Biểu hiện các cellulase tái tổ hợp từ vi khuẩn clostridium thermocellum trong bacillus subtilis

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TT KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU BIỂU HIỆN CÁC CELLULASE TÁI TỔ HỢP TỪ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM TRONG BACILLUS SUBTILIS TS NGUYỄN ĐỨC HOÀNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/ 2015 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU BIỂU HIỆN CÁC CELLULASE TÁI TỔ HỢP TỪ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM TRONG BACILLUS SUBTILIS CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/ 2015 TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu tập trung lên biểu Endoglucanase A (CelA) Exoglucanase S (CelS) Bacillus subtilis để thủy phẩn cellulose Các gene khuếch đại từ Clostridium thermocellum dòng hóa vào vector biểu cho B subtilis Chúng tạo plasmid mang gene celA plasmid mang gene celS Các plasmid mang gene celA gồm có pHT43-celA mang gene celA đầy đủ ba plasmid khác pHT1454, pHT1455 pHT1456 mang đuôi dung hợp Histidine 4x, 5x 6x, theo thứ tự, đầu C CelA Tất khung vector chứa promoter mạnh, cảm ứng IPTG Các vector celS gồm có pHT1717, chép độc lập so với gene pHT1724, chèn vào DNA gene Các vector sau biến nạp vào chủng B subtilis 1012 B subtilis WB800N để khảo sát mức độ biểu Sự biểu ngoại bào cellulases khảo sát thơng qua vịng tan đĩa LB-CMC, SDS-PAGE, Western-blot hoạt tính enzyme Kết khảo sát dựa vòng tan cho thấy CelA biểu tốt nồng độ IPTG từ 0,1 mM đến mM tất chủng B subtilis có chứa plasmid mang gene celA nhiệt độ 30°C hay 37°C Điều thú vị kết vòng tan tương tự kết khảo sát sử dụng phương pháp xác SDS-PAGE, Western blot đo hoạt tính enzyme Thêm vào chúng tơi chứng minh ảnh hưởng His-tag lên biểu tiết CelA B subtilis WB800N cung cấp chứng cho phân cắt CelA protease ngoại bào B subtilis 1012 Đối với biểu CelS, vector pHT1717 pHT1724 cho phép biểu lượng nhỏ enzyme tiết vào mơi trường ni cấy B subtilis Hoạt tính enzyme đo sử dụng chủng WB800N với thời gian ủ với chất CMC RAC (regenerated amorphous cellulose) lâu Thêm vào đó, mức độ biểu enzyme hệ thống lên men lít thu nhận để nghiên cứu hoạt tính Chúng tơi sử dụng chủng B subtilis WB800N/pHT1454 (CelA) B subtilis WB800N/pHT1717 (CelS) để biểu enzyme Hoạt tính enzyme CelA mức cao từ 10 đến 16 giờ, CelS 12 sau cảm ứng 0,1 mM IPTG Lượng đường khử giải phóng sau thủy phân chất CMC CelA 0,37 mg/ml/giờ CelS 0,07 mg/ml/giờ Ngoài ra, tác động cộng hưởng CelA – CelS việc thủy phân cellulose khảo sát Thử nghiệm kết hợp CelA – CelS cung cấp chứng rõ ràng, hỗ hợp enzyme tỉ lệ 1:4 hay 4:1 cho hoạt tính thủy phân chất CMC cao so với thủy phân sử dụng enzyme riêng lẻ Tóm lại, nghiên cứu cho thấy có biểu CelA CelS B subtilis sử dụng hệ thống biểu pHT tác động hiệp lực hai enzyme Chúng chứng minh ảnh hưởng His-tag lên biểu CelA thủy phân CelA tiết vào môi trường nuôi cấy B subtilis Báo cáo cung cấp liệu quan trọng cho nghiên cứu tương lai việc