6,8 6,5 Flavonoid (%) 3,26 ± 0,4 1,19 ± 0,6 3,20 ± 0,4 3,63 ± 0,2 1,47 ± 0,5 3,39 ± 0,3 Trung bình 2,55 2,83 Nhận xét: Từ hình ta thấy hàm lượng flavonid toàn phần Chùm ngây thu Đồng Nai cao so với Chùm ngây Tp Hồ Chí Minh, nhiên chênh lệch khơng đáng kể Trong khu vực nhiên có chênh lệch 47 hàm lượng flavonoid tìm hiểu thấy nơi thu mẫu Chùm ngây mọc hoang dại hàm lượng flavonoid thấp Quận Gò Vấp 1,19%, Long Khánh 1,47%, nhựng nơi trồng trọt chăm sóc kỹ thỉ hảm lượng flavonoi cao Long Khánh 3,63%, Nhơn Trạch 3,39% Theo (Covelo and Gallardo, 2001) nhận thấy hàm lượng flavonoid khác thực vật có nhiều nguyên nhân đất đai, vùng sinh sống, thời tiết; Cũng theo (Kenkt cộng sự, 1996), hàm lượng thành phần flavonoid phụ thuộc vào nơi mọc, mọc vùng nhiệt đới núi cao hàm lượng flavonoid cao vùng ánh sáng mặt trời Nghiên cứu khác hàm lượng flavonoid có tiêu xanh loại rau xanh khác Kana et al., (2005) chứng minh hàm lượng flavonoid tăng tháng 10 đến tháng 12 có khuynh hướng giảm tháng đến tháng Theo kết phân tích ta thấy hàm lƣợng flavonoid toàn phần mẫu Chùm ngây thu Đồng Nai có khác so với Tp.Hồ Chí Minh, điều khu vực Đồng Nai vị trí cao nên đón nhận nguồn lượng Mặt trời lớn nên Chùm ngây tổng hợp nhiều flavonoid nhằm chống lại tia UV, giúp cho chùm ngây thích nghi tốt 3.6.4 Hàm lƣợng flavonoid mẫu non trƣởng thành Bột non trưởng thành Chùm ngây thu huyện Củ Chi Long Khánh đem xác định hàm lượng flavonoid phương pháp UV-Vis Bảng 3.10 Hàm lượng flavonoid mẫu non trưởng thành thu huyện Củ Chi Long khánh Nơi thu mẫu Huyện Củ Chi Huyện Long khánh Mẫu Lá non Lá trưởng thành Lá non Lá trưởng thành Flavonoid (%) 3,39 ± 0,8 3,14 ± 0, 3,67 ± 0,5 3,03 ± 0,6 Cũng theo kết phân tích hàm lượng flavonoid tồn phần mẫu non trưởng thành có khác nhau, hàm lƣợng flavonoid cao non, trƣởng thành Điều giải thích UV nguyên nhân việc gia tăng hàm lượng flavonoid Theo Chaves et al (1997), Martz et al (2007) tác giả 48 chứng minh vai trò sinh lý flavonoid sinh nhằm bảo vệ thực vật chống lại ảnh hưởng tia UV Li et al., (1993) dựa vào đột biến Arabidopsis để chứng minh vai trò flavonoid việc bảo vệ tia UV Thực vậy, thực vật tổng hợp hợp chất tổng hợp flavonoid cho thân chúng nhằm chống lại có hại tia UV chúng dự trữ tế bào biểu bì (Kozaki and Takeba, 1996) Đồng thời, thay đổi hàm lượng flavonoid toàn phần Chùm ngây phù hợp với thí nghiệm K KARLOVAS, K PETRWISKOV, (2005) nghiên cứu hàm lượng flavonoid Achillea collina Rchb Alba chứng minh non có hàm lượng flavonoid tồn phần cao so với trưởng thành 49 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN - Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) thân gỗ nhỏ, than xốp, thường có gơm, hoa màu trắng sữa, kép lông chim lần, giải phẫu thân Chùm ngây có cấu tạo đặc biệt, có túi tiết tiêu bào chứa gơm, trụ bì gồm nhiều lớp tế bào bị hóa mơ cứng - Sơ thành phần hóa thực vật Chùm ngây có nhóm hợp chất sau: tinh dầu, triterpen, couramin, flavonoid, tanin, axit hữa cơ, chất khử Trong hợp chất: Tinh dầu, flavonoid, tanin có nhiều - Hàm lượng protein Chùm ngây cao, khoảng 18-25%, hàm lượng protein Chùm ngây thay đổi theo địa điểm trồng điều kiện chăm sóc; vị trí có khác biệt, trưởng thành cao non - Trong Chùm ngây có nhiều loại acid amin như: alanin; glycine; valin; leucine; isoleucine; threonine; acid aspartic; methionine; lysine; histidine; tyrosine…Trong có acid amin thiết yếu có hàm lượng cao arginine 1,24%, leucine 1,12%, lysine 0,86%, phenylalanine 0,75% - Hàm lượng acid amin mẫu Chùm ngây thu nơi Đồng Nai TP.HCM khơng có biến động đáng kể hàm lượng acid amin mẫu vùng không lớn - Dịch chiết ethyl acetate có chứa flavonoid dùng để xác định hàm lượng flavonoid toàn phần, kết flavonoid toàn phần mẫu Chùm ngây khoảng 1,20 - 3,63% Hàm lượng flavonoid tồn phần trung bình Chùm ngây thu TP Hồ Chí Minh ( 2,55%) thấp so với mẫu thu Đồng Nai (2,83%) Hàm lượng flavonoid toàn phần Chùm ngây non cao so với trưởng thành 4.2 ĐỀ NGHỊ: - Hội đồng nghiệm thu đề tài, đề nghị tiếp tục nghiên cứu định hướng trồng Chùm ngây tự nhiên theo tiêu chuẩn GACP, nhằm cung cấp làm dược liệu thực phẩm giàu dinh dưỡng - Để đề tài hoàn thiện đề nghị thực nội dung hàm lượng flavonoid, protein