sử dụng hệ thống B subtilis để biểu enzyme cellosome Clostridium sp i SUMMARY OF RESEARCH CONTENT This study focused on the expression of Endoglucanase A (CelA) and Exoglucanase S (CelS) in Bacillus subtilis to hydrolyze cellulose The cellulaseencoding genes were amplified from Clostridium thermocellum and introduced into B subtilis expression vectors We constructed plasmids carrying celA gene and vectors harboring full length of celS gene The celA plasmids include pHT43-celA carrying full-length celA gene and the others three, pHT1454, pHT1455 and pHT1456 carrying a 4x-, 5x-and 6x- Histidine tags at the C – terminal of CelA, respectively All of these vector backbones contained a strong Pgrac-derived promoter that can be induced by IPTG The celS vectors consist of pHT1717 that can replicate independently of chromosome and pHT1724 that can integrate into chromosome These constructed vectors were then transformed into B subtilis 1012 and B subtilis WB800N to evaluate the expression levels The extracellular expression of the cellulases were examined by halo on the solid LB-CMC plate, SDS-PAGE, Westernblot and enzymatic assay The results based on the halo screen showed that CelA was expressed well in the presence of IPTG concentration of 0.1 to mM by all of recombinant B subtilis strains which contained CelA plasmid series at either 30oC or 37oC Interestingly, this observation was similar to the more accurate evaluation methods such as SDS-PAGE, Western Blot and enzyme activity measurement We also gave the first demonstration of the negative effect of His number in the fusion tag to CelA secretion ability in B subtilis WB800N Additionally, we provide clues of CelA degradation by external B subtilis protease in B subtilis 1012 For the CelS expression, vectors pHT1717 and pHT1724 allowed only modest amount of enzyme secreted into the B subtilis medium The enzyme activity could be measured only when using WB800N strains with longer incubation time with the substrates, CMC and RAC (regenerated amorphous cellulose) In addition, the expression levels of these enzymes in L fermenter were conducted and obtained to study the activity We applied the B subtilis WB800N/pHT1454 (CelA) and B subtilis WB800N/pHT1717 (CelS) for CelA and CelS production The saturated enzyme activity of CelA was from 10 to 16 hours while CelS was at 12 hour after induction with 0.1 mM of IPTG The highest amount of reduced sugar released by hydrolyzing CMC for CelA was 0.37 mg/ml/hour and CelS was 0.07 mg/ml/hour Furthermore, the synergy effect of CelA – CelS in cellulose hydrolysis was also performed The assay for combination of CelA-CelS showed a strong evidence for higher activity of CelA – CelS mixture at the ratio 4:1 or 1:4 in hydrolyzing CMC substrate in compare to separate ones In summary, this study showed the heterologous CelA and CelS expression in B subtilis using pHT expression system and the synergy effect of CelA and CelS We demonstrated the influence of His-tag on the expression of CelA and the proteolysis of CelA secreted into the B subtilis culture medium This report will provide important data for future study on B subtilis expression systems for the production of proteins from cellulosome of Clostridium sp to hydrolyze cellulose ii MỤC LỤC TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU MỤC LỤC i iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vivii PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài Mục tiêu Nội dung Sản phẩm đề tài CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1 1 1.1 Hiện trạng cơng trình nghiên cứu liên quan đến đề tài 1.2 Đánh giá kết cơng trình nghiên cứu công bố lý thực đề tài 1.3 Dự báo khả ảnh hưởng kết nghiên cứu mặt khoa học, công nghệ, đào tạo, sách phát triển kinh tế xã hội 1.4 Thông tin tổng quát biểu CelA CelS 1.4.1 Endoglucanase A (CelA) 8 1.4.1.1 Cấu trúc CelA 1.4.1.2 Sự tương tác với chất chế hoạt động CelA Exoglucanase S (CelS) 10 1.4.2.1 Cấu trúc CelS 10 1.4.2.2 Sự tương tác chất chế hoạt động CelS 11 1.4.2 1.5 Tổng quan tác động hiệp lực CelA CelS 12 1.5.1 Cellulosome 12 1.5.2 Mini Cellulosome 13 1.5.3 Cellulosome từ C thermocellum 15 CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Thu nhận DNA từ C thermocellum 16 16 2.1.1 Phương pháp nghiên cứu 16 2.1.2 Kết cần đạt 17 2.2 Tạo vector biểu cho B subtilis có mang gene mã hóa cho CelA 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 17 18 iii 2.2.2 2.3 Kết cần đạt Tạo vector biểu cho B subtilis có mang gene mã hóa cho CelS 24 24 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.2 Kết cần đạt 29 2.4 Tạo chủng B subtilis có mang vector biểu 29 2.4.1 Phương pháp nghiên cứu 30 2.4.2 Kết cần đạt 31 2.5 Sàng lọc dịng B subtilis có khả biểu CelA môi trường rắn lỏng 31 2.5.1 Phương pháp nghiên cứu 31 2.5.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả biểu CelA môi trường lỏng 32 2.5.1.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá khả biểu CelA SDS-PAGE 32 2.5.1.4 Thí nghiệm 4: Phương pháp đo hoạt tính enzyme 32 2.5.2 Kết cần đạt 33 2.6 Sàng lọc dòng B subtilis có khả biểu mạnh CelS mơi trường rắn lỏng 33 2.6.1 Phương pháp nghiên cứu 33 2.6.2 Kết cần đạt 33 2.7 Lên men thu nhận cellulase 33 2.7.1 Phương pháp nghiên cứu 33 2.7.2 Kết cần đạt 35 2.8 Phân tích việc thủy phân CMC từ kết hợp CelA CelS 35 2.8.1 Phương pháp nghiên cứu 35 2.8.2 Kết cần đạt 37 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Thu nhận DNA từ C thermocellum 38 3.2 Tạo vector biểu cho B subtilis có mang gene mã hóa cho CelA 39 3.3 Tạo vector biểu cho B subtilis có mang gene mã hóa cho CelS 43 3.4 Tạo chủng B subtilis có mang vector biểu 47 3.5 Sàng lọc dòng B subtilis có khả biểu mạnh CelA mơi trường rắn lỏng 52 3.6 Sàng lọc dòng B subtilis có khả biểu mạnh CelS mơi trường rắn lỏng 69 3.7 Lên men thu nhận cellulase 72 3.8 Phân tích việc thủy phân CMC từ kết hợp CelA CelS 76 iv CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 79 PHỤ LỤC 