acid amin Chùm ngây theo mùa… 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Mơn Dược Liệu (2004), Giáo trình thực tập dược liệu, tập 1, Trường Đại Học Y Dược TPHCM, 26 – 41, 72 – 84, 62 – 67 Võ Văn Chi (1999), Tự điển thuốc Việt Nam, NXB Y Học, trang 248 Dược Điển Việt Nam IV (2010), NXB Y học Hà Nội, PL 182 – 183 Nguyễn Công Đức (2007), Chữa bệnh từ Chùm ngây, Thanh Niên.com, 23/10/2007 Phạm Hoàng Hộ, 2006, Cây có vị thuốc Việt Nam, NXB Trẻ, trang 140-141 Trần Việt Hưng, Võ Duy Huấn (2007), Cây thực phẩm thuốc chùm ngây, Thuốc & Sức khoẻ, số 337 Nguyễn Viết Kình (2003), Bài giảng flavonoid Đại học Y Dược TP.HCM, tài liệu lưu hành nội bộ, trang -16 Nguyễn Hữu Thành cs (1996-1997), Chùm ngây lồi đa cơng dụng phục vụ người, http://www.khuyennongtphcm.com/?mnu=3&s=600008&id=1411 Nguyễn Đức Tuấn (2009), Xây dựng phương pháp định lượng flavonoid toàn phần cao Bạch quả, Tạp chí nghiên cứu y học, phụ tập 13, số 1, ĐH Y- Dược Tp Hồ Chí Minh 10 Adandonon A., T.A.S Aveling, N Labuschagne and M Tamo (2006), Biocontrol agents in combination with Moringa oleifera extract for integrated control of Sclerotium-caused cowpea damping-off and stem root, Trees for Life Journal 11 Caceres, A.; Cabrera, O; Mirals, O Mollinedo, O and Imendia, A (1991), Preliminary screening for antimicrobial activity of Moringa oleifera J, Ethnopharmacol 33: 213 – 216 12 Beth Doerr , Field, (2005), Guide for Emergency Water Treatment with Moringa oleifera ECHO Staff, March 2005 Echo@echonet.org 13 Ramachandran, C.; Peter, K V.; Gopalakrishnan, P K., (1980), Drumstick (Moringa oleifera) a multipu rpose Indian vegetable, Econ Bot, 34, 3, 276–283 14 Marinova D et al., (2005), Total phenolics and total in Bulgarian fruits and vegetables, National center of Public health protection, deparment of Food chemistry, Sofia 1431, Bulgaria 15 Dahiru, D., Onubiyi, J A and Umaru, H A (2006), PHYTOCHEMICAL SCREENING AND ANTIULCEROGENIC EFFECT OF MORINGA OLEIFERA AQUEOUS LEAF EXTRACT, African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, Vol 3, No 3, , pp 70-75 16 Fuglie, Lowell J., ed (2002), The Miracle Tree-Moringa oleifera: Natural Nutrition for the Tropics, Training Manual, 2001, Church World Service, Dakar, Senegal 17 Harborne JB, Tomas-Barberan FA (1991), Ecological Chemistry and Biochemistry of Plant Terpenoids, Oxford Science Publications, pp 159–208 18 Suchanek M., Radzikowska A, Thiele C (April 2005) "Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein-protein interactions in living cells" Nature Methods (4): 261–7 19 Ashok Kumar N., L Pari (2003) Antioxidant Action of Moringa oleifera Lam (Drumstick) A.gainst Antitubercular Drugs Induced Lipid Peroxidation in Rats Journal of Medicinal Food, 6(3): 255-259 20 Pari, L and Kumar, N.A (2002) Hepatoprotective Activity of Moringa oleifera on Anti tubercular drug induce liver damage in rats J Medicinal Food, (3): 171 – 177 21 Ewards R and Gatehouse J A, (1999), Secondary metabolism In: plant biochemistry and molecular biology ndEd., John Wiley and Sons New York, pp 193-218 22 Rubeena saleem (1995), Study in the chemical constituents of Moringa oleifera Lam., and prepaparation of potential biologically significant derivatives of 8hydroxyquinoline H E j, Research institute of chemistry university of Karachi Pakistan 23 Eilert U., B Wolters, A Nahrstedt (1981), The Antibiotic Principle of Seeds of Moringa oleifera and Moringa stenopetalal, Planta Med 42 (5):55-61 Verma, S C.; Banerji, R et al., (1976), Nutritional value of Moringa, Current Science, 45, 21, 769–770 24 Jed W Fahey, Sc.D (2005) Moringa oleifera: A Review of the Medical Evidence for Its Nutritional, Therapeutic, and Prophylactic Properties, Trees for Life Journal 2005, pp 1-5 25 http://www.zijamoringahealth.com/Nutrition/diet%20and%20nutrition/health _foods.html; 26 http://www.moringatree.co.za/analysis.html; 27 http://en.wikipedia.org/wiki/Amino_acid; 28 http://botu07.bio.uu.nl/images/Kassen/Moringa%20oleifera%2086GR00390%2 0c.jpg 29 http://topnews.in/usa/files/Moringa-oleifera-tree.jpg 30 http://www.rfviet.com/forụm/archive/index.php?t22376.html 31 www.moringanews.org/doc/GB/PowerPoint/Ray_yu_GB.pdf