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT Aa amino acid ANOVA Analysis of variance Amp Ampicillin AmpR Ampicillin Resistance gene B subtilis Bacillus subtilis Bp base pair CBM Cellulose Binding Module celA gene mã hóa Endoglucanase A (CelA) cipA Gene mã hóa cho protein CipA (Scaffold) Cm Chloramphenicol CmR Chloramphenicol Resistance gene CMC Carboxy methyl cellulose C thermocellum Clostridium thermocellum DNA Deoxyribose Nucleic Acid dNTP deoxy Nucleotide Triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid EGTA Ethylene Glycol Tetra-acetic Acid GRAS Generally Regarded As Safe His Histidine IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside v kDa kilo Dalton LB Môi trường Luria-Bertani M Marker MCS Multi Cloning Site PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction RAC Regenerated Amorphous Cellulose (cellulose khơng định hình tái sinh) SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SD Shine Dalgarno TAE Tris – Acetate – EDTA TEMED N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 1.1 Bảng tóm tắt biểu CelA CelS tái tổ hợp 1.2 Các nội dung đề tài 1.3 Mô tả thời gian thực nội dung nghiên cứu đề 2.1 Tên trình tự mồi sử dụng đề tài 19 2.2 Thành phần phản ứng PCR 20 2.3 Thành phần cho phản ứng cắt nối 21 2.4 Các mồi sử dụng tạo plasmid mã hóa CelS 26 3.1 Nồng độ DNA gene C thermocellum sau tinh 38 3.2 Kết đo hoạt tính chủng B subtilis 1012 mang 62 vi plasmid tái tổ hợp điều kiện nuôi cấy 37oC 3.3 Kết đo hoạt tính chủng B subtilis WB800N mang 63 plasmid tái tổ hợp điều kiện ni cấy 37oC DANH SÁCH HÌNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG 1.1 Sơ đồ thể phân cắt cellulose định hình (crystalline) khơng định hình (amorphous) cellulase riêng lẻ phức hợp hệ cellulose 1.2 Cấu trúc CelA dựa ngân hàng liệu UniProt 10 1.3 Mơ hình mơ vị trí gắn chất CelA 11 1.4 Cấu trúc CelS dựa ngân hàng liệu UniProt 13 1.5 Mơ hình mơ vị trí gắn chất CelS 14 1.6 Mơ hình cellulosome C thermocellum 15 2.1 Vị trí bám mồi plasmid 20 2.2 Sơ đồ dịng hóa vector pHT43-celA 23 2.3 Sơ đồ dịng hóa tạo plasmid pHT1454, pHT1455 pHT1456 25 mã hóa CelA dung hợp polyhistidine 2.4 Vị trí bám mồi plasmid mã hóa CelS 27 2.5 Sơ đồ dịng hóa tạo plasmid pHT1717 mã hóa CelS 28 2.6 Sơ đồ dịng hóa tạo plasmid pHT1724 mã hóa CelS 29 3.1 Kết nuôi cấy C thermocellum DSM1313 37 3.2 Thu nhận gene celA phản ứng PCR 38 3.3 Kết PCR khuẩn lạc E coli OmniMAX mang plasmid 39 pHT43-celA vii 3.4 Kết thu gene celA phục vụ tạo plasmid pHT1454, 40 pHT1455 pHT1456 3.5 Kết chọn lọc dòng E coli OmniMAX mang plasmid 41 pHT1454, pHT1455, pHT1456 PCR khuẩn lạc 3.6 Kết điện di DNA sản phẩm thu gene celS từ DNA gene 42 C thermocellum 3.7 Kết PCR khuẩn lạc E coli OmniMAX mang plasmid 43 pHT1717 3.8 Kết điện di DNA sản phẩm thu gene celS từ DNA gene 44 C thermocellum 3.9 Kết PCR khuẩn lạc E coli OmniMAX mang plasmid 45 pHT1724 3.10 Khuẩn lạc B subtilis 45 3.11 Kết biến nạp plasmid pHT43-celA, pHT1454, pHT1455, 48 pHT1456, pHT1717 pHT1724 vào chủng B subtilis 1012 B subtilis WB800N 3.12A Kết PCR khuẩn lạc B subtilis mang plasmid CelA 48 3.12B Kết PCR khuẩn lạc B subtilis mang plasmid CelA 49 3.13A Kết PCR khuẩn lạc B subtilis mang plasmid CelS 49 3.13B Kết PCR khuẩn lạc B subtilis mang plasmid CelS 50 3.14 Kết khảo sát khả tiết CelA tái tổ hợp thơng qua đường 51 kính vịng phân giải CMC hai chủng B subtilis 1012 B subtilis WB800N 3.15 Kết tạo vòng phân giải CMC chủng tái tổ hợp B 52 subtilis 1012 mang plasmid pHT1454, pHT1455 pHT1456 nồng độ chất cảm ứng IPTG mM; 0,01 mM; 0,05 mM; 0,1 mM; 0,5 mM mM Điều kiện nuôi cấy 37oC 30oC 24 viii pHT1454 Phụ lục 3: Kết giải trình tự plasmid pHT1454 mồi xi ON1207 nằm ngồi đoạn gene mã hóa cho CelA dung hợp đầu 5’ 83 Phụ lục 4: Kết giải trình tự plasmid pHT1454 mồi ngược ON314 nằm ngồi đoạn gene mã hóa cho CelA dung hợp đầu 3’ 84 pHT1455 Phụ lục 5: Kết giải trình tự plasmid pHT1455 mồi xi ON1207 nằm ngồi đoạn gene mã hóa cho CelA dung hợp đầu 5’ 85 Phụ lục 6: Kết giải trình tự plasmid pHT1455 mồi ngược ON314 nằm ngồi đoạn gene mã hóa cho CelA dung hợp đầu 3’ 86 pHT1456 Phụ lục 7: Kết giải trình tự plasmid pHT1456 mồi xi ON1207 nằm ngồi đoạn gene mã hóa cho CelA dung hợp đầu 5’ 87 Phụ lục 8: Kết giải trình tự plasmid pHT1456 mồi ngược ON314 nằm đoạn gene mã hóa cho CelA dung hợp đầu 3’ 88 Phụ lục 9: Bản đồ plasmid chứa celS 89 Phụ lục 10: Kết giải trình tự plasmid pHT1717 90 Phụ lục 11: Kết gióng cột giải trình tự plasmid pHT1724 mã hóa CelS 91 Phụ lục 12: Kết đo khả phân giải CMC xác định tỉ lệ phối trộn CelA – CelS mức độ cô mẫu khác OD540 nm Tỉ lệ CelA 1:0 1:2 1:3 1:4 0:1 1:1 2:1 3:1 4:1 CelS Tỉ lệ CelA 1:0 1:2 1:3 1:4 0:1 1:1 2:1 3:1 4:1 CelS A 0.091 0.077 0.089 0.079 0.081 0.075 0.080 0.078 0.079 0.082 0.078 B (0.46875X) 0.098 0.076 0.078 0.076 0.076 0.075 0.078 0.077 0.089 0.093 0.075 C (0.625X) 0.126 0.077 0.080 0.084 0.082 0.076 0.086 0.095 0.100 0.109 0.076 I (5X) 0.185 0.118 0.153 0.147 0.157 0.075 0.139 0.161 0.176 0.186 0.084 J (7.5X) 0.180 0.130 0.172 0.151 0.173 0.082 0.135 0.158 0.171 0.176 0.131 K (10X) 0.224 0.154 0.171 0.184 0.187 0.079 0.169 0.181 0.200 0.214 0.118 (0.3125X) D (0.78125X) E (1.25X) 0.120 0.123 0.082 0.082 0.103 0.083 0.087 0.094 0.091 0.095 0.076 0.078 0.083 0.087 0.087 0.098 0.108 0.116 0.105 0.123 0.080 0.086 OD540 nm M L (12.5X) (20X) 0.250 0.255 0.175 0.174 0.184 0.230 0.204 0.233 0.223 0.277 0.111 0.080 0.186 0.212 0.215 0.226 0.228 0.250 0.257 0.275 0.199 0.162 F (1.875X) 0.146 0.082 0.110 0.096 0.095 0.074 0.100 0.109 0.129 0.138 0.075 G (2.5X) 0.160 0.104 0.118 0.124 0.124 0.078 0.126 0.151 0.147 0.156 0.079 H (3.125X) 0.170 0.116 0.121 0.141 0.147 0.079 0.124 0.148 0.162 0.172 0.122 N (30X) 0.258 0.168 0.269 0.266 0.303 0.093 0.210 0.236 0.252 0.267 0.265 O (40X) 0.369 0.206 0.250 0.285 0.313 0.105 0.239 0.294 0.312 0.361 0.244 P (50X) 0.443 0.234 0.287 0.350 0.390 0.174 0.275 0.337 0.402 0.458 0.342 92 Để kiểm chứng khả phối trộn tìm tỉ lệ tối ưu cho phối hợp hoạt động CelA – CelS, so sánh tỉ lệ phối trộn nhiều mức độ cô mẫu khác CelA - CelS (1 volumn = 20 μl) A B C D E F G H I J K L Pha loãng CelA 1:0 1:1 1:2 1:3 1:4 0:1 1:1 2:1 3:1 4:1 CelS 20X 0.255 0.174 0.193 0.23 0.234 0.277 0.079 0.212 0.226 0.25 0.275 0.162 5X 0.185 0.117 0.132 0.153 0.147 0.157 0.075 0.139 0.161 0.176 0.185 0.084 1.25X 0.119 0.082 0.086 0.103 0.087 0.091 0.076 0.083 0.087 0.108 0.104 0.08 0.325X 0.091 0.077 0.08 0.088 0.079 0.079 0.074 0.079 0.078 0.078 0.081 0.077 30X 0.257 0.167 0.205 0.268 0.266 0.303 0.093 0.209 0.236 0.252 0.266 0.264 7.5X 0.18 0.134 0.135 0.172 0.151 0.173 0.081 0.134 0.157 0.17 0.175 0.13 1.875X 0.121 0.082 0.082 0.083 0.093 0.094 0.077 0.087 0.097 0.116 0.123 0.086 0.46875X 0.098 0.076 0.078 0.078 0.076 0.076 0.075 0.078 0.076 0.089 0.093 0.075 40X 0.375 0.206 0.233 0.25 0.285 0.313 0.105 0.24 0.293 0.317 0.359 0.242 10X 0.223 0.154 0.172 0.171 0.182 0.187 0.079 0.169 0.18 0.2 0.213 0.117 2.5X 0.159 0.103 0.125 0.118 0.124 0.124 0.078 0.126 0.152 0.147 0.156 0.078 0.625X 0.124 0.077 0.084 0.08 0.084 0.081 0.076 0.084 0.095 0.1 0.109 0.076 50X 0.442 0.232 0.267 0.286 0.35 0.391 0.174 0.274 0.337 0.436 0.457 0.342 12.5X 0.249 0.175 0.177 0.184 0.203 0.222 0.111 0.187 0.215 0.228 0.256 0.2 3.125X 0.17 0.116 0.12 0.121 0.14 0.147 0.078 0.124 0.148 0.162 0.171 0.122 0.78125X 0.146 0.082 0.085 0.11 0.096 0.094 0.074 0.1 0.108 0.128 0.137 0.074 93  Kết phân tích ANOVA chiều tỉ lệ phối trộn: Source Tỉ lệ Error Total DF 10 341 351 S = 0.07854 Level 0:1 1:0 1:1 1:2 1:3 1:4 2:1 3:1 4:1 CelA CelS N 32 32 32 32 32 32 32 32 32 32 32 SS 0.34121 2.10342 2.44464 MS 0.03412 0.00617 R-Sq = 13.96% Mean 0.08791 0.12828 0.14534 0.15591 0.16244 0.17572 0.16544 0.18238 0.19791 0.19966 0.13822 StDev 0.02511 0.05013 0.06162 0.06941 0.08262 0.09684 0.07720 0.08769 0.10214 0.09617 0.08099 F 5.53 P 0.000 R-Sq(adj) = 11.43% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+( -* ) ( -* ) ( * -) ( * -) ( * -) ( * -) ( * -) ( * -) ( -* ) ( -* ) ( -* ) + -+ -+ -+0.100 0.150 0.200 0.250 Tiến hành xử lý phương pháp xếp hạng Tukey’s HSD: Tỉ lệ CelA 4:1 3:1 1:4 2:1 1:3 1:2 1:1 CelS 1:0 0:1 N 32 32 32 32 32 32 32 32 32 32 32 Mean 0.19966 0.19791 0.18238 0.17572 0.16544 0.16244 0.15591 0.14534 0.13822 0.12828 0.08791 Grouping A A A B A B A B A B A B A B C A B C B C C Kết phân tích cho thấy tỷ lệ phối trộn tốt CelA : CelS  Kết phân tích ANOVA chiều độ pha loãng 94 Source Pha loãng Error Total DF 15 336 351 S = 0.04143 Level A (0.3125X) B (0.46875X) C (0.625X) D (0.78125X) E (1.25X) F (1.875X) G (2.5X) H (3.125X) I (5X) J (7.5X) K (10X) L (12.5X) M (20X) N (30X) O (40X) P (50X) SS 1.86784 0.57680 2.44464 MS 0.12452 0.00172 R-Sq = 76.41% N 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 Mean 0.08059 0.08091 0.08995 0.09268 0.09641 0.10468 0.12405 0.13636 0.14350 0.15059 0.17073 0.20264 0.21577 0.23491 0.27055 0.33541 F 72.54 P 0.000 R-Sq(adj) = 75.35% StDev 0.00490 0.00810 0.01571 0.01353 0.01619 0.02383 0.02785 0.02693 0.03657 0.02891 0.04086 0.03919 0.05662 0.05752 0.07293 0.08605 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ (-*-) (-*-) (-*-) ( *-) (-*-) (-*-) ( *-) (-*-) (-*-) (-*-) (-* ) (-* ) (-*-) (-* ) (-*-) (-*-) + -+ -+ -+ 0.080 0.160 0.240 0.320 Pooled StDev = 0.04143 Tiến hành xử lý phương pháp xếp hạng Tukey’s HSD: Pha loãng P (50X) O (40X) N (30X) M (20X) L (12.5X) K (10X) J (7.5X) I (5X) H (3.125X) G (2.5X) F (1.875X) E (1.25X) D (0.78125X) C (0.625X) B (0.46875X) A (0.3125X) N 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 Mean 0.33541 0.27055 0.23491 0.21577 0.20264 0.17073 0.15059 0.14350 0.13636 0.12405 0.10468 0.09641 0.09268 0.08995 0.08091 0.08059 Grouping A B B C C C D D E E F E F G E F G H F G H I G H I J H I J I J I J J J Kết cho thấy nồng độ mẫu 50 lần cho hoạt tính phân hủy CMC cao Và hoạt tính phân giải CMC tăng dần theo nồng độ pha loãng Như vậy, phương pháp đo cho xác tốt tỷ lệ phối trộn cho hiệu hoạt động tốt nồng độ khảo sát 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Alzari, P.M., Souchon, H and Dominguez, R 1996 The crystal structure of endoglucanase CelA, a family glycosyl hydrolase from Clostridium thermocellum Structure (London, England: 1993) 4, (Mar 1996), 265–275 [2] Demain, A.L., Newcomb, M and Wu, J.H.D 2005 Cellulase, Clostridia, and Ethanol Microbiology and Molecular Biology Reviews 69, (Mar 2005), 124– 154 [3] Demirbas, A.H and Demirbas, I 2007 Importance of rural bioenergy for developing countries Energy Conversion and Management 48, (Aug 2007), 2386–2398 [4] Feinberg, L et al 2011 Complete genome sequence of the cellulolytic thermophile Clostridium thermocellum DSM1313 Journal of bacteriology 193, 11 (Jun 2011), 2906–2907 [5] Ghose, T.K 1987 Measurement of cellulase activities Pure and Applied Chemistry 59, (1987), 257–268 [6] Joliff, G., Edelman, A., Klier, A and Rapoport, G 1989 Inducible Secretion of a Cellulase from Clostridium thermocellum in Bacillus subtilis Applied and Environmental Microbiology 55, 11 (Nov 1989), 2739–2744 [7] Kasana, R.C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S and Gulati, A 2008 A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using gram’s iodine Current microbiology 57, (Nov 2008), 503–507 [8] Kruus, K., Wang, W.K., Ching, J and Wu, J.H 1995 Exoglucanase activities of the recombinant Clostridium thermocellum CelS, a major cellulosome component Journal of Bacteriology 177, (Mar 1995), 1641–1644 [9] Liu, J.-M., Xin, X.-J., Li, C.-X., Xu, J.-H and Bao, J 2012 Cloning of Thermostable Cellulase Genes of Clostridium thermocellum; and Their Secretive Expression in Bacillus subtilis Applied Biochemistry and Biotechnology 166, (2012), 652–662 [10] Lynd, L.R., Weimer, P.J., van Zyl, W.H and Pretorius, I.S 2002 Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology Microbiology and molecular biology reviews: MMBR 66, (Sep 2002), 506–577, table of contents [11] Lytle, B., Myers, C., Kruus, K and Wu, J.H 1996 Interactions of the CelS binding ligand with various receptor domains of the Clostridium thermocellum cellulosomal scaffolding protein, CipA Journal of Bacteriology 178, (Feb 1996), 1200–1203 [12] Mandels, M., Andreotti, R and Roche, C 1976 Measurement of saccharifying cellulase Biotechnology and Bioengineering Symposium (1976), 21–33 [13] Morag, E., Bayer, E.A., Hazlewood, G.P., Gilbert, H.J and Lamed, R 1993 Cellulase Ss (CelS) is synonymous with the major cellobiohydrolase (subunit S8) from the cellulosome of Clostridium thermocellum Applied Biochemistry and Biotechnology 43, (Nov 1993), 147–151 96 [14] Pétré, D., Béguin, P., Millet, J and Aubert, J.P 1985 Heterologous hybridization of bacterial DNA to the endoglucanases A and B structural genes celA and celB of Clostridium thermocellum Annales de l’Institut Pasteur Microbiologie 136B, (Oct 1985), 113–124 [15] Romero, S., Merino, E., Bolivar, F., Gosset, G and Martinez, A 2007 Metabolic Engineering of Bacillus subtilis for Ethanol Production: Lactate Dehydrogenase Plays a Key Role in Fermentative Metabolism Applied and Environmental Microbiology 73, 16 (Aug 2007), 5190–5198 [16] Schumann, W 2007 Production of recombinant proteins in Bacillus subtilis Advances in Applied Microbiology 62, (2007), 137–189 [17] Schwarz, W.H., Gräbnitz, F and Staudenbauer, W.L 1986 Properties of a Clostridium thermocellum Endoglucanase Produced in Escherichia coli Applied and Environmental Microbiology 51, (Jun 1986), 1293–1299 [18] Sleat, R., Mah, R.A and Robinson, R 1984 Isolation and Characterization of an Anaerobic, Cellulolytic Bacterium, Clostridium cellulovorans sp nov Applied and Environmental Microbiology 48, (Jul 1984), 88–93 [19] Soutschek-Bauer, E and Staudenbauer, W.L 1987 Synthesis and secretion of a heat-stable carboxymethylcellulose from Clostridium thermocellum in Bacillus subtilis and Bacillus stearothermophilus Molecular & general genetics: MGG 208, (Jul 1987), 537–541 [20] Tổng cục thống kê 2011 Niên giám thống kê Nhà xuất thống kê [21] Tsai, S.-L., Oh, J., Singh, S., Chen, R and Chen, W 2009 Functional Assembly of Minicellulosomes on the Saccharomyces cerevisiae Cell Surface for Cellulose Hydrolysis and Ethanol Production Applied and Environmental Microbiology 75, 19 (Oct 2009), 6087–6093 [22] Wang, W.K., Kruus, K and Wu, J.H 1993 Cloning and DNA sequence of the gene coding for Clostridium thermocellum cellulase Ss (CelS), a major cellulosome component Journal of Bacteriology 175, (Mar 1993), 1293–1302 [23] Yi, Z.-L., Pei, X.-Q and Wu, Z.-L 2011 Introduction of glycine and proline residues onto protein surface increases the thermostability of endoglucanase CelA from Clostridium thermocellum Bioresource technology 102, (Feb 2011), 3636–3638 [24] Yi, Z.-L and Wu, Z.-L 2010 Mutations from a family-shuffling-library reveal amino acid residues responsible for the thermostability of endoglucanase CelA from Clostridium thermocellum Biotechnology letters 32, 12 (Dec 2010), 1869– 1875 97